CN205861692U - 宫颈癌高危hpv特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片产品和试剂盒 - Google Patents
宫颈癌高危hpv特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片产品和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本实用新型提供了一种宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片产品和试剂盒。具体地，本实用新型质控片产品包括：(i)用于免疫细胞化学染色阳性细胞的第一质控片，所述第一质控片包括第一载玻片，以及位于所述第一载玻片的一个主表面上的阳性细胞粘附区；和(ii)用于免疫细胞化学染色阴性细胞的第二质控片，所述第二质控片包括第二载玻片，以及位于所述第二载玻片的一个主表面上的阴性细胞粘附区。本实用新型的质控片产品操作简单、来源充足、能够检测免疫细胞化学染色试剂质量。
Description
技术领域
本实用新型属于生物医疗技术领域，特别涉及宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片产品和试剂盒。
背景技术
子宫颈癌是我国第二大女性恶性肿瘤，也是唯一病因明确的肿瘤。大量研究证明，高危型人乳头瘤病毒(human papi lloma virus，HPV)是导致宫颈癌的元凶，99％以上的宫颈癌样本中都可检出高危HPV DNA。宫颈病变进展为宫颈癌是高危HPV持续感染的结果，大约需要10年左右的时间，病变过程包括高危HPV持续感染、宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithel ium neoplasia,CIN)、原位癌、浸润癌。子宫颈癌中鳞状细胞癌(squamouscells carcinoma,SCC)占95％，临床治愈率I期可达80-90％，II期60-70％，III期40-50％，IV期仅为10％，因此子宫颈癌前病变包括宫颈上皮内瘤变(CIN)的早期诊断和防治，对控制子宫颈癌的发生、发展和预后具有重要意义。
中华人民共和国卫生部2011年7月发布《子宫颈癌诊断》中指出诊断应采用“三阶梯”程序，即：宫颈脱落细胞检测、阴道镜检查、病理诊断。细胞学检测为“三阶梯”第一步，鉴于细胞形态学检测敏感度低、重复性差、技术人员缺乏等问题，已经由罗氏推出以细胞质蛋白p16作为生物标志物对宫颈脱落细胞进行免疫细胞化学染色。由于80％以上的宫颈癌都是由HPV16和HPV18引起的，因此，对高危HPV蛋白的免疫细胞化学染色检测并将成为宫颈癌检测领域的新热点。但是，目前宫颈癌检测受到涉及宫颈脱落细胞样本量有限、质控样本制备不可重复以及样本保存周期短等的限制。
因此，本领域急需一种操作简单、来源充足、能够检测免疫细胞化学染色试剂质量，针对高危HPV(尤其是HPV16/18)特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片产品。
实用新型内容
本实用新型的目的就是提供一种操作简单、来源充足、能够检测免疫细胞化学染色试剂质量，针对高危HPV(尤其是HPV16/18)特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片。
在本实用新型第一方面，提供了一种宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片产品，所述质控片产品包括：
(i)用于免疫细胞化学染色阳性细胞的第一质控片，所述第一质控片包括第一载玻片，以及位于所述第一载玻片的一个主表面上的阳性细胞粘附区；以及
(ii)用于免疫细胞化学染色阴性细胞的第二质控片，所述第二质控片包括第二载玻片，以及位于所述第二载玻片的一个主表面上的阴性细胞粘附区。
在另一优选例中，所述第一载玻片的一个主表面包括第一磨砂区和第一光滑玻璃区,并且所述阳性细胞粘附区位于所述第一光滑玻璃区上。
在另一优选例中，所述第二载玻片的一个主表面包括第二磨砂区和第二光滑玻璃区，并且所述阴性细胞粘附区位于所述第二光滑玻璃区上。
在另一优选例中，所述第一磨砂区和所述第二磨砂区设有不同颜色。
在另一优选例中，所述第一磨砂区设为白色，所述第二磨砂区设为蓝色。
在另一优选例中，所述第一光滑玻璃区和第二光滑玻璃区经过防脱处理，便于细胞粘附。
在另一优选例中，所述阳性细胞粘附区设有HPV16蛋白阳性肿瘤细胞涂层和/或HPV18蛋白阳性肿瘤细胞涂层。
在另一优选例中，所述阴性细胞粘附区设有不含HPV蛋白阴性肿瘤细胞的涂层或正常细胞涂层。
在另一优选例中，所述HPV16蛋白阳性肿瘤细胞为1种或2种或多种HPV16蛋白阳性肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述HPV18蛋白阳性肿瘤细胞为1种或2种或多种HPV18蛋白阳性肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述HPV16和/或所述HPV18蛋白阳性肿瘤细胞为1种或2种或多种HPV 16和/或HPV18蛋白阳性肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述HPV蛋白阴性肿瘤细胞为1种或2种或多种高危HPV蛋白阴性肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述阳性肿瘤细胞涂层和阴性肿瘤细胞涂层均可采用醛类细胞固定液进行预先固定处理。
在另一优选里中，采用例如，甲醛、戊二醛等醛类细胞固定液进行预先固定处理。
在另一优选里中，所述阳性肿瘤细胞涂层的面积Sp和所述阴性肿瘤细胞涂层的面积Sn均为1～4cm2。
较佳地，所述阳性肿瘤细胞涂层的面积Sp和所述阴性肿瘤细胞涂层的面积Sn均为2～3.5cm2。
在另一优选例中，所述阳性肿瘤细胞涂层和所述阴性肿瘤细胞涂层均为圆形。
在另一优选例中，所述HPV16和/或所述HPV18蛋白阳性肿瘤细胞和HPV蛋白阴性肿瘤细胞为1种或2种或多种细胞株。
在本实用新型的第二方面，提供了一种用于免疫细胞化学染色检测宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物质控片产品的试剂盒，所述试剂盒包含：
一容器；
至少包括两个位于所述容器内的载玻片卡位；以及
位于所述容器中并且在所述载玻片卡位内的本实用新型的第一方面所述宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片。
应理解，在本实用新型范围内中，本实用新型的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相产品，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本实用新型一实施例的质控片的结构示意图。其中，各标识如下：
1、盒体；
2、HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色阳性细胞质控片；
3、HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色阴性细胞质控片；
4、阳性细胞质控片的载玻片磨砂区；
5、阴性细胞质控片的载玻片磨砂区；
6、阳性细胞质控片的载玻片光滑玻璃区；
7、阴性细胞质控片的载玻片光滑玻璃区；
8、阳性细胞质控片的载玻片卡位；
9、阴性细胞质控片的载玻片卡位；
10、阳性细胞粘附区；
11、阴性细胞粘附区。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种用于高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色的质控片。该质控片与实际进行免疫细胞化学检测中染色后的免疫细胞样本具有高度的一致性，故可作为用作细胞样本免疫染色诊断过程的质控对照，提高检测准确性。在此基础上完成了本实用新型。
质控片
本实用新型提供了一种典型的用于宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色的质控片产品。
在优选例中，本实用新型的质控片产品包括第一质控片和第二质控片，其中第一质控片用于HPV16和/或HPV18阳性肿瘤细胞的检测。
在本实用新型中，一种典型的用于HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色的第一质控片包含：
第一载玻片，以及位于第一载玻片的一个主表面上的阳性细胞粘附区；
其中，阳性细胞粘附区设有HPV16蛋白阳性肿瘤细胞涂层和/或HPV18蛋白阳性肿瘤细胞涂层。
优选地，所述阳性细胞粘附区的各细胞涂层是用固定液进行固定的。
在本实用新型的另一实施例中，一种典型的用于宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片产品的第二质控片包含：
第二载玻片，以及位于所述第二载玻片的一个主表面上的阴性细胞粘附区；
其中，所述阴性细胞粘附区设有不含HPV蛋白阴性肿瘤细胞涂层或正常细胞涂层。
优选地，所述阴性细胞粘附区的各细胞涂层是用固定液进行固定的。
在本实用新型中，适用的载玻片没有特别限制，代表性例子包括(但并不限于)：玻璃片、塑料片；优选的光滑玻璃片。
在另一优选例中，所述的载玻片表面一侧或两侧具有磨砂区。
在另一优选例中，所述的载玻片的阳性细胞粘附区和阴性细胞粘附区为光滑的和透明的。
在另一优选例中，第一质控片和第二质控片均设有位于载玻片的磨砂区，并且在所述磨砂区设有不同的多种颜色，用以区别两种质控片。
在另一优选例中，在所述的HPV16蛋白阳性肿瘤细胞涂层中，包括针对1种或2种或多种HPV16蛋白阳性肿瘤细胞的涂层。
在另一优选例中，在所述的HPV18蛋白阳性肿瘤细胞涂层中，包括针对1种或2种或多种HPV18蛋白阳性肿瘤细胞的涂层。
在另一优选例中，所述HPV蛋白阴性细胞为1种或2种或多种HPV蛋白阴性细胞。
在另一优选例中，本实用新型的高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色诊断宫颈癌的质控片，包括：两个载玻片，载玻片表面具有肿瘤细胞涂层；载玻片为光滑玻璃片或一边具有磨砂，磨砂区为多种颜色用以区别两种质控片。本实用新型的质控片解决现存宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色诊断过程中无质控对照或质控对照样本缺乏的问题。
试剂盒
另一方面，本实用新型还提供了免疫细胞化学染色检测宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物质控片产品的试剂盒，该试剂盒包含一个容器、一个或多个(如两个)载玻片卡位以及位于容器中的上述宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括使用说明书。
检测方法
典型地，使用本实用新型的免疫细胞化学染色质控片进行检测时，根据检测HPV型别(HPV16和/或HPV18)，选择相应的质控片，配合免疫细胞化学染色试剂盒进行检测。用于宫颈脱落细胞检测的免疫细胞化学染色试剂盒由以下几部分组成：1)试剂1：封闭液；2)试剂2：一抗；3)试剂3：酶联二抗；4)试剂4：DAB显色系统包括DAB缓冲液和DAB色原；5)试剂5：浓缩洗涤液(20x)。
具体实施过程如下：
1.试剂配制：将浓缩的洗涤液(20x)采用纯化水稀释成为1x洗涤液工作液。
2.水化：将检测样本和质控片一起放入50％的乙醇中浸润10分钟；纯化水漂洗一次。
3.抗原修复：将检测样本和质控片置于95～99℃的抗原修复液中修复10分钟；取出置于室温冷却20分钟；1x洗涤液漂洗一次。
4.去除内源性过氧化物酶活性：样本和质控片各加入200μl 3％过氧化氢处理10分钟，1x洗涤液漂洗一次。
5.封闭：取出试剂盒中试剂1，每个载玻片上样本或细胞涂层处滴加4滴，室温孵育60分钟。
6.一抗孵育：取出试剂盒中试剂2，每个载玻片上样本或细胞涂层处滴加3滴，室温孵育60分钟，1x洗涤液漂洗三次。
7.二抗孵育：取出试剂盒中试剂3，每个载玻片上样本或细胞涂层处滴加3滴，室温孵育30分钟，1x洗涤液漂洗三次。
8.显色：取出试剂盒中的试剂盒4配制DAB显色液，每个载玻片上样本或细胞涂层处滴加4滴，室温处理3～6分钟；纯化水漂洗两次。
9.复染：苏木素复染1分钟，自来水冲洗干净后，在自来水中浸泡10分钟。
10.脱水、封片、镜检：在70％乙醇，95％乙醇，无水乙醇中依次浸泡3分钟，在二甲苯中浸泡5分钟，中性树胶封片，显微镜下观察结果。
染色结果解释：当质控片中HPV蛋白阳性细胞胞质呈现棕色，核为蓝紫色，HPV蛋白阴性细胞呈现蓝紫色时，实验结果有效，否则实验无效。
本实用新型的主要优点包括：
(a)为宫颈癌HPV16/18特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色检测提供一种质控片，且质控片来源稳定，供给充足，解决目前宫颈脱落细胞免疫细胞化学染色无质控片的问题。
(b)通过制备好的不同质控片与检验样本同时进行免疫细胞化学染色，可以检测出HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学试剂是否有效。
(c)通过制备好的质控片与检测样本同时进行免疫细胞化学染色，能够对操作步骤进行监督和检验，提高了免疫细胞化学染色的工作效率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料
实施例中细胞株均为市售的细胞株：
宫颈癌肿瘤细胞模型Ca Ski(人宫颈癌细胞，含有完整的HPV16[每个细胞大约600个拷贝]。Number:CRL-1550TM)为HPV16蛋白阳性肿瘤细胞、
C-33A细胞(人宫颈癌细胞，HPV DNA、RNA阴性。Number:HTB-31TM)为HPV阴性肿瘤细胞；
Hela细胞(含有完整的HPV18序列，Number:CCL-2TM)为HPV18蛋白阳性肿瘤细胞。
实施例1
质控片
1、细胞收集与固定
分别收集处于对数生长期的CaSki细胞和C-33A细胞，采用PBS漂洗一遍，离心后置于10％中性福尔马林中至少固定20分钟以上，备用。
2、细胞涂布
将固定过的细胞计数，调整细胞数目为1x107/ml，采用移液器分别取5μl CaSki涂布于阳性质控片上(白色载玻片)，或者取5μl C-33A涂布于阴性性质控片上(蓝色载玻片)，细胞涂布的直径约为0.5～2.0cm之间。
3、风干、存储
将涂有细胞涂层的载玻片置于通风橱中，风干过夜，将制备好的质控片置于塑料盒中，密封，备用。
实施例2
试剂盒
如图1所示，盒体1内包含两个载玻片卡位8和9，分别用于容纳图1所示的第一质控片2的载玻片和第二质控片3的载玻片。第一质控片2包含阳性细胞质控片的载玻片磨砂区4和阳性细胞质控片的载玻片光滑玻璃区6，阳性细胞粘附在阳性细胞粘附区10。第二质控片3包含阳性细胞质控片的载玻片磨砂区5和阳性细胞质控片的载玻片光滑玻璃区7，阳性细胞粘附在阳性细胞粘附区11。
实施例3
检测应用
A.提供一用于宫颈脱落细胞检测免疫细胞化学染色试剂盒，该试剂盒由以下几部分组成：1)试剂1：封闭液；2)试剂2：一抗；3)试剂3：酶联二抗；4)试剂4：DAB显色系统包括DAB缓冲液和DAB色原；5)试剂5：浓缩洗涤液(20x)。
B.实施步骤：
1、试剂配制：将浓缩的洗涤液(20x)采用纯化水稀释成为1x洗涤液工作液。
2、水化：将检测样本和质控片一起放入50％的乙醇中浸润10分钟；纯化水漂洗一次。
3、抗原修复：将检测样本和质控片置于95～99℃的抗原修复液中修复10分钟；取出置于室温冷却20分钟；1x洗涤液漂洗一次。
4、去除内源性过氧化物酶活性：样本和质控片各加入200μl 3％过氧化氢处理10分钟，1x洗涤液漂洗一次。
5、封闭：取出试剂盒中试剂1，每个载玻片上样本或细胞涂层处滴加4滴，室温孵育60分钟。
6、一抗孵育：取出试剂盒中试剂2，每个载玻片上样本或细胞涂层处滴加3滴，室温孵育60分钟，1x洗涤液漂洗三次。
7、二抗孵育：取出试剂盒中试剂3，每个载玻片上样本或细胞涂层处滴加3滴，室温孵育30分钟，1x洗涤液漂洗三次。
8、显色：取出试剂盒中的试剂盒4配制DAB显色液，每个载玻片上样本或细胞涂层处滴加4滴，室温处理3～6分钟；纯化水漂洗两次。
9、复染：苏木素复染1分钟，自来水冲洗干净后，在自来水中浸泡10分钟。
10、脱水、封片、镜检：在70％乙醇，95％乙醇，无水乙醇中依次浸泡3分钟，在二甲苯中浸泡5分钟，中性树胶封片，显微镜下观察结果。
染色结果解释：当质控片中HPV16/18蛋白阳性细胞胞质呈现棕色，核为蓝紫色，HPV蛋白阴性细胞呈现蓝紫色时，实验结果有效，否则实验无效。
对50组样品进行检测，当采用本实用新型的质控片产品作为对照时，判断准确率达到100％。
对同样50组进行检测，当不采用本实用新型的质控片产品作为对照时，判断准确率达到90％，误判率10％。
在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片产品，其特征在于，所述质控片产品包括：
(i)用于免疫细胞化学染色阳性细胞的第一质控片，所述第一质控片包括第一载玻片，以及位于所述第一载玻片的一个主表面上的阳性细胞粘附区；以及
(ii)用于免疫细胞化学染色阴性细胞的第二质控片，所述第二质控片包括第二载玻片，以及位于所述第二载玻片的一个主表面上的阴性细胞粘附区。
2.根据权利要求1所述的质控片产品，其特征在于，所述第一载玻片的一个主表面包括第一磨砂区和第一光滑玻璃区,并且所述阳性细胞粘附区位于所述第一光滑玻璃区上。
3.根据权利要求1所述的质控片产品，其特征在于，所述第二载玻片的一个主表面包括第二磨砂区和第二光滑玻璃区，并且所述阴性细胞粘附区位于所述第二光滑玻璃区上。
4.根据权利要求1所述的质控片产品，其特征在于，所述第一载玻片的一个主表面包括第一磨砂区和第一光滑玻璃区,并且所述阳性细胞粘附区位于所述第一光滑玻璃区上；所述第二载玻片的一个主表面包括第二磨砂区和第二光滑玻璃区，并且所述阴性细胞粘附区位于所述第二光滑玻璃区上；并且所述第一磨砂区和所述第二磨砂区设有不同颜色。
5.根据权利要求1所述的质控片产品，其特征在于，所述阳性细胞粘附区设有HPV16蛋白阳性肿瘤细胞涂层和/或HPV18蛋白阳性肿瘤细胞涂层。
6.根据权利要求5所述的质控片产品，其特征在于，所述阴性细胞粘附区设有不含HPV蛋白阴性肿瘤细胞的涂层或正常细胞涂层。
7.根据权利要求6所述的质控片产品，其特征在于，所述阳性肿瘤细胞涂层的面积Sp和所述阴性肿瘤细胞涂层的面积Sn均为1～4cm2。
8.根据权利要求6所述的质控片产品，其特征在于，所述阳性肿瘤细胞涂层的面积Sp和所述阴性肿瘤细胞涂层的面积Sn均为2～3.5cm2。
9.根据权利要求6所述的质控片产品，其特征在于，所述阳性肿瘤细胞涂层和所述阴性肿瘤细胞涂层均为圆形。
10.一种用于免疫细胞化学染色检测宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物质 控片产品的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：
一容器；
至少包括两个位于所述容器内的载玻片卡位；以及
位于所述容器中并且在所述载玻片卡位内的权利要求1所述宫颈癌高危HPV特异性蛋白标志物免疫细胞化学染色质控片产品。
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|---|---|---|---|---|
| CN107153021A (zh) * | 2017-05-10 | 2017-09-12 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 循环肿瘤细胞染色的质控品及其制备方法 |
| CN109187943A (zh) * | 2018-08-24 | 2019-01-11 | 四川新健康成生物股份有限公司 | 一种抗干扰试剂杯以及试剂杯内抗干扰涂层的制备方法 |
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