CN116068189A - 早期癌检测试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫组织化学领域，特别涉及早期癌检测试剂及其应用。本发明提供了组合试剂及其在制备消化道早期癌术后预测产品中的应用，所述组合试剂及所述产品可将癌组织和黏膜肌层或血管内皮细胞在同一张切片显现，色彩对比清晰、直观，所带来的诊断信息量远比传统试剂高，具有明显诊断优势，有助于病理医生更加方便的观察肿瘤微小浸润情况、肿瘤和黏膜肌的关系情况，精确测量肿瘤浸润深度，为病理医生对消化道早期癌术后精准的预测提供重要帮助。

Description

早期癌检测试剂及其应用
技术领域
本发明涉及免疫组织化学技术领域，特别涉及早期癌检测试剂及其应用。
背景技术
我国是消化道肿瘤的高发地区，食管癌和胃癌的发病率一直处于世界前列，大肠癌的发生近几十年来也出现显著的增长，成为威胁我国人民生命健康和经济社会发展的严重问题。由于大多数消化道癌症的早期症状并不明显，很容易被患者忽视，一经发现就已是晚期。消化道癌症的治愈率和存活率，与其发现的早晚密切相关，早期发现、早期诊断和早期治疗是提高恶性肿瘤治疗效果的有效手段，准确的病理诊断是消化道癌前病变和早期癌有效治疗的前提和保证。因而，消化道癌前病变和早期癌的诊断一直是国际病理界关注的焦点问题。
目前国内、外针对消化道早期癌术后预测主要依靠常规HE染色或单一的预测指标，准确诊断往往十分困难。目前已有的单预测试剂无法精准的预测肿瘤微小浸润情况、肿瘤和脉管的关系，所能提供的诊断信息有限，且多预测指标在切片过程中带来极大的损耗，故不能满足目前消化道早期癌术后的精确预测。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了早期癌检测试剂及其应用。本发明提供了组合试剂。本发明通过实验发现所述组合试剂可将癌组织和黏膜肌层在同一张切片显现，色彩对比清晰、直观，所带来的诊断信息量远比传统试剂高，具有明显诊断优势，有助于病理医生更加方便的观察肿瘤微小浸润情况、肿瘤和黏膜肌的关系情况，精确测量肿瘤浸润深度，为病理医生对消化道早期癌术后精准的预测提供重要帮助。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了组合试剂，所述组合试剂包括第一抗体，第二抗体和显色剂；
所述第一抗体包括CK（pan）一抗和Desmin一抗或；
所述第一抗体包括CK（pan）一抗和CD31一抗；
所述CK（pan）一抗的浓度不低于1：400；
所述Desmin一抗的浓度不低于1：400；
所述CD31一抗的浓度不低于1：400；
所述第二抗体包括辣根过氧化物酶标记的二抗和碱性磷酸酶标记的二抗；
所述显色剂包括DAB和Fast Red。
在本发明的一些具体实施方案中，所述混合型第二抗体包括辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG聚合物和碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG聚合物的混合抗体。
本发明还提供了所述组合试剂在制备消化道早期癌术后预测的免疫组化双染试剂盒中的应用。
本发明还提供了免疫组化双染试剂盒，其包括所述组合试剂。
本发明还提供了所述组合试剂或所述免疫组化双染试剂盒在制备消化道早期癌术后预测产品中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述消化道早期癌包括食管早期癌，胃早期癌或肠早期癌中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述消化道早期癌术后预测产品包括免疫切片。
本发明还提供了免疫切片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、取石蜡切片，脱蜡和水化；
步骤2、抗原修复，阻断；
步骤3、采用所组合试剂，或所述免疫组化双染试剂盒中的第一抗体孵育；
步骤4、采用所述组合试剂，或所述免疫组化双染试剂盒中的第二抗体孵育；
步骤5、采用所述显色剂显色、Mayer苏木素染液复染、脱水、透明、封片，制得染色后的切片。
在本发明的一些具体实施方案中，所述CK（pan）一抗的浓度不低于1：400；
所述Desmin一抗的浓度不低于1：400；
所述CD31一抗的浓度不低于1：400。
在本发明的一些具体实施方案中，所述DAB的浓度不低于1：50；
所述Fast Red的浓度不低于1：50。
在本发明的一些具体实施方案中，所述复染的时间包括30～60秒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法，包括如下步骤：
步骤1、脱蜡和水化：石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×2次；去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡2分钟×2次；去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡2分钟；去除多余的液体后，置于75%乙醇中，浸泡2分钟；去除多余的液体后，蒸馏水冲洗，置于Ultra冲洗缓冲液中；
步骤2、抗原修复：EDTA抗原修复液pH9.0，于35~90kPa，高火条件下（100~120℃）将切片置于其中，并完全浸泡组织，85~90kPa，中火（100~120℃）继续加热2.5分钟；冷却；23℃±2℃后取出切片，Ultra冲洗缓冲液浸泡清洗2分钟×3次；
滴加50μL内源性过氧化物酶阻断剂，23℃±2℃孵育10分钟；蒸馏水洗2次后甩干液体；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次；
步骤3、滴加50μL所述第一抗体或空白对照试剂，37℃孵育60分钟或2～8℃孵育过夜；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次；
步骤4、滴加50μL所述第二抗体，37℃孵育30分钟；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次；
步骤5、滴加50μL试剂DAB，23℃±2℃孵育15~20分钟；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次；
滴加50μL试剂Fast Red，23℃±2℃孵育5~10分钟；水冲洗；
复染：滴加Mayer苏木素染液23℃±2℃染色30～60秒，水冲洗，返蓝；
脱水、透明、中性树胶封片，制得免疫切片。
本发明还提供了非诊断性的消化道早期癌术后预测方法，基于以下任意项进行消化道早期癌术后预测；
（I）、所述组合试剂；和/或
（II）、所述免疫组化双染试剂盒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述诊断性的消化道早期癌术后预测方法包括如下步骤：
1、脱蜡和水化：石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×次；去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡2分钟×2次；去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡2分钟；去除多余的液体后，置于75%乙醇中，浸泡2分钟；去除多余的液体后，蒸馏水冲洗，置于Ultra冲洗缓冲液中。
2、抗原修复：EDTA抗原修复液pH9.0，于35~90kPa，100~120℃条件下将切片置于其中，并完全浸泡组织，85~90kPa，100~120℃继续加热2.5分钟；冷却；23℃±2℃后取出切片，Ultra冲洗缓冲液浸泡清洗2分钟×3次。
3、滴加50μL（内源性过氧化物酶阻断剂），23℃±2℃孵育10分钟；蒸馏水洗2次后甩干液体，Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次。
4、滴加50μL试剂【双染一抗（CK（pan）+Desmin）/（CK（pan）+CD31）】或空白对照试剂，37℃孵育60分钟或2～8℃孵育过夜；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次。
5、滴加50μL试剂【双染二抗（HRP标记+AP标记）】，37℃孵育30分钟；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次。
6、滴加50μL试剂DAB，23℃±2℃孵育15~20分钟；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次。
7、滴加50μL试剂Fast Red，23℃±2℃孵育5~10分钟；水冲洗。
8、复染：滴加Mayer苏木素染液23℃±2℃染色30～60秒，水冲洗干净，返蓝。
注意：需要控制苏木素染色液的染色强度。颜色过浅或过深都会干扰显色结果的观察。
9、脱水、透明、中性树胶封片。
10、结果判读：在光学显微镜下对染色后切片进行观察和结果判读。
本发明包括但不限于取得如下有益效果：
本发明应用高分子化学与物理技术合成新型消化道早期癌术后预测试剂，可将癌组织和黏膜肌层在同一张切片显现，色彩对比清晰、直观，所带来的诊断信息量远比传统试剂高，具有明显诊断优势，有助于病理医生更加方便的观察肿瘤微小浸润情况、肿瘤和黏膜肌的关系情况，精确测量肿瘤浸润深度，为病理医生对消化道早期癌术后精准的预测提供重要帮助。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示食管早期癌ESD标本HE中倍放大（4×10倍）；
图2示食管早期癌ESD标本CK（pan）/Desmin免疫组化双染中倍放大（4×10倍）；
图3示胃早期癌ESD标本HE中倍放大（4×10倍）；
图4示胃早期癌ESD标本CK（pan）/Desmin免疫组化双染中倍放大（4×10倍）；
图5示肠早期癌ESD标本HE中倍放大（4×10倍）；
图6示肠早期癌ESD标本CK（pan）/Desmin免疫组化双染中倍放大（4×10倍）；
图7示单一HE染色（4×10倍）；
图8示单一CK（pan）染色（4×10倍）；
图9示单一Desmin染色（4×10倍）；
图10示食管早期癌术后预测指标（CK（pan）/CD31）（10×20倍）；
图11示食管早期癌术后预测指标（CK（pan）/CD31）（10×40倍）；
图12示食管早期癌HE预测指标（10×20倍）；
图13示食管早期癌HE预测指标（10×40倍）；
图14示单一HE染色（10×10倍）；
图15示单一CK（pan）染色（10×10倍）；
图16示单一CD31染色（4×20倍）。
具体实施方式
本发明公开了早期癌检测试剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
现有早期癌术后预测技术一般包括如下步骤：1、用第一种种属的动物抗体如兔和相应的标记二抗依次孵育切片，显示第一种抗原；2、再用第二种种属的动物抗体如山羊和相应的标记二抗依次孵育切片，显示第二种抗原；3、再将两种标记的二抗依次孵育切片，最后用DAB显色。缺点：连续多次染色，所费时间较长，且相互之间染色存在信号干扰。
如现有的一种检测癌细胞侵犯神经的免疫组化双标试剂盒。该试剂盒一次性标记、显示癌细胞和神经纤维，对癌细胞神经侵犯的识别高效而准确，但在消化道早期癌中肿瘤细胞和黏膜肌层都染成同一颜色，无法区分；一种用于肝细胞良、恶性肿瘤辅助诊断的双染试剂盒及其应用，该试剂盒所需成分较为复杂，使用的两个一抗来自两个不同的动物种属，而且需要两个不同的二抗以对应两个不同种属的一抗；同时，该试剂盒使用了两个不同的显色系统，染色过程中两个显色系统可能会互相干扰。
本发明以消化道早期癌发生及目前国内外已有预测消化道早期癌术后预测试剂为基础，利用高分子化学与物理技术合成消化道早期癌术后预测试剂，利用抗原抗体结合的原理，在免疫组织化学染色过程中，两种一抗分别特异性结合组织种的靶抗原，形成抗原抗体复合物，两种酶标二抗分别与相应的复合物特异性结合，并通过酶促反应分别使DAB和RED显色。
本发明应用新型消化道早期癌术后预测试剂可将癌组织和黏膜肌层/癌组织和血管内皮细胞在同一张切片显现，对比清晰、直观，所带来的诊断信息量远比传统试剂高，具有明显诊断优势，有助于病理医生更加方便的观察肿瘤微小浸润情况、肿瘤和黏膜肌的关系、血管、淋巴管、神经的情况，精确测量肿瘤浸润深度，为病理医生对消化道早期癌术后精准的预测提供重要帮助。同时探索一种快捷型术后预测系统及优化染色流程，有效避免内源性生物素的干扰，将大大缩短病理技师的工作时间和流程，为消化道早期癌的准确诊断起到积极的推动作用，可使广大的肿瘤患者在早期得到明确诊断及有效治疗，大大节省医疗资源。
本发明的试剂盒可针对上述临床需求提出整体解决方案，主要功能包括：能够对消化道早期癌进行精准化的术后预测，并在同一张切片上更加直观的观察肿瘤微小浸润情况、肿瘤和黏膜肌的关系、淋巴管和脉管侵犯情况、精确测量肿瘤浸润深度等，为后续治疗方针的确定提供强有力的证据；同时，使用本发明的试剂盒，观察者无需费力搜寻就能快速地在切片中发现癌细胞黏膜肌层，继而通过观察癌细胞是否浸润到黏膜肌层内，判断是否存在癌侵犯。因此，使用本发明的试剂盒能高效准确的检测有无消化道肿瘤侵犯。本发明的试剂盒更为简单、廉价，易于操作，并且避免了两种显色系统可能出现的互相干扰。
本发明所需实验试剂如下：
1、CK（pan）（购于福州迈新生物技术开发有限公司），（工作液1：200稀释）用于标记消化道早期肿瘤组织。
2、Desmin（购于福州迈新生物技术开发有限公司），（工作液1：200稀释）用于标记消化道早期癌平滑肌层组织。
3、CD31（购于福州迈新生物技术开发有限公司），（工作液1：200稀释）用于标记消化道早期癌血管内皮细胞。
4、兔二抗法试剂盒（兔聚合物法检测系统）（工作液）（购于北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：PV6001），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG聚合物与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物，聚合物上的HRP催化底物H2O2与DAB反应，最终形成棕褐色不溶性色原，从而在显微镜下显示出组织片中的特定抗原的位点。
5、碱磷酶标记马抗小鼠IgG（H+L）（亲和纯化）（工作液1：50稀释）（购于北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2310），碱性磷酸酶（AP）标记马抗小鼠IgG与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物，聚合物上的AP催化底物H2O2与RED反应，最终形成红色不溶性色原，从而在显微镜下显示出组织片中的特定抗原的位点。
6、DAB显色试剂盒（购于福州迈新生物技术开发有限公司）（工作液1：20稀释）与HRP反应显棕褐色，标记消化道肿瘤组织。
7、免疫显色试剂（红染）染色试剂盒（Fast Red显色剂），（购于赛特瑞，产品编号SD8003或SD8013），（工作液1：25稀释）与AP反应结合显红色，标记消化道早期癌黏膜肌层组织。
8、抗体稀释液，购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
本发明切片来源于消化道早期癌，吉林大学第一医院内镜中心。
如无特殊说明，本发明提供的早期癌检测试剂及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例 切片染色
试剂配置
双染一抗的配制：在1mL抗体稀释液中，分别加入CK（Pan）和Desmin一抗各5μL或分别加入CK（Pan）和CD31一抗各5μL，均匀混合。
双染二抗的配制：在1mL辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG溶液中，加入碱磷酶标记马抗小鼠IgG（H+L）20μL，均匀混合。
实验方法：
1、脱蜡和水化：石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×2次；去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡2分钟×2次；去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡2分钟；去除多余的液体后，置于75%乙醇中，浸泡2分钟；去除多余的液体后，蒸馏水冲洗，置于Ultra冲洗缓冲液中。
2、抗原修复：EDTA抗原修复液pH9.0，90kPa，110℃条件下将切片置于其中，并完全浸泡组织，90kPa，110℃继续加热2.5分钟；冷却；23℃±2℃后取出切片，Ultra冲洗缓冲液浸泡清洗2分钟×3次。
3、滴加50μL（内源性过氧化物酶阻断剂），23℃±2℃孵育10分钟；蒸馏水洗2次后甩干液体，用免疫组化笔在距离组织周围2~3mm处画圈；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次。
4、滴加50μL试剂【双染一抗（CK（pan）+Desmin）】或空白对照试剂，37℃孵育60分钟或2～8℃孵育过夜；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次。
5、滴加50μL试剂【双染二抗（HRP标记+AP标记）】，37℃孵育30分钟；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次。
6、滴加50μL试剂DAB，23℃±2℃孵育15~20分钟；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次。
7、滴加50μL试剂Fast Red，23℃±2℃孵育5~10分钟；水冲洗。
8、复染：滴加Mayer苏木素染液23℃±2℃染色30～60秒，水冲洗干净，返蓝。
注意：需要控制苏木素染色液的染色强度。颜色过浅或过深都会干扰显色结果的观察。
9、快速脱水、透明、中性树胶封片。
10、结果判读：在光学显微镜下对染色后切片进行观察和结果判读。
效果例1 CK（pan）/Desmin免疫组化双染试剂检测
CK（pan）/Desmin免疫组织化学双染在食管早期癌中表达：在食管早期癌38例ESD标本中，我们发现部分病变基膜破坏，浸润到黏膜下层，Desmin标记的红色黏膜肌层完全破坏或消失，取而代之的是CK（pan）阳性表达的病变细胞。同时我们发现6例基底细胞样食管鳞状细胞癌巢，Desmin红色标记的黏膜肌层完全消失，而在其周围增生的鳞状上皮基膜表现完整（图1、图2）。
CK（pan）/Desmin免疫组织化学双染在胃早期癌中表达：在胃早期癌46例ESD标本中，我们发现正常胃小凹上皮、腺体及肿瘤细胞中CK（pan）蛋白完全阳性表达，Desmin红色标记的黏膜肌往往是完整的，但有28例Desmin红色标记的黏膜肌层被破坏，其中10例尚可见残存的黏膜肌层。通过CK（pan）/Desmin蛋白表达我们可以发现一些肿瘤细胞率先从个别腺体底部向下浸润，突破黏膜肌层呈条索状或团块状，并浸润到黏膜下层（图3、图4）。
CK（pan）/Desmin免疫组织化学双染在肠早期癌中表达：在肠早期癌63例ESD标本中，腺瘤及腺癌中CK（pan）蛋白完全阳性表达，Desmin红色标记的黏膜肌往往是完整清晰（图5、图6）。
效果例2 CK（pan）/CD31免疫组化双染试剂检测
由图10、图11可知：CK（pan）/CD31染色中，肿瘤细胞染成棕黄色，血管内皮细胞染成粉色，更有利于判断脉管内是否有癌栓存在。CK（pan）/CD31免疫组化双染试剂，可以在同一张切片上将消化道早期癌的癌组织和血管、淋巴管同时显现，有助于在同一张切片上更加直观的观察肿瘤微小浸润情况，肿瘤和脉管的关系等，为病理医生对ESD手术标本做出精准的评估提供了重要帮助。
对比例 HE染色、CK（pan）、Desmin、CD31免疫组化单染检测
HE 染色步骤：
（1）二甲苯（Ⅰ） 15分钟；
（2）二甲苯（Ⅱ） 15分钟；
（3）二甲苯：无水乙醇=1:1 2分钟；
（4）100%乙醇（Ⅰ） 5分钟；
（5）100%乙醇（Ⅱ） 5分钟；
（6）80%乙醇 5分钟；
（7）蒸馏水 5分钟；
（8）苏木精液染色 5分钟；
（9）水洗10分钟 或流水冲洗5分钟；
（10）1%盐酸乙醇 30秒；
（11）水洗 30秒；
（12）蒸馏水过洗 5秒；
（13）0.5%伊红液染色 1~3分钟；
（14）蒸馏水稍洗 30秒；
（15）80%乙醇稍洗 30秒；
（16）95%乙醇（Ⅰ） 1分钟；
（17）95%乙醇（Ⅱ） 1分钟；
（18）无水乙醇（Ⅰ） 3分钟；
（19）无水乙醇（Ⅱ） 3分钟；
（20）二甲苯（Ⅰ） 3分钟；
（21）二甲苯（Ⅱ） 3分钟；
（22）中性树胶封固。
CK免疫组化单染步骤：
1．切片脱蜡入水，入PBS洗三次/15分钟。
2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3%H2O2（在PAS或0.05Tris-HCL缓冲液pH7.6中或甲醇中）23℃±2℃，30分钟。
3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。
4．减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清），23℃±2℃，30分钟。
5．滴加CK抗体，4℃过液或23℃±2℃，5分钟~1小时。
6．0.1M PBS，洗三次，每次5分钟。
7．滴加第二抗体，23℃±2℃15分钟~60分钟。
8．0.1M PBS洗净，洗三次，每次5分钟。
9．滴加ABC复合物，23℃±2℃ 15~60分钟。
10．0.1M PBS洗三次，每次5分钟。
11．0.05M Tris-HCL 5~10分钟，此步可省略。
12．DAB-H2O2显色：用0.01%H2O2的DAB溶液，23℃±2℃ 5~30分钟，随时镜检（DAB用时新配）。
13．自来水洗净。
14．用Mayer苏木素或0.5%甲基绿，复染胞核（可不染）。
15．常规脱水、透明、封固、镜检。
Desmin免疫组化单染步骤：
1．切片脱蜡入水，入PBS洗三次/15分钟。
2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3% H2O2（在PAS或0.05M Tris-HCL缓冲液pH7.6中或甲醇中）室温，30分钟。
3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。
4．减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清），23℃±2℃，30分钟。
5．滴加CD31抗体，4℃过液或23℃±2℃，5分钟~1小时。
6．0.1M PBS，洗三次，每次5分钟。
7．滴加第二抗体，23℃±2℃，15分钟~60分钟。
8．0.1M PBS洗净，洗三次，每次5分钟。
9．滴加ABC复合物，23℃±2℃，15~60分钟。
10．0.1M PBS洗三次，每次5分钟。
11．0.05M Tris-HCL 5~10分钟，此步可省略。
12．DAB-H2O2显色：用0.01%H2O2的DAB溶液，23℃±2℃，5~30分钟，随时镜检（DAB用时新配）。
13．自来水洗净。
14．用Mayer苏木素或0.5%甲基绿，复染胞核（可不染）。
15．常规脱水、透明、封固、镜检。
CD31免疫组化单染步骤：
1．切片脱蜡入水，入PBS洗三次/15分钟。
2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3% H2O2（在PAS或0.05M Tris-HCL缓冲液pH7.6中或甲醇中）室温，30分钟。
3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。
4．减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清），23℃±2℃，30分钟。
5．滴加CD31抗体，4℃过液或23℃±2℃，5分钟~1小时。
6．0.1M PBS，洗三次，每次5分钟。
7．滴加第二抗体，23℃±2℃，15分钟~60分钟。
8．0.1M PBS洗净，洗三次，每次5分钟。
9．滴加ABC复合物，23℃±2℃，15~60分钟。
10．0.1M PBS洗三次，每次5分钟。
11．0.05M Tris-HCL 5~10分钟，此步可省略。
12．DAB-H2O2显色：用0.01%H2O2的DAB溶液，23℃±2℃，5~30分钟，随时镜检（DAB用时新配）。
13．自来水洗净。
14．用Mayer苏木素或0.5%甲基绿，复染胞核（可不染）。
15．常规脱水、透明、封固、镜检。
CD31免疫组化单染步骤：
1．切片脱蜡入水，入PBS洗三次/15分钟。
2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3%H2O2（在PAS或0.05M Tris-HCL缓冲液pH7.6中或甲醇中）室温，30分钟。
3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。
4．减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清），23℃±2℃，30分钟。
5．滴加CD31抗体，4℃过液或23℃±2℃，5分钟~1小时。
6．0.1M PBS，洗三次，每次5分钟。
7．滴加第二抗体，23℃±2℃，15分钟~60分钟。
8．0.1M PBS洗净，洗三次，每次5分钟。
9．滴加ABC复合物，23℃±2℃，15~60分钟。
10．0.1M PBS洗三次，每次5分钟。
11．0.05M Tris–HCL 5~10分钟，此步可省略。
12．DAB-H2O2显色：用0.01%H2O2的DAB溶液，23℃±2℃，5~30分钟，随时镜检（DAB用时新配）。
13．自来水洗净。
14．用Mayer苏木素或0.5%甲基绿，复染胞核（可不染）。
15．常规脱水、透明、封固、镜检。
根据图7~9可知：传统方法通过HE染色、CK（pan）、Desmin免疫组化单染指标预测ESD术后肿瘤微小浸润情况、肿瘤和黏膜肌的关系，肿瘤浸润深度。容易忽略或漏掉病变，且需要通过多张切片对比完成浸润深度判断。
根据图12~16可知：传统方法通过HE染色、CK（pan）、CD31免疫组化单染指标预测ESD术后肿瘤微小浸润情况、肿瘤和淋巴管、血管、脉管的关系。容易忽略或漏掉病变，且需要通过多张切片对比完成浸润深度判断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.组合试剂，其特征在于，所述组合试剂包括第一抗体，第二抗体和显色剂；
所述第一抗体包括CK（pan）一抗和Desmin一抗；或
所述第一抗体包括CK（pan）一抗和CD31一抗；
所述CK（pan）一抗的浓度不低于1：400；
所述Desmin一抗的浓度不低于1：400；
所述CD31一抗的浓度不低于1：400；
所述第二抗体包括辣根过氧化物酶标记的二抗和碱性磷酸酶标记的二抗；
所述显色剂包括DAB和Fast Red。
2.如权利要求1所述的组合试剂在制备消化道早期癌术后预测的免疫组化双染试剂盒中的应用。
3.免疫组化双染试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的组合试剂。
4.如权利要求1所述的组合试剂或如权利要求3所述的免疫组化双染试剂盒在制备消化道早期癌术后预测产品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述消化道早期癌包括食管早期癌，胃早期癌或肠早期癌中的一种或多种。
6.免疫切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、取石蜡切片，脱蜡和水化；
步骤2、抗原修复，阻断；
步骤3、采用如权利要求1所述组合试剂，或如权利要求3所述免疫组化双染试剂盒中的第一抗体孵育；
步骤4、采用如权利要求1所述组合试剂，或如权利要求3所述免疫组化双染试剂盒中的第二抗体孵育；
步骤5、采用如权利要求1所述的显色剂显色、Mayer苏木素染液复染、脱水、透明、封片，制得染色后的切片。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述CK（pan）一抗的浓度不低于1：400；
所述Desmin一抗的浓度不低于1：400；
所述CD31一抗的浓度不低于1：400；
所述DAB的浓度不低于1：50；
所述Fast Red的浓度不低于1：50。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述复染的时间包括30～60秒。
9.如权利要求8任一项所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、脱蜡和水化：石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×2次；去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡2分钟×2次；去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡2分钟；去除多余的液体后，置于75%乙醇中，浸泡2分钟；去除多余的液体后，蒸馏水冲洗，置于Ultra冲洗缓冲液中；
步骤2、抗原修复：EDTA抗原修复液pH9.0，于35~90kPa，100~120℃条件下将切片置于其中，并完全浸泡组织，85~90kPa，100~120℃继续加热2.5分钟；冷却；23℃±2℃后取出切片，Ultra冲洗缓冲液浸泡清洗2分钟×3次；
滴加50μL内源性过氧化物酶阻断剂，23℃±2℃孵育10分钟；蒸馏水洗2次后甩干液体；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次；
步骤3、滴加50μL所述第一抗体或空白对照试剂，37℃孵育60分钟或2～8℃孵育过夜；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次；
步骤4、滴加50μL所述第二抗体，37℃孵育30分钟；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次；
步骤5、滴加50μL试剂DAB，23℃±2℃孵育15~20分钟；Ultra冲洗缓冲液浸泡2分钟×3次；
滴加50μL试剂Fast Red，23℃±2℃孵育5~10分钟；水冲洗；
复染：滴加Mayer苏木素染液23℃±2℃染色30～60秒，水冲洗，返蓝；
脱水、透明、中性树胶封片，制得免疫切片。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120003639A1 (en) * 2010-04-27 2012-01-05 Prelude, Inc. Cancer biomarkers and methods of use thereof
JP2013200287A (ja) * 2012-03-26 2013-10-03 Kawasaki Gakuen Ｋｉ−６７インデックス算定二重染色法を用いた陽性率測定方法
US20140335018A1 (en) * 2013-05-13 2014-11-13 Vision Global Holdings Ltd. Pharmaceutical composition comprising modified hemoglobin-based therapeutic agent for cancer targeting treatment and diagnostic imaging
JP2017015550A (ja) * 2015-07-01 2017-01-19 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 ２重染色キット
CN107179406A (zh) * 2017-05-27 2017-09-19 福州迈新生物技术开发有限公司 癌栓多标免疫组化染色试剂盒
CN110850094A (zh) * 2019-11-22 2020-02-28 西安交通大学 一种免疫组化双标单染试剂盒及其使用方法和应用
CN112305213A (zh) * 2019-07-26 2021-02-02 项征 富兮双染染色试剂盒及其使用方法
WO2023035728A1 (zh) * 2021-09-07 2023-03-16 福州迈新生物技术开发有限公司 一种基于免疫组化生成训练数据的方法和存储设备

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120003639A1 (en) * 2010-04-27 2012-01-05 Prelude, Inc. Cancer biomarkers and methods of use thereof
JP2013200287A (ja) * 2012-03-26 2013-10-03 Kawasaki Gakuen Ｋｉ−６７インデックス算定二重染色法を用いた陽性率測定方法
US20140335018A1 (en) * 2013-05-13 2014-11-13 Vision Global Holdings Ltd. Pharmaceutical composition comprising modified hemoglobin-based therapeutic agent for cancer targeting treatment and diagnostic imaging
JP2017015550A (ja) * 2015-07-01 2017-01-19 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 ２重染色キット
CN107179406A (zh) * 2017-05-27 2017-09-19 福州迈新生物技术开发有限公司 癌栓多标免疫组化染色试剂盒
CN112305213A (zh) * 2019-07-26 2021-02-02 项征 富兮双染染色试剂盒及其使用方法
CN110850094A (zh) * 2019-11-22 2020-02-28 西安交通大学 一种免疫组化双标单染试剂盒及其使用方法和应用
WO2023035728A1 (zh) * 2021-09-07 2023-03-16 福州迈新生物技术开发有限公司 一种基于免疫组化生成训练数据的方法和存储设备

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNIEKE W GOTINK等: "Do pathologists agree with each other on the histological assessment of pT1b oesophageal adenocarcinoma?", UNITED EUROPEAN GASTROENTEROLOGY, pages 261 - 269 *
F ALEXANDER-SEFRE等: "Detection of tumour lymphovascular space invasion using dual cytokeratin and CD31 immunohistochemistry", JCLINPATH, pages 786 - 788 *

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