CN102304589A

CN102304589A - 乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

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Publication number: CN102304589A
Application number: CN201110194273A
Authority: CN
Inventors: 唐景峰; 王业富; 刘绪
Original assignee: WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2011-07-12
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2031-07-12
Also published as: CN102304589B

Abstract

本发明公开了乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针。该试剂盒含有：荧光定量PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×荧光定量PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、rt181位点正向引物、rt181位点反向引物、rt181A位点探针、rt181V位点探针、rt181T位点探针、rtN236T检测试剂盒特有的rt236位点正向引物、rt236位点反向引物、rt236N位点和rt236T位点探针；试剂盒中还包括DNA提取液、阴性质控品、工作标准品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药毒株，荧光定量PCR方法避免了PCR延伸的步骤；探针可以标记多种荧光标记，同时还具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。

Description

乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

技术领域

本发明涉及本生物检测技术领域，特别涉及一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针。

背景技术

乙型肝炎病毒能引起人体的慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，抗病毒治疗是治疗乙型肝炎病毒的主要措施；核苷类似物是最常见的治疗乙肝病毒药物，阿德福韦酯作为一种新型的核苷类抗乙肝病毒药物，于2005年在我国进入临床治疗。阿德福韦酯还是一种很好的拉米夫定治疗无效补救药，其可以抑制乙肝病毒多聚酶或竞争性参与乙肝病毒的复制，从而中止乙肝病毒DNA链的延长；然而由于cccDNA的存在，乙肝的治愈是一个漫长的过程，随着乙肝患者服药时间的延长，很多患者会出现乙肝病毒反弹和肝病加重等耐药症状，病毒的耐药严重影响着后续抗病毒治疗的疗效。大量研究表明，乙肝病毒阿德福韦酯耐药株的耐药位点主要位于乙肝病毒P基因B区的rtA181V/T位点或D区的rtN236T位点，这些位点的变异显著的导致对阿德福韦酯的敏感性下降；由于乙肝病毒对阿德福韦酯耐药与拉米夫定等药物耐药有着不同的耐药机制，所以，对阿德福韦酯耐药患者进行耐药突变株检测确证，从而提供针对性个性化的药物治疗方案有着十分重要的意义。

目前基因型的耐药检测已经是核苷(酸)类似物抗病毒治疗的常规检测手段。目前已报道的检测乙肝病毒耐阿德福韦酯突变株的方法包括：直接测序法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)、基因芯片，焦磷酸测序、实时荧光定量PCR法等方法，这些方法各有利弊，并且有些检测方法的弊端暂时还没有较好的解决办法。

1、直接测序法

DNA直接测序法一直被认为是检测基因突变的金标准，直接测序包括PCR产物直接测序与克隆测序，PCR产物直接测序是将乙肝病毒基因组的逆转录酶区直接扩增后测序分析的方法，该方法能测定各种突变，并能够发现可能的未知耐药变异位点，也是最常用的基因型耐药检测方法之一。但直接PCR测序对于少量耐药突变株的检测敏感性较差，只有当耐药突变株达到病毒准种的20％-30％以上时才能被检测到。克隆测序即将PCR产物扩增后连接载体转化细菌，挑取单克隆菌落克隆进行测序分析，这种方法虽然灵敏度高，但克隆测序繁琐且价格昂贵，也不适用于大规模筛选。

2、PCR和限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)

PCR-RFLP法是最早用于核苷类似物的耐药检测的方法之一。RFLP技术是利用限制性内切酶专一性识别并切割DNA序列的特点，不同的序列就会被切割成长短不一的DNA片断，再通过凝胶电泳观察酶切结果，然后对酶切图像进行多态性分析找出差异，PCR-RFLP法经济且简便快速，具有较强的灵敏性，能检测出在病毒总体中大于5％的突变株，曾广泛用于检测乙肝病毒拉米夫定的耐药突变，闰杰等(2008)使用该技术能很好的检测乙肝病毒的阿德福韦酯耐药突变株。然而PCR-RFLP的缺陷也是很明显的，该方法没法检测未知的突变位点，对于每一个可能的突变，必须特别设计单独的核酸内切酶，然而某些突变的特异性内切酶可能并不存在，且该方法对多位点联合突变可能无能为力。

Hong等将这种技术MALDI-TOF MS结合，从而开发出限制性片段质谱多态性(RFMP)的方法，即利用MALDI-TOF MS技术来检测PCR-RFLP酶切后的产物，该方法比普通的凝胶电泳有更高的灵敏度、准确度和分辨率。Kim等报道该方法用于拉米夫定YMDD位点耐药检测，最低可检测出1％的耐药病毒。RFMP的方法虽然比PCR-RFLP灵敏度高，但它还是基于PCR-RFLP的，所以具有PCR-RFLP一样的缺点，且价格昂贵，很难在临床推广应用。

3、基因芯片技术

基因芯片技术是根据分子间特异性地相互作用的原理，固体芯片表面按一定的阵列集成了大量的特异目标探针，能与待测的有荧光标记的样品核酸通过碱基互补杂交反应，通过激光共聚焦系统检测到杂交信号，数据通过处理获取基因的序列信息。基因芯片技术广泛应用于基因突变的检测，且检测精度很高，对于检测耐药乙肝病毒是可靠和有用的一种工具；目前已经有通过基因芯片技术检测乙肝病毒拉米夫定耐药的报道，但目前尚无基因芯片方法检测ADV耐药的报道。生物芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、成本低等特点，其缺点是费用很高，数据可能需要专业的生物信息学人员分析，只能检测已知的突变位点，检测低拷贝乙肝病毒不够灵敏等。

4、焦磷酸测序技术

焦磷酸测序技术是一种新兴的酶联级联测序技术，由Nyren等人于1987年发明，该技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在初始的反应体系中不含有四种dNTP，当特异性引物引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，产生的荧光信号强度与聚合的dNTP个数成正比，反应所剩余的dNTP可被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，通过检测荧光的释放和强度，从而达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术在检测单核苷酸多态性(SNP)，遗传多态性分析，分子诊断与病毒分型、甲基化分析、法医鉴定等方面有这很好的应用价值。

焦磷酸测序技术不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，该方法对待测样品的制备和处理比Sanger测序法要简单更快速，具有大通量、低成本、快速、直观的特点。Lindstrom等报道采用焦磷酸测序法来检测拉米夫定耐药，最低可检出10％变异病毒。宋家武等(2005)应用该技术建立了高通量测定乙型肝炎病毒YMDD突变区的方法，质粒标准品的突变检出率及重复率均达100％，而血清标本达98.8％。可见，该技术还有高精度的特点。但由于焦磷酸测序技术一次仅能精确检测大约40bp的碱基，故并不能代替常规的测序技术，且该技术的成本要高于Sanger测序法，针对不同变异位点还要设计相应的特异引物方能检测等缺点；目前尚无焦磷酸测序法检测ADV耐药的报道。

现有技术中还没有一种荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸试剂盒。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种具有高度的特异性、灵敏度与准确性、且技术操作简便、自动化程度高的乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸试剂盒。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒，该试剂盒含有：

(1)荧光定量PCR反应液：

其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×荧光定量PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、rt181位点正向引物、rt181位点反向引物、rt181A位点探针、rt181V位点探针、rt181T位点探针、rtN236T检测试剂盒特有的rt236位点正向引物、rt236位点反向引物、rt236N位点探针和rt236T位点探针；

①181位点引物和探针

rt181位点正向引物序列如序列表中SEQ ID NO.1所示：

5′TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3′

rt181位点反向引物序列如序列表中SEQ ID NO.2所示：

5′AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3′

rt181A探针序列如序列表中SEQ ID NO.3所示：5′TTCTCHTGGCTCAGTTT 3′

rt181V探针序列如序列表中SEQ ID NO.4所示：5′TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3′

rt181T探针序列如序列表中SEQ ID NO.5所示：5′TTCTCHTGACTCAGTTTA 3′

②236位点引物和探针

rt236位点正向引物序列如序列表中SEQ ID NO.6所示：

5′TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3′

rt236位点反向引物序列如序列表中SEQ ID NO.7所示：

5′CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3′

rt236N探针序列如序列表中SEQ ID NO.8所示：5′ATACATTTRAACCC 3′

rt236T探针序列如序列表中SEQ ID NO.9所示：5′ATACATTTRACCCC 3′；

其中，上述探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中，Y＝(C/T)，R＝(A/G)，H＝A/T/C；

(2)DNA提取液：

①溶液A，为聚乙二醇6000；

②溶液B，其中包括EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris-HCl、NP-40(乙基苯基聚乙二醇)；

(3)质控品：

①阴性质控品，为不含外源片段的PSG-TS载体质粒DNA片段；

②阳性质控品，检测rt181时，为1.0×10⁶copy/mL的含有rt181A/rt181V/rt181T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1.0×10⁶copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；

③临界阳性质控品，检测rt181时，为1.0×10⁴copy/mL的含有rt181A/rt181V/rt181T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1.0×10⁴copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；

(4)工作标准品：

检测rt181时，为PSG-TSrt181的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt181A/rt181V/rt181T区间的162个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测rt236时，为PSG-TS rt236的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt236N/rt236T区间的153个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒都在大肠杆菌DH5α中增殖。

具体包括：

a、工作标准品1，为1.0×10⁷copy/mL的PSG-TS rt181质粒DNA溶液或1.0×10⁷copy/mL的PSG-TS rt236质粒DNA溶液；

b、工作标准品2，为1.0×10⁶copy/mL的PSG-TSrt181质粒DNA溶液或1.0×10⁶copy/mL的PSG-TS rt236质粒DNA溶液；

c、工作标准品3，为1.0×10⁵copy/mL的PSG-TS rt181质粒DNA溶液或1.0×10⁵copy/mL的PSG-TS rt236质粒DNA溶液；

d、工作标准品4，为1.0×10⁴copy/mL的PSG-TS rt181质粒DNA溶液或1.0×10⁴copy/mL的PSG-TS rt236质粒DNA溶液。

其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU或NEP；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

所述DNA提取液由溶液A和溶液B组成；

所述溶液A，为聚乙二醇6000；

所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。

所述具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。

所述荧光定量PCR反应液各组分含量的配比为：DEPC处理水用量27.5μL；浓度为5U/μL的热启动Taq酶用量0.3μL；浓度为10mmol/L的dNTPs用量1μL；10×荧光定量PCR Buffer用量5μL；浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液用量7μL，浓度为10μmol/L的正向引物用量1.6μL、浓度为10μmol/L的反向引物用量1.6μL、浓度为10μmol/L的探针用量1μL。

其中：检测rtA181V/T时，PCR反应液中包含的引物为rt181位点正向引物和rt181位点反向引物，探针为rt181A位点探针、rt181V位点探针和rt181T位点探针；检测rtN236T时，PCR反应液中包含的引物为rt236位点正向引物和rt236位点反向引物，探针为rt236N位点探针和rt236T位点探针；

所述聚乙二醇6000的浓度为15％；所述乙二胺四乙酸浓度为0.5％；所述Tris-HCl的pH值为8.0；所述乙基苯基聚乙二醇的浓度为0.1％。

本发明实施例还提供利用所述的试剂盒检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸的检测方法，包括下列步骤：

(1)采集样品：采集人血浆样品，离心分离，上清即为血清样品；

(2)样品处理：取待测血清100μL，加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清，加入50μL裂解溶液B，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液待测；

(3)加样：向装有45μL荧光定量PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品、工作标准品各5μL，盖好管盖，5,000rpm离心10秒；

(4)荧光定量PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行荧光定量PCR扩增；

94℃5分钟；

94℃30秒，58℃45秒，5个循环；

94℃30秒，58℃45秒，35个循环；收集荧光信号，在反应程序的第二步的终了读取荧光Ct值；

(5)分析判断：Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于或等于28且小于或等于32的为临界阳性。

进一步地，当需要绘制标准曲线时，另取4个反应管，直接加入不同浓度梯度的工作标准品5μL，5000rpm离心10秒，放入荧光定量PCR仪器的反应槽内。

本发明还提供：一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测引物和探针，包括下述正向引物、反向引物和荧光探针的一组序列：

rt181位点正向引物：5′TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3′

rt181位点反向引物：5′AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3′

rt181A探针序列：5′TTCTCHTGGCTCAGTTT 3′

rt181V探针序列：5′TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3′

rt181T探针序列：5′TTCTCHTGACTCAGTTTA 3′

rt236位点正向引物：5′TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3′

rt236位点反向引物：5′CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3′

rt236N探针序列：5′ATACATTTRAACCC 3′

rt236T探针序列：5′ATACATTTRACCCC 3′；

或者在上述序列的5′端和/或3′端有延长的核苷酸片段的一组序列；

或者与上述序列的同源性大于85％的一组序列；

或者与上述序列的碱基互补的一组序列；

上述的任意一组序列可单独使用，或以所有序列组之间的任意组合形式而使用；

其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中Y＝(C/T)，R＝(A/G)，H＝A/T/C。

其中，荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU或NEP；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明试剂盒利用特异性的TaqMan探针来检测乙型肝炎病毒，检测完成后无需开盖电泳，避免了产物污染及对实验室人员的伤害。

本发明可用LNA探针、MGB探针、AllGlo^TM探针来实现。

本发明实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时检测克服了扩增产物终点检测所存在的“平台效应”对产物定量的影响；本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测阿德福韦酯耐药毒株，试剂盒可以单用和多重检测乙肝病人的阿德福韦酯耐药情况，荧光定量PCR方法改进为“2步法”，避免了常规PCR延伸的步骤、探针可以标记多种荧光标记，同时还具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。且技术操作简便、自动化程度高；由于采用闭管操作，不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题等特点，结果可靠。

附图说明

图1是本发明实施例1中提供的阿德福韦酯耐药位点rt181荧光定量PCR实验结果图；

图2是本发明实施例1中提供的阿德福韦酯耐药位点rt236二重荧光定量PCR实验结果图；

图3A、图3B、图3C、图3D、图3E和图3F是本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt181重组质粒倍比稀释扩增曲线和标准曲线结果图；

图4A、图4B、图4C和图4D是本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt236重组质粒倍比稀释扩增曲线和标准曲线结果图；

图5A、图5B、图5C、图5D、图5E和图5F是本发明实施例2中提供的阿德福韦酯耐药位点rt181位点181A/181V/181T分别检测样本的荧光定量PCR实验结果和标准曲线图；

图6A、图6B、图6C和图6D是本发明实施例2中提供的阿德福韦酯耐药位点rt236位点236N/236T分别检测样本的荧光定量PCR实验结果和标准曲线图；

图1、图2、图3A、图3C、图3E、图4A、图4C、图5A、图5C、图5E、图6A和图6C中的横坐标表示循环数(Cycle number)、纵坐标表示荧光值(Delta Rn)；

图3B、图3D、图3F、图4B、图4D、图5B、图5D、图5F、图6B和图6D中横坐标表示：LogCo(乙肝病毒起始浓度的对数值)、纵坐标表示：Ct值。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明提供了一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒，该试剂盒含有：荧光定量PCR反应液，其中包括DEPC处理水、Taq酶、dNTPs、10×荧光定量PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、正向引物、反向引物、探针；溶液A，为聚乙二醇6000；溶液B，其中包括EDTA、SDS、Tris-HCl、NP-40；阳性质控品，检测rt181时，为1.0×10⁶copy/mL的含有rt181A/rt181V/rt181T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1.0×10⁶copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；临界阳性质控品，检测rt181时，为1.0×10⁴copy/mL的含有rt181A/rt181V/rt181T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1.0×10⁴copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；工作标准品，检测rt181的工作标准品为PSG-TSrt181的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了为乙型肝炎病毒基因组中含有rt181A/rt181V/rt181T区间的162个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测Rt236的工作标准品为PSG-TS rt236的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了为乙型肝炎病毒基因组中含有rt236N/rt236T区间的153个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒都在大肠杆菌DH5α中增殖。

试剂盒的制造：

1.试剂

本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。

2.荧光定量PCR反应液制备

(1)引物及探针设计与合成：

选择乙型肝炎病毒耐药相关的P基因的特异突变位点区域片段作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得乙型肝炎病毒目前已有的8个基因型的乙型肝炎病毒耐药突变位点的基因序列，并通过VectorNTIAdvance 11软件分别对8个基因型的相应耐药突变位点区间进行序列比对，选择保守区域设计引物和探针。

rt181A序列如序列表中SEQ ID NO.10所示：

GTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTT

rt181V序列如序列表中SEQ ID NO.11所示：

GTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTT

rt181T序列如序列表中SEQ ID NO.12所示：

GTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGACTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTT

rt236N序列如序列表中SEQ ID NO.13所示：

TTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTATCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGTTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGTTGGGGTACT

rt236T序列如序列表中SEQ ID NO.14所示：

TTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTATCTTTGGGTATACATTTAACCCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGTTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGTTGG GGTACT

利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件Primer Express 3.0设计引物、探针序列，引物、探针序列不仅要满足软件中各项指标，而且要确保引物、探针序列能检测全部8个基因型序列。在本发明中，探针的5’端修饰的荧光染料可选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3，Cy5，MAR，JUP，SAT，PLU，NEP或URA；3’端修饰的荧光染料可选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL等。

设计结果如下表所示：

引物名称	碱基	纯化方式	引物序列(5’-3’)
				181-F	21bp	HPLC	5′TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3′
181-R	20bp	HPLC	5′AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3′
				236-F	25bp	HPLC	5′TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3′
236-R	24bp	HPLC	5′CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3′

探针名称	报告基团	淬灭基团	合成序列(5’-3’)
				rt181A	HEX(JUP)	MGB	TTCTCHTGGCTCAGTTT
rt181V	CY3(SAT)	MGB	TTCTCHTGGTTCAGTTTA
				rt181T	ROX(URA)	MGB	TTCTCHTGACTCAGTTTA
rt236N	HEX(JUP)	MGB	ATACATTTRAACCC
				rt236T	CY3(SAT)	MGB	ATACATTTRACCCC

注：“Y和R”为兼并碱基。

Y＝(C/T)，R＝(A/G)，H＝A/T/C。

表中：F：forward，正向引物；

R：reverse，反向引物；

P：probe，探针，探针既可为TaqMan-MGB探针也可为LNA探针或AllGloTM探针。

BHQ或Eclipse：荧光淬灭基团。

按照上表的设计结果，委托宝生物工程(大连)有限公司合成引物和探针。

(2)荧光定量PCR反应液配制：DEPC处理水27.5μL；5U/μL的热启动Taq酶0.3μL；10mmol/L(每种NTP浓度)的dNTPs 1μL；10×荧光定量PCR Buffer 5μL；25mmol/L的MgCl2溶液7μL、10μmol/L的正向引物1.6μL、10μmol/L的反向引物1.6μL和10μmol/L的探针1μL，配制成荧光定量PCR反应液。

3.质控品制备

(1)阴性质控品制备：不含外源片段的PSG-TS质粒DNA片段

取不含外源片段的PSG-TS质粒溶液于样本准备区预处理，定量稀释至浓度为1×107copy/ml(比浊法)，吸取质粒DNA溶液于离心管中，混匀，直接吸取5μL作模板。

(2)阳性质控品制备：高浓度的含有rt181A/rt181V/rt181T相应基因组的DNA片段和高浓度的含有Rt236N/Rt236T相应基因组的DNA片段；

取含rt181A/rt181V/rt181T位点和Rt236N/Rt236T位点的乙型肝炎病毒菌液(菌株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供)经培养后，取含rt181A/rt181V/rt181T位点的乙型肝炎病毒菌液100μL加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清，加入50μL裂解溶液B，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液用分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁶copy/ml，即可作为rt181A/rt181V/rt181T位点阳性质控品模板；rt236N/rt236T位点的乙型肝炎病毒的阳性质控品模板的制备选用含rt236N/rt236T位点的乙型肝炎病毒菌液，制作方法与上述的制作方法相同。

(3)临界阳性质控品制备：低浓度的含有rt181A/rt181V/rt181T相应基因组的DNA片段，和低浓度的含有Rt236N/Rt236T相应基因组的DNA片段；

取含rt181A/rt181V/rt181T位点和Rt236N/Rt236T位点的乙型肝炎病毒菌液(菌株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供)经培养后，取含rt181A/rt181V/rt181T位点的乙型肝炎病毒菌液100μL加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清，加入50μL裂解溶液B，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×104copy/ml，即可作为rt181A/rt181V/rt181T位点临界阳性质控品模板；rt236N/rt236T位点的乙型肝炎病毒的临界阳性质控品模板的制备选用含rt236N/rt236T位点的乙型肝炎病毒菌液，制作方法与上述的制作方法相同。

4.DNA提取液制备：

(1)溶液A，浓度为15％的聚乙二醇6000(PEG6000)；

(2)溶液B，其中包括乙二胺四乙酸(EDTA)(1mM)、SDS(0.5％)、Tris-HCl(10mM、pH8.0)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)(0.1％)；

5.工作标准品制备：

(1)工作标准品1，为1.0×10⁷copy/mL的PSG-TSrt181质粒DNA溶液和/或1.0×10⁷copy/mL的PSG-TS Rt236质粒DNA溶液；

(2)工作标准品2，为1.0×10⁶copy/mL的PSG-TS rt181质粒DNA溶液和/或1.0×10⁶copy/mL的PSG-TS Rt236质粒DNA溶液；

(3)工作标准品3，为1.0×10⁵copy/mL的PSG-TS rt181质粒DNA溶液和/或1.0×10⁵copy/mL的PSG-TS Rt236质粒DNA溶液；

(4)工作标准品4，为1.0×10⁴copy/mL的PSG-TS rt181质粒DNA溶液和/或1.0×10⁴copy/mL的PSG-TS Rt236质粒DNA溶液。

检测rt181的工作标准品为PSG-TS rt181的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入乙型肝炎病毒基因组中含有rt181A/rt181V/rt181T区间的162个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测Rt236的工作标准品为PSG-TS rt236的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入乙型肝炎病毒基因组中含有Rt236N/Rt236T区间的153个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取质粒DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁹copy/ml，-20℃保存。贮存浓度为1.0×10⁹copy/ml，使用前用无菌生理盐水或0.01mol/LPBS进行10倍梯度的系列稀释。工作浓度依次为1.0×10⁷copy/ml，1.0×10⁶copy/ml，1.0×10⁵copy/ml和1.0×10⁴copy/ml，使用前，12000rmp离心1分钟，取上清液作模板。

本发明的试剂盒可以按照下表进行配置(24人份/盒)：

本发明的试剂盒在-10℃±5℃避光储存，避免反复冻融；有效期6个月；适用仪器(ABI7500，ABI7300，Bio-Rad iQ5TM，Stratagene Mx3000P、Stratagene Mx3005P，达安7000)等。

实施例1

用本发明的试剂盒在ABI 7300荧光定量PCR仪上检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸的方法：

(1)采集样品：采集人血清样品；

a、用无菌注射器抽取受检者1ml静脉血，注入无菌1.5ml离心管中，于室温静置2小时，转入4℃静置1小时，8000rpm离心5分钟，吸取200μL上清(注意勿吸入红细胞)，转入另一无菌1.5ml离心管中，即为血清标本。

b、标本保存和运输：如果标本不立即测试，应储存于-20℃，避免反复冻融。标本长途运送应采用0℃冰壶。

(2)样品处理：取待测血清各100μL，加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清，加入50μL裂解溶液B，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液待测；

(3)加样：向装有45μL荧光定量PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品5μL，盖好管盖，5,000rpm离心10秒；

rt181FQ-PCR反应体系如下表：

试剂名称及浓度	加入量/人份(μl))	终浓度
			10×PCR buffer	5.0	1×PCR buffer
MgCl₂(25mmol/L)	7.0	3.5mmol/L
			dNTPs(10mmol/L)	3	0.6mmol/L
rt181FP(10μmol/L)	3.3	0.66μmol/L
			rt181RP(10μmol/L)	3.3	0.66μmol/L
rt181AProbe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
			rt181VProbe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
rt181T Probe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
			Taq酶(5U/μl))	0.9	6.0U/份
模板	5
			加水	19.5
总体积	50

Rt236FQ-PCR反应体系如下表：

试剂名称及浓度	加入量/人份(μl))	终浓度
			10×PCR buffer	5.0	1×PCR buffer
MgCl₂(25mmol/L)	7.0	3.5mmol/L
			dNTPs(10mmol/L)	2	0.4mmol/L
Rt236FP(10μmol/L)	2.1	0.42μmol/L
			Rt236RP(10μmol/L)	2.1	0.42μmol/L
Rt236N Probe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
			Rt236T Probe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
Taq酶(5U/μl))	0.6	4.0U/份
			模板	5
加水	24.2
			总体积	50

(4)荧光定量PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，选择要用的Taqman探针；定义样品孔：阴性质控品选NTC；待检样品、阳性质控品及临界阳性质控品选Unknown。

按下表进行荧光定量PCR扩增；

在反应程序的第二步的终了读取荧光值；

(5)分析判断：

Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于和等于28且小于和等于32的为临界阳性。

本发明实施例1的rt204位点探针在10⁷copies/μl的相同质粒浓度条件下三重荧光定量PCR试验结果如图1所示，rt180位点探针在10⁷copies/μl的相同质粒浓度条件下二重荧光定量PCR试验结果如图2所示。本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt181重组质粒倍比稀释扩增曲线和标准曲线结果如图3A、图3B、图3C、图3D、图3E和图3F所示；本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt236重组质粒倍比稀释扩增曲线和标准曲线结果图如图4A、图4B、图4C和图4D所示。

(6)测定结果：

使用ABI公司的7500仪器，得出rt181A/V/T探针和rtN236T探针在质粒浓度均为10⁷时多重荧光定量PCR扩增曲线的Ct值如下表：

实施例2

用本发明的试剂盒按照实施例1的方法定量检测未知样本的乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸。60个未知样本来源于××医院病人感染乙肝病毒的血液样本。

本发明实施例2的阿德福韦酯耐药位点rt181位点181A/181V/181T分别检测样本的荧光定量PCR实验结果和标准曲线图如图5A、图5B、图5C、图5D、图5E和图5F所示，其中，A，B分别代表rt 181A(野生株)的扩增曲线及标准曲线；C，D分别代表rt181V(突变株)的扩增曲线及标准曲线；E，F分别代表rt181T(突变株)的扩增曲线及标准曲线；由图可以看出，曲线呈平滑S型，扩增效果较好。

rt236位点探针分别对样本荧光定量PCR试验的结果如图6A、图6B、图6C和图6D所示，A，B分别代表rt236N(野生株)的扩增曲线及标准曲线；C，D分别代表rt236T(突变株)的扩增曲线及标准曲线；由图可以看出，曲线呈平滑S型，扩增效果较好。

rt181的具体样本扩增结果如下：

rt236的具体样本扩增结果如下：

由表可见，181V/T耐药时两者通常不会同时发生耐药突变，而只是其中的一种，181V/T耐药能同时伴随着181A的耐药突变；同样，对于rtN236T耐药突变，rt236N耐药突变样本中同时能检测出rt236T野生型，181位探针与236位的探针检测没有明显的相关性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：

(1)荧光定量PCR反应液：

其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×荧光定量PCRBuffer、含有Mg²⁺离子的溶液、rt181位点正向引物、rt181位点反向引物、rt181A位点探针、rt181V位点探针、rt181T位点探针、rtN236T检测试剂盒特有的rt236位点正向引物、rt236位点反向引物、rt236N位点探针和rt236T位点探针；

①181位点引物和探针

rt181位点正向引物：5′TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3′

rt181位点反向引物：5′AAAGCCCTRCGAACCACTGA3′

rt181A探针序列：5′TTCTCHTGGCTCAGTTT 3′

rt181V探针序列：5′TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3′

rt181T探针序列：5′TTCTCHTGACTCAGTTTA 3′

②236位点引物和探针

rt236位点正向引物：5′TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3′

rt236位点反向引物：5′CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3′

rt236N探针序列：5′ATACATTTRAACCC 3′

rt236T探针序列：5′ATACATTTRACCCC 3′；

其中，上述探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中，Y＝(C/T)，R＝(A/G)，H＝A/T/C：

(2)DNA提取液：

①溶液A，为聚乙二醇6000；

②溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。

(3)质控品

①阴性质控品，为不含外源片段的PSG-TS载体质粒DNA；

(4)工作标准品：

检测rt181时，为PSG-TS rt181的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt181A/rt181V/rt181T区间的162个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测rt236时，为PSG-TS rt236的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt236N/rt236T区间的153个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒都在大肠杆菌DH5α中增殖。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU或NEP；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液由溶液A和溶液B组成；

所述溶液A，为聚乙二醇6000；

所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl和乙基苯基聚乙二醇。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：

c、工作标准品3，为1.0×10⁵copy/mL的PSG-TSrt181质粒DNA溶液或1.0×10⁵copy/mL的PSG-TS rt236质粒DNA溶液；

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，

8.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

94℃5分钟；

94℃30秒，58℃45秒，5个循环；

9.一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测引物和探针，包括下述正向引物、反向引物和荧光探针的一组序列：

rt181位点正向引物：5′TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3′

rt181位点反向引物：5′AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3′

rt181A探针序列：5′TTCTCHTGGCTCAGTTT 3′

rt181V探针序列：5′TTCTCHTGGTTCAGTTTA 3′

rt181T探针序列：5′TTCTCHTGACTCAGTTTA 3′

rt236位点正向引物：5′TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3′

rt236位点反向引物：5′CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3′

rt236N探针序列：5′ATACATTTRAACCC 3′

rt236T探针序列：5′ATACATTTRACCCC 3′；

或者在上述序列的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的一组序列；

或者与上述序列的同源性大于85％的一组序列；

或者与上述序列的碱基互补的一组序列；

10.根据权利要求9所述的乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测引物和探针，其特征在于，其中，荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU或NEP；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。