CN107153021A - 循环肿瘤细胞染色的质控品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种循环肿瘤细胞染色的质控品，包括免疫磁珠、循环肿瘤细胞系和白细胞，所述循环肿瘤细胞系富集并结合至免疫磁珠上。本发明还涉及一种循环肿瘤细胞染色的质控品的制备方法。本发明的循环肿瘤细胞染色的质控品可监测染色试剂盒是否出现异常，具有便捷、操作简单等优点，质控结果可直接反应CTC染色试剂盒的质量。
Description
技术领域
本发明涉及细胞染色，特别涉及循环肿瘤细胞染色的质控品及其制备方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC，Circulating TumorCell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。CTC检测通过捕捉检测外周血中恒量存在的CTC，监测CTC类型和数量变化的趋势，以便实时监测肿瘤动态、评估治疗效果以及实现实时个体治疗等。目前国内在循环肿瘤细胞染色试剂盒方面已存在多个相关专利文件，但是尚无对循环肿瘤细胞染色试剂进行质控的专利文件。在实验室中，当我们对循环肿瘤细胞进行染色时，因肿瘤病人的病情轻重血液中分离出的循环肿瘤细胞个数存在差异、染色过程中由于染色步骤多而导致的细胞损失、以及损失量的多少、染色试剂保存不当或者因其他原因造成的试剂出现问题，出现假阳性/假阴性及非特异性等结果，无法做出准确的判断。细胞的损失、假阳性/假阴性的出现造成的数据差异，都会给后续的分析、诊断带来极大的影响。公开号为CN103472227的中国发明专利公开了一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒，该试剂盒中免疫磁性微球的抗体富集及捕获CTC细胞时，同时血液白细胞也有富集及捕获，因此无法排除血液白细胞的干扰，分析出的假阳性率较高。美国Fluxion公司生产的微流体CTC细胞筛选分析系统(IsoFluxTMSystem950-0100)，及其配套试剂CTC富集试剂盒(CTC Enrichment Kit，P/N:910-0091)富集的CTC使用其配套染色试剂盒染色，该试剂盒由于染色操作步骤多，细胞损失量大，无法对CTC染色试剂盒使用过程中因保存、操作不当等因素进行质控。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种可对循环肿瘤细胞染色进行质控的循环肿瘤细胞染色的质控品，并提供上述试剂的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种循环肿瘤细胞染色的质控品，包括免疫磁珠、循环肿瘤细胞系和白细胞，所述循环肿瘤细胞系富集并结合至免疫磁珠上。
一种循环肿瘤细胞染色的质控品，包括结合缓冲液和置于所述结合缓冲液中的上述的循环肿瘤细胞染色的质控品。
一种循环肿瘤细胞染色的质控品的制备方法，将免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得所述免疫磁珠的工作液；将所述免疫磁珠的工作液、白细胞和循环肿瘤细胞系进行混合，混合后分离以去除液体，然后于去除液体后剩余的免疫磁珠中加入固定液进行固定，获得所述质控品。
本发明的有益效果在于：
(1)针对现有技术中染色试剂盒不存在质控产品，设计免疫磁珠，利用免疫磁珠结合肿瘤细胞，以循环肿瘤细胞系和白细胞模拟捕获循环肿瘤细胞制备质控品，之后对使用不同的CTC染色试剂盒进行质控，从而对CTC染色试剂盒进行质控；并通过对比实验对在使用CTC染色试剂盒时是否出现评价或验证测量精密度、测量准确度、试剂变化进行判断；
(2)本发明可以对CTC染色试剂盒使用过程中因保存、操作不当等因素进行质控，可进行染色质控，判断假阳性率；本发明可监测染色试剂盒是否出现异常，具有便捷、操作简单等优点，质控结果可直接反应CTC染色试剂盒的质量。
附图说明
图1为本发明实施例二的循环肿瘤细胞染色的质控品中的SK-OV-3细胞系的质控结果的截图；
图2为本发明实施例二的循环肿瘤细胞染色的质控品中的白细胞的质控结果的截图；
图3为本发明实施例三的循环肿瘤细胞染色的质控品中的SK-OV-3细胞系的质控结果的截图；
图4为本发明实施例三的循环肿瘤细胞染色的质控品中的白细胞的质控结果的截图；
图5为本发明实施例四的循环肿瘤细胞染色的质控品中的SK-OV-3细胞系的质控结果的截图；
图6为本发明实施例四的循环肿瘤细胞染色的质控品中的白细胞的质控结果的截图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
所述EpCAM免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、HER2免疫磁珠和MUC1免疫磁珠分别为EpCAM抗体、EGFR抗体、HER2抗体和MUC1抗体分别与磁性微球偶联得到的免疫磁珠。
所述该富集是指免疫磁珠与循环肿瘤细胞系和白细胞在外加磁场作用下进行富集。
缩略词的含义如下：
CTC：循环肿瘤细胞；
EpCAM：上皮细胞粘附分子；
EGFR：上皮生长因子受体。
HER2：表皮生长因子受体2
MUC1：即MUC1粘蛋白(以下简称MUC1)，是一种Ⅰ型跨膜蛋白，由于MUC1在肿瘤组织中的异常表达，使其成为一种潜在的肿瘤生物学标志物。
本发明最关键的构思在于：设计将循环肿瘤细胞系富集并结合至多重抗体免疫磁珠，以实现染色质控。
请参照图1以及图2，一种循环肿瘤细胞染色的质控品，包括免疫磁珠、循环肿瘤细胞系和白细胞，所述循环肿瘤细胞系富集并结合至免疫磁珠上。
本发明的质控品的工作原理为：利用循环肿瘤细胞系作为阳性对照，白细胞作为阴性对照，对实验样本使用的试剂进行质控。通过对照组试剂是否异常来反应实验组试剂是否正常。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：
(1)针对现有技术中染色试剂盒不存在质控产品，设计免疫磁珠，利用免疫磁珠结合肿瘤细胞，以循环肿瘤细胞系和白细胞模拟捕获循环肿瘤细胞制备质控品，之后对使用不同的CTC染色试剂盒进行质控，从而对CTC染色试剂盒进行质控；并通过对比实验对在使用CTC染色试剂盒时是否出现评价或验证测量精密度、测量准确度、试剂变化进行判断；
(2)本发明可以对CTC染色试剂盒使用过程中因保存、操作不当等因素进行质控，可进行染色质控，判断假阳性率；本发明可监测染色试剂盒是否出现异常，具有便捷、操作简单等优点，质控结果可直接反应CTC染色试剂盒的质量。
进一步的，免疫磁珠为多重抗体免疫磁珠，所述多重抗体免疫磁珠包括至少两种免疫磁珠。
进一步的，所述多重抗体免疫磁珠包括EpCAM免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、HER2免疫磁珠、CD45免疫磁珠和MUC1免疫磁珠中的至少两种。
进一步的，所述多重抗体免疫磁珠由EpCAM免疫磁珠和EGFR免疫磁珠组成。
进一步的，所述循环肿瘤细胞系为SK-OV-3细胞系、NCI-H1975细胞系、MCF7细胞系、A549细胞系或SiHa细胞系。
根据上述描述可知，在阴性富集中，CD45免疫磁珠可与白细胞结合。HER2免疫磁珠和MUC1免疫磁珠在液态活检中作用于循环肿瘤细胞。
本发明可选择EpCAM免疫磁珠和EGFR免疫磁珠共同作用，具有增强特异性的技术效果。
具体的说，EpCAM是上皮细胞粘附分子，可与循环肿瘤细胞特异性结合。EGFR抗体与磁珠结合，可与循环肿瘤细胞的表皮生长因子受体结合。使用两种磁珠起到增加富集效率作用，增强特异性。
本发明使用的免疫磁珠种类的多少取决于细胞的结合的特异性，特异性结合越强，使用的免疫磁珠种类越少越好，可避免磁珠过量导致目标细胞被磁珠包裹与遮挡。
免疫磁珠的选择可根据目标细胞的种类、特异性结合因子进行。例如，在使用的SK-OV-3为上皮来源的卵巢癌细胞系，EpCAM和EGFR两种免疫磁珠可与SK-OV-3细胞特异性结合，达到富集的目的。因此，上皮来源的细胞均可与这两种免疫磁珠结合。
免疫磁珠可以选择Fluxion公司产品，其加入的样本量优选为每个样本加入30μLEpCAM和20μL EGFR。
循环肿瘤细胞除了SK-OV-3细胞系，还可以为NCI-H1975[H-1975,H1975](CRL-5908TM)(人肺腺癌细胞系)、MCF7(HTB-22TM)(乳腺癌细胞系)、A549(CCL-185TM)(非小细胞肺癌细胞系)、以及SiHa(HTB-35TM)(人子宫颈鳞癌细胞)等等。
一种循环肿瘤细胞染色的质控品，包括结合缓冲液和置于所述结合缓冲液中的上述的循环肿瘤细胞染色的质控品。
一种循环肿瘤细胞染色的质控品的制备方法，将免疫磁珠与结合缓冲液混合，分别获得所述免疫磁珠的工作液；将所述免疫磁珠的工作液、白细胞和循环肿瘤细胞系进行混合，混合后分离以去除液体，然后于去除液体后剩余的免疫磁珠中加入固定液进行固定，获得所述质控品。
当免疫磁珠为包括至少两种免疫磁珠的多重抗体免疫磁珠时，其制备方法对应为：将多重抗体免疫磁珠中的每一种免疫磁珠分别与结合缓冲液混合，分别获得对应所述每一种免疫磁珠的工作液；将对应所述每一种免疫磁珠的工作液、白细胞和循环肿瘤细胞系进行混合，混合后分离以去除液体，然后于去除液体后剩余的免疫磁珠中加入固定液进行固定，获得所述质控品。
进一步的，加入固定液进行固定之后，进行分离以去除液体，然后加入结合缓冲液，并于4℃条件下进行保存。
进一步的，还包括从血液样本中分离获得所述白细胞的步骤、以及通过细胞培养获得所述循环肿瘤细胞系的步骤。
进一步的，所述多重抗体免疫磁珠由EpCAM免疫磁珠和EGFR免疫磁珠组成，通过结合缓冲液对EpCAM免疫磁珠和EGFR免疫磁珠进行洗涤，然后将洗涤后的EpCAM免疫磁珠和EGFR免疫磁珠分别置于结合缓冲液中进行重悬，分别获得EpCAM免疫磁珠的工作液和EGFR免疫磁珠的工作液，将EpCAM免疫磁珠的工作液、EGFR免疫磁珠的工作液、白细胞和循环肿瘤细胞系进行混合，所述EpCAM免疫磁珠的工作液和EGFR免疫磁珠的工作液的体积比为3:2，所述白细胞和循环肿瘤细胞系的细胞数比值为104:1，然后将混合后的混合液于4℃条件下以5-18转/分钟的旋转速度旋转1.5h，再进行分离以去除液体。
进一步的，所述固定液为40μL 1.6％Fix，所述固定时间为20min，且于固定时间内每10min进行重悬一次。
请参照图1-6，本发明的实施例一为：
本实施例的循环肿瘤细胞染色的质控品的制备方法，包括：
(一)白细胞的分离
包括下述步骤：
1、通过常规手臂静脉采血的方式使用真空采血管采集受试者外周血4ml。
2、根据样本数量准备相应个数的1.5ml小离心管，各加600ul的结合缓冲液(binding buffer)。
3、根据样本数量准备相应个数的50ml带滤膜离心管，各加入15.2ml淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque PLUS)，室温1000×g离心1min。
4、向步骤3中50ml带滤膜离心管中缓慢加入5ml不含钙离子与镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS-CMF)；轻柔颠倒真空采血管使血样混匀，将血样缓慢倒入带滤膜离心管中；用5ml PBS-CMF冲洗采血管，盖上采血管管盖，轻柔颠倒混匀后倒入同一带滤膜离心管中。用5ml PBS-CMF重复上述动作一次。
5、800×g转速离心15min。(需缓慢降速)
6、将带滤膜离心管中的大部分上清液倒入一支新的50ml普通离心管中，余留5～10ml上清液并轻轻摇晃带滤膜离心管，确保粘在管壁内的细胞全部被涮洗下来，倒入同一50ml普通离心管中。向带滤膜离心管中加入10mlPBS-CMF，用5ml移液枪反复冲洗管壁后吸出，加入同一50ml普通离心管中。(注意：枪头请勿滤膜)
7、室温300×g离心10min。
8、将离心管在实验台面上轻轻磕打，直至管底细胞团完全松散。
9、将离心管底部细胞悬液用移液枪轻柔吹打混匀，通过细胞计数板计数，用binding buffer稀释，每份白细胞106个转移入步骤2已包被好的1.5ml小离心管中，用binding buffer稀释至300ul(分装前需将小离心管中的binding buffer吸出)。
(二)SK-OV-3(HTB-77TM)细胞培养
包括下述步骤：
1、培养皿中的细胞覆盖率达到80％-90％时使用。
2、把原有McCy3’s培养基吸掉，加入3ml PBS漂洗，洗掉PBS。
3、加0.5-1ml胰蛋白酶(立即摇匀能覆盖细胞)，37℃消化3分钟。
4、细胞都变圆后加入1ml含血清的McCy3’s培养基终止消化。
5、用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来。
6、把细胞吸到离心管中，轻轻吹打至分散，300×g离心5min。
7、倒掉上清液，加2ml培养基，把细胞吹散悬浮。
8、收集的SK-OV-3(HTB-77TM)细胞，分为数份，每份100个SK-OV-3细胞，用binding buffer稀释至300ul，以获得SK-OV-3细胞系。
(三)质控品的制备
包括下述步骤：
1、各准备3份上述SK-OV-3细胞系和白细胞，每份SK-OV-3细胞系和白细胞混合，总体积为600ul。
2、将EpCAM磁珠用移液枪充分吹打重悬，取适量EpCAM磁珠(每个样本需30ul，根据样本量取相应体积的磁珠)，置于新的1.5ml小离心管中，将离心管底部紧贴磁铁5s，保持磁铁紧贴在离心管上，将离心管中液体小心吸出。向小离心管中加入1ml binding buffer，将离心管底部紧贴磁铁5s，保持磁铁紧贴在离心管上，将离心管中液体小心吸出。再加入1mlbinding buffer，重复上述步骤一次。用适量体积的binding buffer将磁珠重悬(每个样本需30ul，根据样本量加入相应体积的binding buffer)。
3、将EGFR磁珠用移液枪充分吹打重悬，取适量EGFR磁珠(每个样本需20ul，根据样本量取相应体积的磁珠)，用步骤2同样的方法处理EGFR磁珠备用。
4、将制备好的磁珠用移液枪充分吹打重悬之后加入步骤1中的1.5ml小离心管，每管加入30ul EpCAM磁珠，20ul EGFR磁珠，颠倒混匀。
5、将小离心管紧贴在磁铁上3s，之后颠倒混匀。重复该操作5次。
6、将小离心管置于垂直混匀仪上，于4℃冰箱中旋转混匀1.5h。旋转速度为15-18转/分钟。
7、将孵育的离心管用磁铁紧贴离心管，吸附管内磁珠，弃液体。用40μL 1.6％Fix固定20min，每10min重悬一次。
8、弃液，加入100μL binding buffer，并于4℃保存备用。
本发明的实施例二为：
采集健康人手臂静脉血，按照实施例一所述方法对血样进行处理，收集健康人血液中的白细胞，以及准备SK-OV-3细胞。按照实施例一所述方法制备质控品，制备n份进行固定保存，对CTC染色试剂盒进行质控。
根据不同的保存时间对CTC染色试剂盒进行质控。以当天制备、保存一周的质控品为实验对象，按照CTC染色流程对质控品进行CTC染色。结果参见图1-2。
如图1-2所示，分别为SK-OV-3(CK染色)和白细胞(CD45染色)质控结果截图，根据计数统计，当天制备SK-OV-3染色率平均为72.5％，保存一周染色率平均为65％。
本发明的实施例三为：
采集健康人手臂静脉血，按照实施例一所述方法对血样进行处理，收集健康人血液中的白细胞，以及准备SK-OV-3细胞。按照实施例一所述方法制备质控品，制备n份进行固定保存，对CTC染色试剂盒进行质控。
根据不同的保存时间对CTC染色试剂盒进行质控。以保存一个月的质控品为实验对象，按照CTC染色流程对质控品进行CTC染色。
如图3-4所示，分别为SK-OV-3(DAPI染色)和白细胞(DAPI染色)质控结果截图，根据计数统计，保存一个月染色效率平均为44.5％。
本发明的实施例四为：
采集健康人手臂静脉血，按照实施例一部分所述方法对血样进行处理，收集健康人血液中的白细胞，以及准备SK-OV-3细胞。按照实施例一所述方法制备质控品，制备n份进行固定保存，对CTC染色试剂盒进行质控。
根据不同的保存时间对CTC染色试剂盒进行质控。以保存三个月的质控品为实验对象，按照CTC染色流程对质控品进行CTC染色。
如图5-6所示，分别为SK-OV-3和白细胞质控结果截图，根据计数统计，保存三个月染色效率平均为35％。
此外，对获得的质控品在保存过程中的染色率参数进行检查，获得下述表1，表1为质控品在保存过程中的细胞染色率的数值列表。
表1
| 保存时间 | 0 | 1周 | 1个月 | 三个月 |
| 细胞染色率(％) | 72.5％ | 65％。 | 44.5％ | 35％ |
上述实施例二至实施例四中，采用的CTC染色试剂盒为美国Fluxion公司生产的CTC染色试剂盒，检验流程也是Fluxion公司所提供的操作流程，但用于质控对象的试剂及流程并不局限于上述。
上述实施例二至实施例四中，使用的循环肿瘤细胞系为SK-OV-3细胞系，即卵巢癌细胞系，但不局限于上述SK-OV-3细胞系，只要细胞表面能被EpCAM、EGFR等抗体特异性结合的循环肿瘤细胞系，均可用于制备本发明的质控品。
实施例一至实施例四中，使用的多重抗体免疫磁珠由EpCAM抗体、EGFR抗体分别与磁性微球偶联得到的EpCAM免疫磁珠与EGFR免疫磁珠组成，然后利用EpCAM免疫磁珠与EGFR免疫磁珠与细胞系结合富集目的细胞，但是磁性微球与表面分子的耦联并不局限于EpCAM和EGFR。
实施例一至实施例四中，将细胞与免疫磁珠相结合制备质控品的方法，用于阴性、阳性对照，用于染色试剂盒质控，并不局限于上述实施例中描述的制备方法。
综上所述，本发明提供的循环肿瘤细胞染色的质控品可监测染色试剂盒是否出现异常，具有便捷、操作简单等优点，质控结果可直接反应CTC染色试剂盒的质量。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种循环肿瘤细胞染色的质控品，其特征在于，包括免疫磁珠、循环肿瘤细胞系和白细胞，所述循环肿瘤细胞系富集并结合至免疫磁珠上。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞染色的质控品，其特征在于，所述免疫磁珠为多重抗体免疫磁珠，所述多重抗体免疫磁珠包括至少两种免疫磁珠。
3.根据权利要求1或2所述的循环肿瘤细胞染色的质控品，其特征在于，所述多重抗体免疫磁珠由EpCAM免疫磁珠和EGFR免疫磁珠组成。
4.根据权利要求1或3所述的循环肿瘤细胞染色的质控品，其特征在于，所述循环肿瘤细胞系为SK-OV-3细胞系、NCI-H1975细胞系、MCF7细胞系、A549细胞系或SiHa细胞系。
5.一种循环肿瘤细胞染色的质控品，其特征在于，包括结合缓冲液和置于所述结合缓冲液中的权利要求1-4任意一项所述的循环肿瘤细胞染色的质控品。
6.一种循环肿瘤细胞染色的质控品的制备方法，其特征在于，将免疫磁珠与结合缓冲液混合，获得所述免疫磁珠的工作液；将所述免疫磁珠的工作液、白细胞和循环肿瘤细胞系进行混合，混合后分离以去除液体，然后于去除液体后剩余的免疫磁珠中加入固定液进行固定，获得所述质控品。
7.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞染色的质控品的制备方法，其特征在于，加入固定液进行固定之后，进行分离以去除液体，然后加入结合缓冲液，并于4℃条件下进行保存。
8.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞染色的质控品的制备方法，其特征在于，还包括从血液样本中分离获得所述白细胞的步骤、以及通过细胞培养获得所述循环肿瘤细胞系的步骤。
9.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞染色的质控品的制备方法，其特征在于，所述免疫磁珠为多重抗体免疫磁珠，所述多重抗体免疫磁珠由EpCAM免疫磁珠和EGFR免疫磁珠组成，通过结合缓冲液对EpCAM免疫磁珠和EGFR免疫磁珠进行洗涤，然后将洗涤后的EpCAM免疫磁珠和EGFR免疫磁珠分别置于结合缓冲液中进行重悬，分别获得EpCAM免疫磁珠的工作液和EGFR免疫磁珠的工作液，将EpCAM免疫磁珠的工作液、EGFR免疫磁珠的工作液、白细胞和循环肿瘤细胞系进行混合，所述EpCAM免疫磁珠的工作液和EGFR免疫磁珠的工作液的体积比为3:2，所述白细胞和循环肿瘤细胞系的细胞数比值为104:1，然后将混合后的混合液于4℃条件下以5-18转/分钟的旋转速度旋转1.5h，再进行分离以去除液体。
10.根据权利要求6或9所述的循环肿瘤细胞染色的质控品的制备方法，其特征在于，所述固定液为40μL 1.6％Fix，所述固定时间为20min，且于固定时间内每10min进行重悬一次。
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