CN113607534B - 一种染色方法、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种染色方法、试剂盒及应用。本发明通过在P16INK4a免疫细胞化学染色的基础上联合巴氏染色，并对染色步骤进行了改进调整，采用了含有冰醋酸和丙酮的固定剂，同时用通透剂Ⅰ‑通透剂Ⅱ联合通透处理的方式代替高压修复，有效消除了背景和非特异性着色。采用该方法染色的细胞涂片，能够在同一切片上同时观察P16INK4a免疫细胞化学染色结果与细胞的形态结构，增加了单张片子的信息含量，避免了仅依赖形态学的主观性和不确定性，进而提高结果的重复性和判读的准确性。本发明进一步提供了用于P16INK4a免疫细胞化学染色与巴氏染色联合染色的试剂盒，有助于实现数字化自动阅片，具有显著的经济和社会效益。

Description

一种染色方法、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于细胞学染色技术领域，具体涉及一种染色方法、试剂盒及应用。
背景技术
宫颈癌是影响全球女性健康的第四大恶性肿瘤，也是我国第二大女性恶性肿瘤。当前宫颈癌的筛查流程是“宫颈脱落细胞检查-阴道镜检查-活检病理检查”三阶梯的筛查方式，活检病理是诊断的“金标准”。液基薄层细胞学检查(TCT)是早期筛查宫颈癌的有效手段，易受取材、染色及病理医师主观判断的影响，存在一定的假阴性率或漏诊率，诊断准确性欠佳。HPV病毒检测作为一种辅助检测手段，虽然敏感性高，但特异性低，同时还存在着阴道镜转诊率高的弊端。P16INK4a抑癌基因蛋白表达作为早期宫颈癌的生物标志物，具有较高的特异性和灵敏度，在宫颈组织活检样本中，已经得到普遍认可与应用。
2012年，美国病理学会(CAP)、美国阴道镜与宫颈病理学会(ASCCP)、美国临床病理学会(ASCP)对宫颈癌筛查的联合指南建议，特定的P16INK4a蛋白表达是高危型HPV感染是否影响细胞周期调控的替代生物标志物。2014版TBS(The Bethesda System)指出：P16INK4a免疫细胞化学染色技术可以辅助细胞学诊断。2017年我国《子宫颈癌综合防控指南》和2014年第4版WHO《女性生殖器官肿瘤分类》推荐使用P16INK4a作为辅助LSIL和HSIL诊断的分子生物学指标，提高宫颈癌诊断的准确性。
P16INK4a基因为多肿瘤抑制基因，其表达的蛋白可直接参与调控细胞周期，通过抑制细胞增殖和分裂达到抑癌作用。正常细胞周期中表达的P16INK4a表现为抗增殖效应，因此在终末分化的上皮细胞中，正常水平下不能用免疫组化方法检测到。但在HPV相关的癌前病变和癌变中，代表确立的维持恶性表型的必要因素E7癌蛋白整合到宿主基因内，结合Rb蛋白使其失活，细胞持续增殖聚集形成肿瘤，相应P16INK4a出现了强烈的过度表达而被检测到。因此P16INK4a被认为是HPV感染转化的一个替代性标志物，将P16INK4a免疫标记应用于液基细胞学，可利用抗原抗体特异性结合的原理，在液基细胞学中提供特异性的染色技术，同时联合TCT细胞形态学结果作出精准判断。
然而目前在宫颈癌大规模筛查工作中，液基细胞学通常采用巴氏染色后诊断，有时常需要进一步做免疫细胞化学染色以满足鉴别诊断。但由于再次取材受限，又难以重新获得标本制片，用细胞学剩余标本重新制成的细胞涂片又没有原涂片中的可疑细胞，因此如何在原涂片上进行免疫细胞化学染色成为关键。
P16INK4a是HSIL的检测特异性指标，敏感性与HPV相当，特异性可与细胞学相媲美，并可减少阴道镜转诊率。CN109425527A提供了一种细胞染色方法，能够同时提供细胞形态学和癌症标志物E7癌蛋白的表达鉴定，具体染色步骤为：采用液基细胞仪进行制片并固定后得到待染色涂片；采用抗肿瘤标志蛋白HPV E7抗体进行第一次免疫细胞化学染色；采用巴氏染色液进行第二次染色。但该方法仍然存在以下缺陷：①采用液基细胞仪进行制片后于95％乙醇中固定20～60min，风干20min以上，才得到待染色的涂片，固定时间过长；②细胞涂片采用常规高温修复的方式，耗时40-60min、加热及降温时间长且需要加热设备，过程繁琐；③没有解决血性样本免疫细胞化学染色时的背景和非特异性着色问题；④采用HPV-E7蛋白对细胞涂片进行免疫细胞化学染色；⑤在HPV-E7第一次染色后，中性树胶封片后再次经过褪片脱胶处理后才进行巴氏染色，操作流程繁琐。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种染色方法，能够实现在同一张细胞片子上进行P16INK4a免疫细胞化学染色后原位进行巴氏染色。
本发明的第二个目的在于提供一种辅助宫颈鳞状上皮细胞染色的试剂盒。
本发明的第三个目的在于提供一种宫颈鳞状上皮细胞染色试剂盒。
本发明的第四个目的在于提供上述试剂盒的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种染色方法，包括如下步骤：
1)液基薄层细胞制片：使用液基薄层细胞制片方法制备细胞涂片；
2)固定：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加固定剂室温固定；所述固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95％乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：(0.01-0.03)；
3)细胞通透：清洗液冲洗细胞涂片，采用通透剂处理细胞涂片；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25％-0.5％胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2-0.4％胃酶溶液；
4)免疫细胞化学染色：采用P16INK4a抗体对通透处理后的细胞涂片进行免疫细胞化学染色；
5)巴氏染色：对步骤4)已经完成免疫细胞化学染色的细胞先采用橘黄G染色液染色，漂洗后采用EA50染色液染色；
6)脱水、透明、封片。
固定剂的主要作用为固定细胞结构，维持细胞DNA和蛋白质完整性。一个良好的固定剂不但本身不能损害抗原性，还应很好地保持组织、细胞的结构以及允许大分子进入细胞内与抗原结合。以醛类为基础的固定液(如甲醛)处理标本，能与组织细胞内蛋白质的许多功能基结合，在相邻蛋白质之间形成稳定的桥键，有些交联发生在特殊抗原的抗体反应位置，抗原抗体结合可被干扰或阻断，免疫组化染色时需要进行抗原修复，故免疫细胞化学染色一般不宜选用甲醛固定。
本发明染色方法中采用的固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮组成。研究显示，无交联作用的醇类固定剂在保存DNA方面比醛类固定剂效果更好。而单纯用醇类固定剂，虽然能够固定流动性强的蛋白，但也会不同程度上造成细胞收缩，易导致核固缩、细胞空泡出现等缺陷，从而影响细胞判读。本发明中固定剂的主要成分为95％乙醇，其作为蛋白质沉淀剂能较好地保存抗原。冰醋酸作为核酸凝结剂起到辅助固定的作用，一方面能够使收缩的细胞扩张，对醇类效果进行中和；另一方面，还能够有效溶解细胞制片中的黏液，在此基础上配合后续的通透剂处理，发挥二者的协同作用，能够很好打破封闭的抗原决定簇的蛋白分子与化学键的交联，免疫组化效果大大优于甲醛固定剂。丙酮固定作用较为缓和，能更好地保存细胞上的抗原，尤其有利于提升免疫细胞化学核染色强度，确保了免疫细胞化学染色结果的准确性和可靠性。
固定剂与通透剂配合使用，二者具有协同增效作用。一些宫颈细胞样本含有大量的血细胞、蛋白黏液及细胞碎片，常规高压修复方式做免疫细胞化学染色，可出现较高的背景着色，而且一些团簇状癌变细胞由于黏液蛋白附着，会阻碍抗体进入细胞从而造成假阴性染色。不同于现有技术，本发明采用通透剂Ⅰ-通透剂Ⅱ联合通透处理的方式代替高压修复，有效消除了背景和非特异性着色。同时，还避免了常规抗原修复加热及降温时间长、需要加热设备且过程繁琐的缺陷。
细胞涂片的一个显著缺点是获取标本的重复性不如组织切片相对一致，在巴氏染色涂片上发现的“异常细胞”，有时重复制片时就消失了。本发明提供的染色方法，在P16INK4a免疫细胞化学染色的基础上联合巴氏染色，能够实现在同一张细胞片子上实现P16INK4a免疫细胞化学染色-巴氏染色联染，操作简单，结果可靠，既提高了病理医生的工作效率，又能为紧急情况下患者的诊断和治疗争取了时间。采用该方法染色的细胞涂片，既能根据癌蛋白表达的细胞标记技术准确识别病变细胞，又能观察癌变细胞的形态结构，增加了单张片子的信息含量，同时还可以避免仅依赖形态学的主观性和不确定性，提高结果的重复性和判读的准确性，有助于实现数字化自动阅片，具有明显的经济和社会效益。
优选的，所述步骤1)中采用宫颈脱落细胞样本进行液基薄层细胞制片。
优选的，步骤2)中，固定的时间为5min。
优选的，步骤3)中采用通透剂处理细胞涂片包括如下步骤：先在样本区域滴加通透剂Ⅰ并孵育，清洗液冲洗，再在样本区域滴加通透剂Ⅱ并孵育，或先在样本区域滴加通透剂Ⅱ并孵育，清洗液冲洗，再在样本区域并孵育。
滴加通透剂Ⅰ后孵育条件为：37℃孵育20min；滴加通透剂Ⅱ后孵育条件为：37℃孵育5-10min。
优选的，所述步骤4)中免疫细胞化学染色包括如下步骤：
①加过氧化物酶封闭剂：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加内源性过氧化物酶封闭剂，室温下孵育5min；
②一抗孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加P16INK4a抗体，于37℃孵育60min；
③一抗后孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；
④二抗孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min；
⑤显色：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加DAB显色液，室温孵育3-8min；
⑥苏木素复染：纯水冲洗细胞涂片，在样本区域滴加苏木素复染。
其中，一抗是指第一抗体，二抗是指第二抗体。第一抗体是能和特异性抗原特异性结合的免疫球蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。一抗后Linker用于与一抗形成复合物，起到一抗信号增强的作用，主要成分一般羊抗鼠/兔IgG，Tris缓冲液，动物血清和抑菌剂。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，同时二抗被标记了辣根过氧化物酶(HRP)，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号，并引入显色系统。
优选的，所述步骤5)中巴氏染色包括如下步骤：将已经完成免疫细胞化学染色的细胞涂片置于95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G染色液中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2.5min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s。
优选的，所述步骤5)之前还包括如下步骤：对步骤4)已经完成免疫细胞化学染色的细胞涂片进行脱水透明并用中性树胶封片，而后进行褪片脱胶。宫颈脱落细胞样本P16免疫细胞化学染色后正常脱水封片后，可经过褪片去胶继续进行巴氏染色。
一种辅助宫颈鳞状上皮细胞染色的试剂盒，所述试剂盒包括固定剂和通透剂，所述固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95％乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：(0.01-0.03)；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25％-0.5％胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2-0.4％胃酶溶液。
本发明提供的辅助宫颈鳞状上皮细胞染色的试剂盒中的固定剂和通透剂具有协同作用，固定剂含有冰醋酸和丙酮，使用该固定剂后，采用通透剂Ⅰ-通透剂Ⅱ联合通透处理的方式代替高压修复，可有效消除了背景和非特异性着色，尤其适用于含有大量的血细胞、蛋白黏液及细胞碎片的宫颈细胞样本，能够实现在同一张细胞片子上实现P16INK4a免疫细胞化学染色-巴氏染色联染。
一种宫颈鳞状上皮细胞染色试剂盒，所述试剂盒包括固定剂、通透剂、过氧化物酶封闭剂、P16INK4a抗体、酶标羊抗鼠/兔聚合物、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液、橘黄G染色液和EA50(Eosin Azure)染色液；其中，所述固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95％乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：(0.01-0.03)；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25％-0.5％胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2-0.4％胃酶溶液。
所述试剂盒还包括清洗液，所述清洗液采用浓缩清洗液(10×)按照1:10稀释得到。浓缩清洗液主要组成成分为：Tris缓冲液，表面活性剂、防腐剂及纯化水。
试剂盒将传统巴氏染色试剂与细胞免疫染色试剂进行了组合改进，采用了含有冰醋酸和丙酮的固定剂，同时用通透剂替代了抗原修复试剂，采用该试剂盒对宫颈鳞状上皮细胞进行染色，能够在同一切片上同时观察P16INK4a免疫细胞化学染色结果与细胞的形态结构，增加了单张片子的信息含量，并避免了仅依赖形态学的主观性和不确定性，进而提高结果的重复性和判读的准确性。
上述两种试剂盒在P16INK4a免疫细胞化学染色与巴氏染色联合染色方面的应用。
附图说明
图1为实施例1中Hela细胞与正常宫颈脱落细胞混合样本，经过DAB显色8min，EA50显色2.5min结果图；
图中，Hela细胞被染成棕黑色，正常细胞经过巴氏染色呈现红色或绿色，其中鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞浆染成绿色，表层不全角化细胞胞浆染成粉红色；
图2为实施例2中宫颈脱落细胞样本，经过DAB显色8min，EA50显色2.5min结果图；
图中，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色；
图3为实施例3中宫颈脱落细胞样本，经过DAB显色3min，EA50显色2min结果图；
图中，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色；
图4为实施例4中宫颈脱落细胞样本P16免疫细胞化学染色后正常脱水封片后，再经过褪片去胶后的巴氏染色结果图；
图5为实施例5中宫颈脱落细胞样本P16免疫细胞化学染色结果图；
图中，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黄色，而正常细胞未被染成棕黄色；
图6为实施例5中宫颈脱落细胞样本P16免疫细胞化学染色后，原位巴氏染色结果图；
图中，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色；
图7为对比例1中宫颈脱落细胞样本巴氏染色结果图；
图中，病变的鳞状上皮细胞核深蓝色；
图8为对比例2宫颈脱落细胞样本先巴氏染色后再P16免疫细胞化学染色结果图；
图9为对比例3中血性宫颈脱落细胞样本高压热修复后P16免疫细胞化学染色后巴氏染色结果图；
图中，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色，黏液、红细胞被染成粉红色；
图10为对比例4中血性宫颈脱落细胞样本采用固定+通透联合处理后，P16免疫细胞化学染色后巴氏染色结果图；
图中，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色，没有背景及非特异性着色的干扰；
图11为对比例3和对比例4中，同一来源的血性样本采用不同修复方式处理后，P16免疫细胞化学染色后巴氏染色结果对比图；
图中，标记A为对比例3中高压热修复方式染色后片子(高压修复-ICC P16+巴氏染色)，标记B为对比例4中固定+通透处理方式染色后片子(通透I-II--ICC P16+巴氏染色)；A片子明显有血性染色，B片子干净。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若无特殊说明，实施例及试验例中所用的各类试剂、设备等均为市售商品。
以宫颈脱落细胞为例，对本发明染色方法的具体实施步骤说明如下：
1)液基薄层细胞制片
宫颈脱落细胞样本使用液基薄层细胞制片方法，室温晾干，得到待染色细胞涂片；
2)固定
清洗液冲洗细胞涂片2次，去除溶液，在油笔圈定的待测样本区域内，加入100μL的固定剂，对上述细胞样本进行室温固定5min。固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95％乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：(0.01-0.03)；
3)细胞通透
清洗液冲洗细胞涂片，去除溶液；而后先在样本区域加入100μL通透剂Ⅰ溶液，于37℃孵育20min，清洗液冲洗，再在样本区域加入100μL通透剂Ⅱ溶液，于37℃孵育5-10min，清洗液冲洗；或先在样本区域加入100μL通透剂Ⅱ溶液，于37℃孵育5-10min，清洗液冲洗，再在样本区域加入100μL通透剂Ⅰ溶液，于37℃孵育20min，清洗液冲洗。所述通透剂Ⅰ为0.3-0.5％胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2-0.4％胃酶溶液；
4)加过氧化物酶封闭剂
除去清洗液，在样本区域滴加100μL内源性过氧化物酶封闭剂，室温下孵育5min。然后用清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次；
5)一抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的P16INK4a抗体，于37℃孵育60min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次；
6)一抗后孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次；
7)二抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次；
8)显色
除去清洗液，在样本区域滴加100μL DAB显色液，室温孵育3-8min。纯水冲洗2次，5min/次；注意：显色液需要现配现用，20×DAB浓缩底物：底物缓冲液＝1:20；
9)苏木素复染
去除纯水，在样本区域滴加100μL苏木素复染1.5min，纯水冲洗2次，5min/次；
10)巴氏染色
将上述已经完成免疫细胞化学染色的细胞样本置于95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G(OG)中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2-2.5min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s；
11)脱水透明
无水乙醇中脱水2次，每次1min，将细胞细胞涂片从无水乙醇中取出，置于二甲苯中浸泡2次，每次1min；
12)中性树胶封片
透明完成后将细胞细胞涂片从二甲苯中取出，用中性树胶封固。
P16INK4a免疫细胞化学染色后的细胞片子在显微镜下观察的结果：仅有淡染的显示细胞轮廓为淡蓝色，可判断样本细胞为正常细胞；本发明中选择HRP(辣根过氧化物酶)和DAB(3,3’-二氨基联苯胺)为底物，病变的细胞胞核和胞质被染成棕黄色。
巴氏染色后的细胞片子在显微镜下观察的结果：细胞核大小正常，核膜光滑，染色质较细，染色较淡，核淡蓝色，核仁小，核浆比例大小正常，鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞浆染成绿色，表层不全角化细胞胞浆染成粉红色，完全角化细胞胞浆染成橘黄色，可判断样本细胞为正常细胞。细胞核增大，核膜皱缩不平，染色质粗颗粒状或成块，核深染，深蓝或深紫色，核浆比例增大，可见核分裂像，核膜明显不规则，常有内凹或核沟，细胞大小不一，形态多样，极向紊乱，可判断样本细胞为病变细胞。另外，细菌染成灰色，滴虫染成淡蓝灰色，黏液淡蓝色或粉红色，中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞浆为蓝色，红细胞染成粉红色。
将同一张进行过免疫细胞化学染色和巴氏染色的细胞片子在显微镜下观察，判断样本细胞为阳性或阴性。结果判定：免疫细胞化学染色阳性结果主要呈棕黑色表达，肿瘤细胞核/细胞质着色表示P16INK4a蛋白阳性；若无棕黄色细胞则为阴性。
对于P16INK4a阳性，即使细胞学未见异常，病理医师会有较高的警觉性进行重复仔细阅片以免漏诊，尤其对于HSIL和腺上皮病变。由于P16INK4a结果判读基于颜色的区别，相比TCT对细胞形态学的判读更为简单，易于实现数字化自动阅片，节省细胞学筛查的时间，增加结果的重复性和准确性，高敏感度的P16INK4a检测在一定程度上弥补了TCT的不足。
一些宫颈细胞样本含有大量的血细胞、蛋白黏液及细胞碎片，常规高压修复方式做免疫细胞化学染色，可出现较高的背景着色，而且一些团簇状癌变细胞由于黏液蛋白附着，有可能阻碍抗体进入细胞从而造成假阴性染色。本发明采用通透剂Ⅰ-通透剂Ⅱ联合通透处理的方式代替高压修复，有效消除了背景和非特异性着色。
为了便于本领域技术人员理解，下面将结合实施例和说明书附图作进一步的详细说明。
实施例1
该实施例提供了一种染色方法，包括以下步骤：
1)液基薄层细胞制片
将Hela细胞与宫颈脱落细胞样本混合，使用液基薄层细胞制片方法，室温晾干，得到待染色细胞涂片。Hela细胞为子宫颈癌细胞的细胞系，宫颈脱落细胞采用的是正常细胞样本。
2)固定
清洗液冲洗细胞涂片2次，去除溶液，在油笔圈定的待测样本区域内，加入100μL的固定剂，对上述细胞样本进行室温固定5min。该实施例中所用的固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮按体积比0.9：0.1：0.01组成。
3)细胞通透
清洗液冲洗细胞涂片，去除溶液，在样本区域加入100μL通透剂Ⅰ溶液，于37℃孵育20min，清洗液冲洗，再在样本区域加入100μL通透剂Ⅱ溶液，于37℃孵育5min，清洗液冲洗。该实施例中所用的通透剂Ⅰ为0.3％胰酶溶液、通透剂Ⅱ为0.4％胃酶溶液。
4)加过氧化物酶封闭剂
除去清洗液，在样本区域滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育5min。然后用清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
5)一抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的P16INK4a抗体，于37℃孵育60min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
6)一抗后孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
7)二抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
8)显色
除去清洗液，在样本区域滴加100μL DAB显色液，室温孵育8min。纯水冲洗2次，5min/次。注意：显色液需要现配现用，20X DAB浓缩底物：底物缓冲液＝1:20。
9)苏木素复染
去除纯水，在样本区域滴加100μL苏木素复染1.5min，纯水冲洗2次，5min/次。
10)巴氏染色
将上述已经完成免疫细胞化学染色的细胞样本置于95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G(OG)中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2.5min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s。
11)脱水透明
无水乙醇中脱水2次，每次1min，将细胞涂片从无水乙醇中取出，置于二甲苯中浸泡2次，每次1min。
12)中性树胶封片
透明完成后将细胞涂片从二甲苯中取出，用中性树胶封固。
结果如图1所示，以Hela细胞与正常宫颈脱落细胞混合样本制片，经染色后，Hela细胞被染成棕黑色，正常细胞经过巴氏染色呈现红色或绿色，其中鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞浆染成绿色，表层不全角化细胞胞浆染成粉红色。
实施例2
该实施例提供了一种染色方法，包括以下步骤：
1)液基薄层细胞制片
将宫颈脱落细胞样本使用液基薄层细胞制片方法，室温晾干，得到待染色细胞涂片。
2)固定
清洗液冲洗细胞涂片2次，去除溶液，在油笔圈定的待测样本区域内，加入100μL的固定剂，对上述细胞样本进行室温固定5min。该实施例中所用的固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮按体积比0.9：0.1：0.02组成。
3)细胞通透
清洗液冲洗细胞涂片，去除溶液，在样本区域加入100μL通透剂Ⅰ溶液，于37℃孵育20min，清洗液冲洗，再在样本区域加入100μL通透剂Ⅱ溶液，于37℃孵育10min，清洗液冲洗。该实施例中所用的通透剂Ⅰ为0.4％胰酶溶液、通透剂Ⅱ为0.3％胃酶溶液。
4)加过氧化物酶封闭剂
除去清洗液，在样本区域滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育5min。然后用清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
5)一抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的P16INK4a抗体，于37℃孵育60min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
6)一抗后孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
7)二抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
8)显色
除去清洗液，在样本区域滴加100μL DAB显色液，室温孵育8min。纯水冲洗2次，5min/次。注意：显色液需要现配现用，20×DAB浓缩底物：底物缓冲液＝1:20。
9)苏木素复染
去除纯水，在样本区域滴加100μL苏木素复染1.5min，纯水冲洗2次，5min/次。
10)巴氏染色
将上述已经完成免疫细胞化学染色的细胞样本置于95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G(OG)中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2.5min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s。
11)脱水透明
无水乙醇中脱水2次，每次1min，将细胞涂片从无水乙醇中取出，置于二甲苯中浸泡2次，每次1min。
12)中性树胶封片
透明完成后将细胞涂片从二甲苯中取出，用中性树胶封固。
结果如图2所示，以宫颈脱落细胞样本制片，经染色后，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色。该实施例在同一张细胞片子上P16免疫细胞化学染色后行巴氏染色，操作简单，结果可靠，既增加了单张切片的信息含量，又为紧急情况下患者的诊断和治疗争取了时间。
实施例3
该实施例提供了一种染色方法，包括以下步骤：
1)液基薄层细胞制片
宫颈脱落细胞样本使用液基薄层细胞制片方法，室温晾干，得到待染色细胞涂片；
2)固定
清洗液冲洗细胞涂片2次，去除溶液，在油笔圈定的待测样本区域内，加入100μL的固定剂，对上述细胞样本进行室温固定5min。该实施例中所用的固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮按体积比0.9：0.1：0.03组成。
3)细胞通透
清洗液冲洗细胞涂片，去除溶液，在样本区域加入100μL通透剂Ⅱ溶液，于37℃孵育5min，清洗液冲洗，再在样本区域加入100μL通透剂Ⅰ溶液，于37℃孵育20min，清洗液冲洗。该实施例中所用的通透剂Ⅱ为0.4％胃酶溶液、通透剂Ⅰ为0.25％胰酶溶液。
4)加过氧化物酶封闭剂
除去清洗液，在样本区域滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育5min。然后用清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
5)一抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的P16INK4a抗体，于37℃孵育60min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
6)一抗后孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
7)二抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
8)显色
除去清洗液，在样本区域滴加100μL DAB显色液，室温孵育3min。纯水冲洗2次，5min/次。注意：显色液需要现配现用，20×DAB浓缩底物：底物缓冲液＝1:20。
9)苏木素复染
去除纯水，在样本区域滴加100μL苏木素复染1.5min，纯水冲洗2次，5min/次。
10)巴氏染色
将上述已经完成免疫细胞化学染色的细胞样本置于95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G(OG)中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s。
11)脱水透明
无水乙醇中脱水2次，每次1min，将细胞涂片从无水乙醇中取出，置于二甲苯中浸泡2次，每次1min。
12)中性树胶封片
透明完成后将细胞涂片从二甲苯中取出，用中性树胶封固。
结果如图3所示，以宫颈脱落细胞样本制片，经染色后，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色。
实施例4
该实施例提供了一种染色方法，与实施例1的区别在于，宫颈脱落细胞样本P16免疫细胞化学染色后正常脱水封片后，再经过褪片去胶后巴氏染色，包括以下步骤：
1)液基薄层细胞制片
将宫颈脱落细胞样本使用液基薄层细胞制片方法，室温晾干，得到待染色细胞涂片。
2)固定
清洗液冲洗细胞涂片2次，去除溶液，在油笔圈定的待测样本区域内，加入100μL的固定剂，对上述细胞样本进行室温固定5min。该实施例中所用的固定剂为95％乙醇、冰醋酸、丙酮体积比0.9：0.1：0.01。
3)细胞通透
清洗液冲洗细胞涂片，去除溶液，在样本区域加入100μL通透剂Ⅰ溶液，于37℃孵育20min，清洗液冲洗，再在样本区域加入100μL通透剂Ⅱ溶液，于37℃孵育5min，清洗液冲洗。该实施例中所用的通透剂Ⅰ为0.3％胰酶溶液、通透剂Ⅱ为0.4％胃酶溶液。
4)加过氧化物酶封闭剂
除去清洗液，在样本区域滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育5min。然后用清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
5)一抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的P16INK4a抗体，于37℃孵育60min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
6)一抗后孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
7)二抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
8)显色
除去清洗液，在样本区域滴加100μL DAB显色液，室温孵育8min。纯水冲洗2次，5min/次。注意：显色液需要现配现用，20×DAB浓缩底物：底物缓冲液＝1:20。
9)苏木素复染
去除纯水，在样本区域滴加100μL苏木素复染1.5min，纯水冲洗2次，5min/次。
10)脱水透明
70％乙醇浸泡2min，85％乙醇浸泡2min，95％乙醇浸泡2min，无水乙醇浸泡2次，2min/次，二甲苯浸泡2次，2min/次。
11)中性树胶封片，显微镜下阅片。
12)褪片脱胶
将上述已经完成免疫细胞化学染色的细胞样本置于二甲苯中浸泡不少于1小时，轻轻褪去盖玻片，之后置于无水乙醇中浸泡2min。切记不可强行移去盖玻片，可采取延长浸入二甲苯的时间，直至玻片自动脱落，避免细胞黏附在盖玻片上。如若强行取下盖玻片，则会损坏涂片中的细胞或造成细胞脱落。
13)巴氏染色
将上述已经褪片后的样本置于95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G(OG)中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2.5min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s。
14)脱水透明
无水乙醇中脱水2次，每次1min，将细胞涂片从无水乙醇中取出，置于二甲苯中浸泡2次，每次1min。
15)中性树胶封片
透明完成后将细胞涂片从二甲苯中取出，用中性树胶封固。
结果如图4所示，宫颈脱落细胞样本P16免疫细胞化学染色后正常脱水封片后，再经过褪片去胶后的巴氏染色，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色。染色结果与P16免疫细胞化学染色后不经过脱水封片，直接巴氏染色无差异。
实施例5
该试验例提供了一种染色方法，包括以下步骤：
1)液基薄层细胞制片
将宫颈脱落细胞样本使用液基薄层细胞制片方法，室温晾干，得到待染色细胞涂片。
2)固定
清洗液冲洗玻片2次，去除溶液，在油笔圈定的待测样本区域内，加入100μL的固定剂，对上述细胞样本进行室温固定5min。该实验例中所用的固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮按体积比0.9：0.1：0.01组成。
3)细胞通透
清洗液冲洗玻片，去除溶液，在样本区域加入100μL通透剂Ⅰ溶液，于37℃孵育20min，清洗液冲洗，再在样本区域加入100μL通透剂Ⅱ溶液，于37℃孵育5min，清洗液冲洗。该对比例中所用的通透剂Ⅰ为0.3％胰酶溶液、通透剂Ⅱ为0.4％胃酶溶液。
4)加过氧化物酶封闭剂
除去清洗液，在样本区域滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育5min。然后用清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
5)一抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的P16INK4a抗体，于37℃孵育60min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
6)一抗后孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
7)二抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
8)显色
除去清洗液，在样本区域滴加100μL DAB显色液，室温孵育8min。纯水冲洗2次，5min/次。注意：显色液需要现配现用，20×DAB浓缩底物：底物缓冲液＝1:20。
9)苏木素复染
去除纯水，在样本区域滴加100μL苏木素复染1.5min，纯水冲洗2次，5min/次。于显微镜下观察染色结果并拍照。
10)巴氏染色
将上述已经完成免疫细胞化学染色的细胞样本置于95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G(OG)中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s。
11)脱水透明
无水乙醇中脱水2次，每次1min，将细胞玻片从无水乙醇中取出，置于二甲苯中浸泡2次，每次1min。
12)中性树胶封片
透明完成后将细胞玻片从二甲苯中取出，用中性树胶封固。于显微镜下观察染色结果并拍照。
宫颈脱落细胞样本P16免疫细胞化学染色结果如图5所示，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黄色，而正常细胞未被染成棕黄色；宫颈脱落细胞样本P16免疫细胞化学染色后，原位巴氏染色结果如图6所示，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色。
实施例6
该实施例提供了一种辅助宫颈鳞状上皮细胞染色试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂组分：
1)固定剂，所述固定剂由纯水和95％乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95％乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：0.02；
2)通透剂，所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.4％胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.3％胃酶溶液。
在其他实施例中，固定剂中95％乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：0.01或0.9：0.1：0.03。在其他实施例中，通透剂中通透剂Ⅰ为0.3或0.5％胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2％或0.4％胃酶溶液。
该试剂盒能够应用于P16INK4a免疫细胞化学染色与巴氏染色联合染色(参见实施例1-4)。
实施例7
该实施例提供了一种宫颈鳞状上皮细胞染色试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂组分：
1)固定剂，所述固定剂由纯水和95％乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95％乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：0.02；
2)通透剂，所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.4％胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.3％胃酶溶液；
3)过氧化物酶封闭剂，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3002；
4)P16INK4a抗体，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CPM-0100；
5)酶标羊抗鼠/兔聚合物，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3003；
6)DAB(3,3’-二氨基联苯胺)显色底物，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3004；
7)DAB显色缓冲液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货货号：SD3005；
8)苏木素复染液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3006。
9)橘黄G(OG)染色液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，医疗器械备案证编号：豫郑械备20190234号；
10)EA50(Eosin Azure)染色液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，医疗器械备案证编号：豫郑械备20190234号。
在其他实施例中，固定剂中95％乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：0.01或0.9：0.1：0.03。在其他实施例中，通透剂中通透剂Ⅰ为0.3或0.5％胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2％或0.4％胃酶溶液。在其他实施例中，上述试剂盒还包括清洗液，具体的，清洗液为采用浓缩清洗液(10×)按照1:10稀释得到。
该试剂盒能够应用于P16INK4a免疫细胞化学染色与巴氏染色联合染色(参见实施例1-4)。
对比例1
该对比例提供了传统巴氏染色方法，包括如下步骤：
1)薄层细胞制片
将宫颈脱落细胞样本使用液基薄层细胞制片方法，室温晾干，得到待染色细胞涂片；
2)固定
用95％乙醇对上述细胞样本进行室温固定5min；
3)巴氏染色
将上述细胞样本用纯化水浸泡1min，恒定液浸泡30s，苏木素染色3min，清水洗1min，返蓝液浸泡1.5min，清洗洗1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，橘黄G(OG)中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，EA50染色液中2min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s；
4)脱水透明
无水乙醇中脱水2次，每次1min，将细胞玻片从无水乙醇中取出，置于二甲苯中浸泡2次，每次1min；
5)中性树胶封片
透明完成后将细胞玻片从二甲苯中取出，用中性树胶封固。于显微镜下观察染色结果并拍照。
结果如图7所示，图7为宫颈脱落细胞样本巴氏染色结果图，病变的鳞状上皮细胞核深蓝色。液基薄层细胞学检查(TCT)是早期筛查宫颈癌的有效手段，易受取材、染色及病理医师主观判断的影响，存在一定的假阴性率或漏诊率，诊断准确性欠佳。
对比例2
该对比例提供了一种染色方法，该方法先进行巴氏染色再进行细胞免疫化学染色，具体包括如下步骤：
1)薄层细胞制片
将宫颈脱落细胞样本使用液基薄层细胞制片方法，室温晾干，得到待染色细胞涂片；
2)固定
用95％乙醇对上述细胞样本进行室温固定5min；
3)巴氏染色
将上述细胞样本用纯化水浸泡1min，恒定液浸泡30s，苏木素染色3min，清水洗1min，返蓝液浸泡1.5min，清洗洗1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，橘黄G(OG)中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，EA50染色液中2min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s；
4)脱水透明
无水乙醇中脱水2次，每次1min，将细胞玻片从无水乙醇中取出，置于二甲苯中浸泡2次，每次1min；
5)中性树胶封片
透明完成后将细胞玻片从二甲苯中取出，用中性树胶封固。于显微镜下观察染色结果并拍照；
6)褪片脱胶
将上述已经完成巴氏染色的细胞样本置于二甲苯中浸泡不少于30min，轻轻褪去盖玻片，之后置于无水乙醇中浸泡2min。切记不可强行移去盖玻片，可采取延长浸入二甲苯的时间，直至玻片自动脱落，避免细胞黏附在盖玻片上。如若强行取下盖玻片，则会损坏涂片中的细胞或造成细胞脱落；
7)复水
将上述褪片后细胞样本依次置于95％乙醇浸泡2min，85％乙醇浸泡2min，70％乙醇浸泡2次，然后浸泡于纯化水中；
8)细胞通透
清洗液冲洗切片，去除溶液，在样本区域加入100μL通透剂Ⅰ溶液，于37℃孵育20min，清洗液冲洗，再在样本区域加入100μL通透剂Ⅱ溶液，于37℃孵育5min，清洗液冲洗。该实对比例中所用的通透剂Ⅰ为0.3％胰酶溶液、通透剂Ⅱ为0.4％胃酶溶液；
9)加过氧化物酶封闭剂
除去清洗液，在样本区域滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育5min。然后用清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次；
10)一抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的P16INK4a抗体，于37℃孵育60min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次；
11)一抗后孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次；
12)二抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次；
13)显色
除去清洗液，在样本区域滴加100μL DAB显色液，室温孵育8min。纯水冲洗2次，5min/次；注意：显色液需要现配现用，20X DAB浓缩底物：底物缓冲液＝1:20；
14)苏木素复染
去除纯水，在样本区域滴加100μL苏木素复染1.5min，纯水冲洗2次，5min/次；
15)脱水透明
70％乙醇浸泡2min，85％乙醇浸泡2min，95％乙醇浸泡2min，无水乙醇浸泡2次，2min/次，二甲苯浸泡2次，2min/次；
16)中性树胶封片，显微镜下阅片。
结果如图8所示，先巴氏染色后的细胞片子，一般均采用高压抗原热修复的方式褪色后继而进行免疫细胞化学染色，高压修复过程中加热时间过长或者温度过高，可能会导致细胞涂片中抗原的破坏，进而影响免疫组化检测的灵敏度。而本发明中采用通透剂Ⅰ-通透剂Ⅱ联合通透处理的方式代替高压修复很好地解决了这一问题。该对比例虽然能够实现在褪色的细胞片子上做免疫细胞化学染色，准确表达无交叉反应，但无法实现细胞形态学和免疫细胞化学染色结果在同一张片子上同时呈现。
对比例3
该对比例提供了一种染色方法，针对血性宫颈细胞样本，采用常规高压热修复方法代替本发明中细胞通透处理的方法进行P16免疫细胞化学染色及巴氏染色，具体包括如下步骤：
1)液基薄层细胞制片
将血性宫颈脱落细胞样本使用液基薄层细胞制片方法，室温晾干，得到待染色细胞涂片。
2)固定
采用95％乙醇对上述细胞片子室温固定20min。
3)高压修复
将样本玻片放入免疫组化抗原修复缓冲液中，隔水高压修复2.5min，自然冷却至室温。所采用的的抗原修复液为广泛使用的Tris-EDTA抗原修复(pH9.0)。
4)加过氧化物酶封闭剂
除去清洗液，在样本区域滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育5min。然后用清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
5)一抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的P16INK4a抗体，于37℃孵育60min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
6)一抗后孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
7)二抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
8)显色
除去清洗液，在样本区域滴加100μL DAB显色液，室温孵育8min。纯水冲洗2次，5min/次。注意：显色液需要现配现用，20×DAB浓缩底物：底物缓冲液＝1:20。
9)苏木素复染
去除纯水，在样本区域滴加100μL苏木素复染1.5min，纯水冲洗2次，5min/次。
10)巴氏染色
将上述已经完成免疫细胞化学染色的细胞样本置于95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G(OG)中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2.5min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s。
11)脱水透明
无水乙醇中脱水2次，每次1min，将细胞涂片从无水乙醇中取出，置于二甲苯中浸泡2次，每次1min。
12)中性树胶封片
透明完成后将细胞涂片从二甲苯中取出，用中性树胶封固。
结果如图9及图11所示，其中图9是P16和巴氏染色后显微镜下结果图，对应图11中标记为A的片子。血性宫颈脱落细胞样本制片后，采用常规高压热修复后，经过P16免疫细胞化学染色及巴氏染色后，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色，黏液、红细胞被染成粉红色。血性样本因较多红细胞的存在，染色后片子背景较重，影响对染色结果的判读。
对比例4
该对比例提供了一种染色方法，采用和对比例3同一来源的血性宫颈细胞样本，采用本发明中特用的固定剂和通透剂联合使用代替常规高压热修复方式，继而进行P16免疫细胞化学染色及巴氏染色，具体步骤如下：
1)液基薄层细胞制片
将宫颈脱落细胞样本使用液基薄层细胞制片方法，室温晾干，得到待染色细胞涂片。
2)固定
清洗液冲洗细胞涂片2次，去除溶液，在油笔圈定的待测样本区域内，加入100μL的固定剂，对上述细胞样本进行室温固定5min。该实施例中所用的固定剂为95％乙醇、冰醋酸、丙酮体积比0.9：0.1：0.01。
3)细胞通透
清洗液冲洗细胞涂片，去除溶液，在样本区域加入100μL通透剂Ⅰ溶液，于37℃孵育20min，清洗液冲洗，再在样本区域加入100μL通透剂Ⅱ溶液，于37℃孵育5min，清洗液冲洗。该实施例中所用的通透剂Ⅰ为0.3％胰酶溶液、通透剂Ⅱ为0.4％胃酶溶液。
4)加过氧化物酶封闭剂
除去清洗液，在样本区域滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育5min。然后用清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
5)一抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的P16INK4a抗体，于37℃孵育60min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
6)一抗后孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL的一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
7)二抗孵育
除去清洗液，在样本区域滴加100μL酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min，清洗液冲洗并浸泡3次，3min/次。
8)显色
除去清洗液，在样本区域滴加100μL DAB显色液，室温孵育8min。纯水冲洗2次，5min/次。注意：显色液需要现配现用，20×DAB浓缩底物：底物缓冲液＝1:20。
9)苏木素复染
去除纯水，在样本区域滴加100μL苏木素复染1.5min，纯水冲洗2次，5min/次。
10)巴氏染色
将上述已经完成免疫细胞化学染色的细胞样本置于95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G(OG)中1min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2.5min，95％乙醇中漂洗2次，每次10s。
11)脱水透明
无水乙醇中脱水2次，每次1min，将细胞涂片从无水乙醇中取出，置于二甲苯中浸泡2次，每次1min。
12)中性树胶封片
透明完成后将细胞涂片从二甲苯中取出，用中性树胶封固。
结果如图10及图11所示，其中图10是P16和巴氏染色后显微镜下结果图，对应图11中标记为B的片子。采用和对比例3同一来源的血性宫颈脱落细胞样本制片后，采用本发明中含有冰醋酸和丙酮的固定剂，经过通透剂Ⅰ-通透剂Ⅱ联合通透处理的方式代替高压修复，在该特殊固定剂-通透剂的协同作用下，有效消除了血性样本中的大量血细胞、蛋白黏液及细胞碎片，片子干净，病变的鳞状上皮细胞被染成棕黑色，没有背景及非特异性着色的干扰，提高了判读的准确性。

Claims (8)

1.一种染色方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）液基薄层细胞制片：使用液基薄层细胞制片方法制备细胞涂片；
2）固定：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加固定剂室温固定；所述固定剂由95%乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95%乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：（0.01-0.03）；
3）细胞通透：清洗液冲洗细胞涂片，采用通透剂处理细胞涂片；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25%-0.5%胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2%-0.4%胃酶溶液；
4）免疫细胞化学染色：采用P16INK4a抗体对通透处理后的细胞涂片进行免疫细胞化学染色；
5）巴氏染色：对步骤4）已经完成免疫细胞化学染色的细胞涂片先采用橘黄G染色液染色，漂洗后采用EA50染色液染色；
6）脱水、透明、封片；
步骤1）中采用宫颈脱落细胞样本进行液基薄层细胞制片；
步骤3）中采用通透剂处理细胞涂片包括如下步骤：先在样本区域滴加通透剂Ⅰ并孵育，清洗液冲洗，再在样本区域滴加通透剂Ⅱ并孵育，或先在样本区域滴加通透剂Ⅱ并孵育，清洗液冲洗，再在样本区域滴加通透剂Ⅰ并孵育。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，固定的时间为5min。
3.根据权利要求1~2中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4）中免疫细胞化学染色包括如下步骤：
① 加过氧化物酶封闭剂：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加内源性过氧化物酶封闭剂，室温下孵育5min；
② 一抗孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加P16INK4a抗体，于37℃孵育60min；
③ 一抗后孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；
④ 二抗孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min；
⑤ 显色：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加DAB显色液，室温孵育3-8min；
⑥ 苏木素复染：纯水冲洗细胞涂片，在样本区域滴加苏木素复染。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）中巴氏染色包括如下步骤：将已经完成免疫细胞化学染色的细胞涂片置于95%乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G染色液中1min，95%乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2.5min，95%乙醇中漂洗2次，每次10 s。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤5）之前还包括如下步骤：对步骤4）已经完成免疫细胞化学染色的细胞涂片进行脱水透明并用中性树胶封片，而后进行褪片脱胶。
6.一种用于实施权利要求1所述染色方法的辅助宫颈鳞状上皮细胞染色的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固定剂和通透剂，所述固定剂由95%乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95%乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：（0.01-0.03）；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25%-0.5%胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2%-0.4%胃酶溶液。
7.一种用于实施权利要求1所述染色方法的宫颈鳞状上皮细胞染色试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固定剂、通透剂、过氧化物酶封闭剂、P16INK4a抗体、酶标羊抗鼠/兔聚合物、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液、橘黄G染色液和EA50染色液；其中，所述固定剂由95%乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95%乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：（0.01-0.03）；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25%-0.5%胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2-0.4%胃酶溶液。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒在P16INK4a免疫细胞化学染色与巴氏染色联合染色方面的应用。
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