CN103336134A

CN103336134A - 一种检测her2和muc4蛋白表达的方法及其在癌症治疗中的应用

Info

Publication number: CN103336134A
Application number: CN2013102858262A
Authority: CN
Inventors: 贾浩; 丛茜; 郭晗; 江丽娜; 路之越
Original assignee: BEIJING QINLAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING QINLAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2033-07-09
Also published as: CN103336134B

Abstract

本发明提供了一种检测HER2和MUC4蛋白表达的方法及其在乳腺癌个性化治疗中的应用。本发明通过免疫组化染色乳腺癌患者的病理组织，可检测HER2和MUC4在乳腺癌组织中的表达情况，该方法操作简便，检测准确，通过显微镜观察拍照，检测结果更加直观；本发明的方法检测乳腺癌患者对曲妥珠单抗的耐药性，可为乳腺癌患者的诊断、治疗和评价提供依据，可以防止盲目的使用曲妥珠单抗（赫赛汀）给患者带来的治疗时机的错失以及经济损失。

Description

一种检测HER2和MUC4蛋白表达的方法及其在癌症治疗中的应用

技术领域

本发明涉及核酸、蛋白质检测方法，特别涉及一种检测HER2和MUC4蛋白表达的方法及其应用。

背景技术

乳腺癌目前是世界各地女性中发病率最高，并且成为女性因癌症死亡的主要因素。随着全球人口老龄化及世界总人口的持续增长，以及在发展中国家及地区医疗设施的落后，癌症的发病率急剧上升。根据2011年A Cancer Journal for Clinicians 在线出版了《Global Cancer Statistics》全球肿瘤统计报告中显示，约有1270万癌症病例和760万癌症死亡者进行了评估，其中约56%的癌症病例和64%的癌症死亡者来自发展中国家或地区。乳腺癌在女性中发病率高，并且为女性癌症死亡的主要因素，占所有女性癌症病例的23%和癌症死亡数的14%。与十几年前相比，发展中国家或地区的女性癌症死亡的主因已从以宫颈癌为最常见原因，转变为以乳腺癌。甚至，发展中国家或地区的女性肺癌死亡率与宫颈癌一样高，以上两项均占女性癌症死亡数的11%。虽然发展中国家或地区中两性癌症总发病率为发达国家或地区的一半，但是癌症的死亡率却是相似的。发展中国家或地区中癌症患者将更加贫穷，大概是因为患者晚期就诊及没有得到适时的、标准化的治疗。

在所有的乳腺癌患者中，HER2的过表达与之密切相关。研究发现 20%-25%的乳腺癌患者存在 HER2 基因的过表达或扩增。过表达的 HER2 与其他受体（尤其是 HER3）形成亲和力更强的异源二聚体，表现出更强的信号传导能力。如激活 MAPK 通路，进一步激活其转录因子 c-myc、c-jun 等，促进肿瘤的增殖、转化；激活 PI3K/AKT通路，活化的 AKT 可促使 p53 降解，还可以激活核因子-κB(NF-κB），降低 TNF-α的抗肿瘤能力。除此之外，高表达的 HER2 还可以抵抗他莫昔芬对雌激素受体阳性乳腺癌的治疗作用，这可能与 HER2 减低类固醇激素的表达有关。HER2 分子在乳腺癌发生发展及治疗耐药中起着重要的作用。

曲妥珠单抗（赫赛汀）是重组人源化单克隆抗体，能与 HER2 的胞外区域特异性结合，是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的第一个用于治疗 HER2 过表达转移性乳腺癌的生物治疗药物。研究显示，在HER2阳性乳腺癌妇女中，赫赛汀作为单药治疗、联用标准化疗或在标准化疗后使用，均可提高反应率、无病生存期和总生存期，同时保证生活质量。自1998年以来，赫赛汀已经在全世界用于治疗超过45万名HER2阳性乳腺癌患者。

然而曲妥珠单抗（赫赛汀）对于患者的治疗费用也是相当可观的，在中国药用曲妥珠单抗一个疗程大概需要200,000人民币。曲妥珠单抗用于治疗HER2过表达的转移性乳腺癌患者，取得了较好的治疗效果，然而其单独治疗客观反应率却不高，9 个月的中位生存期只有 12%-34%，并且多数患者在使用该药一年之内就产生了耐药。

综上所述，目前急需一种能够准确检测乳腺癌患者对曲妥珠单抗抗药性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测HER2（人类表皮生长因子受体2，human epidermalgrowth factor receptor-2)和MUC4蛋白（4型黏蛋白）表达的方法，并且所述方法可用于检测乳腺癌患者对曲妥珠单抗的耐药性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种检测HER2和MUC4蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：

A. 免疫组化

1）取乳腺癌患者的病理组织进行石蜡包埋切片，放置于60℃烘箱中20~30min，将所述石蜡切片脱蜡至水，得到所述脱蜡后的切片；

2）将所述脱蜡后的切片置于二甲苯中10min，更换二甲苯再浸泡10min，而后无水乙醇浸泡5min，95%乙醇浸泡5min，80%乙醇浸泡5min，75%乙醇浸泡5min，70%乙醇浸泡5min，PBS浸泡5min并更换PBS重复浸泡3次，得到初步处理后的切片；

3）将所述初步处理后的切片置于3% H₂O₂室温孵育10~20min，以消除内源性过氧化物酶的活性，得到灭酶处理后的切片；

4）用蒸馏水冲洗所述灭酶处理后的切片，而后PBS浸泡5min并更换PBS重复浸泡3次，得到清洗后切片；

5）抗原修复：将所述清洗后切片放入抗原修复液中，并置于微波炉内加热，温度为92~98℃，然后室温放置8~10min，重复上述步骤3次，得到抗原修复后的切片；

6）将所述抗原修复后的切片放置于山羊血清工作液中，室温孵育20~30min后，除去所述山羊血清工作液，向所述切片中滴加一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃孵育过夜，得到一抗处理后的切片；

7）将所述一抗处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；

8）向上述处理后的切片中滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育30~60min，得到二抗处理后的切片；

9）将所述二抗处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；

10）向上述处理后的切片中滴加适量SABC工作液（链霉亲和素-生物素复合物），37℃孵育30~60min；

11）将上述处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡4次；

12）DAB显色：将上述处理后的切片置于DAB（二氨基联苯胺，3，3’-diaminobenzidine）中室温显色，在显微镜下观察切片的显色过程，反应时间控制在5~10min，用蒸馏水冲洗切片，得到显色后切片；

13）复染：向所述显色后切片上滴加苏木素，轻度复染所述切片，而后用盐酸酒精分化所述切片30~60s，自来水冲洗所述切片5~10min，得到复染后的切片；所述盐酸酒精为0.5%盐酸融于无水乙醇；

14）脱水、透明、封片：将所述复染后的切片，依次70%乙醇浸泡5min 75%乙醇浸泡5min，80%乙醇浸泡5min，90%乙醇浸泡5min，95%乙醇浸泡5min并重复3次，100%乙醇浸泡5min并重复3次，二甲苯浸泡20min并重复3次，中性树胶封片；

B. 显微镜观察拍照，即可检测出病理组织中HER2和MUC4蛋白的表达情况。

进一步的，步骤5）中，所述的抗原修复液为0.01M柠檬酸盐缓冲液。

进一步的，步骤6）中，所述的一抗工作液为HER2或MUC4抗体，所述的一抗工作液的浓度为1:100稀释。

进一步的，所述的检测HER2和MUC4蛋白表达的方法的应用，所述方法可用于检测乳腺癌患者对曲妥珠单抗的耐药性，当HER2和MUC4蛋白同时表达时，曲妥珠单抗对于乳腺癌患者的治疗有效。

本发明相比现有技术具有以下有益效果：

1、本发明通过免疫组化染色乳腺癌患者的病理组织，可检测HER2和MUC4在乳腺癌组织中的表达情况，该方法操作简便，检测准确，通过显微镜观察拍照，检测结果更加直观；

2、通过本发明的方法检测乳腺癌患者对曲妥珠单抗的耐药性，可为乳腺癌患者的诊断、治疗和评价提供依据，可以防止盲目的使用曲妥珠单抗（赫赛汀）给患者带来的治疗时机的错失以及经济损失。

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1 在乳腺癌组织中检测结果表明HER2在乳腺癌细胞中不表达或者低表达；

图2 在乳腺癌组织中检测结果表明HER2在乳腺癌细胞中中表达或者高表达；

图3 在乳腺癌组织中检测结果表明MUC4在乳腺癌细胞中中表达或者高表达；

图4 在乳腺癌组织中检测结果表明MUC4在乳腺癌细胞中不表达或者低表达。

具体实施例

实施例1

一种检测HER2蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：

A. 免疫组化

1）取女性A乳腺癌患者的病理组织进行石蜡包埋切片，放置于60℃烘箱中20min，将所述石蜡切片脱蜡至水，得到所述脱蜡后的切片；

3）将所述初步处理后的切片置于3% H₂O₂室温孵育20min，以消除内源性过氧化物酶的活性，得到灭酶处理后的切片；

5）抗原修复：将所述清洗后切片放入抗原修复液中，并置于微波炉内加热，温度为92~98℃，然后室温放置8min，重复上述步骤3次，得到抗原修复后的切片；

6）将所述抗原修复后的切片放置于山羊血清工作液（武汉博世德公司，货号AR0009）中，室温孵育30min后，除去所述山羊血清工作液，向所述切片中滴加一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃孵育过夜，得到一抗处理后的切片；所述的一抗工作液的浓度为1:100稀释；

8）向上述处理后的切片中滴加适量生物素标记二抗工作液（rabbit IgG-HRP 美国santa cruz公司，货号sc-2749），37℃孵育60min，得到二抗处理后的切片；所述二抗工作液的浓度为1:500稀释；

10）向上述处理后的切片中滴加适量SABC工作液（武汉博世德公司，货号SA1029），37℃孵育60min；

12）DAB显色：将上述处理后的切片置于DAB（武汉博世德公司，货号SA2022）中室温显色，在显微镜下观察切片的显色过程，反应时间控制在5~10min，用蒸馏水冲洗切片，得到显色后切片；

13）复染：向所述显色后切片上滴加苏木素，轻度复染所述切片，而后用盐酸酒精分化所述切片30s，自来水冲洗所述切片10min，得到复染后的切片；所述盐酸酒精为0.5%盐酸融于无水乙醇；

B. 显微镜观察拍照，即可检测出病理组织中HER2蛋白的表达情况，所述显微镜为Nikon公司出品。

所述山羊血清工作液、二抗工作液、SABC工作液及DAB购自武汉博世德公司；所述一抗工作液购自CST和ABCAM公司(美国)；

进一步的，步骤6）中，所述的一抗工作液为HER2抗体（美国CST公司，货号：4290）。

显微镜检测结果，如图1所示。

阳性标记强度特征

依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为：

弱阳性（+）┅1分；

中等阳性（++）┅2分；

强阳性（+++）┅3分。

依照阳性细胞数量，可分为：

弱阳性（+ ，指阳性细胞总数在25%以下）；

中等阳性（++,指阳性细胞总数在25%—49%)；

强阳性（+++ ，指阳性细胞总数在50%以上)。

目前多采用积分综合计量。计算公式为：（+）%X1 +（++）%X2+（+++）%X3；总数值<1.0者为（+），1.0-1.5者为(++)，>1.5者为(+++)。至少随机观察4个HPF（High power field，高倍视野）。

该组织切片中HER2的表达程度较低，结果判定为+，无明显的棕黄色颗粒，为HER2检测阴性结果。该患者病理组织切片中HER2的表达程度较低，经过曲妥珠单抗治疗一个疗程即出现了耐药性，终止曲妥珠单抗治疗。

不同的患者之间对于治疗的耐药性反应明显存在差异，因此利用分子诊断技术在乳腺癌个体化沴疗的临床实践中发挥着越来越重要的作用。MUC4的亚基ASGP-2可以通过EGF样结构与HER2结合，在空间上掩盖曲妥珠单抗（赫赛汀）与HER2的结合位点，使得耐药性增强。然而当MUC4基因被敲除以后，可以恢复曲妥珠单抗（赫赛汀）对乳腺癌肿瘤的敏感性。

实施例2

一种检测HER2蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：

A. 免疫组化

1）取女性B乳腺癌患者的病理组织进行石蜡包埋切片，放置于60℃烘箱中20min，将所述石蜡切片脱蜡至水，得到所述脱蜡后的切片；

6）将所述抗原修复后的切片放置于山羊血清工作液中，室温孵育30min后，除去所述山羊血清工作液，向所述切片中滴加一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃孵育过夜，得到一抗处理后的切片；

8）向上述处理后的切片中滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育60min，得到二抗处理后的切片；

10）向上述处理后的切片中滴加适量SABC工作液，37℃孵育60min；

12）DAB显色：将上述处理后的切片置于DAB中室温显色，在显微镜下观察切片的显色过程，反应时间控制在5~10min，用蒸馏水冲洗切片，得到显色后切片；

B. 显微镜观察拍照，即可检测出病理组织中HER2蛋白的表达情况。

进一步的，步骤6）中，所述的一抗工作液为HER2抗体。

显微镜检测结果，如图2所示。可见该组织切片中HER2的表达量较高，结果判定为+++，有明显的黄色颗粒，为HER2检测阳性结果，经过曲妥珠单抗治疗效果明显，未出现耐药性。

继续使用该女性B乳腺癌患者的病理组织进行MUC4的表达量检测，方法与本实施例所述的检测HER2蛋白表达的方法基本相同，不同之处为步骤6）中，所述的一抗工作液为MUC4抗体（美国ABCAM公司，货号：ab52263）。

显微镜检测结果，如图3所示。可见该组织切片中MUC4的表达量较高，结果判定为+++，有明显的黄色颗粒，为MUC4检测阳性结果，后经曲妥珠单抗治疗效果明显，未出现耐药性。

实施例3

一种检测MUC4蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：

A. 免疫组化

1）取女性C乳腺癌患者的病理组织进行石蜡包埋切片，放置于60℃烘箱中20min，将所述石蜡切片脱蜡至水，得到所述脱蜡后的切片；该名患者的病理组织切片已通过检测，证实HER2检测呈阳性；

8）向上述处理后的切片中滴加适量生物素标记二抗工作液（羊抗兔），37℃孵育60min，得到二抗处理后的切片；

B. 显微镜观察拍照，即可检测出病理组织中MUC4蛋白的表达情况。

进一步的，步骤6）中，所述的一抗工作液为MUC4抗体。

显微镜检测结果，如图4所示。可见该组织切片中MUC4的表达量偏低，结果判定为+，未见明显的黄色颗粒，为MUC4检测阴性结果，后经曲妥珠单抗治疗，治疗效果在初期良好，但在化疗第4个疗程开始出现耐药性。

我们通过本发明所述的方法，对45例乳腺癌患者免疫组化染色发现，当HER2呈阳性时，MUC4在乳腺癌组织中高表达或者中表达时，患者对曲妥珠单抗的药物更敏感，即在乳腺癌组织中当HER2和MUC4同时表达时，曲妥珠单抗对于患者的治疗更有效。参见表1，本发明以HER2和MUC4阳性细胞占整个组织的百分比作为阳性结果及阴性结果的判断，即表达率高于30%为阳性（+）。结果发现当HER2在乳腺癌组织表达时，MUC4同时高表达时，患者使用曲妥珠单抗（赫赛汀）对于患者的治疗更有效。X2检验分析显示HER2和MUC4对于乳腺癌的治疗有显著相关性。P＜0.05，属于显著性差异。

Figure 2013102858262100002DEST_PATH_IMAGE001

Claims

1.一种检测HER2和MUC4蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A. 免疫组化

10）向上述处理后的切片中滴加适量SABC工作液，37℃孵育30~60min；

13）复染：向所述显色后切片上滴加苏木素，轻度复染所述切片，而后用盐酸酒精分化所述切片30~60s，自来水冲洗所述切片5~10min，得到复染后的切片；

2.根据权利要求1所述的检测HER2和MUC4蛋白表达的方法，其特征在于，步骤5）中，所述的抗原修复液为0.01M柠檬酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的检测HER2和MUC4蛋白表达的方法，其特征在于，步骤6）中，所述的一抗工作液为HER2抗体或MUC4抗体，所述的一抗工作液的浓度为1:100稀释。

4.一种如权利要求1所述的检测HER2和MUC4蛋白表达的方法的应用，其特征在于，所述方法可用于判断乳腺癌患者对曲妥珠单抗的耐药性，当HER2和MUC4蛋白同时表达时，曲妥珠单抗对于患者的治疗有效。