CN107460244A - 一种用于检测卵巢癌的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测卵巢癌的试剂盒，包括KIAA1199基因标样，检测引物试剂和PCR体系试剂；所述的引物试剂中的引物序列包括上游引物5’‑CCAGGAATGTTGAATGTCT‑3’和下游引物5’‑ATTGGCTCTTGGTGAATG‑3’。本发明运用RT‑PCR、Western Blot、免疫组化和Transwell小室模型等现代分子生物学技术，发现KIAA1199在卵巢癌组织中高表达，其表达与卵巢癌的临床分期、转移有关；并且成功构建出靶向KIAA1199基因干扰siRNA，在细胞水平研究干扰KIAA1199基因后对卵巢癌细胞迁移能力的影响，基于此，本发明提供的试剂盒，可用于检测卵巢癌，提供的干扰siRNA，可干扰靶向KIAA1199基因，具有很好的实用性。

Description

一种用于检测卵巢癌的试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于检测卵巢癌的试剂盒。

背景技术

卵巢癌是严重威胁女性健康的恶性生殖器官肿瘤之一，其发病率位列第三位，但其死亡率一直占据妇科恶性肿瘤首位。卵巢癌以上皮性癌为主，起病隐匿，多数患者就诊时已至晚期，此时卵巢癌生长迅速，并且发生侵袭、扩散和远端转移，表现为腹水形成及腹腔内病灶播散，预后差。临床上虽经瘤体减灭术辅以化疗，但5年生存率仍徘徊在30％左右，给社会造成了沉重的精神和经济负担。到目前为止，卵巢癌病因不明，没有一级预防措施，难以早期发现。因此，探索新的基因功能改变与卵巢癌发生发展的关系，寻找可靠早期诊断指标，设计合理的治疗药物及判断预后，一直是妇科恶性肿瘤研究中的难点与热点问题，这对提高我国卵巢癌的治疗水平具有重要意义。

肿瘤的发生发展是一个多阶段、多步骤、多基因参与的病理过程，涉及到原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的异常表达，在本质上是一种多基因异常的疾病。KIAA1199基因，最初在非综合征性先天性耳聋患者内耳发现，由于其突变，导致患者听觉丧失，因此该基因曾被称为耳聋基因，但这个基因的具体功能当时并不清楚。此后临床陆续发现，在胃癌、大肠癌、舌癌患者癌组织内KIAA1199高表达。相关性分析表明，胃癌组织内KIAA1199表达与五年生存率呈负相关，临床病理显示，KIAA1199高表达者，其癌细胞发生淋巴结转移、远处转移和腹膜播散非常常见，因此KIAA1199可作为一个独立胃癌预后判断因素。另外在早期结肠癌患者的血中也发现高浓度的KIAA1199蛋白，可能是一个早期诊断指标。在一项大规模筛选与细胞迁移相关基因的实验中发现，经concanavalin A处理的人HT-1080纤维肉瘤，其细胞表面蛋白水解能力和细胞迁移显著增强，KIAA1199表达也显著上调。研究发现，KIAA1199在浸润性乳腺癌中高表达，并且与病人的存活存负相关关系。进一步免疫共沉淀实验发现，KIAA1199是一种新型的内质网蛋白，能与分子伴侣绑定蛋白(chaperone binding immunoglobulin protein,BiP)、内质网葡萄糖调节蛋白78形成蛋白复合体，调节内质网钙释放。KIAA1199是通过增加细胞内钙的水平，使得蛋白激酶Cα(PKCα)活化，在细胞迁移和侵袭起着至关重要的作用。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于检测卵巢癌的试剂盒，满足检测卵巢癌的使用需求。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测卵巢癌的试剂盒，包括KIAA1199基因标样，检测引物试剂和PCR体系试剂；所述的引物试剂中的引物序列包括上游引物5’-CCAGGAATGTTG-AATGTCT-3’和下游引物5’-ATTGGCTCTTGGT-GAATG-3’。

所述的KIAA1199基因序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的用于检测卵巢癌的试剂盒的检测方法：提取样品的RNA，使用引物试剂和PCR体系试剂进行PCR反应，并以KIAA1199基因标样为对照，对PCR产物进行检测，并判断结果即可。

一种用于治疗卵巢癌的药物，为靶向KIAA1199基因的干扰siRNA。

有益效果：与现有技术相比，本发明运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化和Transwell小室模型等现代分子生物学技术，发现KIAA1199在卵巢癌组织中高表达，其表达与卵巢癌的临床分期、转移有关；并且成功构建出靶向KIAA1199基因干扰siRNA，在细胞水平研究干扰KIAA1199基因后对卵巢癌细胞迁移能力的影响，基于此，本发明提供的试剂盒，可用于检测卵巢癌，提供的干扰siRNA，可干扰靶向KIAA1199基因，具有很好的实用性。

附图说明

图1是卵巢癌组织、交界性、良性卵巢肿瘤组织中KIAA1199基因mRNA的表达水平结果图；

图2是卵巢癌组织、交界性、良性卵巢肿瘤组织中KIAA1199基因蛋白的表达水平结果图；图中，a,b KIAA1199蛋白在卵巢癌中高表达；c KIAA1199蛋白在交界性卵巢肿瘤中低表达；d KIAA1199蛋白在良性卵巢肿瘤中不表达；

图3是KIAA1199蛋白表达情况与卵巢癌患者五年生存率之间的关系图；

图4是KIAA1199基因干扰后对卵巢癌侵袭迁移能力的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明是实施方式不限于此。以下为实施例所使用的主要试剂与材料：

(1)南通大学附属医院妇产科实验室保存的新鲜或冻存的卵巢癌组织、交界性和良性卵巢肿瘤组织。

(2)南通大学附属医院病理科保存的卵巢癌组织石蜡组织标本(含完整临床资料：影像学资料、临床分期、实验室血清学检查、手术记录和随访结果等)。

(3)卵巢癌细胞系：HO-8910PM和OVCAR-3细胞株，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

(4)KIAA1199抗体购自Santa Cruz。

(5)实时定量PCR方法参照Trizol(Invitrogen公司)说明书提取细胞取组织和细胞中总RNA，按Takara公司SYBR Premix Ex Taq试剂盒检测相关基因的表达(GAPDH为内参)。

(6)组织和细胞蛋白提取按PIERCE公司T-PER Tissue Protein ExtractionReagent说明书进行，按PIERCE公司HaltTMProtease Inhibitor Cocktail Kit说明书加入蛋白酶抑制剂，用PIERCE公司BCATMProtein Assay Kit进行蛋白定量，Western blot方法检测蛋白表达。

(7)免疫组化法，按Zymed公司试剂盒说明书进行检测组织或细胞标本KIAA1199蛋白表达。

(8)KIAA1199-siRNA的合成由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。转染方法按Invitrogen公司LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行，通过CyTM3labeledSilencerR Validated siRNA以及EGFP评估转染效率，qRT-PCR检测表达或干扰效果。

(9)细胞迁移实验Transwell(8mm孔径)小室购自Costar公司，底部事先用ECM(富含HA)包被。

实施例1 RT-PCR法检测KIAA1199基因mRNA在卵巢癌组织、交界性、良性卵巢肿瘤组织中的表达差异

1、总RNA提取：取新鲜或冻存的卵巢癌组织、交界性、良性卵巢肿瘤组织约l00mg，用经液氮预冷的研体彻底研磨粉碎组织块至粉末状，每管内加入Trizol1ml混匀，于室温下孵育5～10min后吸取标本加入Rnase-free EP管中。加入0.2mL氯仿(三氯甲烷)，剧烈振荡15s，室温静置2min。4℃离心，12000r/min×15min，吸取上清(注意不要吸到下层)至另一个1.5mL离心管中。加入与上清等量的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000r/min×10min，弃上清。加入1mL预冷的75％乙醇(用DEPC水配)，轻轻洗涤沉淀，4℃离心，7500r/min×5min，弃上清。晾干，溶于20μL DEPC水中(65℃促溶10-15min)。紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度(单位μg/μL)和纯度，用DEPC水调零，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.0之间，表明提取的RNA纯度好。

2、逆转录为cDNA(reverse transcriptase，RT)：反应体系为：1μL oligo(dT)18primer，4μL 5xReaction Buffer，1μL RibolockTM Ribonuclease inhibitor，2μL10mMdNTP Mix，1μL RevertAidTM Reverse Transcriptase，5μg Total RNA，RNase Free dH₂O补至20μL。混匀后离心，42℃孵育60min，终止反应70℃5min。-20℃保存备用。

3、实时定量PCR方法按Takara公司SYBR Premix Ex Taq试剂盒检测相关基因的表达(GAPDH为内参)。25μL的反应体系为：12.5μL SYBR Green/ROX Master Mix(2×)，0.3μMForward primer(5’-CCAGGAATGTTGAATGTCT-3’)，0.3μM Reverse primer(5’-ATTGGCTCTTGGTGAATG-3’)，1μL cDNA，10.5μL水。95℃10min预变性后，进入PCR循环。95℃15s变性，60℃60s退火延伸，反应进行40个循环。

结果如图1所示，RT-PCR结果提示，检测10例卵巢癌和5例交界性、5例良性卵巢肿瘤组织中KIAA1199mRNA的表达情况。结果显示在卵巢癌组织中KIAA1199mRNA的表达显著上调，相比差异有统计学意义(*P<0.05)。

实施例2 免疫组化法检测KIAA1199蛋白表达，及其与卵巢癌患者临床病理特征和五年生存率之间的关系

1、标本收集及临床资料：126例卵巢癌标本均取自2005-01至2009-12在南通大学附属医院妇产科接受手术治疗的患者。所有患者接受了包括子宫，双侧输卵管卵巢切除术，盆腔和/或腹主动脉旁淋巴结清扫术和阑尾大网膜切除的全面分期手术。患者肿瘤切除手术后至少进行了为期六个周期的化疗。患者术前均未行放疗、化疗和内分泌等相关抗肿瘤治疗。各种临床病理资料，包括患者的年龄、肿瘤大小、病理类型、分化程度、临床分期、淋巴结转移、术前血清CA125等均保存完整。

2、组织芯片的制作

所有组织标本均常规10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，蜡块经筛选无明显缺陷，委托病理科制作成厚度为4mm厚的组织芯片五张，置于冰箱4℃冷藏室储存备用。主要流程如下：根据HE染色切片的镜检结果，在蜡块上有代表性的癌巢区域作标记。1:1混合石蜡与蜂蜡，制作空白受体蜡块。在蜡块上设计10×7孔，共350点组织阵列，然后用组织芯片仪制成TMA空白蜡块。将供体蜡块在标记的点上选取最有代表性的癌巢区域，取直径2mm的组织块，每例各取1个芯。将取好的组织芯转移到受体蜡块的孔中。组织阵列块在55℃的恒温烤箱中加热融合10分钟，在快融化之前放至室温冷却，使受体蜡块与供体组织融为一体。将组织芯片置于4℃条件下冷冻4小时左右，随后用全自动组织切片机对组织阵列块进行修正，速度为20mm/转，等修到所有组织芯完全曝露。用切片机对组织阵列块进行切片，将连续切片分别漂在凉水中，使其自然展开，再将切片转移至45℃温水中展片2分钟左右，待展开后将其贴在经过防脱片处理的载玻片上晾干。将切片置于60℃的环境下烤片3分钟，58℃继续烤片16h。将做好的组织芯片保存于切片盒，置于冰箱4℃冷藏室备用。

3、免疫组化染色(EnVision两步法)：

常规脱蜡水化：脱蜡前，将组织芯片放在60℃的恒温箱中，烘烤约20分钟。将已干燥的组织芯片浸于二甲苯中10分钟2次。取出后进行梯度酒精脱水，100％乙醇10分钟，95％乙醇10分钟，80％乙醇10分钟，70％乙醇10分钟，流水冲洗组织芯片。将组织芯片置于耐高温切片架上，置于PH为6.0的柠檬酸盐缓冲液，高温抗原修复5分钟，自然冷却至室温后用PBS冲洗3次，每次5分钟。取出蒸馏水中的芯片，滴加30％H₂O₂避光孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，再将芯片置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，总共3次，然后取出甩干。滴加200μl的鼠抗人KIAA1199单克隆抗体工作液(稀释比例为1:50)于组织芯片上，在4℃条件下过夜。第二天，取出组织芯片，复温1小时，后置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，之后取出甩干。在组织芯片上滴加200μl的二抗工作液，于室温孵育30分钟，将组织芯片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，之后取出甩干。滴加准备好的显色剂DAB工作液，光镜下控制显色程度，显色完全后，立即用蒸馏水冲洗，终止显色。室温下用苏木素复染2分钟，用蒸馏水流水震洗后甩干。芯片脱水，透明，封片。光镜下观察免疫组化染色结果，细胞相应部位出现棕黄色作为阳性表现。结果判断：免疫组化结果判断采用双盲法，由两位经验丰富的病理科医师对组织芯片上的染色结果进行独立评价。根据染色强度分为两个组：一为KIAA1199蛋白高表达组(++，+++)，二为KIAA1199蛋白阴性或低表达组(-，+)。

4、统计学方法

所有数据均用统计软件SPSS V.20.0和STATA V.9.0处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，有统计学意义的各临床病理参数间用Cox比例风险回归模型进行多因素分析，KIAA1199表达与卵巢癌患者的预后关系分析用Kaplan-Meier生存分析，所有检验结果P<0.05为差异有统计学意义。

结果如图2、图3、图4和表1所示。

表1 KIAA1199的表达与临床病理学参数的关系

通过spearman检验分析相关性。^★:P<0.05。

(1)免疫组化结果提示KIAA1199蛋白阳性表达主要定位于细胞浆，少部分位于细胞膜，在四组不同组织中其表达有明显差(P＝0.000)。良性卵巢上皮肿瘤中表达无明显差异(P＝0.59)，但两者均与交界性及恶性卵巢上皮肿瘤表达有明显差异(P<0.05)，交界性与恶性上皮卵巢肿瘤中表达有明显差异(P＝0.004)；

(2)统计学分析提示KIAA1199的表达与上皮性卵巢癌的临床分期(r＝0.529；P＝0.000)、有无盆腔外转移(r＝0.386；P＝0.000)及肝脏转移(r＝0.258；P＝0.004)有关，其临床期别越晚，则表达分级越低，但与患者的年龄、组织分类、组织学分级和腹水、淋巴结转移与否无关；

(3)根据上皮性卵巢癌中KIAA1199的免疫组织化学染色情况，将卵巢癌患者分为两组：一为KIAA1199蛋白高表达组(++，+++)，二为KIAA1199蛋白阴性或低表达组(-，+)，在随访的过程中，由于不可预测的因素其中7例患者失访，经Kaplan–Meier分析结果显示：KIAA1199阴性或低表达组患者的五年生存率明显高于KIAA1199高表达组，差异有明显统计学意义(P＝0.000)。

实施例3 细胞培养及蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞株中KIAA1199蛋白的表达

1、细胞复苏：从液氮中取出OVCAR-3、HO-8910PM细胞，立即放入37℃水浴箱中快速融化，使细胞在1min内完全解冻。用75％酒精擦拭消毒冻存管表面后，转移至10mL新鲜RPMI-1640培养液中洗涤，1000rpm离心5min。吸除上清，取6mL RPMI1640完全培养基(RPMI1640基础培养基+10％FBS+1％青、链霉素)加入离心管，混匀，转移至培养瓶中，放入于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，次日更换一次培养液后，继续培养。

细胞传代培养：将长满细胞的培养瓶中的旧培养液弃去，PBS冲洗两遍，加入1mL含0.02％EDTA+0.25％胰酶消化液，消化3～5min,显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入5mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化，用吸管反复吹打瓶底。将吹打好后的细胞悬液分装新的培养瓶中，再加入适量培养液，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。

细胞冻存：选择对数生长期汇合度约90％的细胞，常规消化细胞，收集细胞悬液，离心1000r/min，5min。吸去上清，加入冻存液(DMSO：FBS＝1:9)，计数，调整细胞浓度为5×10⁶/mL左右。分管，每管1mL。将冻存管封严，标明细胞种类及冻存日期。依次依次4℃30min，-20℃60min，-80℃24h液氮气层(约-100℃)30min，液氮。

2、Western Blot检测细胞株中KIAA1199蛋白的表达

具体过程如下：

(1)总蛋白的提取：收集对数生长期的细胞，加适量裂解液(含1％的PMSF及磷酸酶抑制剂)，振荡器上震荡混匀后冰上裂解20min，12000r/min离心20min，取上清，即为细胞总蛋白。紫外分光光度仪检测提取蛋白的浓度。按照蛋白体积：SDS-PAGE蛋白上样缓冲液体积＝4:1的比例，加入蛋白上样缓冲液，100℃煮10min，分装并-80℃冰箱保存备用。(2)配聚丙烯酰胺凝胶：根据蛋白分子量的大小配置合适浓度的配胶浓度。将用于配胶的玻璃板洗净干燥后，对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上，准备灌胶(用力夹紧，防止漏胶)。先加分离胶，先快后慢，防止气泡产生，一般加至距上端1.5cm处时加去离子水密封，静置40min后弃去离子水，加浓缩胶至顶端，插入梳子，准备上样。(3)上样电泳：将所有蛋白样品调至等浓度30μg，每孔上样约15～20μl，其中一孔加入预染的蛋白质Marker。起始电压为80V，约40min，待溴酚蓝进入分离胶后，电压改为100V，约60min，当溴酚蓝接近分离胶底部时停止电泳。(4)转膜：先将合适大小的PVDF膜至于甲醇中活化10min，在再把PVDF膜覆盖在电泳后的凝胶上，PVDF膜和凝胶的非接触面均覆盖滤纸和海绵，置于电转槽中电转，恒流电转300mA×120min。(5)封闭：电转后，取出PVDF膜，放入现配制的封闭液(含5％脱脂奶粉的1×TBST)中，4℃过夜或室温摇2h。注意膜正面向上。(6)孵一抗：封闭结束后，取出，放入含有适量1×TBST中洗膜5min×3次；配制含5％脱脂奶粉1×TBST稀释的一抗(抗KIAA1199抗体稀释1000倍，抗GAPDH抗体稀释1000倍，各稀释2mL放离心管中)；将洗好的膜放在平板上，膜的正面向上，稀释好的抗体均匀滴加在膜上；室温孵育约2h，再放入4℃过夜。(7)洗膜，孵二抗：取出PVDF膜，1×TBST液洗3遍，每次10min，边洗边摇。配含5％脱脂奶粉的1×TBST稀释的二抗(二抗稀释1000倍，稀释2mL放离心管中)；将稀释好的二抗均匀滴加在膜上，室温孵育2h；1×TBST(不含脱脂奶粉)清洗，10min×3次。(8)显影：按化学发光试剂盒说明书将ECL发光液的A、B液等比例混合(使用前配制)；将洗好的膜用滤纸贴角吸干；将膜正面向上放在塑料薄膜上，在膜上滴加A、B混合液；凝胶成像系统拍照、保存。

结果如图4A所示，为Western Blot检测KIAA1199蛋白在细胞株中的表达及灰度扫描图。在OVCAR-3、HO-8910PM和正常卵巢上皮细胞系中，OVCAR-3细胞中KIAA1199的表达较高，遂采用OVCAR-3细胞系来进一步的KIAA1199干扰试验。

实施例4 细胞转染及Transwell小室观察转染前后细胞侵袭能力的改变

1、转染具体步骤如下：

转染前一天，收集对数生长期的OVCAR-3细胞，接种于六孔板内，接种数量为(3.0-8.0)×10⁵，加入2mL无抗培养基；在250μL RPMI1640基础培养基中加入80nM siRNA(购自吉玛基因公司)，柔和混匀；用250μL RPMI1640基础培养基稀释5μL脂质体转染试剂，轻轻吹打3-5次，室温静置5min；混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹匀3-5次，室温静置20min；转然后4-6h换液，继续培养24h或48h后，进行转染后的其它检测步骤。

2、Transwell小室观察转染前后细胞迁移能力的改变：

取脂质体转染后的实验组细胞、阴性对照组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化后，细胞计数后用基培重悬，调整细胞密度为2×10⁵/mL。在上室加入100μL细胞悬液，细胞数为2×10⁴个，下室为含20％胎牛血清的RPMI-1640培养液600μL，37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h。孵育结束后，取出小室，用PBS洗两遍，棉签轻轻擦拭上室滤膜内侧面贴壁细胞，PBS洗两遍。将小室滤膜用4％多聚甲醛固定10分钟，吸去固定液，每孔加入600μL考马斯亮蓝染液，染色5min，吸弃染色液，PBS洗三遍，将上室取出，自然干燥。正置荧光显微镜下拍照并计数膜背面迁移的细胞数，计数每张膜的中央部分和周围部分随机3个视野(共15个视野)，计算平均值。

结果如图4B，4C所示，

(1)KIAA1199基因表达干扰后，OVCAR-3细胞的迁移能力下降，较对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；

(2)Transwell迁移实验证实：采用siRNA干扰OVCAR-3的KIAA1199表达后，其迁移能力显著下降，较对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

实施例5

用于检测卵巢癌的试剂盒，包括KIAA1199基因标样，检测引物试剂和PCR体系试剂；引物试剂中的引物序列包括上游引物和下游引物，具体序列如下：

上游引物：5’-CCAGGAATGTTGAATGTCT-3’；

下游引物：5’-ATTGGCTCTTGGTGAATG-3’；

KIAA1199基因序列如SEQ ID NO.1所示。

上述试剂盒的使用方法：提取待检测样品的RNA，使用引物试剂和PCR体系试剂进行PCR反应(参见实施例1)，并以KIAA1199基因标样为对照，对PCR产物进行检测，与正常细胞中的KIAA1199基因表达量进行对比判断出对应结果即可。

SEQUENCE LISTING

<110> 南通大学附属医院

<120> 一种用于检测卵巢癌的试剂盒

<130> 100

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

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tctgccagat acagccctca ccaggacgcc gacccgctga agccccggga gccggccatc 2340

atcagacact tcattgccta caagaaccag gaccacgggg cctggctgcg cggcggggat 2400

gtgtggctgg acagctgccg gtttgctgac aatggcattg gcctgaccct ggccagtggt 2460

ggaaccttcc cgtatgacga cggctccaag caagagataa agaacagctt gtttgttggc 2520

gagagtggca acgtggggac ggaaatgatg gacaatagga tctggggccc tggcggcttg 2580

gaccatagcg gaaggaccct ccctataggc cagaattttc caattagagg aattcagtta 2640

tatgatggcc ccatcaacat ccaaaactgc actttccgaa agtttgtggc cctggagggc 2700

cggcacacca gcgccctggc cttccgcctg aataatgcct ggcagagctg cccccataac 2760

aacgtgaccg gcattgcctt tgaggacgtt ccgattactt ccagagtgtt cttcggagag 2820

cctgggccct ggttcaacca gctggacatg gatggggata agacatctgt gttccatgac 2880

gtcgacggct ccgtgtccga gtaccctggc tcctacctca cgaagaatga caactggctg 2940

gtccggcacc cagactgcat caatgttccc gactggagag gggccatttg cagtgggtgc 3000

tatgcacaga tgtacattca agcctacaag accagtaacc tgcgaatgaa gatcatcaag 3060

aatgacttcc ccagccaccc tctttacctg gagggggcgc tcaccaggag cacccattac 3120

cagcaatacc aaccggttgt caccctgcag aagggctaca ccatccactg ggaccagacg 3180

gcccccgccg aactcgccat ctggctcatc aacttcaaca agggcgactg gatccgagtg 3240

gggctctgct acccgcgagg caccacattc tccatcctct cggatgttca caatcgcctg 3300

ctgaagcaaa cgtccaagac gggcgtcttc gtgaggacct tgcagatgga caaagtggag 3360

cagagctacc ctggcaggag ccactactac tgggacgagg actcagggct gttgttcctg 3420

aagctgaaag ctcagaacga gagagagaag tttgctttct gctccatgaa aggctgtgag 3480

aggataaaga ttaaagctct gattccaaag aacgcaggcg tcagtgactg cacagccaca 3540

gcttacccca agttcaccga gagggctgtc gtagacgtgc cgatgcccaa gaagctcttt 3600

ggttctcagc tgaaaacaaa ggaccatttc ttggaggtga agatggagag ttccaagcag 3660

cacttcttcc acctctggaa cgacttcgct tacattgaag tggatgggaa gaagtacccc 3720

agttcggagg atggcatcca ggtggtggtg attgacggga accaagggcg cgtggtgagc 3780

cacacgagct tcaggaactc cattctgcaa ggcataccat ggcagctttt caactatgtg 3840

gcgaccatcc ctgacaattc catagtgctt atggcatcaa agggaagata cgtctccaga 3900

ggcccatgga ccagagtgct ggaaaagctt ggggcagaca ggggtctcaa gttgaaagag 3960

caaatggcat tcgttggctt caaaggcagc ttccggccca tctgggtgac actggacact 4020

gaggatcaca aagccaaaat cttccaagtt gtgcccatcc ctgtggtgaa gaagaagaag 4080

ttgtga 4086

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物序列

<400> 2

ccaggaatgt tgaatgtct 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物序列

<400> 3

attggctctt ggtgaatg 18

Claims (4)

1.一种用于检测卵巢癌的试剂盒，其特征在于：包括KIAA1199基因标样，检测引物试剂和PCR体系试剂；所述的引物试剂中的引物序列包括上游引物5’-CCAGGAATGTTGAATGTCT-3’和下游引物5’-ATTGGCTCTTGGTGAATG-3’。

2.根据权利要求1所述的用于检测卵巢癌的试剂盒，其特征在于：所述的KIAA1199基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述的用于检测卵巢癌的试剂盒的检测方法，其特征在于：提取样品的RNA，使用引物试剂和PCR体系试剂进行PCR反应，并以KIAA1199基因标样为对照，对PCR产物进行检测，并判断结果即可。

4.一种用于治疗卵巢癌的药物，其特征在于：所述的药物为靶向KIAA1199基因的干扰siRNA。