CN106370852B - 胃腺癌标志物Drosha蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种胃腺癌标志物Drosha蛋白及其应用。包括Drosha蛋白在制备胃腺癌的诊疗试剂中的应用，可用于评估胃腺癌预后和/或筛选胃腺癌药品。本发明中用于评估胃腺癌预后和/或筛选胃腺癌药品的试剂盒，所述试剂盒包括：特异性结合所述Drosha蛋白的抗体；特异性标识所述Drosha蛋白的试剂。本发明应用方法中Drosha蛋白作为标志物在病变样本中胞浆的表达水平和/或表达模式与胃腺癌的分级呈负相关，Drosha蛋白的高表达可作为判断为腺癌病人预后良好的独立预后因子，也可通过将待测化合物与所述Drosha蛋白结合，检测所述化合物是否促进或抑制所述蛋白的表达来筛选有效的胃腺癌药品，具有重要的临床应用价值。

Description

胃腺癌标志物Drosha蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种胃腺癌标志物Drosha蛋白及其应用。

背景技术

胃腺癌是胃癌的一种，是由胃腺体细胞恶变来的，所以叫做腺癌。胃腺癌的发生率占胃恶性肿瘤的95％，胃腺癌对放疗、化疗的敏感性不高，但可作为胃腺癌的治疗辅助方法。世界各地胃癌的发生率各不相同。例如，日本、智利和冰岛发病率非常高。在美国，胃癌最常见于北方人，穷人和黑人，但其发病率已降低到约810万，是引起癌肿死亡的第七位原因，然而，在日本，胃癌发病率已有降低，但仍是最常见的恶性肿瘤，它的发病率随年龄增长而增加，75％以上的患者年龄大于50岁。

肿瘤标志物又称肿瘤标记物，是指特征性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质，或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质，并能反映肿瘤发生、发展，监测肿瘤对治疗反应的一类物质。肿瘤标志物存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测到。对于肿瘤标志物的检测可对肿瘤存在、发病过程及预后作出判断。目前已有不少研究发表，公开号为CN104498495A的专利公布了一种前列腺癌标志物lncRNA MALAT-1及其应用，公开号为CN104630379A的专利公布了一种非小细胞型肺癌标志物FAM107A及其应用，FAM107A与非小细胞肺癌具有很好的相关性，可用于制备非小细胞肺癌辅助诊断或者预后制剂，具有重要的临床应用价值。公开号为CN103217534A的专利公布了一种肺癌标志物SBP-1及其用途，及SBP-1作为标志物用于肺癌的检测方法。目前尚未见有胃腺癌相关的专利公布。

微小RNA(miRNA)是一类长度为18-22个核苷酸的单链非编码RNA，通过碱基互补配对的方式结合到靶信使RNA(mRNA)的3’末端非翻译区，抑制或降解该mRNA，从而调控基因的表达。越来越多证据表明，miRNA可调控相关基因的表达，影响细胞的增殖、侵袭及转移能力从而参与到胃癌的发生及发展过程中。在miRNA的生物学合成过程中，Drosha蛋白属于核糖核酸酶家族成员之一，Drosha作为重要的剪切酶，通过结合DGCR8，行使pri-miRNA到pre-miRNA的剪切加工功能，从而直接影响miRNA的成熟。因此，Drosha与癌症的关系，近年来引起了肿瘤研究者的极大兴趣，Tchernitsa，Merritt等多篇研究结果表明Drosha蛋白是与肿瘤预后有关的重要因素之一，但Drosha与胃腺癌的关系还未有研究和专利公布。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种Drosha蛋白的新用途，即Drosha蛋白在制备胃腺癌的诊疗试剂中的应用。Drosha蛋白序列(NCBI GI：20139357)。Drosha蛋白为核内核糖核酸酶III家族的一员，对miRNAs的转录后调控起着重要的作用，由于miRNAs与癌症密切相关，作为miRNAs重要调控因子的Drosha也得到了研究者们越来越多的关注。

进一步，所述应用包括用于评估胃腺癌预后和/或筛选胃腺癌药品的应用。

本发明的目的之二在于提供一种用于评估胃腺癌预后和/或筛选胃腺癌药品的试剂盒，所述试剂盒用于特异性检测胃腺癌样本胞浆中Drosha蛋白的表达水平和/或表达模式，包括以下物质：

1)特异性结合所述Drosha蛋白的抗体；

2)特异性标识所述Drosha蛋白的试剂。

胃腺癌分级分期越高，肿瘤体积越大，浸润程度越深及远处转移的组织中，胞浆Drosha蛋白的表达水平较低，提示胞浆Drosha蛋白是阻止胃腺癌恶性发展的抑癌因子和标志物。

除了包含在特异性检测所述病变样本胞浆中Drosha蛋白的表达水平和/或表达模式的物质，本发明中用于评估胃腺癌预后的试剂盒还可以包括适用于分析表达水平或表达模式的方法或分析蛋白表达水平或表达模式的相关试剂和仪器装置。本发明旨在达到的技术效果，只要该物质能够检测到这样差异即可。而且，本领域的普通技术人员根据具体的实施方式参照相关领域的公知常识能够选择并使用合适的物质。

与所述Drosha蛋白特异结合的抗体能够用于确定表达水平和/或表达模式。在此，抗体是指能够与抗原的表位特异结合的蛋白，包含多克隆抗体、单克隆抗体以及重组抗体。

进一步，所述胃腺癌样本包括胃腺癌组织和/或胃腺癌细胞。

进一步，所述试剂盒特异性检测的方法包括组织免疫染色和/或蛋白质印迹和/或蛋白芯片和/或Western Blot检测。特异性检测胃腺癌样本胞浆中Drosha蛋白的表达水平和/或表达模式的方法有：蛋白质印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射免疫测定、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)、组织免疫染色、免疫沉淀测定、补体结合试验、FACS(荧光活化细胞分类)、蛋白芯片等。除上述以外，可以使用本领域中普遍采用的其他方法。

本发明的目的之三在于提供一种评估胃腺癌预后的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)处理胃腺癌病变样本；

2)检测所述样本胞浆中Drosha蛋白表达水平和/或表达模式；

3)检测结果与基准比较步骤2)所述样本胞浆中Drosha蛋白表达水平和/或表达模式的差异。

通过上述方法，可以将被胃腺癌病变样本中的抗原抗体复合物的形成水平或形成模式与标准水平比较，且能够从中确定本发明的所述Drosha蛋白的表达水平和/或表达模式，并最终能够评估胃腺癌患者的预后。

进一步，步骤3)所述检测结果中Drosha蛋白在胃腺癌病变样本胞浆中高表达可以作为判断胃腺癌预后良好的独立指标。Drosha蛋白的表达水平和/或表达模式与胃腺癌的分级呈负相关，随着胃腺癌细胞株的分化变差，胞浆Drosha蛋白的表达量逐渐降低。在预后检测中，胞浆Drosha蛋白表达水平相比基准数据越高，胃腺癌病人预后越好。Drosha蛋白的表达水平和/或表达模式与也与病人年龄、肿瘤的体积、浸润深度及分期呈负相关。

进一步，步骤3)所述检测结果中Drosha蛋白表达数据为基准数据的2.37倍以上可视为预后良好。

本发明的目的还在于提供一种筛选胃腺癌药品的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)将待测化合物与所述Drosha蛋白结合；

2)检测所述测试化合物是否促进或抑制所述Drosha蛋白的表达。

进一步，步骤2)所述检测中促进所述Drosha蛋白的表达提示该化合物可作为治疗胃腺癌的药品。本发明的胃腺癌预后标记物是根据胃腺癌患者的预后而显示出表达水平或模式的显著差异，可以作为判断胃腺癌预后良好的独立指标。因此，在可通过胃腺癌预后标记物表达水平或模式筛选有效的胃腺癌药品。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种胃腺癌标志物Drosha蛋白及其应用，包括Drosha蛋白在制备胃腺癌的诊疗试剂中的应用，可用于评估胃腺癌预后和/或筛选胃腺癌药品。本发明应用方法中Drosha蛋白作为标志物在病变样本中胞浆的表达水平和/或表达模式与胃腺癌的分级呈负相关，与病人年龄、肿瘤的体积、浸润深度及分期也呈负相关，Drosha蛋白的高表达可作为判断为腺癌病人预后良好的独立预后因子，也可通过将待测化合物与所述Drosha蛋白结合，检测所述待测化合物是否促进或抑制所述蛋白的表达来筛选有效的胃腺癌药品。本发明应用方法简捷，具有较高的特异性和敏感性，可用于制备胃腺癌诊疗产品中，具有重要的临床应用价值。

附图说明

图1为本发明中胃癌发生发展模式中Drosha亚细胞表达的情况示意图。

图2为本中发明中Western blot检测SGC-7901细胞siRNA干扰前后Drosha蛋白的表达量。

图3为本中发明中SGC-7901细胞siRNA干扰Drosha表达前后细胞侵袭能力检测结果示意图。

图4为本中发明中胞浆/胞核Drosha与胃腺癌病人预后关系示意图。

图5为本发明中Drosha表达值与219例胃腺癌病人总体生存率的Kaplan生存曲线图。A按Drosha表达的中位值将病人分为两组(Drosha阳/阴性)；B按Drosha表达的四分位值将病人分为四组。

图6为本发明中正常及胃癌细胞株中Drosha的亚细胞表达情况示意图。

具体实施方式

以下将结合附图，对本发明作详细的说明。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以，熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中，采用的主要材料：

829例人胃腺癌不同病理阶段组织芯片样本。

胃癌细胞株NCI-N87、MGC-803、HGC-27、SGC-7901和正常胃粘膜上皮细胞株GES-1。

主要分析方法：

IPP软件检测组织芯片中胞浆及胞核Drosha的表达量。

应用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)统计分析软件对相关数据进行统计学分析。独立样本T检验用于分析Drosha在胃各疾病阶段表达的差异，卡方检验用于分析Drosha与各临床参数之间的关系，Kaplan-meier方法用于评估Drosha对腺癌病人预后的价值。所有检验水准P≤0.05表示结果具有统计学意义。

实施例一胞浆与胞核Drosha蛋白的表达量与胃腺癌的临床病理相关分析

材料：829例人胃腺癌不同病理阶段组织芯片样本。

方法：829例胃腺癌样本的组织芯片做免疫组化染色分析，IPP软件检测组织芯片中胞浆及胞核Drosha的表达量。

免疫组织化学染色

1)脱蜡：石蜡包埋的组织芯片，先60℃恒温箱溶化石蜡，然后依次放入二甲苯I、II、III中分别脱蜡10min；

2)水化：脱蜡后的组织芯片依次放入100％酒精I、II，95％酒精，85％酒精，70％酒精，PBS缓冲液I、II、III，各放置5min；

3)封闭内源性过氧化物酶：滴加3％H2O2覆盖组织，37℃作用10min；PBS I、II、III各冲洗5min；

4)抗原高温修复：组织芯片于枸橼酸盐(pH＝6.0)缓冲液中高温高压修复抗原5min；

5)封闭：封闭血清37℃封闭30min；

6)一抗孵育：倾去封闭血清，滴加1:100稀释的兔抗人Drosha抗体(Abcam,ab12286)，PBS作为阴性对照，4℃过夜；

7)二抗孵育：吸尽一抗，PBS I、II、III各冲洗5min，并用滤纸在切片边缘吸尽PBS，在组织芯片上滴加二抗，37℃孵育60min；PBSI、II、III各冲洗5min；

8)DAB显色：1:20配置新鲜DAB显色工作液，滴加于组织上，显微镜下实时观察染色的情况，自来水终止染色；

9)复染：滴加苏木素，染色5min，碳酸锂饱和溶液中返蓝30s；

10)冲洗：自来水冲洗切片30min，自然干燥过夜；

11)透明：二甲苯中浸泡30min；

12)封片：组织表面滴加中性树胶，盖上盖玻片，自然晾干；

13)拍照：正置荧光显微镜拍照保存。

IPP软件检测后分析发现，胃腺癌组织样本中胞浆Drosha表达的中位数值(即样本MOD的中位值)为0.1948，胞核Drosha表达的中位数值为0.1423。按各中位值分别把胃癌病人分为胞浆Drosha表达阳性组(MOD≥0.1948)、胞浆Drosha表达阴性组(MOD<0.1948)和胞核Drosha表达阳性组(MOD≥0.1423)、胞浆Drosha表达阴性组(MOD<0.1423)，然后进行Drosha与临床参数分析。

分析结果如表1所示：胞浆Drosha的表达与胃腺癌的肿瘤分级呈负相关，且随着癌症分级升高，其表达值由I级时的0.325逐渐降低至II级的0.2515，III级的0.1749和IV级的0.0862；此外，胞浆Drosha的表达还与病人年龄，肿瘤的体积、浸润深度及分期负相关，在弥散型胃癌和转移性胃癌中低表达。而胞核Drosha则在癌旁组织中的高表达(0.6024)，在胃腺癌中表达量较低，且与胃腺癌分级的进程不相关(见图1)。

表1 Drosha的胞浆/胞核表达与胃腺癌临床病理的相关性

黑体表示Drosha的胞浆或胞核表达与该病理特征相关，P<0.05。

以上数据分析表明，胞浆Drosha的表达随着胃腺癌恶性的发展逐渐降低，与胃腺癌的病理密切相关。

实施例二抑制Drosha的表达促进胃癌细胞侵袭

材料：胃癌细胞株SGC-7901。

方法：Western blot检测SGC-7901细胞siRNA干扰前后Drosha蛋白的表达量。

细胞培养及细胞转染

含10％胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养SGC-7901细胞。待细胞融合为60％左右时，根据Roche脂质体转染说明书将siRNA和阴性对照序列分别转染SGC-7901细胞，转染48h后收集蛋白进行检测及作Transell侵袭实验。

为进一步验证实施例1表1中Drosha与肿瘤侵润深度之间的相关性，用siRNA抑制胃癌细胞株SGC-7901中Drosha的表达(见图2)，然后Transwell检测细胞的侵袭能力，发现Drosha敲低组的侵袭细胞数(192±15.2)较对照组侵袭细胞数(84±7.1)显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)(见图3)。

实施例三225例胃腺癌病人预后相关分析

为进一步研究Drosha胞浆表达与为胃腺癌病人预后的关系，对实施例1中预后的225例病人作相关预后分析。如图4所示，Kaplan生存曲线分析表明，胞浆Drosha的表达水平与腺癌病人的预后具有显著相关性(LR＝7.088,P＝0.008)，而胞核Drosha的表达水平与腺癌病人的预后不相关(LR＝1.954,P＝0.162)。

为深入探究胞浆/胞核Drosha是否可作为胃腺癌病人的独立预后因子，先用COX单因素分析找出与病人预后相关的潜在预后因子。如表2所示：单因素分析可知胃癌的Laren分型(P＝0.001)，肿瘤发生部位(P＝0.002)，肿瘤浸润深度(P＝0.001)，肿瘤分级(P<0.001)，分期(P<0.001)及胞浆Drosha表达(P＝0.005)可作为胃腺癌病人潜在的独立预后因子。

表2 COX单因素分析胃腺癌病人的预后因子

再对这些潜在预后因子作COX多因素回归分析，如表3所示，结果发现：胞浆Drosha确实可以作为胃腺癌病人的独立预后因子(P＝0.024)，此外，肿瘤浸润深度和胃腺癌分期也可作为独立因子来判断胃腺癌病人预后。

实施例四Drosha对胃腺癌病人的预后价值分析

材料：带随访数据的胃腺癌样本219例Drosha表达数据。

方法：应用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)统计分析软件对相关数据进行统计学分析。独立样本T检验用于分析Drosha在胃各疾病阶段表达的差异，卡方检验用于分析Drosha与各临床参数之间的关系，Kaplan-meier方法用于评估Drosha对腺癌病人预后的价值。所有检验水准P≤0.05表示结果具有统计学意义。

根据Drosha表达的中位值，将有预后资料的胃腺癌病人分为两组，即Drosha阳性病人组和Drosha阴性病人组。分别对该两组病人进行Kaplan生存分析，发现Drosha阳性组生存期高于阴性组，但两者不具有统计学差异(P＝0.075)(见图5A)。进一步以Drosha表达值的四分位数(分别为0.125,0.212,0.310)把胃腺癌病人分为4组，进行Kaplan生存分析，结果表明高四分位组(即Drosha>0.310组)病人的总体生存率明显高于其他三组(Log Rank＝10.024，P＝0.002)(见图5B)。

实施例五胃癌细胞株中胞浆Drosha表达

材料：

胃癌细胞株NCI-N87、MGC-803、HGC-27、SGC-7901和永生化胃正常上皮细胞株GES-1。

方法：通过上述实施例对胃腺癌组织中Drosha的亚细胞表达分析可知，胞浆Drosha与胃腺癌的分级呈负相关。为进一步验证此结果，采用正常胃上皮细胞株(GES-1)和不同分化等级的胃癌细胞株(包括高分化等级的NCI-N87细胞株，中分化的SGC-7901细胞株，低分化的MGC-803细胞株和未分化的HGC-27细胞株)作免疫荧光染色和免疫印迹分析。

细胞培养

含10％胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养细胞。

免疫荧光染色

1)铺细胞爬片：洁净消毒盖玻片置于24孔板，加入常规消化重悬的细胞(细胞密度以保证48h后能长到70％融合度为佳)，37℃培养48h；

2)固定：倾去培养基，PBS洗2次，每孔加入4％多聚甲醛300μl固定20min；

3)透膜：PBS洗2次，加入0.1％Triton 300μl透膜15min；

4)封闭：PBS洗2次，加入5％封闭血清300μl室温封闭1h；

5)一抗孵育：去除爬片放于蜡板上，吸尽封闭血清，滴加稀释后的一抗，4℃孵育过夜；

6)二抗孵育：PBS洗3次，滴加FITC标记二抗，室温孵育2h；

7)定核：PBS洗3次，滴加DAPI液定核5min；

8)封片：PBS洗3次，细胞爬片倒铺于滴加了100％甘油的玻片上；

9)拍照：正置荧光显微镜拍照保存。

细胞浆/核蛋白分离提取

细胞收集：取对数生长期细胞，倾去培养基，PBS清洗1遍，刮取细胞后3000g离心10min，尽可能吸去上清，留取细胞沉淀；

胞浆蛋白抽提：每20μl细胞沉淀加入200μl胞浆蛋白抽提试剂A(已提前几分钟加入PMSF)，剧烈涡旋5s后冰浴15min；按试剂B：试剂A为1:20的量加入试剂B(已提前几分钟加入PMSF)，剧烈涡旋1min后冰浴1min；4℃14000g离心5min，吸取上清即为胞浆蛋白；

胞核蛋白抽提：尽量吸尽上清，留取沉淀，按胞核蛋白抽提试剂：胞浆蛋白抽提试剂A为1:4的量加入胞核蛋白抽提试剂(已提前几分钟加入PMSF)，冰浴30min，期间每隔2min剧烈涡旋3s，4℃14000g离心10min，吸取上清即为胞核蛋白。

免疫印迹分析

1)蛋白电泳：配置8％的SDS-PAGE电泳凝胶，每孔蛋白上样40μg，两步法电泳：恒压80V电泳30min后转为100V继续电泳120min；

2)转PVDF膜：PVDF膜经甲醇30s，双蒸水2min激活后，将电泳后的凝胶覆于膜上，湿转仪恒流210mA转膜130min；

3)一抗孵育：TBST洗膜3次后5％奶粉室温封闭2h，滴加1:1000的兔抗人Drosha抗体4℃孵育过夜；

4)二抗孵育：TBST洗膜3次后滴加1:1000山羊抗兔辣根过氧化物酶二抗室温孵育3h；

发光：TBST洗膜2次，TBS洗膜一次后滴加化学发光液，Licor Odyssey InfraredImaging System扫描成像。

如图6所示，结果均表明：正常胃上皮细胞株中胞浆Drosha基本无表达，随着胃癌细胞株的分化变差，胞浆Drosha的表达量逐渐降低；而胞核Drosha在正常胃上皮细胞株中高表达，在高分化细胞株中表达量很低，在其他分化细胞株中则中度表达。此现象与在胃腺癌组织中的发现相一致。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.Drosha蛋白在制备胃腺癌的分级标志物中的应用，其特征在于，所述Drosha蛋白包括胞浆Drohsa和胞核Drosha；胞浆Drosha的表达与胃腺癌的肿瘤分级呈负相关。

2.根据权利要求1所述的应用，所述胞浆Drosha蛋白随着胃腺癌细胞株的分化变差表达量逐渐降低，胞浆Drosha的表达与病人年龄，肿瘤的体积、浸润深度及分期负相关。