CN105219701A - 一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法及应用 - Google Patents
一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法及应用，利用本发明提供的方法，可从猪肝脏中分离出大量具有高活力的门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞，所得细胞能保持良好的原代肝细胞形态特征、肝细胞的功能以及良好的细胞增殖活力，为门静脉周、肝静脉周肝细胞的分离与鉴定，对体外研究门静脉周、肝静脉周肝细胞代谢差异以及更深层次探索肝脏营养物质代谢的奥秘提供基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法及应用。
技术背景
肝脏是机体中最大的消化腺及代谢器官，承载着多种重要的生理功能如分泌、代谢、解毒等，在调节新陈代谢过程中起到举足轻重的作用。肝脏作为机体内物质代谢的中枢，在三大营养物质代谢过程中起着十分重要的作用。来自日粮和血液中的营养物质经过门静脉和肝动脉进入肝脏，在肝脏进行加工转化合成蛋白质、氨基酸、脂肪、葡萄糖等，由肝静脉输出进入血液循环，供肝外组织利用，对营养物质具有重分配的作用。
然而肝脏并不是我们传统意义上认为的简单实质性器官，而是由数以万计的肝小叶组成。肝小叶中肝细胞组织上虽不易区分，但是它们在功能上却不尽相同。根据门脉三联管到中央肝静脉的位置，可将肝小叶分为3部分：门静脉周、中间区域和肝静脉周。肝脏的分区和肝细胞的异质性，导致了代谢酶系基因的差异表达，如E-钙黏附素在门静脉周肝细胞特异性表达，而在肝静脉周肝细胞中几乎不表达；而谷氨酰胺合成酶在肝静脉周肝细胞中特异性表达，在门静脉周肝细胞中鲜有表达。正是由于这种差异最终导致了肝脏代谢的区室化，即门静脉周、肝静脉周的肝细胞的代谢是存在差异的。脂肪酸β-氧化、能量代谢、氨基酸代谢、尿素生成、糖原的合成、胆固醇、胆汁的合成代谢和糖异生主要发生在门静脉周肝细胞；糖酵解、脂质生成、生酮作用、谷氨酰胺合成和异生物质代谢主要发生在肝静脉周肝细胞。
目前，大多数用于肝脏营养物质代谢的研究主要是在原代肝细胞或者肝癌细胞系上进行的，虽然这些研究在一定程度上能够反映肝脏物质代谢的情况，但是实际上物质代谢在不同的肝细胞代谢是不同的，因此不能清晰准确的掌握肝脏物质代谢的联系。因此，门静脉周、肝静脉周肝细胞的分离与鉴定对体外研究门静脉周、肝静脉周肝细胞代谢差异以及更深层次探索肝脏营养物质代谢的奥秘提供了有利条件且是非常有必要的。目前为止，还没有在猪上成功分离门静脉周、肝静脉周肝细胞的研究报告及专利。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法，利用本发明提供的方法，可从猪肝脏中分离出大量具有高活力的门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞，保持良好的原代肝细胞形态特征、肝细胞的功能以及良好的细胞增殖活力。
本发明的另一个目的在于提供一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法的应用，包括利用本发明提供的方法分离出的猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞，用于这两种细胞的代谢或功能的研究。
为达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法，包括以下步骤：
1)结扎新鲜猪肝脏后腔静脉的远肝端，安装门静脉插管。用37℃预热的灌注溶液A，从门静脉进行灌注，持续灌注直到后腔静脉的近肝端插管安装成功；
2)A：门静脉周肝细胞分离灌注：用37℃预热的灌注溶液A1，从步骤1)中后腔静脉进行灌注，持续灌注直到肝脏表面出现均匀的白色斑点，停止灌注；10-30s后，开始从步骤1)中门静脉，用37℃预热的灌注溶液B1灌注，直到后腔静脉流出的液体变清即可；
B：肝静脉周肝细胞分离灌注：用37℃预热的灌注溶液A1，从步骤1)中门静脉进行灌注，持续灌注直到肝脏表面出现均匀的白色网络时，停止灌注；10-30s后，开始从步骤1)中后腔静脉，用37℃预热的灌注溶液B1灌注，直到门静脉流出的液体变清即可；
3)A：门静脉周肝细胞分离消化：用37℃预热的灌注溶液B2从门静脉持续灌注，以肝脏变成黄白，且组织变松散即可；再用37℃预热的灌注溶液C从门静脉进行灌注，直至消化完全；
B：肝静脉周肝细胞分离消化：用37℃预热的灌注溶液B2从后腔静脉持续灌注，当肝脏变成黄白，且组织变松散即可；再用37℃预热的灌注溶液C从后腔静脉持续灌注，直至消化完全；
判断是否消化完全为本领域的常规方式，在本发明中，通过轻微触动肝脏被膜，肝脏表现比较松软即可；
4)将步骤3)消化完全的肝组织转移无菌平皿中，加入预冷(4℃)的Hanks液，剪碎和吹打肝组织，形成细胞悬液；
5)将步骤4)中的细胞悬液分别过100目、200目、400目细胞筛，即得目的细胞的单细胞悬液。
所述灌注溶液A配方：6.9g/L氯化钠、0.35g/L氯化钾、0.28g/L氯化钙、0.14g/L硫酸镁、0.27g/L磷酸二氢钾、2.1g/L碳酸氢钠、2.0g/L葡萄糖，其余为三蒸水，调pH至7.4；
灌注溶液A1配方包括：在灌注溶液A使用前加入7mmol/L洋地黄皂苷；
PBS缓冲液配方包括：8g/L氯化钠、0.20g/L氯化钾、0.6g/L氯化钙、1.83g/L十二水磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、2g/L葡萄糖，其余为三蒸水，调pH值7.2至7.4；
灌注溶液B1配方包括：PBS缓冲液使用前加入1.46g/L乙二胺四乙酸，调pH值7.2至7.4；
灌注溶液B2配方包括：PBS缓冲液使用前加入0.6g/L氯化钙，调pH值7.2至7.4；
灌注溶液C配方包括：PBS缓冲液使用前加入0.6g/L氯化钙和0.5g/LⅣ型胶原酶，调pH值7.2至7.4。
以上所述方案中，优选的，所述的新鲜猪肝为仔猪的新鲜猪肝。
以上所述的方案中，Hanks液使用前加入10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素。
以上所述的方案中，进一步的，将获得的目的细胞单细胞悬液在500转/分钟，4℃条件下，离心5分钟，弃上清，用基础培养液重悬沉淀，重复离心2次。然后利用密度梯度为1.08g/ml的Percoll离心介质，20000～30000g，离心10-15min，即分离得到门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞。
所述的基础培养液为RPMI-1640培养基。
一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法的应用，包括利用本发明提供的方法分离出的猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞，用于这两种细胞的代谢或功能的研究。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1，现有的技术只能分离出原代肝细胞，不能筛选出门静脉周肝细胞和肝静脉周肝细胞。
2，本发明在传统的两步胶原酶法的基础上结合洋地黄皂苷进行灌注，门静脉周肝细胞的分离灌注洋地黄皂苷是逆着血流方向进行，而肝静脉周肝细胞的分离是顺着血流方向。
3，本发明在灌注溶液B1中加入乙二胺四乙酸(EDTA)，用于结合细胞中的钙离子(Ca2+),有利于细胞的分离，提高细胞活力。
附图说明
图1为门静脉周、肝静脉周肝细胞特异性蛋白的表达示意图。
pp，门静脉周肝细胞；pv，肝静脉周肝细胞；GS，谷氨酰胺合成酶；Cyp1A，细胞色素P4501A；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；E-Cad，E-钙黏附素；Gpr49，G蛋白偶联受体49。
图2为门静脉周、肝静脉周肝细胞中尿素和谷氨酰胺的相对含量示意图。
pp，门静脉周肝细胞；pv，肝静脉周肝细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。下述实施例中试验方案若无特殊说明，均为常规操作方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
一种猪门静脉周肝细胞分离方法，包括以下步骤：
1)结扎新鲜猪肝后腔静脉的远肝端，安装门静脉插管。用37℃预热的灌注溶液A，按35ml/min的速率从门静脉进行灌注，持续灌注直到后腔静脉的近肝端插管安装成功；
所述的新鲜猪肝为仔猪新鲜猪肝；
所述的灌注溶液A的具体配方包括：6.9g/L氯化钠、0.35g/L氯化钾、0.28g/L氯化钙、0.14g/L硫酸镁、0.27g/L磷酸二氢钾、2.1g/L碳酸氢钠、2.0g/L葡萄糖,调pH至7.4，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。
2)门静脉周肝细胞分离灌注：用37℃预热的灌注溶液A1，按10ml/min的速度从步骤1)中后腔静脉进行灌注，持续灌注直到肝脏表面出现均匀的白色斑点且白色斑点的大小与白色斑点间距一样大小时，停止灌注；10s后，开始从步骤1)中门静脉，用37℃预热的灌注溶液B1灌注，按50ml/min的速率，持续时间10～15min，直到后腔静脉流出的液体变清即可；
所述的灌注溶液A1的配方包括：在灌注溶液A使用前加入7mmol/L洋地黄皂苷(购自美国Sigma公司)，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，现配现用；
灌注溶液B1的配方包括：在PBS缓冲液使用前加入1.46g/L乙二胺四乙酸，调pH值7.2至7.4，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后4℃保存；
PBS缓冲液配方包括：8g/L氯化钠、0.20g/L氯化钾、0.6g/L氯化钙、1.83g/L十二水磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、2g/L葡萄糖，调pH值7.2至7.4；
3)门静脉周肝细胞分离消化：用37℃预热的灌注溶液B2从门静脉按50ml/min的速率，持续灌注5min，以肝脏变成黄白，且组织变松散即可；再用37℃预热的灌注溶液C从门静脉按50ml/min的速率进行灌注，持续灌注20～30min直至轻微触动肝脏被膜，表现比较松软，表明消化完全；
所述的灌注溶液B2的配方包括：在PBS缓冲液液使用前加入0.6g/LCaCl2，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，现配现用；
灌注溶液C的配方包括：在PBS缓冲液溶液使用前加入0.6g/LCaCl2和0.5g/LⅣ型胶原酶，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，现配现用。
4)将步骤3)消化完全的肝组织转移无菌平皿中，加入预冷(4℃)的Hanks液，剔除胆囊、血管、脂肪和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分，用镊子撕掉肝脏包膜，剪碎肝组织，大口径吸管轻轻吹打，形成细胞悬液；
Hanks溶液为商业化购买的溶液(购买自美国的HyClone公司)，使用前加入10％胎牛血清(购买自美国的HyClone公司)，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素。
5)将步骤4)中的细胞悬液分别过100目、200目、400目细胞筛，得猪门静脉周肝细胞的单细胞悬液，将获得的猪门静脉周肝细胞单细胞悬液在500转/分钟，4℃条件下，离心5分钟，弃上清，用基础培养液重悬沉淀，重复离心2次。然后利用密度梯度为1.08g/ml的Percoll离心介质，20000g，离心10min，再用基础培养基重悬，用于细胞活性检测。
所述的基础培养基为RPMI-1640培养基。
实施例2：
一种猪肝静脉周肝细胞分离方法，包括以下步骤：
1)结扎新鲜猪肝的后腔静脉的远肝端，安装门静脉插管。用37℃预热的灌注溶液A，按35ml/min的速率从门静脉进行灌注，持续灌注直到后腔静脉的近肝端插管安装成功；
所述的新鲜猪肝为仔猪新鲜猪肝；
2)肝静脉周肝细胞分离灌注：用37℃预热的灌注溶液A1，按10ml/min的速度，从门静脉进行灌注，持续灌注直到肝脏表面出现均匀的白色网络时，停止灌注；10s后，从后腔静脉，用37℃预热的灌注溶液B1按50ml/min的速率灌注，持续时间10～15min，直到门静脉流出的液体变清即可；
3)肝静脉周肝细胞分离消化：用37℃预热的灌注溶液B2从后腔静脉按50ml/min的速率，持续灌注5min，以肝脏变成黄白，且组织变松散即可；再用37℃预热的灌注溶液C按50ml/min的速率从后腔静脉持续灌注20～30min，直至轻微触动肝脏被膜，表现比较松软，表明消化完全；
4)将消化完全的肝组织转移无菌平皿中，加入预冷(4℃)的Hanks液，剔除胆囊、血管、脂肪和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分，用镊子撕掉肝脏包膜，剪碎肝组织，大口径吸管轻轻吹打，形成细胞悬液；
5)将步骤4)中的细胞悬液分别过100目、200目、400目细胞筛，得猪肝静脉周肝细胞单细胞悬液，将获得的猪肝静脉周肝细胞单细胞悬液在500转/分钟，4℃条件下，离心5分钟，弃上清，用基础培养液重悬沉淀，重复离心2次。然后利用密度梯度为1.08g/ml的Percoll离心介质，20000g，离心10min，再用基础培养基重悬，用于细胞活性检测。
所述的基础培养基为RPMI-1640培养基。
本实施例所用溶剂配方与实施例1相同。
实施例3：
细胞活力的检测：
将实施例1和实施例2中得到的基础培养基重悬的单细胞悬液与0.4％台盼蓝染色液以1:1的体积比混匀，迅速将20μL混合液加入到血细胞计数板(购自上海市求精生化试剂仪器有限公司)上，盖上盖玻片。置于倒置显微镜下计算死细胞数和活细胞数，计算细胞活力(死细胞能被台盼蓝染上色，镜下呈深蓝色，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状)和细胞密度。0.4％台盼蓝染色液具体配制方法为：称取0.4g台盼蓝固体溶解到100ml的PBS缓冲液中。
通过实施例1或实施例2所述的方法，分离得到的细胞的活细胞数为4.5×107～7×107个，细胞活力介于82％～90％之间。
实施例4：
门静脉周肝细胞和肝静脉周肝细胞的验证：
实施例1或2获得的细胞悬液用贴壁培养液将细胞悬液稀释至细胞终密度约为7×104～1×105个/cm2接种于细胞板中，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。4小时细胞贴壁后，用生长培养液全量换液，尽量除去死细胞与组织碎片。24小时后再用生长培养基全量换液，可根据细胞长势进行处理。用裂解液裂解贴壁细胞，提取蛋白并测定其蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳后，进行转膜。
所述的贴壁培养液配方包括：RPMI-1640培养液(购买自美国的HyClone公司)使用前加入10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，40μg/mL地塞米松(购自美国Sigma公司)，10μg/mL人胰岛素(购自碧云天生物技术有限公司)，10ng/mL肝细胞生长因子(购自美国PeproTech公司)，20ng/mL上皮生长因子(购自美国PeproTech公司)；
所述的生长培养液配方包括：RPMI-1640培养液使用前加入10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
将转好的膜于室温下脱色摇床上用5％的脱脂牛奶，封闭1h；稀释一抗(TBST溶解的5％脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5％BSA)，4℃孵育过夜(快转)，或者4℃孵育抗体3小时(慢转)；用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min，将二抗(GPR49：HRP标记的山羊多克隆二抗；GS：山羊抗鼠二抗；E-Cad：山羊抗兔二抗；GAPDH：HRP标记的兔抗鼠二抗；Cyp1A：山羊抗鼠二抗)用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。5％的脱脂牛奶具体配方为：5g脱脂奶粉溶于100ml的0.5％TBST缓冲剂中，溶解后4℃保存，可于一周内使用。
将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上与此混合液充分接触，1～2min后，去尽残液，包好，放入暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的光强度调整曝光条件，最后将胶片进行扫描存档。
图1的检测结果显示：氨酰胺合成酶(GS)、细胞色素P4501A(Cyp1A)和G蛋白偶联受体49(Gpr49)在肝静脉周肝细胞中大量表达，仅有少量在门静脉周特异性表达；E-钙黏附素(E-Cad)在门静脉周肝细胞大量表达，在肝静脉周几乎不表达；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在门静脉周肝细胞和肝静脉周肝细胞中均有大量表达。
因此检测到谷氨酰胺合成酶大量表达为肝静脉周肝细胞；检测到E-钙黏附素大量表达则为门静脉周肝细胞。
实施例1的细胞经检测，均为猪门静脉周肝细胞；实施例2分离得到的细胞经检测，均为猪肝静脉周肝细胞。
实施例5：
利用本发明分离的细胞在研究门静脉周肝细胞和肝静脉周肝细胞功能中的应用：
将实施例1和实施例2中分离出的门静脉周肝细胞和肝静脉周肝细胞分别放入含有1mmol15N标记的氯化铵(15NH4Cl)的条件培养基中进行培养，培养24小时后，用质谱仪检测15N标记的尿素和谷氨酰胺。
条件培养液的配方包括：RPMI-1640培养液使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素、1mmol15NH4Cl。
图2的检测结果显示：门静脉周肝细胞尿素的相对含量明显高于肝静脉周肝细胞尿素含量，相反门静脉周谷氨酰胺相对含量显著的低于肝静脉周。这些结果表明氨在门静脉周肝细胞主要生成尿素，而在肝静脉周肝细胞主要生成谷氨酰胺。
以上通过具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不限于这些具体的实施例。本领域技术人员应当理解，还可以对本发明做各种修改、等同替换、变化等等。另外，本申请说明书和权利要求书所使用的一些术语并不是限制性的，仅仅是为了便于描述。
Claims (3)
1.一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法，包括以下步骤：
1)结扎新鲜猪肝脏后腔静脉的远肝端，安装门静脉插管；用37℃预热的灌注溶液A，从门静脉进行灌注，持续灌注直到后腔静脉的近肝端插管安装成功；
2)A：门静脉周肝细胞分离灌注：用37℃预热的灌注溶液A1，从步骤1）中后腔静脉进行灌注，持续灌注直到肝脏表面出现均匀的白色斑点，停止灌注；10-30s后，开始从步骤1）中门静脉，用37℃预热的灌注溶液B1灌注，直到后腔静脉流出的液体变清即可；
B：肝静脉周肝细胞分离灌注：用37℃预热的灌注溶液A1，从步骤1）中门静脉进行灌注，持续灌注直到肝脏表面出现均匀的白色网络时，停止灌注；10-30s后，开始从步骤1）中后腔静脉，用37℃预热的灌注溶液B1灌注，直到门静脉流出的液体变清即可；
3）A：门静脉周肝细胞分离消化：用37℃预热的灌注溶液B2从门静脉持续灌注，以肝脏变成黄白，且组织变松散即可；再用37℃预热的灌注溶液C从门静脉进行灌注，直至消化完全；
B：肝静脉周肝细胞分离消化：用37℃预热的灌注溶液B2从后腔静脉持续灌注，当肝脏变成黄白，且组织变松散即可；再用37℃预热的灌注溶液C从后腔静脉持续灌注，直至消化完全；
4）将步骤3）消化完全的肝组织转移无菌平皿中，加入预冷的Hanks液，剪碎和吹打肝组织，形成细胞悬液；
5）将步骤4）中的细胞悬液分别过100目、200目、400目细胞筛，即得目的细胞的单细胞悬液；
所述灌注溶液A配方：6.9g/L氯化钠、0.35g/L氯化钾、0.28g/L氯化钙、0.14g/L硫酸镁、0.27g/L磷酸二氢钾、2.1g/L碳酸氢钠、2.0g/L葡萄糖，其余为三蒸水，调pH至7.4；
灌注溶液A1配方包括：在灌注溶液A使用前加入7mmol/L洋地黄皂苷；
PBS缓冲液配方包括：8g/L氯化钠、0.20g/L氯化钾、0.6g/L氯化钙、1.83g/L十二水磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、2g/L葡萄糖，其余为三蒸水，调pH值7.2至7.4；
灌注溶液B1配方包括：PBS缓冲液使用前加入1.46g/L乙二胺四乙酸，调pH值7.2至7.4；
灌注溶液B2配方包括：PBS缓冲液使用前加入0.6g/L氯化钙，调pH值7.2至7.4；
灌注溶液C配方包括：PBS缓冲液使用前加入0.6g/L氯化钙和0.5g/LⅣ型胶原酶，调pH值7.2至7.4。
2.根据权利要求1所述的方法，所述Hanks液使用前加入10%胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的新鲜猪肝为仔猪的新鲜猪肝。
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| 李涛等: "经肝静脉与门静脉离体灌注分离猪肝细胞的比较研究", 《肝脏》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106937671A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-07-11 | 青岛大学 | 一种新鲜动物肝脏的清洗、祛毒以及细胞组织保鲜的方法 |
| CN106962804A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-07-21 | 青岛大学 | 祛毒动物肝脏食品及其加工方法 |
| WO2018049874A1 (zh) * | 2017-04-10 | 2018-03-22 | 青岛大学 | 一种新鲜动物肝脏的清洗、祛毒以及细胞组织保鲜的方法 |
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| CN110106140A (zh) * | 2019-06-03 | 2019-08-09 | 华中农业大学 | 一种小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞的分离方法 |
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| Publication number | Publication date |
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| CN105219701B (zh) | 2018-10-16 |
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