CN209555255U - 一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒,涉及诊断试剂技术领域。试剂盒中血样采集模块包括采血管及采血管插孔;细胞检测模块包括样本密度分离液、第一缓冲液、第一清洗液、抗原修复缓冲液、组织固定液、样本稀释液、第二缓冲液、血细胞分析用稀释液、FISH探针、第二清洗液、荧光标记抗体,荧光标记抗体为荧光标记抗人白细胞表面标示物抗体CD31、CD45、CD54;核酸检测模块包括寡核苷酸双荧光标记Taqman探针、特异性引物、荧光定量qPCR反应体系试剂;蛋白检测模块包括96孔反应板、第三缓冲液、标记混合抗体溶液、微球悬液、微球溶液、终止液、采血管、载玻片。该试剂盒可检测肿瘤细胞类型丰富,检测精度高,癌前病变阶段即可检出游离癌性成分。
Description
技术领域
本实用新型涉及诊断试剂技术领域,特别涉及一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的重要疾病之一。据世界卫生组织癌症研究机构(IARC)数据显示:2012年全球恶性肿瘤新发病例超过1400万,死于恶性肿瘤人数约800万。国家癌症中心统计资料显示,在中国,每年新发癌症病例达429万,占全球新发病例的22%,死亡率占全球死亡率的27%。在中国,80%的癌症在被初次诊断时,便已进入癌症晚期,因而失去了最佳治疗时机。
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是肿瘤转移复发的关键,肿 瘤细胞由原发灶脱落,侵入血循环,成为CTCs,逃避机体免疫,在远处器官或原发脏器定居,形成转移复发病灶。研究发现,检测CTCs 数量有助于早期发现癌症,有助于判断癌症患者的预后,评估癌症患者的化疗效果;当CTCs出现上皮间质转换(epithelial-mesenchymaltransition, EMT)、过表达上皮细胞粘附分子(epithelial cellular adhesionmolecule, EpCAM)时,往往提示肿瘤患者预后不佳,因此检测CTCs被形象地称为“液体活检”,具有重要的临床研究及应用价值。
WT1基因在大多数急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴性白血病(ALL)中高度表达。这使得WT1 mRNA成为白血病胚细胞的肿瘤标志物,并可通过定量WT1 mRNA(WT1检测)检测10万个正常外周血单个核细胞(PBMC)中的一个白血病细胞。在慢性骨髓性白血病(CML)和骨髓增生异常综合征(MDS)中,WT1 mRNA表达水平随疾病进展而增加。WT1检测目前被认为是通过检测白血病的最小残留病(MRD)来控制急性白血病和MDS的重要检测。WT1基因在几乎所有类型的实体瘤中均高水平表达,其表达水平作为显着的预后因子。
目前全世界的肿瘤早筛技术都处在起步阶段,肿瘤早筛的手段非常有限。目前最新的恶性肿瘤早期检测方法有多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统(C12芯片)、肿瘤基因突变检测试剂盒、六项肿瘤标志物测定试剂盒、人恶性肿瘤特异性生长因子(TSGF)酶联免疫(ELISA)分析试剂盒。但是,多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统(C12芯片)的检测假阳性较高,检测效率低。肿瘤基因突变检测试剂依靠聚合酶链式反应(PCR)这样繁复的操作,容易产生假阳性,且只能用于易感性风险评估,而且目前很多试剂盒都不能检测白血病。
实用新型内容
针对现有技术存在的上述问题,本实用新型提供了一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒。
根据本实用新型实施例的一个方面,提供一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括血样采集模块、细胞检测模块、核酸检测模块、蛋白检测模块和至少一个试管插孔;
所述血样采集模块包括至少三个采血管及采血管插孔;
所述细胞检测模块包括样本密度分离液、第一缓冲液和第一清洗液、抗原修复缓冲液、组织固定液、样本稀释液、第二缓冲液、血细胞分析用稀释液、FISH探针、第二清洗液和荧光标记抗体,其中,所述荧光标记抗体为荧光标记的抗人白细胞表面标示物抗体CD31、CD45、CD54,所述FISH探针为可特异性地识别人体8号染色体的荧光标记探针;
所述核酸检测模块包括寡核苷酸双荧光标记Taqman探针、特异性引物和荧光定量qPCR反应体系试剂;
所述蛋白检测模块包括96孔反应板、第三缓冲液、标记混合抗体溶液、微球悬液、微球溶液、终止液以及带有抗凝剂的采血管、载玻片,其中,所述标记混合抗体溶液包括抗体AFP、CEA、NSE、SCC、CA199、CA125、CA153、CA125中的至少一种;
所述试管插孔设于所述血样采集模块、所述细胞检测模块、所述核酸检测模块、所述蛋白检测模块的周侧,用于插设测试用试管。
在一个优选的实施例中,所述核酸检测模块中所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的5'端为荧光报告基团,3'端为荧光淬灭基团,所述特异性引物包含7-10个外显子编码的锌指结构区域。
在一个优选的实施例中,所述核酸检测模块包括组合一、组合二、组合三示出的至少一组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物,其中:
在组合一中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-CCTTCAATGTGTGCTTACCCAGG-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GAGAGTCAGACTTGAAAGCACT-3';
在组合二中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-AAGCTAATGTGTGCTTACCCAGG-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-TTACTCTGAGACCAGTGAGAA-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GCATGTCAGACTTGAAAGTCTC-3';
在组合三中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-TTCAAGCTTACACTTACATCGCTTA-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-CCCATGCTACGGAGGCTAGCATTT-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GTACTAAGCGTTAGCATTACTGCATTA-3'。
在一个优选的实施例中,所述样本密度分离液包括硫酸铁、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅,在20℃下的比重为1.07125~1.08158克/毫升;所述第一缓冲液中含有抗白细胞抗体偶联的免疫磁珠,渗透压介于260~300mOsm/kgH2O,pH为6.8~7.8。
在一个优选的实施例中,所述细胞检测模块、所述核酸检测模块、所述蛋白检测模块所处的各个预设位置处分别对应预设数量的试管插孔。
在一个优选的实施例中,所述试剂盒检测外周血中的肿瘤细胞。
与现有技术相比,本实用新型提供的一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒具有以下优点:
本实用新型提供的一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒所用的CTC捕获技术方法简便,快捷,高效,适用于任何体积的血液、淋巴液、骨髓、胸水、腹水、尿液、脑脊液等;WT1-mRNA检测弥补了现有CTC无法检测白血病的缺点,最大限度地提高了癌症筛查方法的敏感性, 可以在癌前病变阶段即检出游离的癌性成分,使得肿瘤的防治获得了更加宽阔的干预空间;此外,本实用新型采用多组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物对细胞核酸进行检测,可避免出现单组Taqman探针和特异性引物在检测过程中基因互补进度未完全导致的检测结果精度较低的技术问题,从而从核酸层面实现对癌变细胞的精确检测;在免疫荧光染色区别血源性与非血源性细胞的基础上,对富集的非血源性肿瘤上皮细胞同步实施瘤标染色及 FISH 检测,以有效鉴别非血源性染色体数目异常且表达不同肿瘤表标志物的细胞,并识别、鉴定出具有不同临床意义的CTC亚类细胞,比如耐药、肿瘤转移与复发等。经大量临床验证。因此,本实用新型提供的用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒在癌症的潜在检测和确诊方面具有极高的精确性和准确性,且通过细胞层面、核酸层面以及蛋白层面的快速综合检测,可缩短同一细胞样本的检测间隔,避免细胞样本在放置和预处理过程中持续分裂导致的检测结果出现误差的问题。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分,示出了符合本实用新型的实施例,并于说明书一起用于解释本实用新型的原理。
图1是本实用新型一个实施例提供的一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒的模块示意图。
图2是本实用新型实施例提供的一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒的示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例(但不限于所举实施例)与附图详细描述本实用新型,本实施例的具体方法仅供说明本实用新型,本实用新型的范围不受实施例的限制,本实用新型在应用中可以作各种形态与结构的修改与变动,这些基于本实用新型基础上的等价形式同样处于本实用新型申请权利要求保护范围。
请参考图1,其示出了本实用新型一个实施例提供的一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒100的模块示意图,参见图1,该试剂盒100包括血样采集模块110、细胞检测模块120、核酸检测模块130、蛋白检测模块140和至少一个试管插孔150。
所述血样采集模块110包括至少三个采血管及采血管插孔。
所述细胞检测模块120包括样本密度分离液、第一缓冲液和第一清洗液、抗原修复缓冲液、组织固定液、样本稀释液、第二缓冲液、血细胞分析用稀释液、FISH探针、第二清洗液和荧光标记抗体,其中,所述荧光标记抗体为荧光标记的抗人白细胞表面标示物抗体CD31、CD45、CD54,所述FISH探针为可特异性地识别人体8号染色体的荧光标记探针。
所述核酸检测模块130包括寡核苷酸双荧光标记Taqman探针、特异性引物和荧光定量qPCR反应体系试剂。
所述蛋白检测模块140包括96孔反应板、第三缓冲液、标记混合抗体溶液、微球悬液、微球溶液、终止液以及带有抗凝剂的采血管、载玻片,其中,所述标记混合抗体溶液包括抗体AFP、CEA、NSE、SCC、CA199、CA125、CA153、CA125中的至少一种。
所述试管插孔150设于所述血样采集模块110、所述细胞检测模块120、所述核酸检测模块130、所述蛋白检测模块140的周侧,用于插设测试用试管。
本实用新型在细胞检测模块120综合使用了荧光标记抗体为荧光标记的抗人白细胞表面标示物抗体CD31、CD45、CD54共同进行瘤标,其中的CD54属于黏附分子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中的成员,是介导黏附反应重要的一个黏附分子。CD54在静息的血管内皮细胞上呈低水平表达,通过与血管内皮细胞表面上的特异性受体结合而发挥其生物学活性,作为白血球和内皮细胞跨膜的蛋白质,CD54在稳定细胞间相互作用和促进白血球和内皮细胞的迁移起到重要作用,因此,本实用新型实施例提供的试剂盒在细胞检测模块通过采用CD31、CD45、CD54共同进行瘤标,可在细胞层面对需要检测的血细胞样本进行鉴别,从而精准确定所述外周血样本所对应目标用户是否患有肿瘤。
需要说明的是,现有肿瘤细胞的检测方法在富集血细胞后,往往仅对同一份血细胞进行单一方面的检测,该种检测方法往往只能对血细胞提供者的患病情况做出患癌或者未患癌这样单一的检测结果,而无法确定血细胞提供着是否具备潜在患癌可能,本实用新型通过综合细胞的富集、细胞层面检测、核酸层面检测、蛋白层面的检测工序,可使得试剂盒对富集的同一份血细胞样本进行快速的多角度的检测,在实现对血细胞样本的精确检测同时,缩短了血细胞样本接受多角度检测的检测间隔,从而尽量避免血细胞样本在检测间隔中持续变异导致的各角度检测条件不一致,检测精度较低的技术问题,达到提高肿瘤细胞检测精度,丰富检测结果形式的技术效果。
在一个优选的实施例中,所述核酸检测模块130中所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的5'端为荧光报告基团,3'端为荧光淬灭基团,所述特异性引物包含7-10个外显子编码的锌指结构区域。
在一个优选的实施例中,所述核酸检测模块130包括组合一、组合二、组合三示出的至少一组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物,其中:
在组合一中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-CCTTCAATGTGTGCTTACCCAGG-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GAGAGTCAGACTTGAAAGCACT-3';
在组合二中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-AAGCTAATGTGTGCTTACCCAGG-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-TTACTCTGAGACCAGTGAGAA-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GCATGTCAGACTTGAAAGTCTC-3';
在组合三中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-TTCAAGCTTACACTTACATCGCTTA-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-CCCATGCTACGGAGGCTAGCATTT-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GTACTAAGCGTTAGCATTACTGCATTA-3'。
比如,本实用新型实施例提供的试剂盒可以采用组合一、组合二、组合三示出的任意一组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物的组合;或,采用组合一、组合二、组合三示出的任易二组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物的组合;或,采用组合一、组合二、组合三这三组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物的组合。
需要说明的是,本实用新型采用的寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物的基因序列组合不仅仅限于上述三组中任一示出的序列对,且,试剂盒采用的组合的数量也不仅仅限于三组,任何基于多组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物的基因序列组合的实用新型,均属于本实用新型所提供的技术启示。
本实用新型实施例提供的试剂盒采用多组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物对细胞核酸进行检测,可避免出现单组Taqman探针和特异性引物在检测过程中基因互补进度未完全导致的检测结果精度较低的技术问题,从而从核酸层面实现对癌变细胞的精确检测。
在一个优选的实施例中,所述样本密度分离液包括硫酸铁、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅,在20℃下的比重为1.07125~1.08158克/毫升;所述第一缓冲液中含有抗白细胞抗体偶联的免疫磁珠,渗透压介于260~300mOsm/kgH2O,pH为6.8~7.8。
在一个优选的实施例中,所述所述细胞检测模块120、所述核酸检测模块130、所述蛋白检测模块140所处的各个预设位置处分别对应预设数量的试管插孔150。
如图2所示,其示出了本实用新型实施例提供的一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒的示意图。
通过在试剂盒中所述细胞检测模块、所述核酸检测模块、所述蛋白检测模块所处的各个预设位置处分别对应设置试管插孔,可以使得各个检测模块待检或者准备的试剂排列于对应的模块区域,可加快检测人员的检测效率同时,防止检测人员拿错试剂,便于检测人员进行检测。
在一个优选的实施例中,所述试剂盒100检测外周血中的肿瘤细胞。
需要说明的是,本实用新型提供的试剂盒最少只需要采集18mL外周血即可完成肿瘤细胞的精确检测,所述肿瘤细胞包括循环的具有上皮来源的任何实体瘤细胞或不具有上皮来源的任何肿瘤细胞、白血病细胞。
本实用新型提供的一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒所用的CTC捕获技术方法简便,快捷,高效,适用于任何体积的血液、淋巴液、骨髓、胸水、腹水、尿液、脑脊液等;WT1-mRNA检测弥补了现有CTC无法检测白血病的缺点,最大限度地提高了癌症筛查方法的敏感性,可以在癌前病变阶段即检出游离的癌性成分,使得肿瘤的防治获得了更加宽阔的干预空间;此外,本实用新型采用多组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物对细胞核酸进行检测,可避免出现单组Taqman探针和特异性引物在检测过程中基因互补进度未完全导致的检测结果精度较低的技术问题,从而从核酸层面实现对癌变细胞的精确检测;在免疫荧光染色区别血源性与非血源性细胞的基础上,对富集的非血源性肿瘤上皮细胞同步实施瘤标染色及 FISH 检测,以有效鉴别非血源性染色体数目异常且表达不同肿瘤表标志物的细胞,并识别、鉴定出具有不同临床意义的CTC亚类细胞,比如耐药、肿瘤转移与复发等。经大量临床验证。因此,本实用新型提供的用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒在癌症的潜在检测和确诊方面具有极高的精确性和准确性,且通过细胞层面、核酸层面以及蛋白层面的快速综合检测,可缩短同一细胞样本的检测间隔,避免细胞样本在放置和预处理过程中持续分裂导致的检测结果出现误差的问题。
为了更好地说明本实用新型实施例提供的用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒100,还示出了上述试剂盒100对应的使用方法,该使用方法包括:
(1)外周血样本的采集:使用采血管从目标用户采集至少三管外周血样本并进行混匀和离心处理。
(2)非血缘性有核稀有细胞的富集:将采集的外周血样本离心后弃上清加入第一清洗液,混匀后加入样本密度分离液中,离心后收集上层去除了红细胞的外周血样本细胞,再向其中加入第一缓冲液,摇动后置于磁力架上吸取并收集正中央未被吸附的液体,向其中加入第一清洗液后离心弃上清至100ul,得到非血缘性有核稀有细胞的富集细胞沉淀。
(3)非血缘性有核稀有细胞的鉴别:抗人白细胞抗体免疫荧光染色以及染色体荧光原位杂交,向所述富集细胞沉淀中加入荧光标记抗体,该荧光标记抗体为荧光标记的抗人白细胞表面标示物抗体CD31、CD45、CD54,孵育预设时长后,洗涤除去未结合的所述荧光标记的抗人白细胞表面标示物抗体,固定干燥后制成染色体荧光原位杂交样本,加入免疫显色试剂 FISH探针,封片进行杂交后置于荧光显微镜下进行细胞图像的拍摄存储,根据细胞图像对非血缘性有核稀有细胞进行鉴别,从而确定所述外周血样本所对应目标用户是否患有肿瘤。
(4)WT1-mRNA的检测:提取所外周血中单个核细胞的总 RNA,并反转录为 cDNA,使用 AB7500 型荧光定量 PCR 仪和 TaqMan 探针法定量检测标本中目的基因和内参基因ABL 的拷贝数,根据ABL 的拷贝数确定所述外周血样本所对应目标用户是否具有潜在白血病风险,其中,TaqMan 探针法所使用的寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物的基因序列组合包括组合一、组合二、组合三示出的至少一组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物。
各组合中寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物的基因序列组合如下所示:
在组合一中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-CCTTCAATGTGTGCTTACCCAGG-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GAGAGTCAGACTTGAAAGCACT-3';
在组合二中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-AAGCTAATGTGTGCTTACCCAGG-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-TTACTCTGAGACCAGTGAGAA-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GCATGTCAGACTTGAAAGTCTC-3';
在组合三中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-TTCAAGCTTACACTTACATCGCTTA-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-CCCATGCTACGGAGGCTAGCATTT-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GTACTAAGCGTTAGCATTACTGCATTA-3'。
(5)糖类抗原的检测:采用双抗体夹心免疫检测法,藻红蛋白PE标记的检测抗体混合液,与所述外周血样本血清中的肿瘤抗原反应后,加入分别交联有抗预设种类肿瘤抗原捕获单克隆抗体的荧光编码微球的混悬液,最终形成了微球-捕获抗体-检测抗体-PE复合物,在Luminex多功能流式点阵仪上进行检测,根据检测数据计算得到各个肿瘤标志物的浓度数值,再根据该各个肿瘤标志物的浓度数值确定所述外周血样本所对应目标用户是否具有潜在肿瘤风险,所述糖类抗原的检测包括对抗原AFP、CEA、NSE、SCC、CA199、CA125、CA153、CA125中至少一种的检测。
需要说明的是,具体的,该用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒的使用方法的操作步骤如下所示:
1.准备工作
步骤101,使用至少三个采血管分别从静脉采集6.0ml外周血样本,采集完毕后将采血管上下颠倒混匀;对于每个采血管,将采集有外周血样本的采血管在室温下离心处理15分钟后,弃除管内外周血样本上清至棕红色沉淀上方5毫米处后,插入血样采集模块的采血管插孔进行备用。
步骤102,将110ml第一清洗液清洗液、3ml样本密度分离液置入27℃的水浴锅预热混匀。
步骤103,向2ml离心管加入适量第一缓冲液, 静置20秒后吸弃上清液,然后加入1ml第一清洗液进行洗涤,混匀并静置20秒后,再次吸弃第一缓冲液的上清,向2ml离心管继续加入适量第一缓冲液至原体积。
步骤104,配制第二缓冲液:将全部第二缓冲液精确定量后,用去离子水稀释10倍。
步骤105,准备2个染色缸,分别标记为缸A和缸B,按下列顺序向每缸中加入40ml相应液体:
1)缸A:第二缓冲液,使用前于恒温水浴锅中预热至37℃;
2)缸B:无水乙醇,室温保存。
步骤106,每次检测前取出16m第一清洗液,按每个检测标本80μl的份量对样本稀释液进行分装,并于恒温水浴锅中预热至37℃后备用,按每个检测标本80μl的份量对血细胞分析用稀释液进行分装、按每个检测标本600μl的份量对第二清洗液进行分装,并对上述各个液体预热至27℃后备用。
步骤107,室温融化-20℃保存的免疫显色试剂FISH探针后,将FISH探针的针管于振荡器上头尾振荡后进行高速离心处理5秒钟,再次头尾振荡并离心。
2.细胞层面的检测
步骤201,从血样采集模块的采血管插孔取出采集有外周血样本的采血管,向该采血管加入第一清洗液至预设位置处后,密封上下颠倒进行混匀,然后置入细胞检测模块对应的试管插孔进行待测。
步骤202,向50ml的离心管a中加入3ml样本密度分离液,将采血管中的血细胞沿离心管a的管壁液面处缓慢加至样本密度分离液顶层,然后将离心管a内的混合液在室温下离心处理6分钟。
需要说明的是,离心处理后的离心管a内混合液分为三层液体,其中,上层液体呈黄色,中间层液体呈透明或淡红色,底层为深棕红色沉积红细胞。
步骤203,将离心管a中上层和中层液体转移至50ml的离心管b中,并将离心管b中的混合液混匀。
步骤204,按每管300μl的份量将第一缓冲液缓慢加入离心管b中,然后将离心管b倾斜固定于摇床上,按125rpm的转速室温摇动20分钟,其中,液面摇晃的最高处于刻度30-35ml之间。
步骤205,将离心管b固定于磁力架上静置2分钟,然后使用5ml枪头伸入沿离心管b正中央,吸取待测细胞液并转移至50ml的离心管c中。
步骤206,向离心管c中加入第一清洗液至45ml,配平后将离心管c中的混合液颠倒混匀,并于室温下离心处理5分钟后,弃上清至100μl,于旋涡混合仪轻柔震荡混匀细胞,加入第一清洗液至45ml,混匀后得到非血缘性有核稀有细胞的富集细胞沉淀,将在室温下离心处理5分钟后待测。
步骤207,向离心管c中的非血缘性有核稀有细胞的富集细胞沉淀加入2µl抗原修复缓冲液,使用振荡混合仪轻柔振荡混匀沉淀细胞,然后在室温下静置10分钟。
步骤208,将 200μl血细胞分析用稀释液、1μl血细胞分析用染色液(CD45)、1μl血细胞分析用染色液(CD31)、1μl血细胞分析用染色液(CD54)进行混合配制得到血细胞分析用染色液混合液,将血细胞分析用染色液混合液使用加样器轻柔吹打10次以充分混匀抗体,然后将配制后的血细胞分析用染色液混合液室温避光放置。
步骤209,在遮光的条件下,向离心管c中加入200μl上述血细胞分析用染色液混合液,使用振荡混合仪轻柔振荡混匀沉淀细胞,室温避光孵育20分钟。
步骤210,向50ml离心管c中加入5ml第一清洗液,使用5ml移液枪轻柔吹打混匀后转移至新的15ml离心管中,加入第一清洗液至14ml,配平后颠倒混匀,在室温下离心处理5分钟后,弃上清至100µl。
步骤211,将该离心管c中的混合液体轻轻吹打混匀后加入100μl组织固定液,并使用保留的加样器枪头轻柔吹打混匀,然后将该离心管c中的混合液体分别涂于载玻片标本框内,干燥后得到待测标本。
步骤212,将待测标本放置于30-32℃干燥箱进行干燥通风10-12h后关闭干燥箱温度,然后将待测标本继续静置于干燥箱中30分钟凉至室温,立即进行后续检测。
步骤213,进行染色体荧光原位杂交,步骤如下:
(a)取20μl组织固定液以及180μl样本稀释液混合配制得到混合液,沿待测标本的标本框内侧边角轻柔滴加200μl混合液覆盖标本框,然后在室温下避光静置10分钟,吸弃待测标本多余的混合液;
(b)沿待测标本的标本框内侧边角轻柔滴加200μl第二缓冲液后,立即吸弃多余第二缓冲液,共重复2次。
(c)沿待测标本的标本框内侧边角轻柔滴加200μl无水乙醇后,立即吸弃多余无水乙醇,共重复2次。
(d)将待测标本插入缸B(无水乙醇)静置2分钟,然后取出待测标本,竖立在滤纸上吸干残留液,并使用微型吹风机将待测标本轻柔吹至完全干燥后,取出分装好的免疫显色试剂FISH探针(CEP8探针),于待测标本的标本框中央滴加10μl探针后,立即使用镊子将盖玻片平放在探针液上,使液体向四周蔓延至整个标本框;剪去1ml加样器尖头,使用封片胶封住盖玻片四边边缘后,直接放入杂交仪进行杂交,杂交工序的参数包括:变性76℃,10分钟;杂交温度为37℃,杂交时长为3小时。
(e)杂交完毕后取出待测标本,使用镊子撕去待测标本的封片胶,将待测标本置于预热至37℃的缸A(第二缓冲液)中,静置1分钟后轻柔晃动缸A,直至盖玻片脱落。
(f)盖玻片脱落后,将待测标本继续在缸A中静置5分钟后晃动5秒取出,使用滤纸吸干残留液,并擦干标本框外围液体,沿标本框内侧边角轻柔滴加200μl第二清洗液后,立即吸弃溶液,共重复2次,沿标本框内侧边角轻柔滴加200μl第二清洗液,室温静置2分钟,吸弃溶液,使用吹风机将玻片标本框吹干。
(g)将血细胞分析用染色液DAPI分装管瞬时高速离心,取10μl血细胞分析用染色液DAPI滴加于待测标本的标本框中央,置放盖玻片后,用真空泵吸头或滤纸挤压并吸干溢出的多余液体,封干待测标本,不可出现气泡。
(h)在荧光显微镜下对待测标本进行检测,并储存待测标本的细胞图片,根据细胞图像对非血缘性有核稀有细胞进行鉴别,从而确定待测标本所对应目标用户是否患有肿瘤。
3.核酸层面的检测:
对富集细胞沉淀进行WT-mRNA检测,检测步骤包括:
步骤301,从血样采集模块的采血管插孔取出采集有外周血样本的采血管,然后置入核酸检测模块对应的试管插孔进行待测。
步骤302,分离出该采血管外周血样本富集细胞沉淀中的单个非血缘性有核稀有细胞,提取非血缘性有核稀有细胞的单个核细胞总RNA,并反转录为cDNA。
步骤303,使用AB7500型荧光定量PCR仪和TaqMan探针法定量检测非血缘性有核稀有细胞中目的基因和内参基因ABL的拷贝数,得到定量检测结果。
需要说明的是,上述检测步骤中定量检测结果用目的基因和内参基因拷贝数的比值(百分比)表示,对目的基因和内参基因ABL的灵敏度为5拷贝/反应体系。
在本实施例中,若检测出ABL拷贝数大于10E+04, 则确定该外周血样本对应的目标用户具有潜在白血病风险。
其中,TaqMan 探针法所使用的寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物的基因序列组合包括组合一、组合二、组合三示出的至少一组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物。各组合中寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物的基因序列组合如下所示:
在组合一中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-CCTTCAATGTGTGCTTACCCAGG-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GAGAGTCAGACTTGAAAGCACT-3';
在组合二中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-AAGCTAATGTGTGCTTACCCAGG-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-TTACTCTGAGACCAGTGAGAA-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GCATGTCAGACTTGAAAGTCTC-3';
在组合三中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-TTCAAGCTTACACTTACATCGCTTA-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-CCCATGCTACGGAGGCTAGCATTT-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GTACTAAGCGTTAGCATTACTGCATTA-3'。
优选的,使用组合二和组合三共同作为核酸检测模块中的寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物的基因序列组合。
4.蛋白质层面的检测:
蛋白质层面的检测步骤包括:
步骤401,从血样采集模块的采血管插孔取出采集有外周血样本的采血管,然后置入蛋白检测模块对应的试管插孔进行待测。
步骤402,将蛋白检测模块中的各试剂置于室温平衡30min,加样前充分混匀各试剂。
步骤403,用纯化水按标示量复溶校准品,静置2分钟待其充分混匀后备用。
步骤404,将微球溶液用微球混悬液按使用量稀释10倍。
步骤405,从血样采集模块的采血管插孔取出采集有外周血样本的采血管,分别在96孔反应板上依次加入第三缓冲液(25ul/孔),采血管中外周血样本(10ul/孔),标记抗体混合液(25ul/孔),加盖封板纸,于振荡器上充分混匀,置37℃恒温箱避光反应5min,其中,标记混合抗体溶液包括抗体AFP、CEA、NSE、SCC、CA199、CA125、CA153、CA125中的至少一种。
步骤406,反应结束后,向96孔反应板中的混合液体加入终止液(100ul/孔)后进行混匀;
步骤407,在Luminex多功能流式点阵仪上读数,最后导入结果计算可得出外周血样本中相应肿瘤标志物的浓度。
需要说明的是,CTC的识别标准为:
1.非血源性CTC判断标准:DAPI+/CD45-/CD31-/CD54+或-/CEP8+(单体、或多体)
CD45:染色阴性,有时红色通道下整个细胞有时可见淡红色。与白细胞最明显的区别是没围绕细胞核的鲜明红色光环
CEP8:单体或多体。信号在红色或橙色通道下均很清晰
CD31:绿色信号阴性。因CD31与血小板结合,因此绿光下有成簇点状染色,背景高低因人而异
CD54:粉色信号阳性或阴性。因激发光肉眼不可见,需借助ZeissMetafer-iFISH全自动CTC扫描和图像分析系统。
DAPI:蓝色,圆或椭圆形
2.循环血管内皮细胞(CEC)判断标准:DAPI+/CD45-/CD31+/CD54+或-/CEP8。
CD45:染色阴性,有时红色通道下整个细胞有时可见淡红色。与白细胞最明显的区别是没围绕细胞核的鲜明红色光环。
CEP8:各种数目染色体均有。信号在红色或橙色通道下均很清晰。
CD31:绿色信号阳性。因CD31表达量不同,信号明暗不一。CD31与血小板结合,因此绿光下有成簇点状染色,背景高低因人而异。
CD54:粉色信号阴性,少数呈阳性。因激发光肉眼不可见,需借助ZeissMetafer-iFISH全自动CTC扫描和图像分析系统。
3.血源性白细胞(WBC)判断标准:DAPI+/CD45+/CD31+或-/CD54+或-/CEP8+(大多数二倍体)。
CD45:染色阳性,红色通道下可见明显的围绕蓝色细胞核的红色光环CEP8:绝大多数染色体二倍体。信号在红色或橙色通道下均很清晰。
CD31:绿色信号阴性,少数呈阳性。
CD54:粉色信号阳性或阴性。因激发光肉眼不可见,需借助ZeissMetafer-iFISH全自动CTC扫描和图像分析系统。
DAPI:蓝色,圆或椭圆形。
虽然,前文已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本实用新型做了详尽的描述,但在本实用新型基础上,可以对之进行修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本实用新型精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本实用新型要求保护的范围。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里的实用新型的后,将容易想到本实用新型的其它实施方案。本实用新型旨在涵盖本实用新型的任何变型、用途或者适应性变化,这些变型、用途或者适应性变化遵循本实用新型的一般性原理并包括本实用新型未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。应当理解的是,本实用新型并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构,并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。
Claims (5)
1.一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括血样采集模块、细胞检测模块、核酸检测模块、蛋白检测模块和至少一个试管插孔;
所述血样采集模块包括至少三个采血管及采血管插孔;
所述细胞检测模块包括样本密度分离液、第一缓冲液和第一清洗液、抗原修复缓冲液、组织固定液、样本稀释液、第二缓冲液、血细胞分析用稀释液、FISH探针、第二清洗液和荧光标记抗体,其中,所述荧光标记抗体为荧光标记的抗人白细胞表面标示物抗体CD31、CD45、CD54,所述FISH探针为可特异性地识别人体8号染色体的荧光标记探针;
所述核酸检测模块包括寡核苷酸双荧光标记Taqman探针、特异性引物和荧光定量qPCR反应体系试剂;
所述蛋白检测模块包括96孔反应板、第三缓冲液、标记混合抗体溶液、微球悬液、微球溶液、终止液以及带有抗凝剂的采血管、载玻片,其中,所述标记混合抗体溶液包括抗体AFP、CEA、NSE、SCC、CA199、CA125、CA153、CA125中的至少一种;
所述试管插孔设于所述血样采集模块、所述细胞检测模块、所述核酸检测模块、所述蛋白检测模块的周侧,用于插设测试用试管。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸检测模块中所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的5'端为荧光报告基团,3'端为荧光淬灭基团,所述特异性引物包含7-10个外显子编码的锌指结构区域。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸检测模块包括组合一、组合二、组合三示出的至少一组寡核苷酸双荧光标记Taqman探针和特异性引物,其中:
在组合一中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-CCTTCAATGTGTGCTTACCCAGG-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GAGAGTCAGACTTGAAAGCACT-3';
在组合二中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-AAGCTAATGTGTGCTTACCCAGG-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-TTACTCTGAGACCAGTGAGAA-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GCATGTCAGACTTGAAAGTCTC-3';
在组合三中,所述寡核苷酸双荧光标记Taqman探针的探针序列为5'-TTCAAGCTTACACTTACATCGCTTA-3',所述特异性引物的上游引物碱基序列为5'-CCCATGCTACGGAGGCTAGCATTT-3',所述特异性引物的下游引物碱基序列为5'-GTACTAAGCGTTAGCATTACTGCATTA-3'。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述细胞检测模块、所述核酸检测模块、所述蛋白检测模块所处的各个预设位置处分别对应预设数量的试管插孔。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒检测外周血中的肿瘤细胞。
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WO2021213304A1 (zh) * | 2020-04-21 | 2021-10-28 | 山东第一医科大学(山东省医学科学院) | 一种检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞nse基因突变的试剂盒及检测方法 |
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