CN108273049A - Ddx3用于制备宫颈癌治疗药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物药物领域，具体涉及一种DDX3用于制备宫颈癌治疗药物的用途。本发明提供了一种治疗宫颈癌的药物，其主要成分能够诱导DDX3基因或蛋白的表达，提高DDX3蛋白的表达水平。本发明还提供了一种筛选上述宫颈癌治疗药物的方法，为治疗宫颈癌提供了一种新的选择，具有较高的应用价值。

Description

DDX3用于制备宫颈癌治疗药物的用途
技术领域
本发明属于生物药物领域，具体涉及一种DDX3用于制备宫颈癌治疗药物的用途。
背景技术
宫颈癌是危害女性健康的恶性肿瘤之一，最新癌症统计数据显示，2012年全球新增宫颈癌病例约52.76万，近26.57万女性死于这一疾病，其中90％的死亡发生在发展中国家。2015年我国预计有9.89万新增宫颈癌病例，3.05万患者将死于这一疾病，与发达国家不同，由于缺乏系统性的筛查措施，HPV病毒感染率逐渐增加，以及医疗体系覆盖不足等原因，我国宫颈癌发病率呈现显著上升趋势。高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)是患宫颈癌的主要风险因素，HPV16和HPV18是两种风险最高的病毒株。目前预防宫颈癌发生发展的有效方法是注射HPV疫苗，2016年7月18日，葛兰素史克(GSK)宣布，人乳头状瘤病毒(HPV)疫苗“希瑞适”获得中国国家食品药品监督管理总局的上市许可，成为中国首个获批的预防宫颈癌的HPV疫苗。然而，HPV疫苗只可用于预防，对于已经感染病毒的患者并无治疗作用，且不能覆盖所有的HPV病毒亚型。因此，宫颈癌的早期筛查与早期诊断对于宫颈癌的防治非常重要，并且发展新的宫颈癌治疗药物是急需解决的重要课题和国民健康的重大需求。
DDX3(DEAD-box helicase 3，DEAD-box解旋酶3)蛋白是一种ATP酶(ATPase)依赖的RNA解旋酶，参与多种RNA代谢，包括转录、翻译、RNA剪接、RNA输出、RNA降解以及核糖体的形成等。越来越多的研究表明，DDX3蛋白在肿瘤的发生发展中具有重要作用，是肿瘤治疗的一个潜在靶点。根据现有研究报道，DDX3基因在不同肿瘤细胞中的功能不尽相同，在肝癌、非小细胞肺癌中DDX3具备抑癌基因的作用，但在乳腺癌、口腔癌、尤文肉瘤、结肠癌肿瘤细胞中DDX3又起到致癌基因的作用。但是到目前为止，未见有DDX3蛋白和宫颈癌关系的相关报道，也未见通过升高其表达水平来达到治疗宫颈癌的目的的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：现有研究未见有DDX3蛋白和宫颈癌关系的报道，不知DDX3蛋白是否与宫颈癌的发病或治疗有关。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种DEAD-box解旋酶3在制备预防或治疗宫颈癌药物中的用途。
特别的，本发明还提供了上述DEAD-box解旋酶3的编码基因在制备预防或治疗宫颈癌药物中的用途。
本发明还进一步给出了含有上述DEAD-box解旋酶3编码基因的重组载体、含有该重组载体的宿主细胞在制备预防或治疗宫颈癌药物中的用途。
更进一步的，本发明还提供了一种增加上述DEAD-box解旋酶3的蛋白表达水平或其编码基因转录的mRNA含量的药物在预防或治疗宫颈癌中的用途。
本发明提供了一种预防或治疗宫颈癌的药物，该药物含有能增加DEAD-box解旋酶3的蛋白表达水平或其编码基因转录的mRNA含量的药物。
其中，上述预防或治疗宫颈癌的药物，由下述方法筛选得到：
a、建立宫颈癌的细胞模型或动物模型的模型组，并设立正常对照组；
b、用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组，然后检测其中DDX3的蛋白表达水平或其转录水平的mRNA含量；
c、将检测结果与正常对照组进行比较，能使模型组中DDX3的蛋白表达水平或其转录水平mRNA含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。
本发明还提供了一种筛选上述预防或治疗宫颈癌药物的方法。该方法包括以下步骤：
a、建立宫颈癌的细胞模型或动物模型的模型组，并设立正常对照组；
b、用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组，然后检测其中DDX3的蛋白表达水平或其转录水平的mRNA含量；
c、将检测结果与正常对照组进行比较，能使模型组中DDX3的蛋白表达水平或其转录水平mRNA含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。
本发明的有益效果为：
本发明首次创造性的发现了DDX3与宫颈癌的关系，提供了DDX3及其编码基因、重组载体和宿主细胞在制备预防或治疗宫颈癌药物中的用途。进一步的，本发明还提供了一种治疗宫颈癌的药物，主要成分为能增加DDX3的蛋白表达水平或能增加DDX3编码基因转录的mRNA含量的成分，为寻找防治宫颈癌疾病的药物提供了一种新的途径，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1、DDX3蛋白在宫颈癌细胞系中的表达；结果表明与HPV阴性宫颈癌细胞C33A相比，DDX3蛋白在HPV感染的宫颈癌细胞SiHa(A)、HeLa(B)中低表达；
图2、DDX3蛋白在宫颈癌组织(A-D)与非宫颈癌组织(E-H)中的表达，宫颈癌组织中DDX3蛋白的表达低于非宫颈癌组织；(A)-(D)分别代表宫颈癌组织中DDX3蛋白阴性表达、弱阳性表达、中度阳性表达和强阳性表达的染色程度；(E)-(H)分别代表了DDX3蛋白在非宫颈癌组织中阴性表达、弱阳性表达、中度阳性表达和强阳性表达的染色程度；其中在宫颈癌组织中的(C)和(D)分别表示了DDX3蛋白的表达位置；(G)和(H)分别表示了DDX3蛋白在非宫颈组织中的表达；图中横线代表100μm(原始放大400倍)；
图3、DDX3基因/蛋白抑制宫颈癌细胞体外生长；A和C分别表示过表达DDX3基因后，使得DDX3蛋白过表达，从而抑制宫颈癌细胞HeLa、SiHa的生长；B和D分别表示用DDX3基因的siRNA干扰DDX3基因表达后，DDX3蛋白表达降低，可以促进宫颈癌细胞HeLa、SiHa的生长。
图4、DDX3基因/蛋白降低HPV 18 E6蛋白的表达；A表示在HeLa细胞中过表达DDX3基因，能够显著增加DDX3蛋白的表达，并降低HPV18 E6蛋白的表达；B表示用DDX3基因的siRNA干扰DDX3基因表达后，DDX3蛋白表达降低，HPV18 E6蛋白含量增加；
图5、裸鼠实验证明DDX3基因/蛋白可以抑制宫颈癌细胞SiHa在裸鼠体内的增殖；A表明过表达DDX3基因/蛋白抑制宫颈癌细胞SiHa在裸鼠体内的生长；B表明DDX3基因敲除降低DDX3蛋白表达促进宫颈癌细胞SiHa在裸鼠体内的生长。
具体实施方式
本发明的建立是基于对HPV病毒感染的宫颈癌细胞发生发展相关蛋白的研究，通过对HPV感染的宫颈癌细胞研究，分析检测出宫颈癌相关蛋白DDX3。
本发明还进一步应用免疫组织化学技术研究DDX3蛋白在宫颈癌组织中的表达，实验研究提示与宫颈癌密切相关的DDX3蛋白能应用于临床诊断、预后判断及药物开发中。
在上述大量的开创性研究的基础上，本领域技术人员可将上述DDX3蛋白或其转录水平的mRNA作为靶标，筛选治疗宫颈癌药物的方法，该治疗宫颈癌的药物能增加DDX3的蛋白表达水平或其转录水平的mRNA含量。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例 DDX3在预防或治疗宫颈癌中的用途
1实验材料
1.1、细胞和组织样本来源
人宫颈癌细胞C33A：源自ATCC，保存于四川大学生物治疗国家重点实验室；人宫颈癌株SiHa：源自ATCC，保存于四川大学生物治疗国家重点实验室；人宫颈癌细胞HeLa：源自ATCC，保存于四川大学生物治疗国家重点实验室。
42例宫颈癌组织及18例非宫颈癌组织，均由四川大学华西附二院提供，样本提供者手术后签署知情同意书，每例组织均通过病理活检。
1.2、试剂来源
细胞培养液DMEM：购自Gibco BRL；细胞培养液RPMI1640：购自Gibco BRL；胎牛血清(FBS)、消化液胰酶(Trypsin)购自Gibco BRL。
DDX3单克隆抗体(sc-81247)：购自Santa Cruz biotechnology,Inc；p53单克隆抗体(sc-126)：购自Santa Cruz biotechnology,Inc；小鼠抗人GAPDH抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。
即用型免疫组化超敏S-P(鼠/兔)试剂盒(KIT-9710)购自北京莱博生物实验材料研究所。DAB显色试剂盒(AR1022)购自武汉博士德生物工程有限公司。
2方法
2.1细胞总RNA的提取
将宫颈癌细胞C33A、SiHa培养在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中培养，将HeLa细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液中培养，待细胞长到90％左右用胰酶消化收集，并用冰冷的PBS洗3次，向其中加入1ml Trizol试剂将细胞进行裂解，冰上放置5min，然后向其中加入0.2ml氯仿震荡15s，在冰上放置2-3min，13300rpm，4℃离心15min；取上清并向其中加入0.5ml异丙醇，冰上放置10min后，13300rpm下离心10min；去上清，加入1ml 75％乙醇进行洗涤，13300rpm离心5min，让沉淀在是室温干燥后加入RNA-free水进行反转录以及qPCR。
2.2蛋白样品的制备
将收集好的细胞中加入200μL RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液裂解，同时加入蛋白酶抑制剂cocktail(RIPA/cocktail＝50/1(V/V)，即按体积比200μLRIPA中加入4μL cocktail)，吹打混匀。冰上放置30-40min后，利用超声波裂解：使用探针型超声冰上进行适当频率的短促冲击，共5-8次，每次3-5s，中间间隔7-10s。裂解混合物于4℃，15000r/min离心(细胞裂解混合物离心30min，组织裂解混合物离心60min)。吸取上清于新的Ep管，用Protein Assay Kit测定蛋白浓度。-80℃保存备用或立即用于下游实验。
2.3蛋白免疫印迹
蛋白样品准备：根据测定浓度(测定蛋白浓度一般为6-12mg/mL)，取30μg蛋白。
上样电泳：在样品中加入等体积2×SDS上样缓冲液，沸水煮5-10min，12000g离心5min，保留上清。起始电压80V，直到溴酚蓝指示剂进入分离胶，调整电压为120V，至指示剂到达底部边缘，停止电泳，取出凝胶切角做记号。
转膜：依据胶的大小剪取适当大小的磨和滤纸，将PVDF(聚偏二氟乙烯膜)膜用甲醇浸泡5-10s后放入转膜缓冲液中，按照：海绵-3层滤纸-胶-膜-3层滤纸-海绵，放置好后，在100V，0.2-0.4A的电流下转膜1h；转膜结束后，取出PVDF膜，迅速放入三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS缓冲液)中。
免疫杂交与显色：TBS室温洗膜5min后，将膜置于50ml封闭液中，室温摇动2-3h(4℃过夜)，TBST缓冲溶液洗膜3次，每次10min，加入一抗37℃孵育2h；TBST缓冲溶液洗膜3次，每次10min，加入适当的二抗37℃孵育1h；TBST洗膜3次，每次10min；TBS洗膜一次5min，显色液显色曝光。
2.4免疫组化检测DDX3蛋白的表达
2.4.1组织处理及切片
(1)取人宫颈癌和非宫颈癌组织，切成小块，厚度不超过5mm，做好标记，用10％中性福尔马林固定24h以上，自来水冲洗过夜；
(2)过梯度酒精：75％酒精，1次，1h→85％酒精，1次，1h→95％酒精，1次，1h→100％酒精，2次，每次30min；
(3)二甲苯，2次，每次30min；
(4)石蜡浸泡，3次，每次30min；
(5)用石蜡包埋组织；
(6)切片：厚度为3～5μm。
2.4.2免疫组化染色
(1)石蜡切片脱蜡至水：将石蜡切片置于60℃中加热2h，迅速置于二甲苯I脱蜡10min，再置于二甲苯II脱蜡10min，分别用100％、95％、80％、70％酒精处理各2min，蒸馏水洗涤2次(置于摇床)，每次5min。
(2)过氧化氢(Maixin-Bio,KIT-9710a)封闭内源性过氧化物酶：3％H2O2，室温避光处理10min，再用蒸馏水洗2次，每次5min。
(3)抗原修复：将切片置于抗原修复液(10mM柠檬酸钠缓冲液，pH 6.0)中，煮沸后高压加热5min，自然冷却至室温，PBS洗片2次，每次5min。
(4)正常血清封闭：取出切片，用滤纸吸去切片背面水分及切片正面组织周围水分(保持组织呈湿润状态)，滴加正常血清(与第二抗体同源动物血清)(Maixin-Bio,KIT-9710b)，37℃孵育15min，PBS洗2次，每次5min。
(5)一抗孵育：用滤纸吸多余血清，直接滴加鼠抗人DDX3单克隆抗体(1：500)，4℃过夜孵育，PBS洗2次，每次5min。
(6)二抗孵育：滴加生物素标记的第二抗体(Maixin-Bio,KIT-9710c)，37℃孵育40min，PBS洗2次，每次5min。
(7)三抗孵育：滴加酶标链亲和素复合物(Maixin-Bio,KIT-9710d)37℃孵育40min，PBS洗2次，每次5min。
(8)DAB显色：滤纸吸去切片周围液体，滴加新鲜配制DAB工作液(显色剂A：显色剂B：显色剂C 1:1:1混合后稀释20倍)显色，镜下观察，适时用自来水终止显色。
(9)苏木素复染：室温30s，自来水冲洗返蓝15min。
(10)梯度酒精脱水：80％酒精，2min→95％酒精，2min→100％酒精，2次，每次5min。
(11)用中性树胶封片，光镜下观察
2.5MTT法检测细胞活力
细胞过表达DDX3或抑制DDX3表达48h后，接种在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液的96孔板中，每孔2×103个细胞，孵育48h。每孔各加入20ul MTT(四甲基偶氮唑蓝)溶液(5mg/ml,Sigma)，37℃孵育2-4h。甲瓒晶体用150ul二甲亚砜(Sigma)溶解后立即用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值。
细胞活力(％)＝实验组吸光值/对照组吸光值×100％。
3.结果及分析
①DDX3蛋白在宫颈癌细胞系中的表达。我们通过用Western Blot在宫颈癌细胞中检测DDX3蛋白的表达(图1A-B)。结果显示，与HPV阴性宫颈癌细胞C33A相比，DDX3蛋白在HPV感染的宫颈癌细胞SiHa、HeLa中低表达。
②DDX3蛋白在宫颈癌组织中的表达。我们通过免疫组化的方法在42例宫颈癌组织和18例非宫颈癌组织中检测DDX3蛋白的表达(图2)。结果显示与正常宫颈组织相比，DDX3蛋白在宫颈癌组织中低表达(p<0.05)(表1)。
表1.DDX3蛋白在宫颈癌组织和非宫颈癌组织中的表达
表1中评分的原理为：免疫组化的得分通过阳性染色的比例0(negative),1(1-25％),2(26-50％),3(51-75％),和4(76-100％)与阳性染色的强度0(阴性),1(弱阳性),2(中阳性),或3(强阳性)相乘得到，每一块组织的评分由三个病理学专家评定，最终得分取平均值。
CCTs:宫颈癌组织，NCTs:非宫颈癌组织。
1阳性例数/总例数。
*Student’s t test，p<0.01(a与b相比)。
+：弱表达；++：强表达。
③DDX3蛋白表达与宫颈癌患者临床信息的关系。在上述western blot和免疫组化的基础上，进一步分析了宫颈癌中DDX3蛋白的相对表达水平与患者临床信息的关系。我们发现DDX3蛋白的表达与患者HPV病毒感染状态以及肿瘤的分化程度密切相关，DDX3蛋白水平在HPV感染的低分化宫颈癌组织中显著降低(表2)。在42例宫颈癌组织中，33例(78.6％)样本为HPV病毒感染的宫颈癌组织，且DDX3蛋白的平均着色程度为中度阳性，其平均分数为4.44，DDX3蛋白在9例(21.4％)非HPV病毒感染的宫颈癌组织中的着色平均分数为2.15。根据宫颈癌组织的分化程度来分，32例的宫颈癌组织为低分化组织，并且DDX3蛋白在高分化宫颈癌组织中的着色分数明显高于低分化组织(p<0.05)。没有发现DDX3蛋白的表达和患者年龄的相关性(p>0.05)。42例病人的平均年龄为46岁，小于45岁的有26人，DDX3蛋白的表达与患者年龄没有关联性。
表2 DDX3蛋白的表达与宫颈癌临床信息的关系
表2中的评分方法同表1的评分。
1.Student’s t test分析，P<0.05为具有显著性差异；
2.<1/2，病灶的浸润深度小于全部宫颈组织的二分之一；>1/2，病灶的浸润深度大于或等于全部宫颈组织的二分之一；Low，低分化宫颈癌组织；High，高分化宫颈癌组织。
④DDX3基因/蛋白抑制宫颈癌细胞体外生长(图3)；A和C分别表示过表达DDX3基因后，使得DDX3蛋白过表达，从而抑制宫颈癌细胞HeLa、SiHa的生长；B和D分别表示用DDX3基因的siRNA干扰DDX3基因表达后，DDX3蛋白表达降低，可以促进宫颈癌细胞HeLa、SiHa的生长。
⑤DDX3基因/蛋白降低HPV 18 E6蛋白的表达(图4)；A表示在HeLa细胞中过表达DDX3基因，能够显著增加DDX3蛋白的表达，并降低HPV18 E6蛋白的表达；B表示用DDX3基因的siRNA干扰DDX3基因表达后，DDX3蛋白表达降低，HPV18 E6蛋白含量增加；
⑥裸鼠实验证明DDX3基因可以抑制宫颈癌细胞SiHa在裸鼠体内的增殖。我们成功建立宫颈癌SiHa裸鼠皮下移植瘤模型，以皮下瘤结节体积达100mm3为成瘤标准，成瘤率为100％。在裸鼠体内接种宫颈癌细胞SiHa 30天后，杀死裸鼠取出肿瘤组织。过表达DDX3基因组裸鼠肿瘤体积(236.38±178.37mm3)明显小于对照组组裸鼠肿瘤体积(881.63±235.30mm3)(P<0.05)(图5A)。而敲除DDX3基因组裸鼠肿瘤体积(1915.50±459.05mm3)则明显大于对照组组裸鼠肿瘤体积(694.38±167.93mm3)(P<0.05)(图5B)。以上结果说明DDX3基因抑制了人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长。
本发明的试验首次阐明了DDX3基因/蛋白在宫颈癌发生发展中的作用，对于优化当前可用的疗法以及发展宫颈癌诊治新的靶标分子具有重要意义，尤其是开发了一种预防或治疗宫颈癌的药物，该药物含有能增加DEAD-box解旋酶3的蛋白表达水平或其编码基因转录的mRNA含量的药物，进而起到预防或治疗宫颈癌的目的，为宫颈癌的治疗提供了一种全新的选择，应用前景广阔。

Claims (8)

1.DEAD-box解旋酶3在制备预防或治疗宫颈癌的药物中的用途。
2.权利要求1所述的DEAD-box解旋酶3的编码基因在制备预防或治疗宫颈癌的药物中的用途。
3.含有权利要求2所述编码基因的重组载体在制备预防或治疗宫颈癌的药物中的用途。
4.含有权利要求3所述重组载体的宿主细胞在制备预防或治疗宫颈癌的药物中的用途。
5.增加权利要求1所述的DEAD-box解旋酶3的蛋白表达水平或其编码基因转录的mRNA含量的药物在制备预防或治疗宫颈癌药物中的用途。
6.预防或治疗宫颈癌的药物，其特征在于：该药物含有能增加DEAD-box解旋酶3的蛋白表达水平或其编码基因转录的mRNA含量的药物。
7.根据权利要求6所述的预防或治疗宫颈癌的药物，其特征在于：所述药物由下列方法筛选得到：
a、建立宫颈癌的细胞模型或动物模型的模型组，并设立正常对照组；
b、用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组，然后检测其中DDX3的蛋白表达水平或其转录水平的mRNA含量；
c、将检测结果与正常对照组进行比较，能使模型组中DDX3的蛋白表达水平或其转录水平mRNA含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。
8.筛选权利要求6或7所述的预防或治疗宫颈癌的药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、建立宫颈癌的细胞模型或动物模型的模型组，并设立正常对照组；
b、用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组，然后检测其中DDX3的蛋白表达水平或其转录水平的mRNA含量；
c、将检测结果与正常对照组进行比较，能使模型组中DDX3的蛋白表达水平或其转录水平mRNA含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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