CN110628721A - 一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒 - Google Patents

一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110628721A
CN110628721A CN201911013559.7A CN201911013559A CN110628721A CN 110628721 A CN110628721 A CN 110628721A CN 201911013559 A CN201911013559 A CN 201911013559A CN 110628721 A CN110628721 A CN 110628721A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
liquid
added
pbs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911013559.7A
Other languages
English (en)
Inventor
魏勋斌
谢志强
陈建一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Jiale Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Foshan Pudi Medical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan Pudi Medical Technology Co Ltd filed Critical Foshan Pudi Medical Technology Co Ltd
Publication of CN110628721A publication Critical patent/CN110628721A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Abstract

本发明公开一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒，所述方法包括以下步骤：取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到PBMC；将PBMC与基础培养液混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；培养容器内放置有三维培养支架，将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架内，再加入细胞培养液；在第一天和第三天更换一次细胞培养液。以血液为标本，无需对肿瘤病患进行穿刺或手术取得肿瘤标本来进行分离培养，不仅降低病患标本取得风险，也缩短了肿瘤分离所需时间。

Description

一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，主要涉及一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒。
背景技术
循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，）简称CTC，通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞检测在乳腺癌、肺癌、结直肠癌及前列腺癌等转移性实体瘤的微转移、监测术后复发、疗效评估与预后及个体化靶向治疗等方面的有重要作用。将CTC捕获出来进行培养，进一步对其进行基因测序、mRNA表达和蛋白表达情况分析，为患者制定/调整治疗方案，达到个体化治疗目的。CTC的富集关键在于如何从复杂的血液环境中高效、迅速、准确地富集CTC。因为血液循环系统存在着数量巨大的血液细胞，包括红细胞、白细胞、血小板，而CTC在肿瘤患者外周血中数量稀少，平均106～107个白细胞中仅含有1个CTC。CTC的富集效果（尤其是富集效率）直接影响了对病人肿瘤诊断的预判以及后续的基因检测等。因此，目前针对循环肿瘤细胞的分离和培养方法还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒，可以从血液中分离循环肿瘤细胞，旨在提供一种新的循环肿瘤细胞的分离培养方法，缩短循环肿瘤分离及培养所需要的时间进程。
本发明的技术方案如下：
一种循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，包括以下步骤：
（1）取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到PBMC；
（2）将PBMC与基础培养液混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；
（3）培养容器内放置有三维培养支架，将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架内，再加入细胞培养液。
所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，步骤（1）中，将人体全血标本与PBS以1:1~3混合得到稀释血液，取聚蔗糖置于离心管，缓慢披覆稀释血液于聚蔗糖的上层，并于15~25℃下，以350~450×g离心25~45分钟，取离心管中间白色层，即为PBMC；
步骤（2）中，用基础培养液打散PBMC，混合均匀后，以150~300×g离心3~8分钟；所述基础培养液为天然或人工合成培养基，所述基础培养液中添加至少一种天然或人工生长因子；
步骤（3）中，所述细胞容器采用细胞培养板，每孔内底部放置一片直径为3mm的三维培养支架；每片3mm的三维培养支架加入3~10μL细胞液体，再加入80~200μL细胞培养液；添加完细胞培养液之后，转入细胞培养箱，37℃，5~20% CO2条件，进行培养；所述细胞培养液为天然或人工合成培养基，所述细胞培养液中添加至少一种天然或人工生长因子。
所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，步骤（3）中，在添加完细胞培养液后，还包括以下步骤：
在孔盘外圈加入PBS。
所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，所述循环肿瘤细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
（4）在第一天和第三天更换一次培养基：先移除细胞培养液，再加入洗涤缓冲溶液，移除；最后添加新的细胞培养液。
一种用于分离循环肿瘤细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括梯度液、基础培养液、放置有三维培养支架的培养容器、细胞培养液、洗涤缓冲溶液。
一种循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，包括以下步骤：
（a）取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到PBMC；
（b）将PBMC与PBS混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；
（c）在细胞液体中加入PBS，混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；再加入PBS，打散细胞团块；
（d）在细胞液体中加入至少一种能辨识及结合循环肿瘤细胞表面抗原之荧光接合专一抗体与至少一种能辨识及结合白血球细胞表面抗原之荧光接合专一抗体，得到含抗体的细胞液体；
（e）经由流式细胞仪作为侦测并定量血液中之循环肿瘤细胞，分选有循环肿瘤细胞表面抗原且无白血球细胞表面抗原讯号之细胞族群；
（f）培养容器内放置有三维培养支架，将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架，再加入细胞培养液。
所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，步骤（a）中，将人体全血标本与PBS以1:1~3混合得到稀释血液，取聚蔗糖置于离心管，缓慢披覆稀释血液于聚蔗糖的上层，并于15~25℃下，以350~450×g离心25~45分钟，取离心管中间白色层，即为PBMC；
步骤（b）中，将PBMC转移至离心管中，加入PBS，所述PBS的加入量为人体全血标本体积的3~5倍，轻轻翻转约5次，以350~450×g离心10-25分钟；
步骤（c）中，在细胞液体中先加入少量PBS，将细胞团块打散后，再加入PBS，此处PBS加入量为细胞液体的7~10倍，混合均匀，以350~450×g离心10-25分钟；离心后，除去上层清液，保留下层细胞液体，再加入PBS，此处PBS的添加量为细胞液体的0.7~1.5倍，打散细胞团块；
步骤（d）中，每种抗体的加入量约为步骤（c）混合液体体积的2~4%；加入PBS，此处PBS的加入量约为步骤（c）混合液体体积的4~7倍；离心条件为，350~450×g，15~25℃，5~15min；所述能辨识及结合肿瘤细胞表面抗原之荧光接合专一性抗体为上皮细胞粘合蛋白、细胞角质蛋白、癌干细胞表面抗原、表皮生长因素受体、人类表皮生长因素受体、钙黏蛋白中的一种或以上；所述能辨识及结合白血球细胞表面抗原之荧光接合专一抗体为CD45；
步骤（e）中，先采用100um的细胞过滤网对含抗体的细胞液体进行过滤，再进行分选；
步骤（f）中，所述细胞容器采用细胞培养板，每孔内底部放置一片直径为3mm的三维培养支架；每片3mm的三维培养支架加入3~10μL细胞液体，再加入80~200μL细胞培养液；添加完细胞培养液之后，转入细胞培养箱，37℃，5~20% CO2条件，进行培养；所述细胞培养液为天然或人工合成培养基，所述细胞培养液中添加至少一种天然或人工生长因子。
所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，步骤（f）中，在添加完细胞培养液后，还包括以下步骤：
在孔盘外圈加入PBS。
所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其中，所述循环肿瘤细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
（g）在第一天和第三天更换一次培养基：先移除细胞培养液，再加入洗涤缓冲溶液，移除；最后添加新的细胞培养液。
一种用于分离循环肿瘤细胞的试剂盒，其中，包括梯度液、至少一种能辨识及结合循环肿瘤细胞表面抗原之荧光接合专一抗体、至少一种能辨识及结合白血球细胞表面抗原之荧光接合专一抗体、放置有三维培养支架的培养容器、细胞培养液、洗涤缓冲溶液。
有益效果：本发明提供的循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒，以血液为标本，无需对肿瘤病患进行穿刺或手术取得肿瘤标本来进行分离培养，不仅降低病患标本取得风险，也缩短了肿瘤分离所需时间。若病患进行穿刺或手术取得肿瘤标本，病患需要时间安排进行手术。若为抽血从血液中取得，则可以省下许多时间。另外有些病患可能因身体状况而不适合进行手术，抽血较容易执行，从而解决了无法取得标本的问题。采用本发明所提供的循环肿瘤细胞的分离培养方法，可以缩短肿瘤细胞标本取得之操作过程并提高肿瘤细胞标本取得之准确性。利用本发明方法取得的循环肿瘤细胞，可以用于体外确定测试药物是否具有抑制循环肿瘤细胞的效果。透过将癌细胞加入血液中后取出培养，经细胞培养后观察的实验结果，可以证明两种循环肿瘤细胞的培养方法是可行的。使用收集再培养的方法是希望能直接培养肿瘤细胞，这样培养成功率会较高。
附图说明
图1为本发明实施例1中培养后第二天的细胞染色观察结果图。
图2为本发明实施例1中培养后第五天的细胞染色观察结果图。
图3为本发明实施例2中培养后第二天的细胞染色观察结果图。
图4为本发明实施例2中培养后第五天的细胞染色观察结果图。
图5为本发明实施例2中培养后第五天的癌症细胞株表面抗原CD326染色标定观察结果图。
具体实施方式
本发明提供一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所提供的一种循环肿瘤细胞的分离培养方法，主要是从血液标本中分离培养，无需对肿瘤病患进行穿刺或手术取得肿瘤标本来进行分离培养，降低病患标本取得风险，也缩短CTC分离培养所需的时间进程，进而提高制定/调整治疗方案的效率和有效性。
具体地，所述循环肿瘤细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
（1）取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到外周血单个核细胞（PBMC）。
步骤（1）中，具体操作过程可以为：将人体全血标本与磷酸盐缓冲盐液（PBS）以1:1~3混合得到稀释血液，取聚蔗糖（Ficoll）置于离心管，缓慢披覆稀释血液于聚蔗糖的上层，并于15~25℃下，以350~450×g离心25~45分钟（优选地，此离心过程中，减速加速度最小，加速加速度最大，这样离心分层的效果较好）。取离心管中间白色层（绕着边缘环状取雾白色一环），即为外周血单个核细胞（PBMC）。
步骤（1）中，除了聚蔗糖以外，还可以单纯使用蔗糖（sucrose）或是能提供密度差的液体，或改成聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）密度梯度离心法或是其他密度梯度离心法。
（2）将PBMC与基础培养液（Basal medium）混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体。
步骤（2）的作用与步骤（1）加入PBS的作用相同，起到清洗的作用。步骤（2）中，于含PBMC的离心管中加入基础培养液，并用基础培养液打散PBMC，混合均匀后，以150~300×g离心3~8分钟。移除上清液，保留下层细胞液体积至少350 μL。
其中，基础培养液的加入量可以为人体全血标本体积的1~2倍。所述基础培养液可以为任何天然或人工合成培养基，优选地，所述基础培养液中可添加至少一种天然或人工生长因子，如添加0.5-10%动物血清。在本发明实施例中所述基础培养液采用DMEM培养液为例，对本发明进行详细说明，所述基础培养液中添加有2%的胎牛血清。
（3）培养容器内放置有三维培养支架（3D Cellusponge），将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架内，再加入细胞培养液（Culture medium）。
步骤（3）中，所述三维培养支架为植物纤维生物材料制成，为申请人的其中一项专利技术，此产品市面上可购得。所述细胞容器可以采用细胞培养板，每孔内底部放置一片直径为3mm的三维培养支架。将细胞液体转移至三维培养支架上时，每片3mm的三维培养支架可以加入3~10μL细胞液体，待细胞液体完全吸收贴覆在三维培养支架上后，再加入80~200μL细胞培养液。添加完细胞培养液之后，可放入细胞培养箱，37℃，5~20% CO2条件，进行培养。
其中，所述细胞培养液可以为任何天然或人工合成培养基，优选地，在细胞培养液中可以添加至少一种天然或人工生长因子，如添加0.5-10%动物血清之培养液。所述细胞培养液和基础培养液可以采用相同的培养液。在本发明实施例中所述细胞培养液采用DMEM培养液为例，对本发明进行详细说明，所述细胞培养液中添加有2%的胎牛血清。
优选地，加入所述细胞培养液后，可以再在孔盘最外圈加入150~200μLPBS，可以防止培养容器放入培养箱后，液体蒸发而导致细胞生长不良。PBS是加在孔盘最外圈，所述细胞培养液是直接加入到三维培养支架上。
（4）在第一天和第三天更换一次培养基，观察细胞生长情况。
步骤（4）中，于D1/D3更换一次培养基过程为，先移除培养基，再加入80~200μL洗涤缓冲溶液（Wash buffer），移除；再添加80~200μL细胞培养液。若在孔盘外圈加入有PBS，外圈的PBS无需一同移除，另可根据PBS的剩余量，补充新PBS。
本发明中还提供一种用于分离循环肿瘤细胞的试剂盒，其中包括梯度液、基础培养液、放置有三维培养支架的培养容器、细胞培养液、洗涤缓冲溶液等。所述试剂盒可以用于从血液中分离出循环肿瘤细胞，分离效率高。
以下通过具体实施例对本发明上述方案进行进一步说明。
实施例1
预备工作：
准备两支人体全血，每支不少于8毫升，将肝癌细胞株HepG2加入血液中模拟病患CTC血液。将全血以磷酸盐缓冲盐液（PBS）体积1：1稀释。
操作步骤：
1、取3mL Ficoll到15 mL离心管，调整电动吸液枪（Pipet）速度至重力G，加入4mL稀释后的血。
2、将 pipet 调到非重力/速度最小，将按不下去的血全部注入离心管中。
3、离心 400 g (1500 rpm)，20℃，30 min (此步骤: 减速加速度最小，加速加速度最大)。
4、用1 mL Pipet取PBMC，绕着边缘环状取雾白色一环，至新的15 mL 离心管。（贴在管壁的细胞也需取出，若雾白色一环中间有血球飘浮，尽量避免吸入。）
5、将15 mL离心管，加入6 mL Basal medium，打散细胞团块（pellet）。
6、离心 200 g，5 min。
7、移除上清液，保留细胞液体积至少350 μL 。
8、将细胞液加入细胞培养样板（well plate）中，每孔中放置有一片直径3mm的三维培养支架，每片加入5μL细胞液体。
9、每孔中加入100 μL Culture medium。 ．可于孔盘最外圈加入200 μL PBS 。 ．于D1/D3更换一次培养基，移除培养基，加入100 μL Wash buffer，移除后添加100 μLCulture medium。
10、观察细胞生长情形。
分别于培养后第二天与第五天进行死活细胞染色进行观察。图1为第二天细胞观察图，图2为第五天细胞观察图，绿色颗粒或团块为活细胞、红色则为死细胞，从图1和图2可以看出，细胞生长良好。
本发明中还提供另一种实施方案，所述循环肿瘤细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
（a）取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到外周血单个核细胞（PBMC）。
本方案中的步骤（a）与上述方案中的步骤（1）相同。
（b）将PBMC与PBS混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体。
步骤（b）中，具体操作过程可以为：将PBMC转移至离心管中，加入PBS，轻轻翻转约5次。以350~450×g离心10-25分钟。移除上清液，保留下层细胞液体。其中，所述PBS的加入量依抽取出的PBMC量决定，大约为人体全血标本体积的3~5倍。
（c）在细胞液体中加入PBS，混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；再加入PBS，打散细胞团块。
步骤（c）中，具体操作过程可以为：在细胞液体中先加入少量PBS，将细胞团块打散后，再加入PBS，混合均匀，其中此处PBS加入量为细胞液体的7~10倍；以350~450×g离心10-25分钟；离心后，除去上层清液，保留下层细胞液体，再加入PBS，此处PBS的添加量为细胞液体的0.7~1.5倍，打散细胞团块。
（d）在细胞液体中加入至少一种能辨识及结合循环肿瘤细胞表面抗原之荧光接合专一抗体与至少一种能辨识及结合白血球细胞表面抗原之荧光接合专一抗体。
步骤（d）中，所述能辨识及结合肿瘤细胞表面抗原之荧光接合专一性抗体，可以为上皮细胞粘合蛋白(EpCAM)、细胞角质蛋白(CK)、癌干细胞表面抗原(CD133、CD44或CD24)、表皮生长因素受体(EGFR)、人类表皮生长因素受体(HER2)、钙黏蛋白(N-Cadherin)等。所述能辨识及结合白血球细胞表面抗原之荧光接合专一抗体，目前最有效且广泛性表现于白血球上的表面抗原为CD45。
在本发明实施例方案中采用这两种FITC抗体，CD326（上皮细胞粘附分子）和CD45（白细胞共同抗原）为例，对本发明方案进行具体说明。具体操作步骤可以为：稀释FITC抗体，再细胞液体中加入CD326， CD45 避光染色1 小时，外围包锡箔纸，其中，每种抗体的加入量约为步骤（c）混合液体体积的2~4%；加入PBS，此处PBS的加入量约为步骤（c）混合液体体积的4~7倍；离心350~450×g，15~25℃，5~15min；移除部分上清液后，保留下层细胞液体，对细胞液体进行吹打，打散细胞团块。
（e）经由流式细胞仪作为侦测并定量血液中之循环肿瘤细胞，分选有循环肿瘤细胞表面抗原且无白血球细胞表面抗原讯号之细胞族群。
步骤（e）中，具体操作步骤可以为：
取一上机容器，在上机容器上方放置100um的细胞过滤网（cell strainer），对细胞液体进行过滤。上机容器可用离心管（Eppendorf，尖底，可以将液体收完）或彭氏管（P.S.tube ，底圆，可能会无法收到完）。优选地，因为盛装细胞液体的原本容器和前一步骤中用于吹打细胞液体的微量吸管中内可能会有残留，为了保证尽可能多的细胞通过分选，可以再在原本容器中加入少量 PBS润洗，并用以先前吹打细胞液体的微量吸管分散液体，将润洗液体经过细胞过滤网进入上机容器中。上机分选出CD45－/CD326＋的细胞液，此细胞族群即为循环肿瘤细胞。
（f）培养容器内放置有三维培养支架（3D Cellusponge），将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架，再加入细胞培养液（Culture medium）。
（g）在第一天和第三天更换一次培养基，观察细胞生长情况。
本方案中的步骤（f）（g）与上述方案中的步骤（3）（4）相同
本发明中还提供一种用于分离循环肿瘤细胞的试剂盒，其中包括梯度液、至少一种能辨识及结合循环肿瘤细胞表面抗原之荧光接合专一抗体、至少一种能辨识及结合白血球细胞表面抗原之荧光接合专一抗体、放置有三维培养支架的培养容器、细胞培养液、洗涤缓冲溶液等。所述试剂盒可以用于从血液中分离出循环肿瘤细胞，分离效率高。
以下通过具体实施例对本发明上述方案进行进一步说明。
实施例2
预备工作：
准备两支人体全血，每支不少于8毫升，将癌症细胞株HCT116加入血液中模拟病患CTC血液。将全血以磷酸盐缓冲盐液（PBS）体积1：1稀释。
操作步骤：
1、取3mL Ficoll到15 mL离心管，调整电动吸液枪（Pipet）速度至重力G，加入4mL稀释后的血。
2、将 pipet 调到非重力/速度最小，将按不下去的血全部注入离心管中。
3、离心 400 g (1500 rpm)，20℃，30 min (此步骤: 减速加速度最小，加速加速度最大)。
4、用1 mL Pipet取PBMC，绕着边缘环状取雾白色一环，至新的15 mL 离心管。（贴在管壁的细胞也需取出，若雾白色一环中间有血球飘浮，尽量避免吸入。）
5、将15 mL离心管，加 PBS 至14~15 mL刻度位置，轻轻翻转约5次。
6、离心400 g，15 min。
7、移除上清液，使液体剩约500 μL。
8、加入1 mL PBS打散细胞团块。
9、加入PBS 到6 mL 刻度位置。
10、离心400 g，15 min。
11、移除上清液，使液体剩约200 μL。
12、加入200 μL PBS打散pellet。
13、最终体积为 400 μL 。
14、稀释FITC抗体，需多稀释一些，以防取时不足。在本实施例方案中所采用的FITC抗体为CD326和CD45。
15、于各管分别加入配好的10 μL CD326, 10 μL CD45 避光染色1 hr，外围包锡箔纸。
16、加入2 mL PBS (若为容器为离心管，则加1 mL PBS即可) 。
17、离心 400 g，10 min，20℃。
18、移除部分上清液后，吹打保留下来的细胞液体，打散细胞团块，保留吹打所用的微量吸管，留下来的细胞液体约为200~500微升的量。
19、取一新离心管作为上机容器，离心管的上方放置 100 μm 细胞过滤网，将上机溶液都过滤完毕。
20、加入少量 PBS润洗原本容器，以先前保留的微量吸管分散液体，将原本容器内和微量吸管内可能残留的细胞都洗到润洗液体中，将润洗液体也注入细胞过滤网内，流入上机容器内。
21、上机分选出CD45－/CD326＋的细胞液，体积350 μL。
22、将细胞液加入细胞培养样板（well plate）中，每孔中放置有一片直径3mm的三维培养支架，每片加入5μL细胞液体。
23、每孔中加入100 μL细胞培养液（Culture medium）。 ．可于孔盘最外圈加入200μL PBS 。 ．于D1/D3更换一次培养基，移除培养基后，加入100 μL洗涤缓冲溶液（Washbuffer），移除后添加100 μL细胞培养液（Culture medium）。
24、观察细胞生长情形。
分别于培养后第二天与第五天进行死活细胞染色进行观察。图3为第二天细胞观察图，图4为第五天细胞观察图，绿色颗粒或团块为活细胞、红色则为死细胞，从图3和图4可以看出，细胞生长良好。同时，于培养后第五天进行癌症细胞株表面抗原CD326染色标定，可以观察到被标定绿色萤光的癌症细胞株，如图5所示。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到PBMC；
（2）将PBMC与基础培养液混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；
（3）培养容器内放置有三维培养支架，将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架内，再加入细胞培养液。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（1）中，将人体全血标本与PBS以1:1~3混合得到稀释血液，取聚蔗糖置于离心管，缓慢披覆稀释血液于聚蔗糖的上层，并于15~25℃下，以350~450×g离心25~45分钟，取离心管中间白色层，即为PBMC；
步骤（2）中，用基础培养液打散PBMC，混合均匀后，以150~300×g离心3~8分钟；所述基础培养液为天然或人工合成培养基，所述基础培养液中添加至少一种天然或人工生长因子；
步骤（3）中，所述细胞容器采用细胞培养板，每孔内底部放置一片直径为3mm的三维培养支架；每片3mm的三维培养支架加入3~10μL细胞液体，再加入80~200μL细胞培养液；添加完细胞培养液之后，转入细胞培养箱，37℃，5~20% CO2条件，进行培养；所述细胞培养液为天然或人工合成培养基，所述细胞培养液中添加至少一种天然或人工生长因子。
3.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（3）中，在添加完细胞培养液后，还包括以下步骤：
在孔盘外圈加入PBS。
4.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
（4）在第一天和第三天更换一次培养基：先移除细胞培养液，再加入洗涤缓冲溶液，移除；最后添加新的细胞培养液。
5.一种用于分离循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括梯度液、基础培养液、放置有三维培养支架的培养容器、细胞培养液、洗涤缓冲溶液。
6.一种循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）取人体全血标本，采用密度梯度离心的方式，分离得到PBMC；
（b）将PBMC与PBS混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；
（c）在细胞液体中加入PBS，混合，离心，移除上清液，保留下层细胞液体；再加入PBS，打散细胞团块；
（d）在细胞液体中加入至少一种能辨识及结合循环肿瘤细胞表面抗原之荧光接合专一抗体与至少一种能辨识及结合白血球细胞表面抗原之荧光接合专一抗体，得到含抗体的细胞液体；
（e）经由流式细胞仪作为侦测并定量血液中之循环肿瘤细胞，分选有循环肿瘤细胞表面抗原且无白血球细胞表面抗原讯号之细胞族群；
（f）培养容器内放置有三维培养支架，将细胞液体转移至培养容器中的三维培养支架，再加入细胞培养液。
7.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（a）中，将人体全血标本与PBS以1:1~3混合得到稀释血液，取聚蔗糖置于离心管，缓慢披覆稀释血液于聚蔗糖的上层，并于15~25℃下，以350~450×g离心25~45分钟，取离心管中间白色层，即为PBMC；
步骤（b）中，将PBMC转移至离心管中，加入PBS，所述PBS的加入量为人体全血标本体积的3~5倍，轻轻翻转约5次，以350~450×g离心10-25分钟；
步骤（c）中，在细胞液体中先加入少量PBS，将细胞团块打散后，再加入PBS，此处PBS加入量为细胞液体的7~10倍，混合均匀，以350~450×g离心10-25分钟；离心后，除去上层清液，保留下层细胞液体，再加入PBS，此处PBS的添加量为细胞液体的0.7~1.5倍，打散细胞团块；
步骤（d）中，每种抗体的加入量约为步骤（c）混合液体体积的2~4%；加入PBS，此处PBS的加入量约为步骤（c）混合液体体积的4~7倍；离心条件为，350~450×g，15~25℃，5~15min；所述能辨识及结合肿瘤细胞表面抗原之荧光接合专一性抗体为上皮细胞粘合蛋白、细胞角质蛋白、癌干细胞表面抗原、表皮生长因素受体、人类表皮生长因素受体、钙黏蛋白中的一种或以上；所述能辨识及结合白血球细胞表面抗原之荧光接合专一抗体为CD45；
步骤（e）中，先采用100um的细胞过滤网对含抗体的细胞液体进行过滤，再进行分选；
步骤（f）中，所述细胞容器采用细胞培养板，每孔内底部放置一片直径为3mm的三维培养支架；每片3mm的三维培养支架加入3~10μL细胞液体，再加入80~200μL细胞培养液；添加完细胞培养液之后，转入细胞培养箱，37℃，5~20% CO2条件，进行培养；所述细胞培养液为天然或人工合成培养基，所述细胞培养液中添加至少一种天然或人工生长因子。
8.根据权利要求7所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（f）中，在添加完细胞培养液后，还包括以下步骤：
在孔盘外圈加入PBS。
9.根据权利要求7所述的循环肿瘤细胞的分离培养方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞的分离培养方法还包括以下步骤：
（g）在第一天和第三天更换一次培养基：先移除细胞培养液，再加入洗涤缓冲溶液，移除；最后添加新的细胞培养液。
10.一种用于分离循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，包括梯度液、至少一种能辨识及结合循环肿瘤细胞表面抗原之荧光接合专一抗体、至少一种能辨识及结合白血球细胞表面抗原之荧光接合专一抗体、放置有三维培养支架的培养容器、细胞培养液、洗涤缓冲溶液。
CN201911013559.7A 2019-05-30 2019-10-23 一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒 Pending CN110628721A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910464478 2019-05-30
CN2019104644782 2019-05-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110628721A true CN110628721A (zh) 2019-12-31

Family

ID=68977440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911013559.7A Pending CN110628721A (zh) 2019-05-30 2019-10-23 一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110628721A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111197031A (zh) * 2020-02-21 2020-05-26 复旦大学附属肿瘤医院 一种源于循环肿瘤细胞的肠癌类器官培养和传代方法
CN113248748A (zh) * 2020-02-12 2021-08-13 精拓生技股份有限公司 用于体外扩增循环肿瘤细胞的培养容器的复合材料薄膜的制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130078667A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 Oscar B. Goodman Methods for detecting and collecting circulating tumor cells
US20160077097A1 (en) * 2013-02-02 2016-03-17 Duke University Method of isolating circulating tumor cells
US20180258378A1 (en) * 2015-07-31 2018-09-13 Shanghai Jiaotong University Method and device for detecting circulating tumor cell
CN108795869A (zh) * 2018-06-28 2018-11-13 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种循环肿瘤细胞阳性富集方法
CN109207428A (zh) * 2018-09-12 2019-01-15 上海易对医生物医药科技有限公司 循环肿瘤细胞的分离和培养方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130078667A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 Oscar B. Goodman Methods for detecting and collecting circulating tumor cells
US20160077097A1 (en) * 2013-02-02 2016-03-17 Duke University Method of isolating circulating tumor cells
US20180258378A1 (en) * 2015-07-31 2018-09-13 Shanghai Jiaotong University Method and device for detecting circulating tumor cell
CN108795869A (zh) * 2018-06-28 2018-11-13 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种循环肿瘤细胞阳性富集方法
CN109207428A (zh) * 2018-09-12 2019-01-15 上海易对医生物医药科技有限公司 循环肿瘤细胞的分离和培养方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIA-JUNG LIAO ET AL.: "Isolation of label-free and viable circulating tumour cells (CTCs) from blood samples of cancer patients through a two-step process: negative selection type immunomagnetic beads and spheroid cell culture-based cell isolation", 《RSC ADVANCES》 *
RUOXIANG WANG ET AL.: "Cultured circulating tumor cells and their derived xenografts for personalized oncology", 《ASIAN JOURNAL OF UROLOGY》 *
吴文君 等: "肺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的快速分离与体外培养", 《遗传》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113248748A (zh) * 2020-02-12 2021-08-13 精拓生技股份有限公司 用于体外扩增循环肿瘤细胞的培养容器的复合材料薄膜的制备方法
CN111197031A (zh) * 2020-02-21 2020-05-26 复旦大学附属肿瘤医院 一种源于循环肿瘤细胞的肠癌类器官培养和传代方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11098274B2 (en) Method and device for detecting circulating tumor cell
Franquesa et al. Update on controls for isolation and quantification methodology of extracellular vesicles derived from adipose tissue mesenchymal stem cells
CN105954246B (zh) 一种在人的生物液体样本中检测游离的稀有肿瘤细胞的方法和试剂盒
CN102892900B (zh) 用于分离靶细胞的方法
US20110195413A1 (en) Integrated Method for Enriching and Detecting Rare Cells from Biological Body Fluid Sample
US20030119077A1 (en) Method of enriching rare cells
AU2016228165A1 (en) Methods for obtaining single cells and applications of single cell omics
CN107449713B (zh) 依赖于混合抗体的循环肿瘤细胞分选和富集的方法
CN109563486A (zh) 用于在癌症护理中做出患者特定的治疗决策的诊断方法
CN109439732B (zh) 一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒
CN106970225B (zh) 一种应用cd45免疫荧光联合cep 8探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用
CN110628721A (zh) 一种循环肿瘤细胞的分离培养方法及试剂盒
AU2013298450B2 (en) Method for culturing a subpopulation of circulating epithelial tumour cells from a body fluid
Esparza-López et al. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy
Dimatteo et al. IL-2 secretion-based sorting of single T cells using high-throughput microfluidic on-cell cytokine capture
CN106980018A (zh) 一种应用cd45免疫荧光联合cep17探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用
CN106970224A (zh) 一种应用cd45免疫荧光联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用
CN110174519B (zh) 一种基于固相凝集技术的汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒及制备方法
CN111351937A (zh) 一种mmr蛋白表达缺失检测试剂盒及其检测方法
CN114487415A (zh) 肿瘤细胞pd-l1pd-l2免疫荧光+fish检测试剂盒
CN111141906A (zh) 一种小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞及pd-l1的检测试剂盒
CN108486039B (zh) 小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法
CN112920999B (zh) 一种体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的方法
CN106676074B (zh) 一种体外扩增肝癌干细胞的方法
TWI790399B (zh) 循環腫瘤細胞資訊評估方法及其分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200811

Address after: 048400 Taiwan Industrial Park, Gaoping economic and Technological Development Zone, Hexi Town, Gaoping City, Jincheng City, Shanxi Province

Applicant after: Shanxi Jiale Medical Technology Co.,Ltd.

Address before: Room 1105-11, floor 11, block B, phase I, Guangdong biomedical industry base, Xianxi section, national highway 321, Shishan town, Nanhai District, Foshan City, Guangdong Province (application for residence)

Applicant before: Foshan Pudi Medical Technology Co.,Ltd.

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20191231