CN112881647A - CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法 - Google Patents
CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112881647A CN112881647A CN202110035078.7A CN202110035078A CN112881647A CN 112881647 A CN112881647 A CN 112881647A CN 202110035078 A CN202110035078 A CN 202110035078A CN 112881647 A CN112881647 A CN 112881647A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- quality control
- imfish
- detection technology
- combining
- control sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/24—Earth materials
Abstract
本发明提供了CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,包括以下步骤:留取肿瘤细胞,经胰酶消化后利用甲醇‑乙酸固定液进行梯度固定。该方法制备的质控样品,可从CTC的富集至imFISH阶段做全程质控,可用于判断批次间检测技术的准确性;该质控样品为经过处理并固定DNA的培养肿瘤细胞,可长期保存于固定液中,而且在常温或冰箱冷藏保存即可,无需超低温冰箱保存活细胞。本发明解决了CTC阴性富集法联合imFISH检测技术中缺少临床实验室质控要求的问题,所制备的质控样品能够从富集细胞开始到imFISH最后的阅片阶段实现质量控制,有利于提高检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)的检测已被广泛应用于肿瘤疗效的快速评估、预后的判别及耐药与复发的即时性监测。免疫荧光原位杂交(imFISH)是在组织、细胞水平上对蛋白、DNA或RNA进行定性、定位和定量分析的实验技术,利用该技术对CTC进行鉴别与分类,可确定并分离出具有特殊临床意义的CTC。近年来CTC阴性富集法联合imFISH检测技术展现出了良好的前景。
质控样品对于确保方法的准确性具有重要作用。现有技术中,循环肿瘤细胞(CTC)阴性富集法+imFISH检测技术未有质控品及质控方法,因此该方法用于检测CTC的准确性难以判断。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷,提供CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,以解决现有技术中缺乏此类质控品的技术问题。
为实现以上技术目的,本发明采用以下技术方案:
CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,包括以下步骤:留取肿瘤细胞,经胰酶消化后利用甲醇-乙酸固定液进行梯度固定。
作为优选,所述肿瘤细胞是经细胞培养获得的。
作为优选,所述肿瘤细胞是活体肿瘤经切除破碎获得的。
作为优选,所述肿瘤细胞是单个肿瘤细胞或肿瘤细胞团。
作为优选,所述胰酶消化的时长为3~5min,待肿瘤细胞呈漂浮状时,加入封闭血清终止消化。
作为优选,在所述梯度固定的过程中,每次均包括以下步骤:向肿瘤细胞中加入其体积20~50倍的、含有甲醇乙酸混合液的工作液,混匀,静置10min后,800~2000r/min离心5~10min。
作为优选,在所述梯度固定的过程中,甲醇乙酸混合液在工作液中的占比依次为25%、50%、75%、100%;所述工作液中,除甲醇乙酸混合液之外,余量均为浓度0.9%的NaCl溶液。
作为优选,所述梯度固定完毕后,还包括以下步骤:将肿瘤细胞重悬于甲醇乙酸混合液中,利用甲醇乙酸混合液对其进行稀释,并进行细胞计数。
作为优选,待稀释至5-10个细胞或细胞团/μL时,停止稀释,置于不低于0℃的环境中保存。
作为优选,在胰酶消化后,不执行所述梯度固定步骤,而执行以下步骤:将肿瘤细胞与细胞冻存液混匀,置于不高于-70℃的环境中保存。
在以上技术方案中,质控细胞可为单个肿瘤细胞也可以是肿瘤细胞团。此外,培养的肿瘤细胞在酶消化后(或活体肿瘤切除破碎后的肿瘤细胞用酶处理后)可不经过甲醇-乙酸-NaCl梯度固定液固定,而是可直接计数后用细胞冻存液混匀,置超低温冰箱保存。
本发明提供了CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法。该方法制备的质控样品,可从CTC的富集至imFISH阶段做全程质控,可用于判断批次间检测技术的准确性,并对检测人员操作方法及细胞回收率进行质控,保证每一例病例检测的准确性。该质控样品为经过处理并固定DNA的培养肿瘤细胞,可长期保存于固定液中,而且在常温或冰箱冷藏保存即可,无需超低温冰箱保存活细胞。
本发明解决了CTC阴性富集法联合imFISH检测技术中缺少临床实验室质控要求的问题,所制备的质控样品能够从富集细胞开始到imFISH最后的阅片阶段实现质量控制,在该项检测技术中增加质控项目有利于提高检测的准确性,对实验室及检测技术中存在失控之处能及时反应出来,并及时予以纠正,对提高此项检测技术的检测质量具有积极意义。本发明在循环肿瘤细胞(CTC)阴性富集法+imFISH检测技术中实现了富集细胞阶段及imFISH阶段的实验室质量控制,可具体用于检测CTC富集阶段的肿瘤细胞富集率、评价imFISH阶段的制片情况等实验。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节,在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述,表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外,以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,包括以下步骤:
1、细胞实验室培养肿瘤细胞:
A、将含有肿瘤细胞的细胞冻存管从液氮或超低温冰箱中取出后,迅速放入37℃水浴锅中轻微摇动,复苏细胞。待液体融化后,用75%酒精喷洒瓶身并移至超净工作台。
B、将冻存管中的细胞悬液全部转移至含有10ml培养液的15ml离心管中,1000r/min,离心5min。
C、离心完毕后,取出离心管,弃去上清,并于离心管中加入1ml培养液,混匀。将混匀后的细胞悬液全部转移至装有10ml培养液的10cm培养皿中,轻轻摇动,使得细胞与培养液充分混匀并均匀分布于培养皿中。
D、将盛有细胞混悬液的培养皿置于37℃,5%CO2培养箱中培养。
E、隔夜培养,并于倒置显微镜下观察培养细胞覆盖率。当培养皿中的细胞覆盖率达到80%~90%时传代。将原有培养液吸取并弃去,加入2ml PBS液,清洗细胞,清洗2次,并吸尽培养皿中的PBS。
2、培养良好的肿瘤细胞从培养箱取出后,加入1ml胰酶消化3-5min,(胰酶量可根据细胞量而定)并在倒置显微镜下观察,待大部分细胞呈漂浮状时,加入封闭血清终止消化。
3、将培养皿中的细胞悬液全部转移至15ml离心管中,800-2000r/min离心5-10min。
4、离心完毕,弃去上清液,加入25%的甲醇-乙酸-0.9%NaCl液(甲醇乙酸混合液占25%),加入的量约为离心管中细胞沉淀的20-50倍体积大小。混匀,静置10min后,800-2000r/min离心5-10min。
5、离心完毕,弃去上清液,加入50%的甲醇-乙酸-0.9%NaCl液(甲醇乙酸混合液占50%),加入的量约为离心管中细胞沉淀的20-50倍体积大小。混匀,静置10min后,800-2000r/min离心5-10min。
6、离心完毕,弃去上清液,加入75%的甲醇-乙酸-0.9%NaCl液(甲醇乙酸混合液占75%),加入的量约为离心管中细胞沉淀的20-50倍体积大小。混匀,静置10min后,800-2000r/min离心5-10min。
7、离心完毕,弃去上清液,加入100%的甲醇-乙酸液,加入的量约为离心管中细胞沉淀的20-50倍体积大小。混匀,静置10min后,800-2000r/min离心5-10min。
8、离心完毕,弃去上清液,加入100%的甲醇-乙酸液至10ml刻度线并混匀细胞悬液。
9、将15ml离心管中的细胞悬液在进一步稀释,可分装于多个15ml或50ml离心管中并用甲醇-乙酸固定液稀释,边稀释边用移液枪吸取10ul滴于玻片中观察并计数细胞,稀释至5-10个/ul细胞或细胞团时可停止稀释。
10、吸取100-200ul细胞悬液于微量细胞计数保存瓶中,并放置于倒置显微镜中计数并记下细胞数,瓶壁编号。
11、计数完毕后于保存瓶中加入500-1000ul的甲醇-乙酸固定液,拧紧瓶盖,常温或常规冷藏保存均可。
12、保存于微量细胞计数保存瓶中的质控细胞混悬液可按阴性富集法收集CTC操作,用于批内与批间质控。
以上对本发明的实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,其特征在于包括以下步骤:留取肿瘤细胞,经胰酶消化后利用甲醇-乙酸固定液进行梯度固定。
2.根据权利要求1所述的CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,其特征在于,所述肿瘤细胞是经细胞培养获得的。
3.根据权利要求1所述的CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,其特征在于,所述肿瘤细胞是活体肿瘤经切除破碎获得的。
4.根据权利要求1所述的CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,其特征在于,所述肿瘤细胞是单个肿瘤细胞或肿瘤细胞团。
5.根据权利要求1所述的CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,其特征在于,所述胰酶消化的时长为3~5min,待肿瘤细胞呈漂浮状时,加入封闭血清终止消化。
6.根据权利要求1所述的CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,其特征在于,在所述梯度固定的过程中,每次均包括以下步骤:向肿瘤细胞中加入其体积20~50倍的、含有甲醇乙酸混合液的工作液,混匀,静置10min后,800~2000r/r/min离心5~10min。
7.根据权利要求6所述的CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,其特征在于,在所述梯度固定的过程中,甲醇乙酸混合液在工作液中的占比依次为25%、50%、75%、100%;所述工作液中,除甲醇乙酸混合液之外,余量均为浓度0.9%的NaCl溶液。
8.根据权利要求1所述的CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,其特征在于,所述梯度固定完毕后,还包括以下步骤:将肿瘤细胞重悬于甲醇乙酸混合液中,利用甲醇乙酸混合液对其进行稀释,并进行细胞计数。
9.根据权利要求8所述的CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,其特征在于,待稀释至5-10个细胞或细胞团/μL时,停止稀释,置于不低于0℃的环境中保存。
10.根据权利要求1所述的CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法,其特征在于,在胰酶消化后,不执行所述梯度固定步骤,而执行以下步骤:将肿瘤细胞与细胞冻存液混匀,置于不高于-70℃的环境中保存。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110035078.7A CN112881647A (zh) | 2021-01-12 | 2021-01-12 | CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110035078.7A CN112881647A (zh) | 2021-01-12 | 2021-01-12 | CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112881647A true CN112881647A (zh) | 2021-06-01 |
Family
ID=76045507
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110035078.7A Pending CN112881647A (zh) | 2021-01-12 | 2021-01-12 | CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112881647A (zh) |
Citations (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5478722A (en) * | 1991-02-17 | 1995-12-26 | The Curators Of The University Of Missouri | Preserved cell preparations for flow cytometry and immunology |
CN1609194A (zh) * | 2003-10-25 | 2005-04-27 | 翁炳焕 | 染色体异常质控细胞的制备及质控方法 |
US20120088233A1 (en) * | 2010-10-12 | 2012-04-12 | Life Technologies Corporation | Method of Preparing Quality Control Material for FFPE |
CN104060329A (zh) * | 2013-03-19 | 2014-09-24 | 翁炳焕 | 一种染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法 |
CN104569397A (zh) * | 2015-01-30 | 2015-04-29 | 卫生部北京医院 | 一种乳腺癌检测质控品及其制备方法 |
CN105177124A (zh) * | 2015-08-20 | 2015-12-23 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种细胞源性质控品的制备方法 |
CN105441541A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-03-30 | 北京医院 | 一种肺癌检测质控品及其制备方法 |
CN105675378A (zh) * | 2014-11-18 | 2016-06-15 | 上海张江转化医学研发中心有限公司 | 一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置 |
CN106011240A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-10-12 | 合肥艾迪康临床检验所有限公司 | 一种融合基因室内质控品、制作方法及其固定液的配方 |
CN106635995A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-05-10 | 亚能生物技术(深圳)有限公司 | 一种循环肿瘤细胞阴性富集方法 |
CN107132089A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-09-05 | 遵义医学院附属医院 | 一种医用脑脊液质控品的制备方法 |
CN107153021A (zh) * | 2017-05-10 | 2017-09-12 | 亚能生物技术(深圳)有限公司 | 循环肿瘤细胞染色的质控品及其制备方法 |
US20170284909A1 (en) * | 2015-02-06 | 2017-10-05 | Wei Ding | Method for preparing liquid-state dripping or coating pathological quality control product and uses thereof |
US20180258378A1 (en) * | 2015-07-31 | 2018-09-13 | Shanghai Jiaotong University | Method and device for detecting circulating tumor cell |
CN109187978A (zh) * | 2018-08-10 | 2019-01-11 | 北京莱尔生物医药科技有限公司 | 一种检测循环肿瘤细胞her2、er、pr的免疫荧光试剂盒及其应用 |
CN109946129A (zh) * | 2019-03-12 | 2019-06-28 | 江苏中济万泰生物医药有限公司 | 五分类血细胞分析仪用质控品制备方法 |
CN110702909A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-01-17 | 骏实生物科技(上海)有限公司 | 循环肿瘤细胞阴性富集检测方法 |
US20200095555A1 (en) * | 2018-09-21 | 2020-03-26 | National Taiwan University | Method for circulating tumor cells isolation |
-
2021
- 2021-01-12 CN CN202110035078.7A patent/CN112881647A/zh active Pending
Patent Citations (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5478722A (en) * | 1991-02-17 | 1995-12-26 | The Curators Of The University Of Missouri | Preserved cell preparations for flow cytometry and immunology |
CN1609194A (zh) * | 2003-10-25 | 2005-04-27 | 翁炳焕 | 染色体异常质控细胞的制备及质控方法 |
US20120088233A1 (en) * | 2010-10-12 | 2012-04-12 | Life Technologies Corporation | Method of Preparing Quality Control Material for FFPE |
CN104060329A (zh) * | 2013-03-19 | 2014-09-24 | 翁炳焕 | 一种染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法 |
CN105675378A (zh) * | 2014-11-18 | 2016-06-15 | 上海张江转化医学研发中心有限公司 | 一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置 |
CN104569397A (zh) * | 2015-01-30 | 2015-04-29 | 卫生部北京医院 | 一种乳腺癌检测质控品及其制备方法 |
US20170284909A1 (en) * | 2015-02-06 | 2017-10-05 | Wei Ding | Method for preparing liquid-state dripping or coating pathological quality control product and uses thereof |
US20180258378A1 (en) * | 2015-07-31 | 2018-09-13 | Shanghai Jiaotong University | Method and device for detecting circulating tumor cell |
CN105177124A (zh) * | 2015-08-20 | 2015-12-23 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种细胞源性质控品的制备方法 |
CN105441541A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-03-30 | 北京医院 | 一种肺癌检测质控品及其制备方法 |
CN106011240A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-10-12 | 合肥艾迪康临床检验所有限公司 | 一种融合基因室内质控品、制作方法及其固定液的配方 |
CN106635995A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-05-10 | 亚能生物技术(深圳)有限公司 | 一种循环肿瘤细胞阴性富集方法 |
CN107132089A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-09-05 | 遵义医学院附属医院 | 一种医用脑脊液质控品的制备方法 |
CN107153021A (zh) * | 2017-05-10 | 2017-09-12 | 亚能生物技术(深圳)有限公司 | 循环肿瘤细胞染色的质控品及其制备方法 |
CN109187978A (zh) * | 2018-08-10 | 2019-01-11 | 北京莱尔生物医药科技有限公司 | 一种检测循环肿瘤细胞her2、er、pr的免疫荧光试剂盒及其应用 |
US20200095555A1 (en) * | 2018-09-21 | 2020-03-26 | National Taiwan University | Method for circulating tumor cells isolation |
CN109946129A (zh) * | 2019-03-12 | 2019-06-28 | 江苏中济万泰生物医药有限公司 | 五分类血细胞分析仪用质控品制备方法 |
CN110702909A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-01-17 | 骏实生物科技(上海)有限公司 | 循环肿瘤细胞阴性富集检测方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN114317443A (zh) | 乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 | |
CN111189761A (zh) | 基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒及检测方法 | |
CN110608991B (zh) | 基于质谱流式检测技术的细胞周期检测试剂盒及检测方法 | |
CN111334469A (zh) | Pbmc体外3d甲基纤维素琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法 | |
CN112029813A (zh) | 一种评价城市垃圾焚烧飞灰浸出毒性的方法 | |
CN113186156A (zh) | 一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法 | |
WO2022161294A1 (zh) | 一种中通量单细胞拷贝数文库构建的方法及其应用 | |
CN115247147A (zh) | 一种脐带间充质干细胞的培养及冻存方法 | |
CN112881647A (zh) | CTC阴性富集法联合imFISH检测技术质控样品的制备方法 | |
CN219752329U (zh) | 一种快速检测用干细胞培养装置 | |
CN115754306A (zh) | 化合物下拉靶点蛋白的方法 | |
CN115044639A (zh) | 一种抗衰老药物的筛选方法 | |
CN113322314B (zh) | 一种新型组织单细胞空间转录组技术 | |
CN113717922B (zh) | 一种适用于拟南芥叶片组织原生质体分离的含转录抑制剂的试剂盒及其应用 | |
CN107400719B (zh) | 一组柞蚕微孢子虫检测引物及其应用 | |
CN112391444A (zh) | 不同功能特性的间充质干细胞在治疗不同疾病中的应用 | |
CN112376115A (zh) | 一种利用单细胞转录组测序技术检测不同疾病的方法 | |
CN112438252A (zh) | 一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法 | |
CN112662621B (zh) | 一种逆转间充质干细胞衰老的方法及应用 | |
CN116376821B (zh) | 一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法 | |
CN109370978B (zh) | 一种栉孔扇贝消化盲囊亚细胞组分分离方法 | |
CN214702988U (zh) | 一种染色体核型分析快速染色试剂盒 | |
CN111454940B (zh) | 一种用于高通量snp分型的猪毛囊dna高效提取的方法 | |
CN113528503B (zh) | 研究淡水超微真核藻群落结构多样性的固定方法 | |
CN107663513B (zh) | 一种高效的宫膜干细胞分离提取方法及建库方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |