CN110013555B - Lrp11作为靶点在制备治疗宫颈癌的制品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种LRP11作为靶点在制备治疗宫颈癌的制品中的应用。本发明从宫颈高级别上皮内病变和宫颈癌患者获取组织标本，通过检测LRP11的表达水平，并通过在宫颈癌细胞系中对LRP11进行基因沉默，发现LRP11在宫颈癌细胞增殖、周期阻滞、细胞凋亡、迁移侵袭、体外成瘤方面的作用。

Description

LRP11作为靶点在制备治疗宫颈癌的制品中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及LRP11作为靶点在制备治疗宫颈癌的制品中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤，根据世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构(IRAC)2018年版全球癌症(GLOBOCAN)统计报告推算，2018年全球宫颈癌新发病例数为569,847人，死亡病例数为311365人，发病比例(13.1％)和死亡比例(6.9％)在全身女性肿瘤中均排在第四位，与此同时，在2015年公布的中国癌症统计学报告中发现，中国女性的宫颈癌发病率及死亡率自2000年至2011年都在逐年上升，在34-44岁年龄段女性中发病率高居第二位，因此，宫颈癌在全国及全世界范围内仍对社会造成沉重的经济负担，严重危害人类女性的健康。众所周知，宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)的持续感染引起的，但这个过程缓慢，常持续数十年，且仅有极少数的HPV感染患者进展为宫颈癌，说明除HPV持续感染外，还有其它因素参与了宫颈癌的发生发展。

生物活性脂质在细胞生存、相互作用、增殖和死亡中起关键作用，因为它们参与细胞间的信号传导，细胞膜及细胞-细胞间的相互作用，这些过程与致癌过程密切相关，尤其在癌症的转化、进展和转移方面，是许多致癌过程的介质(Perrotti,F.,et al.,Advancesin Lipidomics for Cancer Biomarkers Discovery.Int J Mol Sci,2016.17(12).)。低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)家族是跨膜蛋白，可以通过受体介导的脂蛋白颗粒内吞作用调节胆固醇体内平衡；此外，有实验证据表明该家族的其他成员具有额外的生理功能，比如信号转导(May,P.,et al.,The LDL receptor-related protein(LRP)family:an oldfamily of proteins with new physiological functions.Ann Med,2007.39(3):p.219-28.)。此外，其家族成员LRP1和LRP1B已被报道可作为结肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、尿路上皮癌和肾透明细胞癌的预后标志物，在这些肿瘤的发生中起重要作用。

发明内容

发明人通过本发明的研究发现，低密度脂蛋白受体11(LRP11)作为新的LRP家族成员，在宫颈高级别上皮内病变(HSIL，属于宫颈癌前病变或早期宫颈癌)及宫颈癌患者中呈高表达趋势，并且根据生物信息分析学分析发现其与宫颈癌患者的临床不良预后相关。本发明从宫颈高级别上皮内病变和宫颈癌患者获取组织标本，通过检测LRP11的表达水平，并通过在宫颈癌细胞系中对LRP11进行基因沉默，发现LRP11在宫颈癌细胞增殖、周期阻滞、细胞凋亡、迁移侵袭、体外成瘤方面的作用。

因此，本发明的目的之一在于提供LRP11作为靶点在制备治疗宫颈癌前病变、宫颈癌的制品中的应用；本发明的目的之二在于提供LRP11作为靶点在影响宫颈癌的发生或发展的制品中的应用；本发明的目的之三在于提供LRP11作为靶点在影响宫颈癌细胞增殖、迁移和/或侵袭、细胞周期、细胞凋亡、体外成瘤中的一种或多种的制品中的应用；以及，本发明的目的之五在于提供LRP11作为靶点在制备用于下调P16、CDK 2、CDK 4、cyclin D1、cyclin E1、MMP-2、MMP-9和VEGF中一种或多种蛋白的表达水平的制品中的应用。

具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的。

在本发明的第一方面，本发明提供了LRP11作为靶点在制备用于治疗宫颈癌前病变或宫颈癌的制品中的应用。

所述宫颈癌前病变比如为宫颈上皮内病变，尤其指宫颈高级别上皮内病变。

本发明所述LRP11作为靶点对宫颈癌前病变或宫颈癌的治疗表现为下列中的一种或多种：抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞的增殖、抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞的迁移和/或侵袭能力、抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞的体外成瘤、阻滞宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞周期(尤其使细胞周期的G0、G1期停滞)、下调MMP-2、MMP-9和VEGF中一种或多种蛋白的表达水平、下调P16、CDK 2、CDK4、cyclin D1和cyclin E1中的一种或多种蛋白的表达水平、以及促进宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞的凋亡。

在本发明的第二方面，本发明提供了LRP11作为靶点在制备用于抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞增殖的制品中的应用。

在本发明的第三方面，本发明提供了LRP11作为靶点在制备用于抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞的迁移和/或侵袭能力的制品中的应用。

在本发明的第四方面，本发明提供了LRP11作为靶点在制备用于下调MMP-2、MMP-9和VEGF中一种或多种蛋白的表达水平的制品中的应用。

在本发明的第五方面，本发明提供了LRP11作为靶点在制备用于抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞体外成瘤的制品中的应用。

在本发明的第六方面，本发明提供了LRP11作为靶点在制备用于阻滞宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞周期的制品中的应用。

其中，所述组织细胞周期表现为使宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞在细胞周期的G0、G1期停滞。

在本发明的第七方面，本发明提供了LRP11作为靶点在制备用于下调P16、CDK 2、CDK 4、cyclin D1和cyclin E1中的一种或多种蛋白的表达的制品中的应用。

在本发明的第八方面，本发明提供了LRP11作为靶点在制备用于促进宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞凋亡的制品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，本发明对LRP11进行基因沉默后，SiHa细胞系早期凋亡增加、晚期凋亡没有显著变化，而CaSki细胞系中沉默LRP11对早期凋亡和晚期凋亡均无显著影响。

根据本发明的上述多个方面，在本发明的实施方式中，所述制品可将LRP11作为靶点对其进行基因突变或基因沉默；或者，所述制品为抑制LRP11的活性或表达、或者阻断LRP11、或者降解LRP11的物质。

根据本发明的上述多个方面，在本发明的一些实施方式中，所述制品可以为药物或者生化试剂。

根据本发明的上述多个方面，在本发明的一个或多个实施方式中，所述制品可以选自基因干扰、基因编辑、基因沉默或基因敲除材料。

在本发明的一些实施方式中，所述制品为药物时，所述药物中可以含有一种或者多种药学上可接受的载体；以及，所述药物可以通过药学领域的常规方法进一步制成相应的药物制剂；以及，所述药物中也可以含有一种或多种其他与本发明具有相同或相似活性的成分，或者与本发明具有不同活性的成分，这些成分可以增强本发明上述多个方面中所述的活性，或者甚至在某些情况下，可以辅料或其他活性成分降低本发明上述多个方面中所述的活性。

在本发明的第九方面，本发明还提供了一种LRP11抑制剂或拮抗剂或包含其为成分的组合物，其具有下述(1)至(7)种产品功能中的至少一种：

(1)用于诊断和/或治疗宫颈癌前病变或宫颈癌；

(2)用于抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞的增殖；

(3)用于抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞的迁移和/或侵袭能力；

(4)用于抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞体外成瘤；

(5)用于阻滞宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞周期，所述细胞周期优选为G0、G1期；

(6)用于下调MMP-2、MMP-9和VEGF中一种或多种蛋白的表达水平；

(7)用于下调P16、CDK 2、CDK 4、cyclin D1和cyclin E1中的一种或多种蛋白的表达水平。

本发明所述的抑制剂或拮抗剂为可以抑制LRP11的活性或表达、或者能够阻断LRP11、或者能够降解LRP11的物质或制剂。

本发明所述的包含LRP11抑制剂或拮抗剂的组合物，尤其为以LRP11抑制剂或拮抗剂为主要活性物质或唯一活性物质。

以及，在本发明的第十方面，本发明提供了一种LRP11激动剂或包含其为成分的组合物，其具有下述(1)至(6)种产品功能中的至少一种：

(1)用于促进宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞的增殖；

(2)用于促进宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞的迁移和/或侵袭能力；

(3)用于促进宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞体外成瘤；

(4)用于加速宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞周期，所述细胞周期优选为G0、G1期；

(5)用于上调MMP-2、MMP-9和VEGF中一种或多种蛋白的表达水平；

(6)用于上调P16、CDK 2、CDK 4、cyclin D1和cyclin E1中的一种或多种蛋白的表达水平。

本发明所述的激动剂为可以直接或间接激活LRP11或提高LRP11的活性或促进LRP11的表达、或者能够抑制LRP11抑制剂或拮抗剂的活性、或者能够降解LRP11抑制剂或拮抗剂的物质或制剂。

本发明所述的包含LRP11激动剂的组合物，尤其为以LRP11激动剂为主要活性物质或唯一活性物质。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

如无特殊说明，本发明中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图1示出了正常宫颈组织和宫颈癌组织中的LRP11表达情况。其中，A图为LRP11的蛋白质表达通过Western Blot实验在12例正常宫颈组织和12例宫颈癌组织中测定情况。B图为A图中所示的蛋白质的定量表达水平；*P<0.05。

图2示出了数据库(实施例1.1中所示)的生物信息学分析结果；其中，A图示出了在GEO数据库中LRP11mRNA在不同病变级别的宫颈组织中的表达情况；B图和C图示出了在Oncomine数据中LRP11在正常宫颈及宫颈癌组织中的表达情况；D图示出了在GEPIA数据库中LRP11和CDK2的共表达关系；E图示出了在GEPIA数据库中LRP11和CDK4的共表达关系；F图和G图示出了在GEIPA数据库中P16和LRP11表达情况与宫颈癌患者整体生存预后之间的关系；其中，CDKN2A基因也称多重肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor l，MTS1)，也称为P16基因。**P<0.01，***P<0.001。

图3示出了LRP11和P16在宫颈癌组织中的表达及其相关性。其中，A图为P16在正常宫颈(Normal cervix)、宫颈高级别上皮内病变(HSIL)和宫颈癌组织(cervix cancer)中的表达；B图为LRP11在正常宫颈、宫颈高级别上皮内病变和宫颈癌组织中的表达；分别为×40和×200。C图为正常子宫颈、HSIL和宫颈癌中P16的H-Score评分；D图为正常子宫颈、HSIL和宫颈癌中LRP11的H-Score评分；E图为P16和LRP11的表达之间的相关性(r＝0.5407)；***P<0.001。

图4示出了宫颈癌患者的Kaplan-Meier总生存曲线与P16表达(A)和LRP11表达(B)的相关性；*P<0.05。

图5示出了LRP11沉默对P16的影响；其中，A图示出Western blot检测在SiHa细胞系沉默LRP11后，P16表达降低；B图示出Western blot检测在CaSki细胞系沉默LRP11后，P16表达降低。*与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01。

图6示出了LRP11对细胞存活力和细胞周期分布的影响。A图和B图分别为在培养0、12、24、48、72小时后，通过CCK-8实验分别测定评估SiHa细胞系(A图)和CaSki细胞系(B图)LRP11沉默组(即sh-LRP11)及对照组(即NC)的存活率；C图和D图为分别为通过流式细胞术分别评估LRP11沉默组及对照组细胞的细胞周期分布；E图和F图分别为对C图和D图中细胞周期分布情况进行的定量分析；G图和H图分别为沉默LRP11后，分别对CDK 2-cyclin E1和CDK 4-cyclin D1的蛋白表达水平进行测定分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图7示出了LRP11对细胞凋亡的影响：A图示出了沉默LRP11诱导SiHa细胞的早期凋亡；B图示出了在CaSki细胞中沉默sh-LRP11,细胞凋亡没有变化；C图和D图分别为对A图和B图的定量分析；E图和F图为分别对SiHa细胞系和CaSki细胞系中凋亡相关蛋白进行测定。*P<0.05。

图8示出了LRP11对SiHa和CaSki细胞迁移和侵袭的影响。A图和B图示出了分别在SiHa和CaSki细胞中沉默LRP11，导致细胞迁移和侵袭数目减少。C图和D图为分别对A图和B图的定量分析。E图和F图示出了进行Western Blot实验以验证分别在SiHa和CaSki细胞中沉默LRP11后MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白质水平变化；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图9示出了LRP11对体内肿瘤生长的影响：将用sh-LRP11转染的SiHa细胞及对照组注射到裸鼠皮下，A图和B图示出了连续测量肿瘤体积41天的肿瘤体积变化情况；C图和D图示出了在第41天处死裸鼠获取肿瘤对肿瘤的测量与称重情况；E图为通过免疫组织化学检测LRP11和P16表达。F图为对E图中LRP11和P16进行评分。*P<0.05，***P<0.001。

图10示出了LRP11致癌作用的模式图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。未单独注明来源的试剂或材料为本领域常规的试剂或材料，可按照本领域常识选取或按照常规方式处理或者按照厂商建议条件处理或使用，以及可通过常规渠道购买获得。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例

1.材料及方法

1.1生物信息学分析数据库

对LRP11行生信分析的数据库主要有：GEO数据库(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles),Oncomine数据库(https://www.oncomine.org),GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/).

1.2组织学标本

新鲜组织样本(12例正常子宫颈组织和12例宫颈癌组织)来自妇产科手术室。石蜡包埋的组织样本来自39名正常对照(健康或子宫良性肿瘤病例)、40名宫颈高级别上皮内病变患者和50例宫颈癌患者，这些患者于2009年至2012年入住山东大学齐鲁医院。制作石蜡包埋的组织块，最后制作组织微阵列(TMA)蜡块。检查所有临床信息，包括年龄，HPV感染状态，ThinPrep细胞学检查(TCT)结果，阴道镜检查和病理诊断结果，并根据2009年FIGO分期指南对患者进行分期。该项已得到齐鲁医院伦理委员会的批准。

1.3免疫组织化学实验及评分

TMA蜡块切成4微米厚度，并购买一抗P16(1:200,Abcam,USA,ab189034)和一抗LRP11(10μg/mL,R&D Systems,USA,AF8355)进行免疫组织化学染色，染色及评分步骤如下：

染色步骤：

(1)脱蜡、脱苯、水化；

(2)PBS清洗2～3次各5分钟；

(3)抗原修复物理修复：采用微波修复法；

(4)PBS清洗3次，每次各3分钟；

(5)滴加足量3％H₂O₂于切片，完全覆盖组织，对内源性过氧化物酶进行封闭，室温下孵育20分钟；

(6)PBS清洗3次，每次各3分钟；

(7)试剂盒中B溶液为山羊血清封闭液，可用来封闭非特异性抗原,室温下孵育20分钟。

(8)滴加已经稀释好的一抗200-400μl，4℃冰箱过夜。

(9)4℃过夜后需在室温下平衡1小时温度；

(10)PBS清洗3次，每次各3分钟；

(11)滴加二抗200-400μl(试剂盒)，室温孵育30-60分钟；

(12)PBS洗3次各3分钟；

(13)取试剂盒底物，均匀滴到组织切片上，室温下孵育30分钟左右；

(14)滴DAB于组织切片上，根据显微镜下组织染色变化终止染色；

(15)使用PBS或者自来水冲清洗10分钟；

(16)将组织切片置于苏木素染色液中染色5分钟，并进行盐酸酒精分化及氨水返蓝步骤；

(17)自来水冲洗10～15分钟；

(18)行脱水、透明，并封片、镜检。

H-Sore评分步骤：

(1)组织芯片扫描仪型号为Pannoramic MIDI，供应厂家：3D HISTECH。组织芯片染色完成之后可上机，芯片将缓慢的在Pannoramic MIDI扫描仪的镜头下移动，并且图像将被扫描保存。使用Pannoramic查看器软件打开文件后，可以以1到400倍的任何倍率对图像进行方法，并可以在任意位置进行图像截取；

(2)Quant center是Pannoramic查看器的分析软件。当组织芯片的图像扫描完成后，Quant center中的TMA软件会设置编号，与组织芯片的排列相对应，此后，Quant center中的densito定量软件自动识别芯片组织中所有深褐色点为强阳性，棕黄色点为中度阳性，浅黄色点为弱阳性，仅蓝色细胞核为阴性，并分析各染色(强、中、弱、阴性)区域的百分比，以像素为单位，最后进行H-Score评分。

1.4宫颈癌细胞的培养

人宫颈癌细胞系SiHa(HPV 16阳性宫颈鳞癌)、CaSki(HPV 16、18阳性宫颈鳞癌)均自中国上海中科院细胞库购买。SiHa细胞系采用MEM培养基，CaSKi细胞系采用RPMI-1640培养基，上述培养基均加入10％含量胎牛血清(FBS)，1％含量青霉素和链霉素双抗，上述四种细胞系均在37℃+5％CO₂含量的细胞孵箱中进行无菌培养。

1.5LRP11基因干扰技术

为了进一步阐明LRP11在宫颈癌中的作用，本实施例用LRP11短发夹RNA(shRNA)质粒转染至SiHa和CaSki细胞系，以靶向沉默LRP11的表达。该质粒由和元公司(中国上海)设计并提供。慢病毒载体pLKD-CMV-G&PR-U6用于促进转导效率。用嘌呤霉素二盐酸盐(2μg/ml；Amresco，Solon，OH，USA)选择性培养7天后，可筛选出稳定沉默的细胞系进行后续实验。为方便起见，本实施例将LRP11沉默细胞系命名为sh-LRP11，而对照细胞系命名为NC。

1.6细胞增殖实验

使用CCK-8试剂盒(同仁，上海，中国)评估细胞存活能力。根据试剂说明书，将2×10³个细胞接种在96孔板的孔中，并培养0、12、24、48、72小时。然后，将4μl CCK-8试剂加入包括阴性对照的每个孔中，继续培养4个小时，最后使用酶标仪(Infinite 2000；Tecan，

Switzerland)测量450nm处的光密度(OD)。

1.7流式实验

流式周期实验

(1)当对照组及实验组细胞生长到对数期时，可用来进行流式周期实验；

(2)细胞固定：800rpm转速下离心5min，弃掉上清，收集细胞沉淀，用提前预的1×PBS洗涤两次，加入提前预冷的75％乙醇溶液，并置于4℃冰箱固定过夜；

(3)细胞染色：1200rpm转速下离心5min，弃掉上清，用1×PBS洗涤1次，再次在1200rpm转速下离心5min，并加入400uL溴化乙锭(PI，浓度为50ug/mL)，100ul RNase A(浓度为100ug/mL)，避光条件下孵育30min；

(4)流式上机及分析：按照标准程序使用流式细胞仪进行检测，一般计数2万个左右细胞数，使用拟和软件ModFit对细胞周期结果进行分析。

流式凋亡实验

(1)当对照组及实验组细胞生长到对数期时，可用来进行流式凋亡实验；

(2)细胞染色：在800rpm转速下离心5min，弃掉上清，收集细胞沉淀，用1×PBS洗涤1次，并加入FITC标记的Annexin-V染液5μL，加入PI染液5μL，在室温下避光孵育30min；

(3)流式上机及分析：按照标准程序使用流式细胞仪进行检测，一般计数1万个细胞左右，收集完成后对正常细胞数目、早期凋亡细胞数目、晚期凋亡细胞数目及其占总体细胞数目的比例进行统计；

1.8Transwell迁移侵袭实验

(1)将保存于-20℃的Matrigel基质胶转移至置于4℃冰箱融化为液态。将Transwell小室小心放入24孔培养板中，用不含血清的培养基为稀释液，以1：8的比例对Matrigel胶进行稀释，60μL稀释好的Matrigel均匀加入小室中，覆盖于上室的表面，置于4℃冰箱10min，37℃孵箱中静置1个小时；

(2)取对数生长期各组细胞常规消化，含血清培养基终止消化，800rpm离心5min，使用不含血清的培养基重悬混匀细胞，并进行细胞计数；

(3)向下室中加入700μL含有10％FBS或者20％FBS的完全培养基,上室加入200μL细胞悬液，水平混匀，注意下室与液面之间不要留有气泡；

(4)将24孔细胞培养板置于孵箱，迁移实验培养24h左右，侵袭实验培养48h左右；

(5)取出24孔板，弃掉上室中的培养液，用PBS洗涤小室数次。用移液枪吸取700μL4％多聚甲醛于小室底部，固定细胞30min，三蒸水洗3次，用移液枪吸取700μL 0.1％结晶紫溶液于小室底部，染色30分钟；三蒸水洗3次，用棉签轻轻擦去小室上方的细胞，倒置在卫生纸上晾干小室；

(6)将小室置于倒置显微镜下观察，放大200倍，随机选择5个高倍镜视野，拍照，用软件Image J计算照片中穿过的细胞总数。

1.9Western Blot实验

(1)清洗玻璃板，组装胶架；

(2)配制分离胶：根据蛋白分子的大小配制10％或者12％的分离胶；

(3)灌胶：将胶配好后用移液枪将胶液注入玻璃架内。然后加入双蒸水或者异丙醇，隔绝空气。室温静置约20分钟，待胶凝固后，倒掉上层的双蒸水或者异丙醇；

(4)按需配制5％或者6％浓度的浓缩胶；

(5)混匀，加入玻璃板架槽内，插入梳子。插梳子时应该迅速，可避免产生气泡。室温下静置20min，直至上层浓缩胶凝固；

(6)将凝胶板取下并放入电泳槽中，而后加入1×电泳缓冲液；

(7)加样：根据蛋白浓度计算上样体积(每孔30-60μg)，用移液枪加入样品至对应的孔内，样品的两侧上样孔加入5μL蛋白Marker，在实验本上记录每个上样孔中的样品名称及体积；

(8)电泳：连接电泳槽与电泳仪，打开电源开关，设置80v保持恒压，电泳至样品接近分离胶顶端时，调整电压120-130v保持恒压，至溴酚蓝和蛋白Marker移动至分离胶底端时，关闭电源；

(9)根据加入蛋白上样孔的数量，裁剪对应大小的PVDF膜，并在甲醇溶液中浸泡20s激活，然后取出浸在预冷的转膜缓冲液中备用，将海绵、滤纸也浸入转膜液中备用；

(10)取出玻璃板，小心裁掉浓缩胶及部分多余的分离胶。整个过程避免干胶；

(11)打开转移夹盖板，按照三明治夹心结构放入白色夹板、海绵垫、滤纸、PVDF膜、分离胶、滤纸、海绵垫、黑色夹板。避免胶与膜之间产生气泡；

(12)夹板置于转膜装置内，加入预冷转膜液，可以泡在盛满冰水混合的泡沫箱内维持低温环境，连接电源；

(13)设定转膜电流为220-300mA之间，转膜90-120min；

(14)右上角裁掉标记膜的正面后，将PVDF膜浸入5％脱脂奶粉，在摇床上缓慢摇动90min,室温封闭；

(15)孵育一抗：根据目的蛋白的分子量及蛋白Marker裁剪条带，孵育相应一抗，4℃冰箱过夜；

(16)孵育大约16-20小时后，TBST洗涤3次，每次10分钟；

(17)将蛋白条带移入到辣根过氧化物酶标记的二抗中，室温孵育90min；

(18)TBST洗涤3次，每次10分钟；

(19)按需等体积混合ECL试剂盒中的A溶液和B溶液，配制发光液；

(20)将发光液滴加在膜上，曝光；

(21)收集图像，并使用软件Image J进行分析。

1.10体外裸鼠成瘤实验

(1)订购5周龄裸鼠饲养于裸鼠实验动物房；

(2)适应性喂养3天后，裸鼠称重，剔除体重偏离过大的裸鼠然后随机分组，根据实验组别小鼠数目进行剪耳标记并称重记为初始体重；

(3)培养肿瘤细胞，并于接种前0.25％胰酶消化1000rpm，4min离心收集细胞，血球计数板细胞计数并用无血清培养基调整细胞浓度到5*10⁷个/mL；

(4)碘酒擦拭裸鼠右侧腋下，注射器吸取细胞悬液500uL，于右侧腋窝皮下进针推注100μL，所接种细胞量为5*10⁶个/只；

(5)将裸鼠放回IVC笼架上，之后每天观察裸鼠一次，并一周监测裸鼠体重2次并观察裸鼠肿瘤生长情况，8天后进行肿瘤监测，且每周2次同步于体重监测。

1.11统计学方法

使用GraphPad Prism 5.01版本(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA)用于统计分析和绘图。在本研究中，涉及到检验方法有：Student t检验、卡方检验(包括校正公式及Fisher确切概率法)、Pearson相关检验、Log Rank检验。P＜0.05时被认为具有统计学差异。

2.结果部分

2.1LRP11及P16在正常宫颈、宫颈高级别上皮内病变组织及宫颈癌组织中的表达情况

本实施例通过Western Blot实验检测了12例新鲜正常宫颈组织和12新鲜宫颈癌组织中LRP11的相对蛋白质表达水平(图1A)。发现宫颈癌样本中LRP11的蛋白水平显着高于正常组织(P<0.05)(图1B)。这些结果与本实施例的生物信息分析一致，生物信息学分析结果如图2所示。然后，通过免疫组织化学实验比较正常宫颈，宫颈高级别上皮内病变和宫颈癌组织中P16和LRP11的表达水平(图3)。宫颈高级别上皮内病变和宫颈癌组织中P16的表达水平高于正常宫颈组织(P<0.001)(图3A、C)，而LRP11表达水平随病变程度增加，表达水平逐渐上升，与病理水平变化显著相关(P<0.0001)(图3B、D)。此外，本实施例进行了Pearsonr检验以确定LRP11和P16的表达之间的相关性。结果发现LRP11表达与P16表达正相关(r＝0.5407，P<0.001)(图3E)。

2.2LRP11及P16的表达水平与临床病理因素间的关系，与宫颈癌患者整体生存预后间的关系

相关结果列于下表1中。如表1中所示，LRP11的表达与宫颈癌分化程度相关(P＝0.0266<0.05)，与年龄、组织类型、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移(LNM)或淋巴脉管间隙浸润(LVSI)因素无关。P16的表达水平与上述临床因素无相关性。此外，本实施例收集了这些宫颈癌患者的生存数据，包括33名生存者、12名死亡和5名失访的患者。LRP11高表达的宫颈癌患者整体生存时间短于LRP11低表达的宫颈癌患者(P<0.05)；然而，P16表达水平高低和宫颈癌患者的整体生存率无明显相关性(如图3A、B)。这与本实施例的生物信息学生存分析结果一致(如图2F、G)，是对生物信息学生存分析结果的进一步验证。

表1.LRP11、P16表达情况和宫颈癌患者临床病理因素间的关系(卡方检验)

备注：*P<0.05。

2.3干扰LRP11对P16蛋白的影响

为了研究LRP11对P16表达的影响，本实施例进行了Western Blot实验，结果如图5所示。与其各自的对照组(NC)相比，SiHa、CaSki细胞系中LRP11的沉默导致P16表达下降(P<0.05)。

2.4LRP11增强了宫颈癌细胞的增殖能力，并能加速细胞的周期循环速度

为了确认LRP11是否影响细胞活力和细胞周期，本实施例进行了CCK-8增殖实验和流式细胞周期测定。与NC组相比，SiHa细胞系sh-LRP11组的细胞存活率在12和24小时较低(图6A)，CaSki细胞系sh-LRP11组的细胞存活率在24和48小时(图6B)降低。本实施例还使用流式细胞术测量细胞周期分布。与NC组相比，SiHa和CaSki的sh-LRP11组在G0/G1期停滞(图6C、D)。本实施例还发现细胞周期调节蛋白，包括CDK2/4和cyclin D1/E1，受LRP11表达的影响。在SiHa和CaSki中沉默LRP11，这些蛋白表达水平下降(图6G，H)。此外，在本实施例的生物信息分析中发现，CDK2、CDK 4的表达与LRP11的表达呈正相关(CDK 2：r＝0.38/0.12，P<0.001/0.05；CDK 4：r＝0.12，P<0.05)。

2.5LRP11对细胞凋亡的影响较小

为了研究LRP11是否影响宫颈癌细胞的凋亡，本实施例进行了流式凋亡测定实验。本实施例发现在SiHa细胞系中沉默LRP11会导致早期凋亡(碘化丙啶PI-/膜联蛋白Annexin+)小幅度增加，晚期凋亡(碘化丙啶PI+/膜联蛋白+)没有发生显著变化(图7A、C)；在CaSki细胞系中沉默LRP11对早期凋亡和晚期凋亡都没有什么影响(图7B、D)。Western Blot实验结果显示凋亡相关蛋白(包括PARP，BcL-xL，Bax)也没有显著变化。

2.6LRP11能促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力

与NC组相比，SiHa细胞系sh-LRP11组和CaSki细胞系sh-LRP11组中迁移和侵袭细胞的数量显著较低(P<0.01/P<0.001)(图8A、B、C、D)。为了检测LRP11是否在蛋白质水平上影响MMP-2、MMP-9和VEGF，本实施例进行了Western Blot实验，发现MMP-2、MMP-9和VEGF随着LRP11的沉默而下调(图8E、F)。

2.7沉默LRP11抑制了裸鼠瘤体的生长

为了检测宫颈癌中LRP11的沉默是否会抑制体内肿瘤生长，本实施例将转染了空白对照质粒和sh-LRP11质粒的SiHa细胞注射到无胸腺裸鼠皮下。连续测量肿瘤体积41天，肿瘤体积情况如图9A和B所示，在第41天时发现，sh-LRP11组肿瘤比对照组中的肿瘤生长速度慢(P<0.05)。此外，sh-LRP11组肿瘤的平均体积和重量比对照组(NC)更小和更轻(P<0.05)(图9C、D)。免疫组织化学实验显示sh-LRP11组中P16表达较低(P<0.05)(图9E、F)，这些结果也验证了前述2.3中Western Blot的实验结果，即干扰LRP11对P16蛋白有影响，LRP11的沉默导致P16表达下降。

3.结果分析

稳定的细胞周期及相关调节对于子宫颈细胞的正常生长至关重要。在正常细胞的G1期，低磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)与E2F-DP1转录因子结合，控制细胞过度的增殖。当需要正常增殖活动时，CDK 2-cyclin E和CDK 4/6-cyclin D共同作用会使有Rb和E2F转录复合物失活(Satyanarayana,A.and P.Kaldis,Mammalian cell-cycle regulation:several Cdks,numerous cyclins and diverse compensatory mechanisms.Oncogene,2009.28(33):p.2925-39.；Kim,Y.T.and M.Zhao,Aberrant cell cycle regulation incervical carcinoma.Yonsei Med J,2005.46(5):p.597-613.)，从而促进细胞的生长增殖。宫颈癌主要由持续性的高危型HPV感染引起，在HPV致癌基因整合后，它产生大量的E7癌蛋白，E7会与Rb结合，使Rb-E2F复合物失活，导致细胞过度增殖，最终引起宫颈上皮内病变及宫颈癌的发生(LRP11致癌作用的模式图如图10所示)。本实施例发现在宫颈上皮内病变及宫颈癌患者的宫颈组织中LRP11表达升高，并且与宫颈癌患者的总体存活率相关。此外，本实施例发现LRP11与CDK 2、CDK 4呈正相关，表明LRP11与细胞周期活动有关，抑制LRP11比如对LRP11进行基因沉默可下调CDK 2、CDK4的表达水平、阻滞细胞周期，尤其使细胞周期的G0、G1期停滞。在本发明中，为了验证生物信息学分析的结果，实施例进行了WesternBlot实验和免疫组织化学实验，结果是一致的。此外，本实施例将P16作为LRP11的参照，因为有大量研究证实，P16参与细胞周期调控，目前已经广泛应用于宫颈上皮内病变及宫颈癌患者的临床检测(比如Nuovo,G.J.,et al.,New biomarkers of human papillomavirusinfection in acute cervical intraepithelial neoplasia.Ann Diagn Pathol,2018.36:p.21-27.)。本实施例发现LRP11随病变级别上升而表达增高，与宫颈癌分化程度相关，并且可以用作宫颈癌患者的生存预后标记物，这是优于P16的地方。在CCK-8和流式细胞术检测及Western Blot实验结果表明LRP11可通过影响CDK 2-cyclin E和CDK 4-cyclinD的表达来加速细胞周期，但对细胞凋亡几乎没有影响。此外，Transwell结果显示LRP11可以通过调节MMP-2，MMP-9和VEGF的表达促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭，而抑制LRP11比如对LRP11进行基因沉默，可下调MMP-2，MMP-9和VEGF的表达，抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。最后，体外裸鼠成瘤实验也验证了LRP11的致癌作用，而抑制LRP11比如对LRP11进行基因沉默，可抑制宫颈癌细胞的体外成瘤。

总之，本发明实施例表明LRP11可参与人宫颈上皮内病变及和宫颈癌的发生及进展过程。LRP11的高表达与宫颈癌的低分化和患者较差的总体生存率显著相关。此外，LRP11可影响CDK2-cyclin E和CDK4-cyclin D细胞周期途径参与细胞生长增殖过程(图10)。所有这些结果表明LRP11可用作宫颈癌患者的预后标志物和治疗靶点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.将LRP11作为靶点在筛选用于治疗宫颈癌前病变或宫颈癌的制品中的应用。

2.将LRP11作为靶点在筛选用于抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞增殖的制品中的应用。

3.将LRP11作为靶点在筛选用于抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞的迁移和/或侵袭能力的制品中的应用。

4.将LRP11作为靶点在筛选用于抑制宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞体外成瘤的制品中的应用。

5.将LRP11作为靶点在筛选用于阻滞宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞周期的制品中的应用。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述组织细胞周期表现为使宫颈癌前病变组织细胞或宫颈癌细胞在细胞周期的G0、G1期停滞。

7.将LRP11作为靶点筛选在体外用于下调宫颈癌细胞MMP-2、MMP-9和VEGF中一种或多种蛋白的表达水平的制品中的应用；和/或，

将LRP11作为靶点筛选在体外用于下调宫颈癌细胞P16、CDK 2、CDK 4、cyclin D1和cyclin E1中的一种或多种蛋白的表达的制品中的应用；

上述应用皆不包括疾病的诊断和治疗。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于，所述制品选自LRP11基因沉默材料。

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