CN111551720A - 一种检测ogn蛋白表达的方法及其在胃癌辅助诊断中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测OGN蛋白表达的方法及其在胃癌辅助诊断中的应用，该方法包括：取胃癌患者的病理组织进行石蜡包埋切片,将石蜡切片脱蜡至水；将脱蜡后的切片初步处理后，置于过氧化氢溶液避光浸泡后纯水润洗；采用枸橼酸缓冲液，微波抗原修复，冷却至室温，纯水润洗后将切片放入湿盒内，免疫组化笔画圈标记，滴加二抗来源的血清封闭；孵育一抗、二抗和SABC；苏木精轻度复染，脱水、透明、封片后进行镜检，以胞浆或胞膜上出现的棕黄色或浅黄色颗粒为阳性表达。本发明通过免疫组化染色胃患者的病理组织，可检测OGN在胃癌组织中的表达情况，该方法操作简便，检测准确，为胃癌患者的诊断、治疗和评价提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测OGN蛋白表达的方法及其在胃癌辅助诊断中的应用，属于生物检测技术领域。
背景技术
根据国际癌症研究机构（IARC），胃癌（GC）是世界第五常见恶性肿瘤。据估计，每年约有一百万例胃癌发生，其中超过一半的胃癌病例发生在东亚地区，包括中国、日本和南韩。男性的比例明显高于女性。在欠发达国家，男性胃癌是第三常见的诊断癌症，也是导致癌症死亡的主要原因之一。而在美国、欧洲和中国，因为大多数胃癌一经确诊就已经进入晚期，它们的5年生存率很低胃癌患者的生存率较低，通常只有20%到25%。可切除胃癌患者的生存率明显高于不能切除的患者。目前还没有一种生物分子能够及时诊断并有针对性地进行治疗。因此探索胃癌的相关分子，找到能够早期诊断胃癌的分子标记物，提供治疗途径中的新靶点具有重要的临床价值。
研究表明，SLRP基因家族与胶原纤维的形成、细胞迁移和粘附有关。OGN作为SLRP家族的一员，在调节细胞粘附和迁移方面也发挥了作用，并参与了细胞凋亡。此外，这种分子可以作为血管细胞外基质基本成分的代表。
骨生成诱导因子（OGN）是相对分子质量为12的分泌蛋白，它最初是从牛骨基质中提取分离得到的，与骨组织形成有关，OGN广泛存在于骨基质、结缔组织和软骨细胞中，有研究表明它能通过对蛋白酶的加工而调节细胞增殖分化，参与骨骼、胶原纤维和肿瘤的形成，还与结缔组织疾病有关。目前，有研究报道TCGA数据显示肿瘤中OGN表达水平分别与CD3、CD8和PTPRC表达呈正相关。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种检测OGN蛋白表达的方法及其在胃癌辅助诊断中的应用，评估了胃癌组织中OGN的表达，利用OGN作为胃癌诊断或胃癌进展程度的一个新的分子标记。
为解决上述技术问题，本发明提供一种检测OGN蛋白表达的方法，包括：
取胃癌患者的病理组织进行石蜡包埋切片,放置于烘箱中烘干,将石蜡切片脱蜡至水，得到脱蜡后的切片；
将脱蜡后的切片采用二甲苯和乙醇初步处理后，置于过氧化氢溶液避光浸泡后纯水润洗；
采用枸橼酸缓冲液，微波抗原修复，冷却至室温，纯水润洗后将切片放入湿盒内，免疫组化笔画圈标记，滴加二抗来源的血清进行封闭处理，倾去血清；
孵育一抗、二抗和SABC；
苏木精轻度复染，脱水、透明、封片后进行镜检，以胞浆或胞膜上出现的棕黄色或浅黄色颗粒为阳性表达，并进行图像分析。
进一步地，采用二甲苯和乙醇初步处理的具体步骤包括：置于二甲苯中l0分钟,更换二甲苯再浸泡l0分钟,而后无水乙醇浸泡5分钟, 95%乙醇浸泡5分钟, 80%乙醇浸泡5分钟, 75%乙醇浸泡5分钟, 70%乙醇浸泡5分钟, PBS浸泡5分钟并更换PBS重复浸泡3次。
进一步地，孵育一抗的具体方法为：在免疫组化笔画圈标记的中央滴加50ul/片按一定比例稀释好的一抗，4℃过夜孵育后，纯水润洗3次，每次5分钟。
进一步地，所述的一抗工作液为OGN抗体，所述的一抗工作液浓度为1：200。
进一步地，孵育二抗的具体方法为：在免疫组化笔画圈标记的中央滴加50ul/片生物素标记的二抗，37℃孵育30分钟后，纯水润洗3次，每次5分钟。
进一步地，孵育SABC的具体方法为：在免疫组化笔画标记的中央滴一滴新鲜配置好的DAB显色液，室温显色，镜下控制反应时间，纯水洗涤以终止显色。
进一步地，苏木精轻度复染的具体方法为：苏木精淡染核5秒后，将切片放于玻片架在染缸内流水冲洗5分钟，然后采用1%稀盐酸分化浸润5秒，最好将切片放于玻片架在染缸内流水冲洗5分钟。
进一步地，脱水、透明、封片的具体方法为：80% 乙醇，30秒→95%乙醇I，1-2分钟→95%乙醇II，1-2分钟→无水乙醇I，1-2分钟→无水乙醇II，1-2分钟→二甲苯，3分钟，通风橱内晾片，中性树胶封片。
进一步地，图像分析的具体方法为：采用Image-pro Plus图像分析软件，以光学显微镜放大200倍的免疫组化图片为观察对象，每组每个时间点每张切片随机选择3个视野，对所选择视野中的阳性信号进行图像的分析，用半定量的方法算出每个视野下的平均光密度值来估计各因子的表达情况；所述平均光密度值的计算方法为：平均光密度值=积分光密度值/像素点的数量。
本发明还提供了上述的一种检测OGN蛋白表达的方法在胃癌辅助诊断中的应用。所述方法可用于检测胃癌不同分期中OGN蛋白的表达，当OGN蛋白表达低时，胃癌的分化程度高，预后较好。
本发明所达到的有益效果：
1.本发明通过免疫组化染色胃患者的病理组织，可检测OGN在胃癌组织中的表达情况，该方法操作简便，检测准确,通过显微镜观察拍照，检测结果更加直观。
2.通过本发明的方法检测胃癌患者可为胃癌患者的诊断、治疗和评价提供依据，可以给胃癌患者的临床分期提供参考，防止患者带来的治疗时机的错失以及经济损失。
附图说明
图1在胃癌组织中检测结果表明OGN在早期胃癌细胞中中表达或者高表达；
图2在胃癌组织中检测结果表明OGN在晚期胃癌细胞中无表达或者低表达。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
一种检测OGN蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：
A.石蜡切片的制备：
1）固定：取不同时期（早期、晚期）胃癌患者的病理组织，置于10%中性福尔马林固定过夜。
2）脱水：将固定好的标本取出，流水下充分漂洗，漂洗后低浓度酒精到高浓度酒精逐级脱水。70% 乙醇，120分钟→80% 乙醇，120分钟→90%乙醇，120分钟→95%乙醇I，120分钟→95%乙醇II，60分钟→无水乙醇，60分钟→无水乙醇II，60分钟。
3）透明：无水乙醇和二甲苯混合液（1：1），10分钟→二甲苯I，8分钟→二甲苯II，8分钟。
4）浸蜡：将透明好的标本投入熔化后的石蜡浸渍。蜡缸A，90分钟→蜡缸B，60分钟。
5）包埋： 于包埋框中滴入少许熔化的石蜡，用加热的镊子将标本放入，稍加调整标本位置，再次滴入熔化的石蜡直至没过包埋框的表面，水平放于冷冻台上直至凝固。包埋过程中应避免气泡。
6）切片：将包埋好的蜡块固定于石蜡切片机上——修块——切取厚度为3um的石蜡切片——展片——捞片——烤片。
B.免疫组织化学法检测OGN
1)将早期胃癌患者病理组织的石蜡包埋切片放置于60°C烘箱中20~30分钟,将所述石蜡切片脱蜡至水，得到所述脱蜡后的切片；将所述脱蜡后的切片置于二甲苯中l0分钟,更换二甲苯再浸泡l0分钟,而后无水乙醇 浸泡5分钟, 95%乙醇浸泡5分钟, 80%乙醇浸泡5分钟, 75%乙醇浸泡5分钟, 70%乙醇浸泡5分钟, PBS浸泡5分钟并更换PBS重复浸泡3次，得到初步处理后的切片；
2)灭活内源性过氧化物酶：将所述初步处理后的切片置于3%过氧化氢溶液（避光）浸泡8钟，纯水润洗3次，每次5分钟。
3)抗原修复：0.01M枸橼酸缓冲液，微波抗原修复15分钟，冷却至室温，纯水润洗3次，每次5分钟。
4)封闭：将切片放入湿盒内——免疫组化笔画圈标记——滴加二抗来源的血清（武汉博世德公司，货号AR0009）于37℃封闭30分钟——倾去，勿洗。
5)孵育一抗：在免疫组化笔画圈标记的中央滴加50ul/片按一定比例稀释好的一抗（美国Abcam公司，货号：ab244329）——4℃过夜孵育——纯水润洗3次，每次5分钟。所述的一抗工作液浓度为1：200。
6)孵育二抗：在免疫组化笔画圈标记的中央滴加50ul/片生物素标记的二抗（rabbit IgG-HRP美国Abcam公司，货号ab205718）——37℃孵育30分钟——纯水润洗3次，每次5分钟。
7)孵育SABC：在免疫组化笔画标记的中央滴一滴新鲜配置好的DAB显色液（武汉博世德公司，货号SA1029）——室温显色，镜下控制反应时间——纯水洗涤以终止显色。
8）苏木精轻度复染：苏木精淡染核5秒——切片放于玻片架在染缸内流水冲洗5分钟——1%稀盐酸分化浸润5秒——切片放于玻片架在染缸内流水冲洗5分钟。
9)脱水，透明，封片
80% 乙醇，30秒→95%乙醇I，1-2分钟→95%乙醇II，1-2分钟→无水乙醇I，1-2分钟→无水乙醇II，1-2分钟→二甲苯，3分钟。
10)通风橱内晾片，中性树胶封片。
11)镜检：以胞浆或胞膜上出现的棕黄色或浅黄色颗粒为阳性表达。即可检测出病理组织中OGN蛋白的表达情况,所述显微镜为 Nikon公司出品。
所述山羊血清工作液、SABC工作液及DAB购自武汉博世德公司；所述一抗和二抗工作液购自ABCAM公司（美国）；
12)图像分析：采用Image-pro Plus图像分析软件，以光学显微镜放大200倍的免疫组化图片为观察对象。每组每个时间点每张切片随机选择3个视野，对所选择视野中的阳性信号进行图像的分析，用半定量的方法算出每个视野下的平均的光密度值来估计各因子的表达情况。平均光密度值（AOD，Average optical density）=积分光密度值（IOD，Intergrating optical density）/像素点的数量（面积，Area）。
显微镜检测结果，如图1所示。
阳性标记强度特征
依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为：
空白组（-）... 0 分
弱阳性（+ ）…1分；
中等阳性（++） … 2分；
强阳性（+++）…3分。
依照阳性细胞数量,可分为：
弱阳性（+，指阳性细胞总数在25%以下）；
中等阳性（++,指阳性细胞总数在25%—49%）；
强阳性（+++，指阳性细胞总数在50%以上）。
目前多米用积分综合计量。计算公式为:（ + ）%X1 + （++）%X2+ （+++）%X3 ；总数值 <1. 0 者为（ + ）, 1. 0-1. 5 者为（++）, >1. 5 者为（+++）。至少随机观察 4 个 HPF（High power field,高倍视野）。
如图1所示该组织切片中OGN的表达程度较高，结果判定为+++,有明显的棕黄色颗粒,为OGN检测强阳性结果。该结果表明OGN在早期胃癌细胞中中表达或者高表达。
实施例2
一种检测OGN蛋白表达的方法，所述检测方法与实施例1相同，检测对象为晚期胃癌患者病理组织。
显微镜检测结果如图2所示。该组织切片中OGN的表达程度较低，结果判定为+,无明显的棕黄色颗粒,为OGN检测弱阳性结果。该结果表明OGN在晚期胃癌细胞中无表达或者低表达。
综上，不同分期的患者之间OGN表达明显存在差异，因此利用分子诊断技术在胃癌个体化治疗的临床实践中发挥着越来越重要的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测OGN蛋白表达的方法，其特征是，包括：
取胃癌患者的病理组织进行石蜡包埋切片,放置于烘箱中烘干,将石蜡切片脱蜡至水，得到脱蜡后的切片；
将脱蜡后的切片采用二甲苯和乙醇初步处理后，置于过氧化氢溶液避光浸泡后纯水润洗；
采用枸橼酸缓冲液，微波抗原修复，冷却至室温，纯水润洗后将切片放入湿盒内，免疫组化笔画圈标记，滴加二抗来源的血清进行封闭处理，倾去血清；
孵育一抗、二抗和SABC；
苏木精轻度复染，脱水、透明、封片后进行镜检，以胞浆或胞膜上出现的棕黄色或浅黄色颗粒为阳性表达，并进行图像分析。
2.根据权利要求1所述的一种检测OGN蛋白表达的方法，其特征是，采用二甲苯和乙醇初步处理的具体步骤包括：置于二甲苯中l0分钟,更换二甲苯再浸泡l0分钟,而后无水乙醇浸泡5分钟, 95%乙醇浸泡5分钟, 80%乙醇浸泡5分钟, 75%乙醇浸泡5分钟, 70%乙醇浸泡5分钟, PBS浸泡5分钟并更换PBS重复浸泡3次。
3.根据权利要求1所述的一种检测OGN蛋白表达的方法，其特征是，孵育一抗的具体方法为：在免疫组化笔画圈标记的中央滴加50ul/片按一定比例稀释好的一抗，4℃过夜孵育后，纯水润洗3次，每次5分钟。
4.根据权利要求1所述的一种检测OGN蛋白表达的方法，其特征是，所述的一抗工作液为OGN抗体，所述的一抗工作液浓度为1：200。
5.根据权利要求1所述的一种检测OGN蛋白表达的方法，其特征是，孵育二抗的具体方法为：在免疫组化笔画圈标记的中央滴加50ul/片生物素标记的二抗，37℃孵育30分钟后，纯水润洗3次，每次5分钟。
6.根据权利要求1所述的一种检测OGN蛋白表达的方法，其特征是，孵育SABC的具体方法为：在免疫组化笔画标记的中央滴一滴新鲜配置好的DAB显色液，室温显色，镜下控制反应时间，纯水洗涤以终止显色。
7.根据权利要求1所述的一种检测OGN蛋白表达的方法，其特征是，苏木精轻度复染的具体方法为：苏木精淡染核5秒后，将切片放于玻片架在染缸内流水冲洗5分钟，然后采用1%稀盐酸分化浸润5秒，最好将切片放于玻片架在染缸内流水冲洗5分钟。
8.根据权利要求1所述的一种检测OGN蛋白表达的方法，其特征是，脱水、透明、封片的具体方法为：80% 乙醇，30秒→95%乙醇I，1-2分钟→95%乙醇II，1-2分钟→无水乙醇I，1-2分钟→无水乙醇II，1-2分钟→二甲苯，3分钟，通风橱内晾片，中性树胶封片。
9.根据权利要求1所述的一种检测OGN蛋白表达的方法，其特征是，图像分析的具体方法为：采用Image-pro Plus图像分析软件，以光学显微镜放大200倍的免疫组化图片为观察对象，每组每个时间点每张切片随机选择3个视野，对所选择视野中的阳性信号进行图像的分析，用半定量的方法算出每个视野下的平均光密度值来估计各因子的表达情况；所述平均光密度值的计算方法为：平均光密度值=积分光密度值/像素点的数量。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的一种检测OGN蛋白表达的方法在胃癌辅助诊断中的应用。
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