CN113008649A - 一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒、染色方法及应用 - Google Patents
一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒、染色方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒、染色方法及应用。本发明提供的试剂盒包括如下组分：抗原修复液、维多利亚蓝染液、过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂A、二抗试剂B、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、HRP‑Blue底物、HRP‑Blue底物缓冲液液、苏木素复染液；其中，所述一抗试剂为主要由抗体A和抗体B组成的混合抗体，所述抗体A为鼠单克隆抗体，所述抗体B为兔单克隆抗体；所述二抗试剂A为HRP酶标记的羊抗鼠聚合物；所述二抗试剂B为HRP酶标记的羊抗兔聚合物。本发明还提供了具体染色方法。本发明的试剂盒及染色方法首次将免疫组化双重染色和弹性纤维染色有机结合，简化染色程序，提高检测效率，对组织样本的需求量显著降低。
Description
技术领域
本发明属于临床病理检测技术领域，具体涉及一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒、染色方法及应用。
背景技术
免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC)又称免疫细胞化学染色，简称免疫组化，是病理学诊断、鉴别诊断、肿瘤特异性分子靶标筛选、鉴定的最重要平台性技术。近年来，在恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；确定转移性恶性肿瘤的原发部位；对某类肿瘤进行进一步的病理分型；应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；发现微小转移灶，有助于临床治疗方案确定，包括手术范围的确定；为临床提供治疗方案的选择等多方面都得到了广泛应用。
在过去的几十年间，一种称为“免疫组化双染技术(dual-staining)”应运而生(Hofman FM,et all.2013；Ojima T,et al.2013；刘洪博,等,2016；张爱凤,等,2010；石磊,等.2017；朱长乐,等.2014.)。现有免疫组化双染技术是采用针对两种不同分子靶标的特异性抗体、两种不同酶标的二抗(如过氧化物酶和碱性磷酸酶)和相应的两种能呈现不同颜色的显色底物，将两种分子靶标显示为两种不同颜色，从而实现在同一张组织切片上检测两个分子靶标的目的。
恶性肿瘤是一类生长迅速、转移早、预后差的异质性疾病，而良恶性鉴别、临床分期、瘤细胞浸润范围或深度等因素决定后续的治疗。病理医师采用HE染色对肿瘤组织进行病理学诊断，虽然HE染色能较好地识别肿瘤细胞，但有些情况下对于侵犯深度和范围的判断并不十分准确，在某些特殊类型恶性肿瘤的鉴别诊断中也有局限性。特殊染色是一种传统的化学染色技术，随着免疫组化技术的广泛应用以及分子病理学技术的逐渐普及，特染染色的应用受到限制甚至萎缩，但一部分特殊染色项目在肿瘤诊断中仍具有重要价值。由于特殊染色试剂盒的标准化和商品化，其使用较以前更为方便，传统的特殊染色应用又焕发出生机。在众多的特殊染色项目中，弹力纤维染色能够较好的显示浆膜下层、肿瘤周边血管中的弹力纤维组织，对HE染色难以判断的恶性肿瘤诊断问题提供了新的解决方法。
弹力纤维在新鲜标本中呈黄色发亮的细线条状，在HE切片中呈淡红，不易与胶原纤维区分，可通过弹力纤维染色识别。弹力纤维染色主要机制是带负电荷的弹性蛋白(含二硫键及酸性基团)与带有弱正电荷的染料通过非极性吸着完成染色。在弹性纤维染色中，通常采用高锰酸钾先氧化组织上的各种蛋白，然后用草酸清洗掉组织上的高锰酸钾染色液，维多利亚蓝染色液与组织进行染色，其中间二苯酚是维多利亚蓝与弹性纤维上被氧化蛋白结合的媒介物，再通过95％乙醇脱掉组织上多余的维多利亚蓝染色液。能够特异性的将弹性纤维染成蓝色，亦显示肥大细胞颗粒、脂褐素、嗜酸性细胞等。
弹力纤维染色目前在恶性肿瘤中(如肺癌、结直肠癌以及黑色素瘤等)主要用于判断是否存在血管受侵、评估肿瘤浸润深度及某些肿瘤的鉴别诊断。
(1)弹力纤维染色在肺癌中的诊断价值脏层胸膜受侵是肺癌术后患者最重要的不良预后因素之一；
(2)弹力纤维染色在结直肠癌中的诊断价值在第7版AJCC分期中，结直肠癌T分期仍完全依赖于肿瘤侵犯深度的组织学评估；
(3)弹力纤维染色在其他恶性肿瘤中的诊断价值弹力纤维染色在评估食管癌血管受侵以及黑色素瘤的鉴别诊断中均有较大价值。
表1弹力纤维染色在恶性肿瘤中的研究及意义
目前，对某些癌的鉴别和诊断需要结合常规HE染色、肿瘤标志物的免疫组化染色(IHC)、Fish荧光原位杂交染色及特殊染色，综合上述染色结果才能对肺癌的类型及肿瘤细胞对胸膜的侵害程度等作出可靠的诊断。这就需要准备多张切片，分别进行不同种类肿瘤标志物的免疫组化染色及弹性纤维特殊染色；并在染色后在显微镜下反复对照组织位置，才能结合免疫组化指标和特殊染色结果来做出综合判断。这不仅造成制片过程步骤繁琐及诊断过程效率低下，还对病理标本的要求较高，尤其是对于肺癌穿刺组织，由于肺穿刺检查为创伤性检查，且穿刺医生技术精疏有别及患者的个体性差异，获取的穿刺组织样本往往较少，标本质量数量常不尽人意，难以获得足够数量的切片用于常规HE染色、免疫组化染色、Fish荧光原位杂交染色或是特殊染色等各项指标的检测。因此，在标本或片子量有限的情况下，如在同一张组织玻片上实现多重指标的检测，呈现更多信息量成为本领域急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒，该试剂盒能够在同一张组织切片上同时进行特定肿瘤标志物的免疫组化双重染色和弹性纤维特殊染色，且染色步骤少耗时短。
本发明的第二个目的在于提供免疫组化联合弹性纤维多重染色方法。
本发明的第三个目的在于提供上述免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒、染色方法的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒，包括如下组分：抗原修复液、维多利亚蓝染液、过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂A、二抗试剂B、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、HRP-Blue底物、HRP-Blue底物缓冲液液、苏木素复染液；
其中，所述一抗试剂为主要由抗体A和抗体B组成的混合抗体，所述抗体A为鼠单克隆抗体，所述抗体B为兔单克隆抗体；
所述二抗试剂A为HRP酶标记的羊抗鼠聚合物；
所述二抗试剂B为HRP酶标记的羊抗兔聚合物。
优选的，所述抗体A为抗TTF-1鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗p40兔单克隆抗体；或所述抗体A为p40鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗TTF-1兔单克隆抗体。
优选的，所述抗体A为抗ER鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗Her2兔单克隆抗体；或所述抗体A为Her2鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗ER兔单克隆抗体。
优选的，所述抗原修复液为柠檬酸修复液(pH6.0)或EDTA修复液(pH9.0)。
优选的，所述DAB显色底物和DAB显色缓冲液购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS1001。
优选的，所述HRP-Blue底物和HRP-Blue底物缓冲液购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号SD8004。
优选的，所述维多利亚蓝染液主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。
优选的，所述维多利亚蓝染液的配制方法包括如下步骤：
1)维多利亚蓝2.0g，糊精0.5g，间二苯酚4.0g，蒸馏水200ml，混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min；
2)将30％三氯化铁水溶液25ml煮沸后加入上述混合液中，继续煮沸3min，要不断搅拌，搅拌棒上会出现胶样物质；
3)终止加热，冷却后过滤；
4)将滤纸上的物质连同滤纸放入60℃恒温箱中烤干；
5)将烤干的蓝色粉末连同滤纸溶于400ml 70％乙醇中；
6)加浓盐酸4ml，苯酚5g，苯酚不能溶解时可略加温溶解，放置成熟后使用。
优选的，所述试剂盒还包括95％乙醇和/或清洗液，优选的，所述清洗液为PBST缓冲液(pH7.4)或TBST缓冲液(pH8.0)
本发明提供了一种免疫组化联合弹性纤维多重染色方法，包括如下步骤：
1)脱蜡和水化：石蜡组织切片由二甲苯到无水乙醇，再到95％、85％、75％梯度乙醇浸泡，至水化；
2)抗原修复；
3)弹性纤维染色：95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育1小时；
4)分化：95％乙醇快速浸洗至无多余染液；
5)纯化水浸泡，冲洗；
6)加过氧化物酶封闭剂，室温下孵育5min；清洗液洗涤；
7)加一抗试剂，室温孵育60min，清洗液洗涤；
8)加二抗试剂A，室温孵育30min；清洗液洗涤，所述二抗试剂A为HRP酶标记的羊抗鼠聚合物；
9)DAB显色：加入新鲜配制的DAB染色液，室温孵育5～10min，纯化水冲洗；
10)加二抗试剂B，室温孵育30min；清洗液洗涤，所述二抗试剂B为HRP酶标记的羊
抗兔聚合物；
11)HRP-Blue显色：加入新鲜配制的HRP-Blue染色液，室温孵育5～10min,纯化水冲洗；
12)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
优选的，所述步骤2)抗原修复采用高压修复法，包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片先经过二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，盖紧锅盖，待冒气后，开始计时2.5分钟，离开热源5分钟，流水下冲凉。
优选的，所述步骤2)抗原修复采用微沸修复法，包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片不经二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，待修复液微沸后，开始计时30分钟；离开热源5分钟，流水下冲凉。
本发明还提供了上述免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒或染色方法在肺癌病理组织染色中的应用。
本发明取得的有益效果：
本发明提供的试剂盒首次将免疫组化双重染色和弹性纤维染色有机结合，能够在同一张组织切片上同时进行两种肿瘤标志物的免疫组化染色和弹性纤维特殊染色，对组织样本的需求量显著降低，显色对比鲜明直观，无需在显微镜下反复对照不同切片的组织位置，所提供的信息量显著优于传统单染。
本发明还提供了免疫组化联合弹性纤维多重染色方法，该方法并非简单的将传统免疫组化和弹性纤维染色方法叠加。传统的弹性纤维染色需要经过高锰酸钾氧化和草酸溶液漂白后，才能进行后续的维多利亚蓝染色。本发明经过对染色步骤的设计调整与大量实验验证，将免疫组化染色和弹性纤维染色有机结合，在组织进行抗原修复后，先采用维多利亚蓝染液对弹性纤维进行染色，省去了高锰酸钾的氧化和草酸溶液漂白两个步骤，简化染色程序，提高检测效率；而后加入混合一抗试剂，并先后采用DAB显色与HRP-Blue显色体系进行免疫组化双重染色，能够在同一张组织切片上同时进行两种免疫组化肿瘤标志物的染色并联合弹性纤维特殊染色的多重组织染色，既标示出肿瘤细胞，又显示了弹力纤维，方便病理医师对组织样本进行综合多方面参考指标进行诊断和分析。同时，DAB显色为棕色，HRP-Blue为天蓝色，弹力纤维染色为蓝绿色，三者颜色区分明显，易于观察。再者，对组织样本的需求量显著降低，显色对比鲜明直观，无需在显微镜下反复对照不同切片的组织位置，所提供的信息量显著优于传统单染。
附图说明
图1为试验例1染色结果图；
该图为肺组织，进行高锰酸钾氧化后弹性纤维染色(弹性纤维被染成蓝色)。
图2为试验例2染色结果图；
该图为肺组织，省略高锰酸钾氧化，直接进行弹性纤维染色(弹力纤维着色显著减弱)。
图3为试验例3染色结果图；
该图为肺组织，进行免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，直接进行弹性纤维染色(弹力纤维为蓝绿色)。
图4为试验例4染色结果图；
该图为肺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，再进行TTF-1免疫组化染色。
图5为试验例5染色结果图；
该图为肺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，再进行p40免疫组化染色。
图6为试验例6染色结果图；
该图为肺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，在进行TTF-1和p40免疫组化双重染色。
图7为试验例7染色结果图。
该图为乳腺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，在进行ER和Her2免疫组化双重染色。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例及试验例中所用的各类试剂和仪器若无特殊说明均为市售商品。
实施例1免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒1
该实施例提供了一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒，包括如下组分：
1)抗原修复液：EDTA修复液(pH9.0)
2)维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。
3)过氧化物酶封闭剂购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS3001。
4)一抗试剂：所述一抗试剂为主要由抗体A和抗体B组成的混合抗体，所述抗体A为抗TTF-1鼠单克隆抗体(克隆号8G7G3/1，河南赛诺特生物技术有限公司，货号CTM-0261)，所述抗体B为抗p40兔单克隆抗体(克隆号C3B4，河南赛诺特生物技术有限公司，货号CPM-0133)；
5)二抗试剂A：HRP酶标记的羊抗鼠聚合物，购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS4001；
6)二抗试剂B：HRP酶标记的羊抗兔聚合物，购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS3001；
7)DAB显色底物和DAB显色缓冲液购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS1001。
8)HRP-Blue底物和HRP-Blue底物缓冲液，购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号SD8004。
9)清洗液：PBST缓冲液(pH7.4)或TBST缓冲液(pH8.0)
其中，所述维多利亚蓝染液的配制方法包括如下步骤：
1)维多利亚蓝2.0g，糊精0.5g，间二苯酚4.0g，蒸馏水200ml，混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min；
2)将30％三氯化铁水溶液25ml煮沸后加入上述混合液中，继续煮沸3min，要不断搅拌，搅拌棒上会出现胶样物质；
3)终止加热，冷却后过滤；
4)将滤纸上的物质连同滤纸放入60℃恒温箱中烤干；
5)将烤干的蓝色粉末连同滤纸溶于400ml 70％乙醇中；
6)加浓盐酸4ml，苯酚5g，苯酚不能溶解时可略加温溶解，放置成熟后使用。
实施例2免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒2
该实施例提供了一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒，包括如下组分：
1)抗原修复液：EDTA修复液(pH9.0)
2)维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成，配制方法参见实施例1。
3)过氧化物酶封闭剂：购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS3001。
4)一抗试剂：所述一抗试剂为主要由抗体A和抗体B组成的混合抗体，所述抗体A为抗ER鼠单克隆抗体(克隆号C6H7，河南赛诺特生物技术有限公司，货号CEM-0081)，所述抗体B为抗Her2兔单克隆抗体(兔克隆号EP3，河南赛诺特生物技术有限公司，货号CCR-0743)；
5)二抗试剂A：HRP酶标记的羊抗鼠聚合物，购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS4001；
6)二抗试剂B：HRP酶标记的羊抗兔聚合物，购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS3001；
7)DAB显色底物和DAB显色缓冲液购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS1001。
8)HRP-Blue底物和HRP-Blue底物缓冲液，购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号SD8004。
9)清洗液PBST缓冲液(pH7.4)或TBST缓冲液(pH8.0)
对比例1弹性纤维染色试剂盒1
该对比例提供了传统的弹性纤维染色试剂盒1，包括如下组分：
1)高锰酸钾氧化剂：1％高锰酸钾水溶液
2)草酸漂白剂：2％草酸水溶液
3)维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。配制方法参见实施例1；
4)苏木素染液
对比例2弹性纤维染色试剂盒2
该实施例提供了弹性纤维染色试剂盒2，该试剂盒不包含高锰酸钾氧化剂、草酸漂白剂，具体包括如下组分：
1)维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。配制方法参见实施例1；
2)苏木素染液。
对比例3弹性纤维染色试剂盒3
该对比例提供了弹性纤维染色试剂盒3，该试剂盒不包含高锰酸钾氧化剂、草酸漂白剂，但增加了抗原修复液，具体包括如下组分：
1)维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。配制方法参见实施例1；
2)抗原修复液：EDTA修复液(pH9.0)
对比例4免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒1
该对比例提供了一种免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒，包括如下组分：
1)抗原修复液：EDTA修复液(pH9.0)
2)维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。
3)过氧化物酶封闭剂：购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS3001。
4)一抗试剂：包含TTF-1单克隆抗体(克隆号8G7G3/1，河南赛诺特生物技术有限公司，货号CTM-0261)
5)二抗试剂：
二抗试剂A：HRP酶标记的羊抗鼠聚合物，购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS4001；
二抗试剂B：HRP酶标记的羊抗兔聚合物，购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS3001；
6)HRP-Blue底物和HRP-Blue底物缓冲液，购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号SD8004。
7)清洗液：PBST缓冲液(pH7.4)或TBST缓冲液(pH8.0)。
对比例5免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒2
该对比例提供了一种免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒，包括如下组分：
1)抗原修复液：EDTA修复液(pH9.0)
2)维多利亚蓝染液：主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。
3)过氧化物酶封闭剂：购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS3001。
4)一抗试剂：包含P40单克隆抗体(克隆号C3B4，河南赛诺特生物技术有限公司，货号CPM-0133)
5)二抗试剂：购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号SD3103；
6)DAB显色底物和DAB显色缓冲液购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号RS1001
8)清洗液PBST缓冲液(pH7.4)或TBST缓冲液(pH8.0)
实施例3免疫组化联合弹性纤维多重染色方法1
该对比例提供了免疫组化联合弹性纤维多重染色方法：组织切片脱蜡水化后，免疫组化高压修复，不进行高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，再进行免疫组化双重染色，包括如下步骤：
1)脱蜡和水化：由二甲苯到无水乙醇，再到95％、85％、75％梯度乙醇浸泡，至水化。
2)抗原修复；
3)弹性纤维染色：95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育1小时；
4)分化：95％乙醇快速浸洗至无多余染液；
5)纯化水浸泡，冲洗；
6)加100μL过氧化物酶封闭剂，室温下孵育5min；清洗液洗涤；
7)加100μL一抗试剂，室温孵育60min，清洗液洗涤；
8)加100μL二抗试剂A，室温孵育30min；清洗液洗涤，所述二抗试剂A为HRP酶标记的羊抗鼠聚合物；
9)显色：加入100μL新鲜配制的DAB染色液，室温孵育5～10min，纯化水冲洗；
10)加100μL二抗试剂B，室温孵育30min；清洗液洗涤，所述二抗试剂B为HRP酶标记的羊抗兔聚合物。
11)HRP-Blue显色：加入100μL新鲜配制的HRP-Blue染色液，室温孵育5～10min,纯化水冲洗；
12)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
其中，所述步骤2)抗原修复采用高压修复法，包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片先经过二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，盖紧锅盖，待冒气后，开始计时2.5分钟，离开热源5分钟，流水下冲凉。
步骤2)抗原修复也可采用微沸修复法，包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片不经二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，待修复液微沸后，开始计时30分钟；离开热源5分钟，流水下冲凉。
对比例6弹性纤维染色方法1
该对比例提供了传统弹性纤维染色方法1，包括如下步骤：
(1)常规脱蜡水化；
(2)高锰酸钾溶液氧化5min，纯化水冲洗；
(3)草酸溶液漂白1-3min，至标本无色为止，细流水稍洗；
(4)95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育1小时(加盖避免染液挥发，染液挥发后要再次添加)；
(5)95％乙醇快速浸洗至无多余染液脱下(必要时镜下控制，避免脱色过度)；
(6)用苏木素染液复染3min，倾去染液不可用水洗；
(7)95％乙醇快速分化数秒，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
对比例7弹性纤维染色方法2
该对比例提供了组织切片脱蜡水化后，不进行高锰酸钾氧化、草酸漂白，直接进行维多利亚蓝染色的弹性纤维染色方法2，包括如下步骤：
(1)常规脱蜡水化；
(2)95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育1小时(加盖避免染液挥发，染液挥发后要再次添加)；
(3)95％乙醇快速浸洗至无多余染液脱下(必要时镜下控制，避免脱色过度)；
(4)用苏木素染液复染3min，倾去染液，水洗，浸泡5min；
(5)95％乙醇快速分化数秒，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
对比例8弹性纤维染色方法3
该对比例提供了组织切片脱蜡水化后，先进行免疫组化高压修复，不进行高锰酸钾氧化、草酸漂白，而后进行维多利亚蓝染色的弹性纤维染色方法2，包括如下步骤：
(1)脱蜡及水化：组织切片经常规脱蜡至水，蒸馏水中待用。
(2)抗原修复：在修复液中放入切片架(修复液要要没过组织)，盖上锅盖，待冒气后，开始计时2.5分钟，离开热源5分钟，流水下冲凉。
蒸馏水浸泡5分钟，免疫组化笔花圈。清洗液浸泡2次，每次5分钟。
(3)95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育1小时(加盖避免染液挥发，染液挥发后要再次添加)。
(4)95％乙醇快速浸洗至无多余染液脱下(必要时镜下控制，避免脱色过度)；
(5)用苏木素染液复染3min，倾去染液，水洗，浸泡5min。
(6)95％乙醇快速分化数秒，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
对比例9免疫组化联合弹性纤维双重染色方法1
该对比例提供了免疫组化联合弹性纤维双重染色方法1：组织切片脱蜡水化后，免疫组化高压修复，不进行高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，再进行免疫组化染色，包括如下步骤：
(1)脱蜡及水化：组织切片经常规脱蜡至水，蒸馏水中待用。
(2)抗原修复：在修复液中放入切片架(修复液要要没过组织)，盖上锅盖，待冒气后，开始计时2.5分钟，离开热源5分钟，流水下冲凉。
蒸馏水浸泡5分钟，免疫组化笔花圈。清洗液浸泡2次，每次5分钟。
(3)95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育1小时(加盖避免染液挥发，染液挥发后要再次添加)。
(4)95％乙醇快速浸洗至无多余染液。
(5)纯化水冲洗，浸泡5min。
(6)封闭：滴加100微升封闭剂，封闭5分钟，冲洗封闭剂，清洗液浸泡2次，每次5分钟。
(7)一抗孵育：甩掉清洗液，滴加100微升一抗试剂，室温孵育1小时，清洗液冲洗，清洗液浸泡2次，每次5分钟。
(8)二抗孵育：甩掉清洗液，滴加100微升二抗试剂，室温孵育30分钟，清洗液冲洗，清洗液浸泡2次，每次5分钟。
(9)显色：甩掉清洗液，滴加100微升新鲜配制的DAB显色液或HRP-Blue显色液，室温孵育5分钟。纯化水冲洗，纯化水浸泡5分钟。
(10)苏木素染色液复染3min，纯化水冲洗，纯化水浸泡5分钟。
(11)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
试验例
该部分分别采用实施例1-2或对比例1-5提供的试剂盒，按照实施例3或对比例6-9提供的染色方法对病理组织进行染色，对本发明免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒的实际应用效果以及染色方法步骤的可靠性及稳定性进行进行了验证，证明了本发明试剂盒组分合理，染色结果准确可靠，能够实现在同一张组织切片综合显示出多种检测结果。
试验例1
该试验例采用对比例1提供的弹性纤维染色试剂盒1，按照对比例6提供的传统的弹性纤维染色方法1对肺癌病理组织进行弹性纤维单染。
染色结果如图1所示，该图为肺组织，进行高锰酸钾氧化后弹性纤维染色(弹性纤维被染成蓝色)。
试验例2
该试验例采用对比例2提供的弹性纤维染色试剂盒2，按照对比例7提供的弹性纤维染色方法2对肺癌病理组织进行弹性纤维单染。
染色结果如图2所示，该图为肺组织，省略高锰酸钾氧化，直接进行弹性纤维染色(弹力纤维着色显著减弱)。
试验例3
该试验例采用对比例3提供的弹性纤维染色试剂盒3，按照对比例8提供的弹性纤维染色方法3对肺癌病理组织进行弹性纤维单染。
染色结果如图3所示，该图为肺组织，进行免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，直接进行弹性纤维染色。由图3可知，肺组织中，弹力纤维被染为蓝绿色。
试验例4
该试验例采用对比例4提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒1，按照对比例9提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色方法1对肺癌病理组织进行双重染色。
当对比例4提供的试剂盒中一抗试剂包含TTF-1单克隆抗体时，染色结果如图4所示，该图为肺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，再进行TTF-1免疫组化染色。由图4可知，肺组织中，TTF-1(核染色)棕色，弹力纤维为蓝绿色。
试验例5
该试验例采用对比例5提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒2，按照对比例9提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色方法1对肺癌病理组织进行双重染色。
当对比例4提供的试剂盒中一抗试剂包含p40单克隆抗体时，染色结果如图5所示，该图为肺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，再进行p40免疫组化染色。由图5可知，肺组织中，p40(核染色)蓝色，弹力纤维为蓝绿色。
试验例6
该试验例采用实施例1提供的免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒1，按照实施例3提供的免疫组化联合弹性纤维多重染色方法1对肺癌病理组织进行多重染色。
染色结果如图6所示，该图为肺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，在进行TTF-1和p40免疫组化双重染色。由图6可知，肺组织中，TTF-1(核染色)棕色，P40(核染色)蓝色，弹力纤维为蓝绿色。
试验例7
该试验例采用实施例2提供的免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒2，按照实施例3提供的免疫组化联合弹性纤维多重染色方法1对乳腺癌病理组织进行多重染色。
染色结果如图7所示，该图为乳腺组织，免疫组化高压修复，省略高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，在进行ER和Her2免疫组化双重染色。由图7可知，乳腺组织中，ER(核染色)棕色，Her2(膜染色)蓝色，弹力纤维为蓝绿色。
对比图1、图2可知，对于弹性纤维单染来说，高锰酸钾氧化十分必要，未经高锰酸钾氧化的组织其弹力纤维着色显著减弱。对比图3可知，省略高锰酸钾氧化与草酸漂白，并经过高压修复后，弹力纤维染色可以得到很好的染色效果；从图4和5可知，石蜡切片组织正常免疫组化高压修复后，不进行高锰酸钾氧化，先进行弹性纤维染色，再进行TTF-1免疫组化染色，能够将免疫组化单色染色和弹力纤维特殊染色有机结合，实现双重染色；且DAB显色与HRP-Blue显色体系均可与弹性纤维的蓝绿色染色相区分开。从图6和7可知，石蜡切片组织在进行抗原修复后，省去了高锰酸钾的氧化和草酸溶液漂白两个步骤，先采用维多利亚蓝染液对弹性纤维进行染色，简化染色程序，提高检测效率；而后加入混合一抗试剂，并先后采用DAB显色与HRP-Blue显色体系进行免疫组化双重染色，能够在同一张组织切片上同时进行两种免疫组化肿瘤标志物的染色并联合弹性纤维特殊染色的多重组织染色，既标示出肿瘤细胞，又显示了弹力纤维，方便病理医师对组织样本进行综合多方面参考指标进行诊断和分析。同时，DAB显色为棕色，HRP-Blue为天蓝色，弹力纤维染色为蓝绿色，三者颜色区分明显，易于观察。再者，对组织样本的需求量显著降低，显色对比鲜明直观，无需在显微镜下反复对照不同切片的组织位置，所提供的信息量显著优于传统单染。
Claims (10)
1.一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒，其特征在于，包括如下组分：抗原修复液、维多利亚蓝染液、过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂A、二抗试剂B、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、HRP-Blue底物、HRP-Blue底物缓冲液液、苏木素复染液；
其中，所述一抗试剂为主要由抗体A和抗体B组成的混合抗体，所述抗体A为鼠单克隆抗体，所述抗体B为兔单克隆抗体；
所述二抗试剂A为HRP酶标记的羊抗鼠聚合物；
所述二抗试剂B为HRP酶标记的羊抗兔聚合物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体A为抗TTF-1鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗p40兔单克隆抗体；或所述抗体A为p40鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗TTF-1兔单克隆抗体；或所述抗体A为抗ER鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗Her2兔单克隆抗体；或所述抗体A为Her2鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗ER兔单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原修复液为柠檬酸修复液(pH6.0)或EDTA修复液(pH9.0)。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述维多利亚蓝染液主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述维多利亚蓝染液的配制方法包括如下步骤：
1)维多利亚蓝2.0g，糊精0.5g，间二苯酚4.0g，蒸馏水200ml，混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min；
2)将30％三氯化铁水溶液25ml煮沸后加入上述混合液中，继续煮沸3min，要不断搅拌，搅拌棒上会出现胶样物质；
3)终止加热，冷却后过滤；
4)将滤纸上的物质连同滤纸放入60℃恒温箱中烤干；
5)将烤干的蓝色粉末连同滤纸溶于400ml 70％乙醇中；
6)加浓盐酸4ml，苯酚5g，苯酚不能溶解时可略加温溶解，放置成熟后使用。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括95％乙醇和/或清洗液，所述清洗液为PBST缓冲液(pH7.4)或TBST缓冲液(pH8.0)。
7.一种免疫组化联合弹性纤维多重染色方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)脱蜡和水化：由二甲苯到无水乙醇，再到95％、85％、75％梯度乙醇浸泡，至水化；
2)抗原修复；
3)弹性纤维染色：95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育1小时；
4)分化：95％乙醇快速浸洗至无多余染液；
5)纯化水浸泡，冲洗；
6)加过氧化物酶封闭剂，室温下孵育5min，清洗液洗涤；
7)加一抗试剂，室温孵育60min，清洗液洗涤；
8)加二抗试剂A，室温孵育30min，清洗液洗涤，所述二抗试剂A为HRP酶标记的羊抗鼠聚合物；
9)DAB显色：加入新鲜配制的DAB染色液，室温孵育5～10min，纯化水冲洗；
10)加二抗试剂B，室温孵育30min，清洗液洗涤，所述二抗试剂B为HRP酶标记的羊抗兔聚合物；
11)HRP-Blue显色：加入新鲜配制的HRP-Blue染色液，室温孵育5～10min,纯化水冲洗；
12)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
8.根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于，所述步骤2)抗原修复采用高压修复法，包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片先经过二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，盖紧锅盖，待冒气后，开始计时2.5分钟，离开热源5分钟，流水下冲凉。
9.根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于，所述步骤2)抗原修复采用微沸修复法，包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片不经二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，待修复液微沸后，开始计时30分钟；离开热源5分钟，流水下冲凉。
10.如权利要求1-6任一项所述的试剂盒、如权利要求7-10任一项所述的染色方法在肿瘤病理组织染色中的应用。
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