CN106950163B - 流式细胞术检测鸡胸腺t淋巴细胞亚群的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，包括以下步骤：鸡处死后，获取胸腺组织并制取单细胞悬液；取所述单细胞悬液，加入抗鸡的CD3、CD4和CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色；取染色后的细胞液，用PBS洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；分析检测结果，获得鸡胸腺T淋巴细胞亚群比例。本发明流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，针对样本处理、检测及分析过程中目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题，建立了一种稳定规范的鸡胸腺T淋巴细胞亚群的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于细胞检测技术领域，具体地说，涉及一种流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法。
背景技术
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种利用流式细胞仪进行单细胞定量分析和分选的技术。其工作原理是通过荧光标记的单克隆抗体或荧光微球，对单个细胞或分子进行标记或捕获后，进行多参数的定量分析。在检测过程中，通过非荧光散射信号，即前向散射光FSC和侧向散射光SSC信号，可分别获得与细胞大小和胞内物质密度相关的信息，从而对细胞进行分群，这一细胞分群处理过程可以为下一步分析特定靶细胞群的特点奠定基础。
流式细胞分析最大的优点是对混合细胞群中各亚群细胞进行分类计数。在人类医学中，人外周血T淋巴细胞亚群(包括CD3、CD4和CD8细胞)检测结果与患者细胞免疫功能密切相关。例如，可通过CD3+CD4+CD8-T淋巴细胞的绝对数量和相对比例来诊断艾滋病。胸腺是T淋巴细胞增殖分化的场所，因此检测鸡胸腺T淋巴细胞各亚群的构成情况，可用于科学研究中评估鸡T淋巴细胞在胸腺的分化成熟速度和程度。研究发现，样本前处理、目标细胞选取、电压调节、荧光补偿调节、分析时阳性范围及参数选择等均会影响检测结果，而目前尚无使用流式细胞仪检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的可靠参考方法。
发明内容
有鉴于此，本发明针对样本处理、检测及分析过程中目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题，提供了一种流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，旨在建立一种稳定规范的鸡胸腺T淋巴细胞亚群的检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，
包括以下步骤：
步骤1，获取受试鸡胸腺组织并制取单细胞悬液；
步骤2，吸取所述单细胞悬液于两支流式管中，一份细胞液中加入抗鸡的CD3、CD4和CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色，用作检测管；另一份用作阴性设置管；
步骤3，取染色后的细胞液，用PBS洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；
步骤4，分析检测结果，获得鸡胸腺T淋巴细胞亚群比例。
进一步地，所述制取单细胞悬液具体为：将获取的胸腺组织用机械破碎法获得单细胞，过滤、洗涤后，用预冷的PBS液稀释细胞，获得浓度为1×106-1×107个/mL单细胞悬液，于4℃保存备用。
进一步地，阴性设置管的处理方式有两种，一是用同型对照试剂染色；二是不染色。
进一步地，同型对照试剂的选择方法具体为：选择与抗体对应表面标志的一抗完全相同种属来源、相同亚型及荧光标记的抗体。例如，检测管使用的是小鼠抗鸡的CD4FITC标记的抗体，说明书上显示其成份是Mouse IgG1，那么同型对照就是FITC标记的MouseIgG1。熟悉各单抗阳性细胞的分群情况后，通常使用空白对照来设置阴性对照即可。
进一步地，所述染色的时间为30min。
进一步地，所述洗涤具体是以600-1000r/min的转速离心5分钟。
进一步地，所述使用流式细胞仪进行检测，包括：在前向散射光/侧向散射光双参数图中调节电压和电流线性增益参数，使组织细胞团位于散点图的中央区；选取胸腺细胞并设门；用阴性设置管设定阴性区；用检测管调节通道的荧光补偿，完成样品的数据获取。
进一步地，所述调节电压和电流线性增益参数，具体为：调节侧向散射光通道的电压，使细胞位于侧向散射光轴的中段；调节前向散射光通道的电流线性增益参数，使组织细胞与细胞碎片分开。
进一步地，所述设定阴性区具体为：用阴性设置管上流式细胞仪，设定散点图中十字门左下方的区域为阴性区，调节电压使阴性区内细胞百分比大于98％。
进一步地，所述调节通道的荧光补偿，具体为：在CD4和CD8的双参数图中，调节CD4+CD8+细胞的比例大于60％，且与CD8单阳性细胞间具有分界。
进一步地，所述分析检测结果，包括：圈取目标细胞并设门、分别在CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8象限图中准确界定双阴性区、单阴性区和双阳性区，分别读取CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞百分比，从而获得鸡胸腺T淋巴细胞亚群比例。
进一步地，所述圈取目标细胞并设门要求圈取除碎片以外98％以上的胸腺组织细胞。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
(1)本发明成功建立了稳定规范的流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，通过对样品前处理、检测和分析过程中的目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题进行改进，避免了试验过程中人为因素造成的误差，提高了结果判断的真实性和客观性。
(2)本方法操作步骤简单，易于掌握，在评价鸡胸腺损伤及免疫相关的生物医学研究等领域有广阔的应用前景。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1a为利用本发明方法在流式细胞仪上得到的正常调节补偿后的二维散点图，图1b为在FL2通道过度调节补偿的二维散点图；
图2为利用本发明方法在流式细胞仪上得到的FSC和SSC的二维散点图中圈取不同目标细胞后的结果分析图；
图3是本发明经腹腔注射环磷酰胺的雏鸡鸡胸腺T淋巴细胞亚群结果分析图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，具体包括以下步骤：
步骤1，获取受试鸡胸腺组织并制取单细胞悬液；
进一步地，所述制取单细胞悬液具体为：将获取的胸腺组织用机械破碎法获得单细胞，过滤、洗涤后，用4℃的PBS液稀释细胞，获得浓度为1×106-1×107个/mL单细胞悬液，于4℃保存备用。
在本实施例中，单细胞液的浓度过低会导致上机时每秒收集细胞数量过少；单细胞液浓度过高则可导致目标细胞不能被充分染色。
步骤2，取所述单细胞悬液100μL，加入至流式上机管中，随后加入抗鸡的CD3、CD4和CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色30min，用作检测管；
同时，吸取100μL所述单细胞悬液于另一流式管中，用做阴性设置管，用于上机检测时设置阴性区。
进一步地，阴性设置管的处理方式有两种，一是用同型对照试剂染色；二是不染色。
进一步地，同型对照试剂的选择方法具体为：选择与抗体对应表面标志的一抗完全相同种属来源、相同亚型及荧光标记的抗体。例如，检测管使用的是小鼠抗鸡的CD4FITC标记的抗体，说明书上显示其成份是Mouse IgG1，那么同型对照就是FITC标记的MouseIgG1。熟悉各单抗阳性细胞的分群情况后，通常使用不染色的空白对照来设置阴性对照区即可。
步骤3，取染色后的胸腺组织细胞液，用PBS洗涤后用500μL PBS液重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；
进一步地，所述步骤3中使用流式细胞仪进行检测，包括：在前向散射光/侧向散射光(FSC/SSC)双参数图中调节电压和电流线性增益(AMP)参数，使组织细胞团位于散点图的中央区；选取胸腺细胞并设门；用阴性设置管设定阴性区；用检测管调节通道的荧光补偿，完成样品的数据获取。
本实施例中，在检测时，将重悬细胞液置于上样口，以低速模式运行流式细胞仪。
其中，所述调节电压和电流线性增益(AMP)参数，具体为：调节侧向散射光(SSC)通道的电压，使细胞位于SSC轴的中央区；调节前向散射光(FSC)通道的AMP参数，使两团组织细胞与左侧火箭形的细胞碎片分开。
其中，所述选取胸腺细胞并设门，要求设门圈取除碎片以外的全部细胞的98％以上。
其中，所述设定阴性区，具体为：用阴性设置管上流式细胞仪，设定散点图中十字门左下方的区域为阴性区，分别在CD3/CD4、CD3/CD8和CD4/CD8的双参数图中，调节十字门左下角的细胞，使其百分比大于98％。
具体的，在调节荧光补偿时，根据胸腺中CD4+CD8+细胞数量较多的特点，不能过度调节补偿。在CD4和CD8的双参数图中，调节CD4+CD8+细胞的比例应大于60％，且与右下角的CD8单阳性细胞间有较明显的分界。
步骤4，分析检测结果，获得CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞百分比，同时获得CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+细胞百分比，得到鸡胸腺T淋巴细胞亚群比例。
所述分析检测结果，包括：调出阴性区设置图，确定十字门的具体位置；调出检测结果图，在FSC/SSC双参数图中圈取胸腺组织细胞并设门；再分别在CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8象限图中准确界定双阴性区、单阴性区和双阳性区，分别读取CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞百分比，从而获得鸡胸腺T淋巴细胞亚群比例。
具体的，应用CellQuest或者FlowJo软件在FSC/SSC双参数图中正确圈取胸腺组织细胞并设门。分析时圈取淋巴细胞的设门位置会导致结果差异极大，应圈取除碎片以外98％以上的细胞。
其中，所述界定双阴性区、单阴性区和双阳性区，具体为：按照阴性区细胞数量大于98％的标准，用未染色胸腺细胞的CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8象限图确定十字门的位置，由此确定染色胸腺细胞在相应象限图中的十字门位置，十字门左下角显示双阴性区细胞比例，左上角和右下角显示单阳性细胞比例，右上角显示双阳性细胞比例。用染色细胞做分析时，则直接采用前述的十字门的位置。
其中，所述分别读取CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞百分比，具体为：CD3+T淋巴细胞百分比的值为CD3/CD4象限图中左上角和右上角的百分比总和；CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞百分比的值分别为CD3/CD4和CD3/CD8象限图中右上象限的百分比；CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞百分比的值分别为CD4/CD8象限图中左上、右下和右上象限的百分比。
实施例
步骤1，处死受试鸡后，获取胸腺组织并制取单细胞悬液
按一定剂量水平对鸡单次腹腔注射环磷酰胺，建立免疫抑制模型。取成功建模的鸡，颈椎脱臼处死后，立即剖杀，取出胸腺组织，用滤纸吸净血污、用眼科剪修去周围结缔组织后，置于4℃的PBS液中保存；
取保存的样品，置表面皿中，用眼科剪反复剪碎至组织呈泥状后，加入适量PBS液，混匀；然后用300目尼龙网过滤后得滤液；以600-1000r/min的转速对滤液离心5分钟，弃上清液；再加入1mL PBS液，旋涡混匀后，再次离心，弃上清液；重悬细胞，获得细胞浓度为1×106-1×107个/mL的单细胞悬液，于4℃保存备用；
步骤2，取所述单细胞悬液各100μL，分别加入两支流式上机管中，一份细胞液不染色，用作阴性设置管；另一份细胞液中加入抗鸡的CD3、CD4和CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色30分钟，用作检测管；
步骤3，取出染色后的细胞液，加入1mL PBS液，混匀后，以600-1000r/min的转速离心5分钟，弃上清液，然后加入500μL PBS液重悬细胞，使用流式细胞仪上机检测；
检测在FACSCalibur型的流式细胞仪上进行，包括：将重悬细胞液置于上样口，以低速模式运行流式细胞仪；在前向散射光/侧向散射光双参数图中调节SSC通道的电压和FSC通道的AMP参数，使组织细胞团位于散点图的中央区；除细胞碎片外，选取尽量多的胸腺细胞并设门；用阴性设置管设定阴性区；用检测管调节通道的荧光补偿，完成样品的数据获取。
在调节荧光补偿时，根据胸腺中CD4+CD8+细胞数量较多的特点，不能过度调节补偿。CD4和CD8的双参数图中，不能根据外周血T淋巴细胞检测经验调节为CD4+CD8+细胞占少数的状态(如图1b所示)，而应该调节成CD4+CD8+细胞占多数的状态(如图1a所示)。图1a所示为正确调节补偿时CD4和CD8的双参数图，应调节CD4+CD8+细胞的比例大于60％，且与CD8单阳性细胞间具有分界。由图1可以看出，图1a中CD4和CD8双阳性细胞比例较大；图1b在FL2通道过度调节补偿，导致CD8单阳性细胞比例偏高，CD4和CD8双阳性细胞比例偏低，不能反映样品的真实情况。因此在样品收集过程中，应根据胸腺组织中CD4和CD8双阳性细胞较多的特点，调节成CD4+CD8+细胞比例大于60％的状态。
步骤4，分析检测结果，获得CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞百分比，同时获得CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+细胞百分比，得到鸡胸腺T淋巴细胞亚群比例。
用FlowJo7.6或Cell quest软件分析检测结果。在FSC/SSC双参数图中用门(gate)圈出目标细胞群，应圈取除碎片外98％以上的胸腺组织细胞并设门；再用未染色细胞的测试数据分别在CD3/CD4、CD3/CD8和CD4/CD8象限图中划十字门，十字门位置按阴性区细胞数量小于98％的标准设定；用染色细胞的测试数据进一步做分析，采用前述的十字门位置设置阴性区，进而获得CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞百分比值。
分析时圈取淋巴细胞的设门位置会导致结果差异极大。由图2可以看出，圈取a群细胞时(图2a)，CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞百分比数值偏小，CD4+CD8+细胞百分比数值偏大(占70.41％)，表明该团细胞中，未分化成熟的T淋巴细胞较多；圈取b群细胞时(图2b)的结果与选a群时的相反，CD4+CD8+T淋巴细胞百分比为33.07％，表明b群细胞中分化成熟的T淋巴细胞较多；c群细胞圈取了除碎片以外98％以上的胸腺组织细胞(图2c)。可见，按图2a和图2b的方法设门，只分析了部分胸腺细胞的情况，按图2c的方法设门，则分析了整个胸腺组织细胞的分化情况，更具有代表性。因此在进行结果分析时要圈取尽量多的胸腺组织细胞。
实验观察到腹腔注射环磷酰胺导致雏鸡胸腺细胞中的CD4+CD8+细胞百分比升高(图3)，表明CD4、CD8双阳性细胞向单阳性细胞的选择分化过程可能受到了环磷酰胺的干扰。
通过上述内容可以看出，本发明实施例提供的流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，主要包括对以下几个方面的改进：一是调节荧光补偿时，应正确展示胸腺组织中CD4+CD8+T细胞占比例较多的情况；二是在FSC和SSC二维象限图中，要圈取尽量多的胸腺组织细胞进行结果分析；三是在分析结果时，除获得常规T淋巴细胞亚群指标，即CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞百分率外，还应记录CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+细胞的百分比，以考察试验因素是否干扰雏鸡胸腺中CD4+CD8+T细胞向对应的单阳性T细胞的增殖分化。从而建立了一种稳定规范的鸡胸腺T淋巴细胞亚群的流式细胞仪检测方法。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (2)
1.流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，获取受试鸡胸腺组织并制取单细胞悬液，所述制取单细胞悬液具体为：将获取的胸腺组织用机械破碎法获得单细胞，过滤、洗涤，所述洗涤具体是以600-1000r/min的转速离心5分钟，后用预冷的PBS液稀释细胞，获得浓度为1×106-1×107个/mL单细胞悬液，于4℃保存备用；
步骤2，取所述单细胞悬液两份，一份加入抗鸡的CD3、CD4和CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色，所述染色的时间为30min，用于检测；另一份用于设置阴性区；
步骤3，取染色后的细胞液，用PBS洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测，所述使用流式细胞仪进行检测，包括：在前向散射光/侧向散射光双参数图中调节电压和电流线性增益参数，使组织细胞团位于散点图的中央区；选取胸腺细胞并设门；用阴性设置管设定阴性区；用检测管调节通道的荧光补偿，完成样品的数据获取；
所述调节电压和电流线性增益参数，具体为：调节侧向散射光通道的电压，使细胞位于侧向散射光轴的中段；调节前向散射光通道的电流线性增益参数，使组织细胞与细胞碎片分开；
所述调节通道的荧光补偿，具体为：在CD4和CD8的双参数图中，调节CD4+CD8+细胞的比例大于60%，且与CD8单阳性细胞间具有分界；
步骤4，分析检测结果，获得鸡胸腺T淋巴细胞亚群比例；分析检测结果，包括：圈取目标细胞并设门、分别在CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8象限图中准确界定双阴性区、单阴性区和双阳性区，分别读取CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+ 、CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞百分比，从而获得鸡胸腺T淋巴细胞亚群比例；所述圈取目标细胞并设门要求圈取除碎片以外98%以上的胸腺组织细胞。
2.如权利要求1所述的流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，其特征在于，所述设定阴性区具体为：用阴性设置管上流式细胞仪，设定散点图中十字门左下方的区域为阴性区，调节电压使阴性区内细胞百分比大于98%。
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