CN1920559A - 一种细胞生物技术、试剂盒及制备装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的细胞生物技术、试剂盒及制备装置。该技术灵敏快速、信息量大，制造简便、成本低，可对样品中多种不同的核酸、蛋白和化学分子等同时进行检测分析。主要特征在于将不同的细胞附着在片基上或种植在微孔板的不同微孔中，被检样品与细胞或其所携带的生物分子杂交或结合，检测结果可用目测或仪器记录分析。本发明可广泛地用于生物学、医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域的医药研究、环境检测、疾病诊断、基因组/蛋白质组学和分子文库等的研究与开发。

Description

一种细胞生物技术、试剂盒及制备装置

技术领域

本发明涉及一种新型的细胞生物技术、试剂盒及制备装置。该技术灵敏快速、信息量大，制备方法简便、成本低，能同时分析基因、蛋白和抗原等生物分子在多种不同组织细胞或细胞样品中的分布和表达调控；也可以用于样品中多种不同的化学物质、生物分子、微生物或细胞等成分的高通量并行检测分析，可广泛地用于生物学、医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。

背景技术

细胞和细胞系是生物学、医学、药学及相关领域最常用的活体实验材料，常被用于基因、蛋白等生物分子的组织分布、细胞定位和表达调控以及药物筛选等。大部分情况下需要在同时进行多个不同组织来源的细胞实验，以便对特点基因或蛋白在多种不同组织细胞中的表达与否、表达量和调控机制等做出平行的定性、定量、定位等检测分析。在此情况下，传统的细胞铺片试验所存在的问题是：对超过2种或以上的不同组织细胞，由于难以区分，很难同时进行。也就是说，用传统的细胞实验技术方法，在一个试验中所要分析的组织细胞的数量和种类受到实验系统的限制或制约。采用细胞点阵的方法，将不同组织或物种来源的细胞，呈点状有序地排列在同一张载玻片上，则可以解决上述的问题。

在单克隆抗体的制备中，抗原表位的确定与抗原设计是制备单克隆抗体成功与否的基础。抗体识别的抗原表位分为一级结构表位和构象表位2种形式，一级结构表位由连续的氨基酸序列组成，构象表位则是由不连续的氨基酸序列或翻译后修饰基团所形成的具有一定结构的空间构象组成。由于构象表位具有更高的分子特异性，因此在免疫组化、免疫细胞化学和流式细胞术等研究中，需要用抗构象表位的抗体才能获得理想的实验结果。为了获得抗构象表位的抗体，用作免疫动物和抗体筛选的抗原必需保持生物活性或天然构象，而原核表达系统获得的某些重组蛋白不能正确折叠或修饰而失去构象表位，故必需用真核或哺乳动物细胞表达系统才能获得理想的免疫原和筛选用抗原。此外，由于基因转染的生物工程细胞，重组蛋白不仅表达量高，而且能正确折叠或修饰，故抗原活性好，因此还可直接用于免疫检测分析和单抗的筛选以及医学诊断。

在现代免疫检测和蛋白组学分析和研究中，需要对同一未知样品中大量的、多种不同化学物质、抗原、抗体或蛋白质等成分进行快速、灵敏的高通量检测，以分析化学物质、抗原、抗体或蛋白的种类、数量、组成、变异以及多态性、翻译后修饰、个体的感染状态或个体免疫系统的功能状态等。在大部分情况下，需要在同一个容器里、同时进行两项或多项实验，以便对样品中多种不同成分的有无、含量和来源等做出平行的定性、定量、定位等检测分析；或对单一种分子的多种不同特性(如单一蛋白分子具有多个不同的表位或抗原决定簇)进行平行检测与分析。在此情况下，传统的固相吸附试验所存在的问题是：对超过3种以上的不同被检测物，由于难以区分，很难同时进行。也就是说，用传统的固相吸附试验方法，在一个试验中所要检测或分析被检测物的数量受固相系统的限制或制约。譬如，传统的办法是首先通过分离纯化等技术和工艺，分别纯化大量的各种不同的生物探针，如药物分子、蛋白酶分子、生长因子与受体、抗原和各种不同特异性的抗体等，再分别将生物探针固相化在不同的微孔板或微珠等固相基质的表面，分别与样品中对应的化学物质、抗体或/和抗原分别反应，再分别进行检测分析，因此如要检测十几种成分就需进行十几次不同的实验，异常繁琐复杂。将基因转染和转化与位序编码技术相结合，把转染或转化的工程细胞/菌以点阵的方式排列在同一固相载体表面，将诱导、表达和检测分析集成为一体，并省略分离纯化等操作，则可以使样品的高通量检测更简单，操作更简便，并大大提高生产效率，降低生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便灵敏、快速及时，可同时对多种不同组织细胞或物质成分进行检测分析的技术。

本发明的主要技术特征是，将单层生长并融合成片的不同细胞或细胞系点状排列在片基上，形成细胞点阵，以便对样品中未知的化学物质、生物靶分子、细胞和微生物等多种不同成分的有无、性质、含量、来源；或对已知的核酸、蛋白与抗原等生物分子在组织与细胞中的分布和定位等同时进行鉴定、分析或检测的生物技术。各细胞点的反应结果可用目测、显微镜或扫描仪等仪器记录分析，根据细胞点在细胞片中的排列位置和顺序，完成样品中核酸、蛋白与抗原等分子的检测和组织细胞的分布、表达调控。本项发明同时还提供了一种基于本生物检测技术的试剂盒及用于细胞片的制备装置和方法。利用试剂盒中所提供的试剂和方法可对细胞片中各点所捕获的样品成分，做进一步分析。该试剂盒不仅大大简化了同一样品进行多因素检测分析的操作步骤，缩短了操作时间，降低了工作强度，更增加了检测结果的精确性、灵敏度、重现性和可比性，而且还可同时对检测样品中多种不同的物质成分做进一步的不同分析，使用更方便，操作更快捷，并且可广泛地应用于环境检测、疾病诊断、新药开发、疫苗研究、基因组和蛋白组学等技术研究领域。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案，其基本特征在于基因、蛋白和抗原的组织细胞分布、表达调控分析及被检样品中的化学/生物分子、细胞、细菌和病毒等的高通量生物检测至少包括下述成分和操作：

①一种细胞片：由片基(1)和细胞(2)组成。细胞片用制备装置将细胞(2)或两个及以上不同物种、同一物种不同组织来源、不同状态或完全相同的细胞，通过表面涂层或手臂分子的不同活性基团(3)，一同附着在片基的表面并呈点状有序地排列，经生物固定剂处理后，固着在片基(1)的表面；

②样品处理：对被检样品，如固/液体标本、生物体液、组织、细胞、微生物等进行稀释、浓缩、梯度密度分离、组织/细胞的匀浆、裂解、去除颗粒性物质、分离纯化、反转录、PCR或RT-PCR扩增等处理或不进行处理；

③标记：用荧光素(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red等)、酶(如HRP，AP，半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，尿素梅和荧光素酶等)、胶体金、同位素(如¹²⁵I，³²P，³⁵S等)、稀土离子(如Eu，Sm，Tb和Dy等)及其螯合物(如Eu³⁺-DTPA)等物质或其衍生物(如Cy5-dCTP，³²P-dCTP等)等指示性标记分子直接标记被检样品；或将一抗、生物素、地高辛等示踪性标记分子或其不同标记物(如荧光抗体、酶标抗体、生物素化抗体、生物素化酶、Eu³⁺-DTPA-抗体等标记物)用公知的技术或方法标记(直接或间接标记)被检样品或不经过标记处理直接使用；

④特异结合：标记或未标记的被检样品与片基上固着的细胞或其核酸、蛋白、抗原等生物分子相互作用或特异性结合；未经标记的样品或用一抗、生物素、地高辛等示踪性标记分子标记的样品与细胞反应后，加入用指示性标记分子标记的抗体、抗抗体或亲和素等指示性标记物，使之与样品或示踪性标记分子结合；

⑤漂洗：上述各步骤中，细胞片上未结合的、非特异性结合的或残留的样品、样品标记物、示踪性或指示性标记物等用洗液(如含0.03-0.1％的Tween20或Triton X-100等的PBS，Tris-HCl，HEPES等缓冲液)漂洗去除；

⑥结果观察：结果观察：用显微镜、扫描仪或目测等观察细胞片上各细胞点标记分子(如荧光、显色产物或发光产物、放射性)的有无、强弱、颜色的深浅，对照排列顺序以分析样品中被检物的有无、含量、组成、来源、组织/细胞分布与定位等；

⑦指示性标记物为酶时，如HRP(辣根过氧化物酶)，AP(碱性磷酸酶)、荧光素酶(Luciferase)等，观察结果前需加入酶的对应底物，如DAB(二氨基联苯胺)，OPD(邻苯二胺)或鲁米诺、甲基伞形酮磷酸酯、对羟基苯乙酸等显色剂或发光试剂以显示结果；

⑧染色与脱色：可用苏木素、伊红、吉姆萨或其它公知的组织细胞染色液复染显示细胞的细微结构；

⑨原位杂交和原位PCR：探针或被检测物为核酸时，可采用公知的原位杂交、PCR或RT-PCR反应进行扩增、标记和检测。

本发明的特征还在于：细胞片由片基(1)和细胞(2)组成；细胞成单层生长并融合成片，在片基上成点状排列；在一张细胞片上至少有2个或以上的细胞点，细胞点可组成不同的点；在一张细胞片上可以有一个或多个细胞点阵，点与点之间可以是相同的细胞也可以是不同的细胞；点阵之间可以相同，也可以不同；细胞点与点，点阵与点阵之间的空隙，可以有间隔(4)，围绕细胞点或细胞点阵形成彼此独立的微反应池(5)；

本发明的特征还在于：细胞片中的细胞(2)可以是肿瘤细胞或肿瘤细胞系，如Hela，HepG2等；也可以是正常细胞、传代细胞、原代细胞、基因转染或转化细胞、微生物感染细胞，经特定的化学分子、生物制剂、生物活性分子或任何可产生生物效应的理化因素、药物等处理的细胞，可以是原核(如E.Coli)、真核(酵母细胞)、昆虫、哺乳动物细胞、植物细胞或其它不同或相同物种，相同或不同组织来源的细胞，或者是完全相同的细胞；

本发明的特征还在于：片基(1)可以是玻璃、陶瓷、金属材料，纤维素、乳胶、硅胶等天然或人工合成的高分子材料或任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的，被加工成方形、长方形、园盘型的平板、薄片或薄膜，或是被加工成带有微孔或带有微孔及由微管、进/出液孔及盖板等形成的微流路或其它外观形状的硬质或软质材料；其表面本身具有，或经不同的物理处理、化学修饰或表面处理，如：

①用多聚赖氨酸浸泡处理；

②硅烷化处理，如丙氨基-三乙基硅烷(APES)等；

③用白胶，商售的专用固着剂；

④用胶原蛋白或细胞外基质，如胶原，纤粘连蛋白等涂布载玻片、塑料片/膜；

⑤通过化学修饰在片基表面形成一层由活性基团组成的表面分子层，如氨基、醛基、环氧基、羧基、羟基、巯基、溴乙酰基、酰肼基、环化亚胺碳酸盐基团等化学活性基团；

⑥通过辛胺、泰富隆(Teflon)涂层、硅化等处理获得惰性化学涂层；

以获得具有惰性或活性基团的化学分子或生物分子表面或涂层(3)；片基材料自身，涂层或其表面的分子活性基团有助于细胞的附着或固着，可以保证细胞在实验操作中不会脱落；或减少样品和/或标记物等在微流路表面等非细胞附着区的非特异性吸附；

本发明的特征还在于：细胞片制备装置，为全自动、半自动或手动实验或生产装置，可由有或无凹槽的底层托盘(6)、密封垫/圈(7)、通孔板(8)、紧固装置、单或多通路微量液体分注器和操作控制系统等组件共同或分别组成；密封垫/圈与通孔板可以是一体式也可以是分体式；底层托盘、密封垫/圈、通孔板等是由任何可加工成型的材质，经加工而成的，具有不同外观形状的组件；通孔板、密封垫/圈通过紧固装置、加压或粘贴等方式，与片基共同或分别组成的、带有相互独立的微孔的多孔微孔板，微孔膜或微孔片；与单或多通路微量液体分注器、操作控制系统等以一体式或分体式等方式组装而成；在实施中，细胞可与细胞培养基、缓冲液以及各种添加剂与水配制成一定浓度的细胞悬液，借助操作控制系统可将一定体积的不同细胞悬液，通过单或多通路微量液体分注器分别加入各微孔中，静置或离心等使细胞分别沉积在片基上，细胞经孵育成单层生长并融合成片，形成点状排列在片基上；

本发明的特征还在于：细胞片的制备至少包括以下部分或全部操作：

①细胞的分离纯化与培养扩增：新鲜的组织标本，经剪切、消化(如胰酶、胶原酶)等处理获得单个分散细胞，再经梯度和/或密度沉降、离心，或磁性微球，流式细胞术分选等公知方法分离和纯化，分别培养或扩增；

②细胞的复苏与培养扩增：引种或低温保存的，传代的正常细胞系、胚胎细胞系、肿瘤细胞系、感染、转染或转化细胞系、原代细胞等经复苏后，分别用公知的技术方法培养扩增；

③细胞的收集和计数：分离纯化的或扩增培养的细胞，收集，再经离心、计数和漂洗等操作后分别用培养基、平衡盐溶液、缓冲液等配成一定浓度的单个细胞悬液；贴壁生长的细胞需经胰酶、EDTA等试剂消化分散，制备成单个细胞后配制成细胞悬液；

④微孔板的准备：将片基(1)放入底层托盘(6)的定位凹槽中，依次加装密封垫/圈(7)、通孔板(8)，加压紧固，形成以片基为底的，各孔相互独立的多孔微孔板；

⑤单或多通路微量液体分注器将一定体积的细胞悬液，依序分别加入各微孔中；

⑥经过放置或离心等使细胞分别沉积在片基上，用公知的方法孵育至细胞附着在片基上，形成单层并融合成片，以点状在片基上排列；

⑦倾去各微孔中的液体，取下已附着细胞的片基，漂洗去除未附着的细胞、死细胞、细胞碎片和残留的细胞液，并将附着在片基上的细胞用公知的方法进行固定，同时或分别进行过氧化物酶、磷酸酶、核酸酶等内源性酶的灭活和非特异性结合位点的封闭等处理；

⑧漂洗去除残留的细胞固定液等，加入聚乙二醇—乙醇、甘油、蔗糖或其它公知的组织细胞保存液处理细胞片；

本发明的特征还在于：片基可以是微孔板，在板体(9)和板盖(10)上可分别具有微孔(11)、微流路(12)、驱动孔(18)、定位孔(19)和视窗(20)等部分或全部结构；微孔按一定的格式排列，通过微流路与外界相通或形成闭合环路。微流路由进液孔(13)、出液孔(14)、微槽/管(15)、密封圈(16)、蠕动管(17)等结构组成，可分别位于板体或板盖上，也可全部位于板体或板盖上；微流路通过微管与微孔相连，并通过进液孔和出液孔与外界相通；蠕动管位于进液孔和出液孔之间，将微流路连接成闭合环路，使样品和标记物等液体可以在微流路中循环流动，以促进样品和标记物等与细胞及其生物分子等的相互作用及结合；蠕动管可位于板体或板盖上，也可以外置；当片基具有微流路时优选专利号为00120798.9，01207812.3和02125914.3所述的检测板或微孔板；

本发明的特征还在于：间隔(4)是指在制备过程中或之后添加的，围绕细胞点或细胞点阵，使之形成彼此独立的微反应池的结构，此结构可以是高分子材料、纤维素、薄膜、油漆或涂料等，可以通过粘贴，喷刷、热压、熨烫或超声等方法使之附着、粘贴于片基上或与片基融为一体。

本发明的特征还在于：试剂盒至少装有一张细胞片，并与下述成分或试剂分别或共同组成不同的试剂盒，这些成分或试剂可以是液体、固体、干粉或胶体：

①至少有一管组织/细胞或微生物样品处理液，用于核酸、蛋白、多糖的分离；处理液中可根据需要至少含有核酸、蛋白、多糖或糖等的水解/分解/裂解酶等的酶抑制剂(如异硫氰酸胍、盐酸胍、PMSF TPCK，TLCK，aprotinin，leupeptin，antipain等)，去垢剂(NP40，Tween，SDS，胆酸等)，还原剂(如二巯基乙醇，二巯基苏糖醇等)，金属离子螯合剂(如EDTA，EGTA)，密度梯度(如氯化铯、BSA、泛影葡胺、聚蔗糖等)分层液、沉淀剂等；

②至少有一种样品标记试剂，含指示性/示踪性标记分子或其标记物，可用于样品中待检成分的标记；

③至少有一管洗涤液、稀释液或其浓缩液，如含有适量BSA或小牛血清、脱脂牛奶、Tween等的PBST，或TBST等缓冲液，用于样品、标记物等的稀释，或各步骤间残留物和非特异性附着物的漂洗和去除；

④至少有一管为指示性标记物，核酸探针、抗原或抗体、蛋白、多糖或凝集素，或其标记物；其中核酸可以是RNA，DNA或cDNA片段、全序列的单链或双链等；其中抗体可以是一抗、二抗等；

⑤至少有一管为蛋白、核酸、脂或酯、糖和多糖等的浓度测定试剂，如Folin酚、蒽酮等试剂；

⑥在标记物为酶类时，至少有一种显色底物或发光底物，如OPD或DAB与过氧化氢/脲、鲁米诺，甲基伞形酮磷酸酯，ATP等；

⑦至少有一管为PCR或RT-PCR引物、核酸探针、分子杂交液或预杂交液，用于核酸的扩增、杂交或预杂交；

⑧至少有一管为核酸聚合酶、蛋白水解酶、蛋白酶抑制剂或聚合酶底物，如DNA/RNA聚合酶，细菌碱性磷酸酶，马铃薯磷酸酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，羧肽酶，或糖基修饰分析酶PNGase F及核酸聚合酶的底物dNTP等；

⑨至少有一管为生物微球，其表面有抗体、蛋白分子、药物、核酸或引物等，以对细胞片特定细胞点的细胞或细胞结合物等成分的分离用于进一步分析；

⑩至少有一管为组织细胞染色液，如苏木素、伊红、吉姆萨等，用于细胞的复染；

本发明的特征还在于：可以用试剂盒中的试剂通过下述不同的方法对样品或细胞片不同细胞点中的细胞及其所结合的样品成分分别做PCR、RT-PCR、基因克隆、质谱分析、序列测定、电泳等进一步分析或分析前的处理：

①直接在感兴趣的细胞点中加入PCR试剂或电泳样品缓冲液、染色液等试剂，对结合物在原位做进一步分析前的样品处理；

②将细胞片上的细胞取出，在微量反应器中加入PCR试剂或电泳样品缓冲液或染色液等试剂对结合物做进一步分析前的样品处理；

③将新鲜样品分别与感兴趣细胞点的生物微球或包被相同结合特性分子单体的微球共育，以同样的条件重复细胞片的操作步骤，将样品中感兴趣的成分吸附在生物微球上，充分漂洗去除未结合的样品混合物，加入PCR试剂、核酸内切酶或蛋白水解酶、磷酸酶、电泳样品缓冲液、蛋白质糖基化分析或染色液等试剂，对结合物做进一步电泳、质谱和系列测定等分析或分析前的处理；

④样品的PCR，RT-PCR扩增反应和标记等处理可在细胞片上进行，也可在试管中进行。

本发明具有以下优点：1信息量大。在一张载玻片大小的片基上，排列数十甚至数百种不同特性的细胞，一次实验操作就可获得被分析物在片基上所有细胞的细胞学定位、组织分布与表达调控等数据资料，或完成对成百上千种不同被检物的高通量定性、定量并行分析。2.易于制备、成本低。本发明所述的细胞片可选用各种商售产品为原材料，如载玻片，聚苯乙烯、聚碳酯、尼龙、硅胶、纤维素等膜片或薄板等作为片基成本低廉；生产所需的专用设备采用本发明所述的自制装置，不仅成本低，而且可满足一般生产的需要。所需细胞可通过培养扩增大量获得；与细胞的感染、转染或转化，诱导表达及固相分离纯化等技术相结合，将细胞或其产物作为抗原直接用于生物检测分析和诊断，还可以实现将基因的重组表达、蛋白的制备、分离纯化、解吸附以及变性、复性等复杂的实验操作融为一体，省略了繁琐的重复性操作等过程。3.自由组合，灵活易变。可完全依照使用目的的不同，自由组合，或灵活地改变细胞片中细胞的种类和生物学特性以改变检测的内容，而无需变动全部排列顺序和格式。4.灵敏度高。经转染或转化的细胞可作为抗原，直接用于生物检测分析和诊断。由于表达的重组蛋白未经过分离纯化等过程，因此保留了生物分子的天然构象等生物特性；此外，采用真核细胞或哺乳动物细胞表达，可完全模拟基因表达的自然过程，如翻译后的折叠和糖基修饰等。因此，将转染细胞直接作为抗原用于检测分析，不仅反应特异性与亲和力得到提高，而且由于抗原都能更好的保留其生物活性，还可以大大提高检测灵敏度。当采用带有微流路的片基制备细胞片时，种植在微孔内的细胞分别作为固相(相当于固化了配基/配体的亲和层析基质)，与沿微流路逐一流经各孔的流动相中的被检物(如抗体、蛋白、多糖或核酸分子)特异结合或杂交，同时被固相吸附后的样品液不再与样品原液混合(具有过滤、亲和层析、分离与浓缩效用)，去除了被检测物(如抗原/抗体等)在反应中因反复扩散、平衡而被稀释的影响，故更加灵敏。5.操作简便，节省样品与试剂。采用本发明所述的细胞片进行基因、蛋白、抗原等组织细胞的分布、定位与调控分析或用于检测分析，将几十个甚至几百个实验集成在一起，并行操作，改变了传统和现有技术分别清洗、分别分离纯化、分别制备、分别反应，分别检测或在较大的容器中反应和浸洗的操作方式，因此可大量节约试剂，解决因样品不易获得和标记物价格昂贵所带来的困扰；同时还简化了繁琐的重复性操作，并且易于实现全自动化。6.定量分析更准确。本方法将数十种甚至数千种表达不同生物分子的细胞种植在片基的微孔中，将检测分析集中在一块细胞片上同时进行，不仅可以确定样品的组成及各组分的来源、含量，组织/细胞定位，同时又便于不同样品间和同一样品不同成分间的平行比对。微孔中种植的细胞或微生物体可同时在同一培养器皿中一次性大量制备，从而可保证各复孔和各细胞片之间的检测结果的平行一致。在需要对某一成分进行定量分析时，只需增加种植相同细胞等微生物体的复孔数，配合单向的微流路，比较前后各复孔荧光、发光的强弱变化或胶体金沉积、成色产物生成多少的变化，对照标准物，即可实现对被检物的定量分析，解决了定量分析的准确性、重复性和不同实验室及不同批次检测分析结果的不可比对性等问题。7.保留了传统和现有检测方法重复性好，准确性高、可靠性强等优特点。8.结果易于分析。由于细胞点和微孔的形状和尺寸相同，封闭式微流路结构可避免灰尘等引起的噪声信号，因而能获得均匀和最小的图像背景强度，同时每个细胞点或微孔的排列可与光电信号转换元件的排列一致，因此可获得最佳的细胞芯片图像。9.用途更广泛。本发明不仅可用于基因、蛋白和抗原等组织/细胞定位与表达调控等研究，还可以直接用于疾病的诊断、新药的开发和蛋白质组学等现代生命科学的研究与开发；而且对感兴趣的细胞亚微结构还可借助激光显微切割捕获技术，直接进行质谱分析；获得的结合物的不同洗脱条件等数据资料还可用于后续的靶分子的分离纯化等。

附图简要说明

图1为细胞片基本结构示意图。

图中所示为片基(1)、细胞(2)，细胞呈点状排列，形成点阵。

图2是细胞片的截面微细结构示意图。

图中所示为片基(1)，细胞(2)和片基表面可促进细胞附着的活性基团或分子形成的表面分子层或称涂层(3)。借助片基(1)表面的涂层(3)，成单层生长并融合成片的细胞(2)较牢固地吸附在片基(1)的表面。

图3为不同排列格式的细胞片

图中3.1和3.2所示为片基(1)、细胞(2)，间隔(4)，细胞呈点状排列，形成不同密度的点阵和微反应池(5)。

图4是细胞片制备专用装置结构与工作原理示意图。

图中所示为片基1、底层托盘(6)、密封垫/圈(7)、通孔板(8)。通孔板、密封垫/圈通过加压紧固使之形成以片基为底的多孔微孔板。操作控制系统借助多通路微量液体分注器将不同的细胞悬液分别加入各微孔中，经静置或离心等使细胞分别沉积在片基上，细胞经孵育成单层生长并融合成片形成点状，排列在片基上；

图5是带有微孔和微流路的细胞片基本结构示意图。

图中所示为片基(1)，细胞(2)、板体(9)和板盖(10)。在板体(9)上具有微孔(11)，其间有微槽/管(12)相连；进液孔(13)、出液孔(14)、密封圈(16)、蠕动管(17)等结构与板盖(10)形成微流路(15)。微孔(11)按一定的格式排列，其内可种植不同的细胞(2)，通过微流路(15)与外界相通或借助蠕动管(17)形成闭合环路。

图6是圆盘式细胞片的外观结构示意图。

图中所示为片基(1)，进液孔(13)、出液孔(14)、驱动孔(18)、定位孔(19)；细胞点阵以驱动孔(18)为中心呈环形或扇形排列，通过进液孔(13)、出液孔(14)与外界相通；分析结果时，动力装置借助驱动孔(18)实现细胞片的自动旋转和位移，并借助定位孔(19)完成扫描仪等分析系统的自动寻址和定位。图7是视窗式细胞片的外观结构示意图。

图中所示为片基1，进液孔(13)、出液孔(14)、视窗(20)；细胞点阵在视窗区的片基上排列，表面覆以透明材质的薄膜或薄片形成视窗(20)，在视窗与片基间留有微隙，通过进液孔(13)、出液孔(14)与外界相通，以有利于样品、洗液等与细胞及其生物分子的相互作用；分析结果时，可通过视窗直接观察结果。

本发明在实施中的基本操作步骤和方法如下：

一.细胞片的制备：

细胞片的制备方法包括以下基本方法和步骤：

1.表面处理：表面处理因所选片基材料的不同而略有不同，每种材料其具体处理方法和条件都有多种，本发明在此将《生物分子固定化技术及应用》(蒋中华等，1998年，化学出版社)及中国专利号为01207812.3和申请号为00120798.9的专利为主要参考文献。运用公知的各种生物大分子固相化技术，处理各种材料的片基，使其表面带有特定的活性基团，可与细胞、化学分子、药物分子和生物分子上的活性基团反应，而具有特定的吸附能力。如载玻片经严格清洗后用二甲苯浸洗，再经70％的乙醇漂洗、烘干；然后在2％丙氨基-三乙基硅烷无水丙酮溶液(APES，3-Aminopropyltriethoxysilane，Sigma公司，目录号A3648)中浸泡30秒，用无水丙酮和蒸馏水顺序漂洗，干燥(Weetall，H.H.，Biochem.Biophys.Acta，1970；212：1)。或以商售的经表面处理的各种材料作为片基。

2.装片：将经过处理的片基(1)放入细胞片生产制备专用装置底层托盘(6)的凹槽中，然后依次是密封垫/圈(7)、通孔板(8)，调整紧固装置，使之形成以片基为底、孔与孔间互不相通的多孔板。

3.细胞培养与扩增：依据细胞来源的不同，可以有多种不同的基本操作方式①单个的细胞：引种的细胞，低温保存复苏后的细胞；②新鲜的组织标本：细胞的分离纯化与培养扩增需先进行剪切、消化等处理获得单个分散细胞和③经感染、转染或转化处理的细胞系或原代细胞，或经梯度和/或密度沉降、离心，或磁性微球，流式细胞术分选等方法分离和纯化的细胞。分别用公知的技术方法培养扩增。扩增后的细胞分别收集到离心管中，贴壁生长的细胞需经胰酶、EDTA等试剂消化处理；离心和漂洗，同时取少量计数，然后分别用培养基、平衡盐溶液、缓冲液等根据计数结果配成一定浓度的单个细胞悬液；

4.细胞片的制备：用单或多通路微量液体分注器将一定体积的细胞悬液，依序分别加入或种植在准备好的多孔微孔板的各微孔中，静置或离心等使细胞分别沉积在片基上，温箱或培养箱孵育至细胞在片基上成单层附着或贴壁并融合成片。倾去各微孔中的液体，取下附着细胞的片基，漂洗去除未附着的细胞、死细胞、细胞碎片和残留细胞液。

5.固定：将附着在片基上的细胞用甲醛、多聚甲醛、冷丙酮、甲醇、乙醇、苦味酸等公知的方法进行固定，漂洗去除残留的固定液。

6.封闭：将片基浸入分别含有动物血清或BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、白明胶、聚蔗糖、Tween、NP40，叠氮钠和去垢剂等试剂的封闭溶液中处理，以封闭片基上的非特异性结合位点，同时或分别进行过氧化物酶、磷酸酶、核酸酶、蛋白酶等内源性酶灭活，以降低结果观察时的背景影响或特异性信号的减弱。

7.封片：在片基上加入聚乙二醇-乙醇、甘油、蔗糖或其它公知的组织细胞保存液，使之覆盖各细胞点，待干燥即获得了由不同细胞组成，呈点状排列的细胞片。

二.样品的检测分析

样品的检测分析一般包括以下基本步骤和方法：

1.样品的制备与处理：根据检测目的的不同，生物样品在检测前将分别进行不同的处理。常见样品处理方法包括：①可溶性样品加入适量缓冲液以调节样品浓度或蛋白浓度，离子强度和酸碱度等；②组织、细胞、微生物等用裂解缓冲液配合匀浆或超声粉碎等处理使之成为真性溶液；③离心或过滤去除悬浮物或颗粒物，如血细胞等。④新鲜组织经剪切、消化等处理获得单个分散细胞，再经梯度和/或密度沉降、离心，或磁性微球，流式细胞术分选等分离和纯化；⑤核酸提取物：用DNA或RNA抽提液处理各种生物样品、生物体液或培养物以提取样品中的DNA或RNA等；⑥上述方法的不同组合。

2.样品的标记：①直接标记。运用公知的生物分子标记技术，分别用生物素、酶、荧光素、胶体金、同位素或稀土离子及其螯合剂等物质或其衍生物等标记分子作为指示剂直接标记样品或待检标本。②采用间接标记。用上述标记分子的标记物标记样品，但标记反应是在完成加待检样品和漂洗等步骤后进行。③掺入标记，运用各种合成技术，如固相合成技术、反转录合成、PCR或RT-PCR扩增等将标记分子或标记物掺入被标记分子中。

3.加待检样品：将样品、处理样品或标记样品加至细胞片上，使之与各点的细胞及其生物分子等进行反应。被检样品中与细胞对应的生物分子被捕获并特异结合或吸附，未结合的部分可被漂洗去除。②将寡核苷酸引物、dNTP，可掺入标记物和耐热DNA聚合酶等加至细胞片，进行至少一个循环的PCR或RT-PCR扩增反应。③样品中的抗原抗体、配基配体、细胞因子或药物分子等与片基表面附着细胞或其不同的生物分子结合。

4.漂洗或流洗：在细胞片上加入洗液或借助微流路用洗液流洗，以去除细胞片中残留的被检样品(未结合物或称游离物)或标记物等。

5.结果分析：根据标记分子的不同用目测或显微镜、扫描仪等仪器观察并记录各细胞点反应的有无以及强弱(如生成产物颜色的深浅、胶体金沉积、荧光强度、放射强度等的强弱变化)。对照细胞点的排列位置，借助计算机分析即可以确定该样品中，被检测物的有无，组成以及各组分的含量，组织分布，细胞定位与表达调控。但是在标记物为酶时，实施中则必须添加对应的底物才能观察检测结果，其检测结果为呈色反应或发光反应。

本发明在实施中，上述操作步骤依据细胞等微生物体、探针、被检测物、标记物和显示结果以及检测目的的等的不同，可有多种不同的组合方式。各种生物反应可全部在细胞片上进行，也可部分在试管中进行。

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例I：在单克隆抗体开发中的应用。

在小鼠单克隆抗体的研究中，通常需要对抗体识别的抗原靶分子的组织细胞分布进行鉴定，如细胞表面的各种受体分子或CD分子等，在实施中的具体操作步骤如下：

1.载玻片处理：经严格清洗的载玻片用二甲苯浸洗，再经70％的乙醇漂洗、烘干；然后在2％丙氨基-三乙基硅烷无水丙酮溶液(APES，3-Aminopropyltriethoxysilane)中浸泡30秒，用无水丙酮和蒸馏水顺序漂洗，干燥。

2.装片：将经过处理的载玻片放入细胞片制备装置底层托盘的凹槽中，然后依次是密封垫/圈、通孔板，旋紧紧固装置后备用。

3.细胞片的制备：将贴壁生长的人不同肿瘤细胞系接种入培养瓶中，至对数生长期，用EDTA-胰酶消化分散，收集至离心管中，混匀计数，离心漂洗数次后加入新鲜培养液，配制成一定浓度的细胞悬液。依序将细胞种植入多孔板的微孔中，置二氧化碳培养箱中孵育，待细胞贴壁后，倾去培养液，Hank’s液或无血清培养液漂洗数次，加入固定液(如含3.7％的多聚甲醛和4％的蔗糖的PBS)适当固定(10-30分钟)后，漂洗数次后用封闭缓冲液(如含1-3％牛血清白蛋白的PBS)处理，以封闭去除载玻片表面可能残留的活性基团或非特异性结合位点，即获得细胞片，置4℃保存备用。

4.加入样品：取适量体积(50-150ul)的待鉴定杂交瘤细胞的培养液(含小鼠抗体)，加至细胞片的微反应池中，孵育适当时间(5-90分钟)，使抗体与细胞表面的抗原分子充分作用。

5.漂洗：用洗液(PBS含1％的BSA，0.03-0.05％的Tween20或Triton X-100)漂洗去除微反应池中残留的被检样品(未结合的抗体)。

6.标记：加入100-200ul的FITC标记的抗小鼠Ig抗体，孵育适当时间(15-60分钟)。

7.漂洗：漂洗以去除细胞片中残留的标记物(FITC-抗小鼠Ig)。

8.结果分析：荧光显微镜或生物芯片扫描仪等仪器观察并记录各细胞点荧光反应的有无，对照阳性孔的排列位置或细胞点阵的位序编码，即可以确定该单克隆抗体所识别的抗原分子的组织细胞分布特性，或其组织细胞反应的特异性。根据荧光反应的强弱差异，可以推测不同细胞的抗原表达密度。

实施例II：在优生优育方面的应用。

真核基因和病毒蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效，而且成本低廉。然而，表达的蛋白因折叠方式不正确或效率的低下，常常活性很低，甚至没有活性。特别是蛋白的翻译后加工与修饰，原核细胞根本不能进行。风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、柯萨基病毒和弓形虫等是引起宫内感染并导致胎儿畸形的主要病原体；乙肝、梅毒和艾滋病等是可以通过垂直传播引起新生儿感染的传染性疾病的病原体。因此，对育龄和妊娠妇女开展上述病原体感染的检测诊断成为预防先天性畸形和新生儿感染的重要手段。在实施中具体操作步骤如下：

1.细胞片的制备：将贴壁生长的基因转染细胞接种入培养瓶中，至对数生长期，用EDTA-胰酶消化分散，收集至离心管中，混匀计数，离心漂洗2-3次后加入新鲜培养液，配制成一定浓度的细胞悬液。将转染不同病原体抗原基因的细胞依序分别直接种植入微流路片基的微孔中，置二氧化碳培养箱中孵育，待细胞贴壁后，倾去培养液，Hank’s液或无血清培养液漂洗数次，加入固定液(如含3.7％的多聚甲醛和4％的蔗糖的PBS)适当固定(10-30分钟)后，漂洗数次后，加盖板或盖膜使之形成完整的微流路，用封闭缓冲液(如含1-3％牛血清白蛋白的PBS)以封闭去除片基和微流路表面可能残留的活性基团或非特异性结合位点，即获得细胞片，置4℃保存备用。

2.加入样品：取10-50ul的被检者血清适量稀释，经微流路加入细胞片中，孵育适当时间(5-90分钟)，使血清中的抗体与转染细胞表达的抗原分子充分作用。

3.漂洗：用洗液经微流路漂洗去除细胞片中残留的被检血清(未结合的抗体)。

4.标记：加入100-200ul的Cy3和Cy5分别标记的抗人IgG和IgM抗体混合液，孵育适当时间(15-60分钟)。

5.漂洗：漂洗以去除细胞片中残留的标记物。

6.结果分析：荧光显微镜或生物芯片扫描仪等仪器观察并记录各细胞点荧光反应的有无及颜色变化，对照阳性孔的排列位置或细胞点阵的位序编码，即可以确定该被检者血清中有无被检抗体，以确定该患者或被检者有无相应的病毒感染；根据复孔Cy3和Cy5荧光强弱的差异和变化对照标准参照物，可以计算出抗原特异性IgG和IgM的含量，由此确定被检者是否处于感染的早期，以及有无传染性和被检者的免疫力状况等。

实施例III：在原位杂交中的应用。

原位杂交实验是分子生物学、组织和病理学研究中，特别是在基因的表达调控和组织细胞定位中最常用的技术方法，在实施中的具体操作步骤如下：

1.取DEPC-PBS(用DEPC处理过的双蒸水配制的磷酸盐缓冲液)处理的细胞片用Triton-X100处理15分钟，经DEPC-PBS洗25分钟后，用Rnase-free的蛋白酶K或胃蛋白酶于37℃孵育10-30分钟，经甘氨酸PBS或DEPC-PBS漂洗后用多聚甲醛固定，用DEPC-PBS漂洗后醋酸酐三乙醇胺溶液孵育，再用2xSSC洗3分钟；

2.用随机引物、缺口翻译或PCR等方法标记或制备探针；

3.用不含探针的寡核甘酸探针杂交缓冲液在37℃孵育2小时，2xSSC洗5分钟；用含探针的杂交缓冲液37℃孵育约18小时，依次用1xSSC室温漂洗，55℃水浴摇洗，0.5xSSC在55℃水浴摇洗，室温漂洗，用Tris缓冲液摇洗，封闭液室温孵育30分钟；

4.除去封闭液，用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体室温孵育2-4小时，Tris缓冲液漂洗；

5.用含MgCL₂的Tris缓冲液室温孵育10分钟，BCIP/NBT避光显色2-24小时；

6.用TE缓冲液终止显色后，将细胞片在蒸馏水中浸洗，核固红套染，水溶性封片剂封片，显微镜观察结果。

本发明把细胞的体外培养、重组基因的转染和表达与生物芯片的高通量快速并行分析技术相结合，集数种技术的优点于一身，是一种全新概念的高通量生物学分析检测技术；把先进技术与自制生产专用设备相结合，融高新技术与低生产开发成本于一体。具有信息量大、定量准确、灵敏度高、制造成本低，用途广等突出优点，可广泛用于生物学、医药学，环境科学、能源与材料科学等领域。

Claims (10)

1.一种可分析基因、蛋白和抗原等生物分子的组织细胞分布、表达调控及检测样品中的化学/生物分子、细胞、细菌和病毒等的细胞生物技术、试剂盒及制备装置，该技术和试剂盒至少包括下述成分和操作：

①一种细胞片：由片基和细胞组成。细胞片用制备装置将细胞或两个及以上不同物种、同一物种不同组织来源、不同状态或完全相同的细胞，通过表面涂层或手臂分子的不同活性基团，一同附着在片基的表面并呈单层点状有序地排列，经生物固定剂处理后，固着在片基表面；

②样品处理：对被检样品进行稀释、浓缩或梯度密度分离、匀浆、裂解、去除颗粒性物质、分离纯化、反转录、PCR或RT-PCR扩增等处理，或不进行处理；

③标记：用荧光素、酶、胶体金、同位素等指示性标记分子，或一抗、生物素、地高辛等示踪性标记分子或其不同标记物标记样品；

④特异结合：标记或未标记的被检样品与片基上固着的细胞或其核酸、蛋白、抗原等生物分子相互作用或特异性结合；未经标记的样品或用一抗、生物素、地高辛等示踪性标记分子标记的样品与细胞反应后，加入用指示性标记分子标记的抗体、抗抗体或亲和素等指示性标记物，使之与样品或示踪性标记分子结合；

⑤漂洗：上述各步骤中，细胞片上未结合的、非特异性结合的或残留的样品、样品标记物、示踪性或指示性标记物等用洗液漂洗去除；

⑥结果观察：用显微镜、扫描仪或目测等检测细胞片上各细胞点标记分子的有无、强弱、颜色的深浅，对照排列顺序等，以分析样品中被检物的有无、含量、组成、来源、组织/细胞分布与定位等；

⑦指示性标记物为酶时，观察结果前需加入酶的对应底物以显示结果；

⑧染色与脱色：细胞的结构可用苏木素、伊红或其它公知的组织细胞染色液复染显示；

⑨原位杂交和原位PCR：探针或被检测物为核酸时，可采用公知的原位杂交、PCR或RT-PCR反应进行扩增、标记和检测。

2.根据权利要求1所述的细胞片，由片基和细胞组成；细胞成单层生长并融合成片，在片基上成点状排列；在一张细胞片上至少有2个或以上的细胞点，细胞点可组成不同的点阵；点与点之间可以是相同的细胞也可以是不同的细胞，点阵之间可以相同，也可以不同；细胞点与点，点阵与点阵之间的空隙可以有间隔，围绕细胞点或细胞点阵形成彼此独立的微反应池；

3.根据权利要求1和权利要求2所述的细胞，可以是肿瘤细胞，也可以是正常细胞、传代细胞、原代细胞、基因转染或转化细胞、微生物感染细胞，经特定的化学分子、生物制剂、生物活性分子或任何可产生生物效应的理化因素、药物处理的细胞，还可以是真核、原核、昆虫、哺乳动物细胞或其它不同或相同物种，相同或不同组织来源的细胞，或者是完全相同的细胞；

4.根据权利要求1、权利要求2所述的片基，可以是玻璃、陶瓷、硅片、天然或人工合成的高分子材料，或任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的，被加工成方形、长方形、园盘型的平板、薄片或薄膜，微孔板或其它外观形状的硬质或软质材料；其表面本身具有，或经不同的物理处理、化学修饰或表面处理，获得具有惰性或活性基团的化学分子或生物分子表面或涂层；片基材料自身，涂层或其表面的分子活性基团有助于细胞的附着或固着，减少或降低非细胞附着区的非特异性吸附；

5.根据权利要求1所述的细胞片生产制备专用装置，为全自动、半自动或手动实验或生产装置，可由有或无凹槽的底层托盘、密封垫/圈、通孔板、紧固装置、单或多通路微量液体分注器和操作控制系统等组件共同或分别组成；其中密封垫/圈与通孔板可以是分体式也可以是一体式；底层托盘、密封垫/圈、通孔板等是由任何可加工成型的材质，经加工而成的，具有不同外观形状的组件；通孔板、密封垫/圈通过紧固装置、加压或粘贴等方式，与片基共同或分别组成的、带有相互独立的微孔的多孔微孔板，微孔膜或微孔片；与单或多通路微量液体分注器、操作控制系统以一体式或分体式等方式组装而成；

6.根据权利要求1、权利要求2和权利要求5所述的细胞片，其制备至少包括以下部分或全部操作：

①细胞的分离纯化与培养扩增：新鲜的组织标本，经剪切、消化等处理获得单个分散细胞，再经梯度和/或密度沉降、离心，或磁性微球，流式细胞术分选等公知方法分离和纯化，分别培养或扩增；

②细胞的复苏与培养扩增：引种或低温保存的，传代的正常细胞系、胚胎细胞系、肿瘤细胞系、感染、转染或转化细胞系、原代细胞等经复苏后，分别用公知的技术方法培养扩增；

③细胞的收集和计数：分离纯化的或培养扩增的细胞，收集，再经离心、计数和漂洗等操作后分别用培养基、平衡盐溶液、缓冲液等配成一定浓度的单个细胞悬液；贴壁生长的细胞需经胰酶、EDTA等试剂消化分散，制备成单个细胞，并配成一定浓度的细胞悬液；

④微孔板的准备：将片基放入底层托盘的定位凹槽中，依次加装密封垫/圈、微孔板，紧固加压，形成以片基为底的，各孔相互独立的多孔微孔板；

⑤单或多通路微量液体分注器将细胞悬液，依序分别加入各微孔中；

⑥经静置或离心等使细胞分别沉积在片基上，用公知的方法孵育至细胞附着在片基上形成单层并融合成片，在片基上呈点状排列；

⑦倾去各微孔中的液体，取下附着细胞的片基，漂洗去除未附着的细胞、死细胞、细胞碎片和残留的细胞液，并将附着在片基上的细胞用公知的方法进行固定，同时或分别进行过氧化物酶、磷酸酶、核酸酶等内源性酶的灭活和非特异性结合位点的封闭等处理；

⑧漂洗去除残留的细胞固定液等，加入聚乙二醇-乙醇、甘油、蔗糖或其它公知的组织细胞保存液处理细胞片；

7.根据权利要求1、权利要求2和权利要求4所述的片基，可以是微孔板，在板体和板盖上可分别具有微孔、微流路、驱动孔、定位孔和视窗等部分或全部结构；微孔按一定的格式排列，通过微流路与外界相通或形成闭合环路。微流路由进液孔、出液孔、微槽/管、密封圈、蠕动管等结构组成，可分别位于板体或板盖上，也可全部位于板体或板盖上；微流路通过微管与微孔相连，并通过进液孔和出液孔与外界相通；蠕动管位于进液孔和出液孔之间，将微流路连接成闭合环路；蠕动管可位于片基上也可以外置；

8.根据权利要求2所述的间隔，是指在制备过程中或之后添加的，围绕细胞点或细胞点阵形成的，使之彼此独立的微反应池的结构，此结构可以是高分子材料、纤维素、薄膜、油漆或涂料等，可以通过粘贴，喷刷、热压、熨烫或超声等方法使之附着、粘贴于片基上或与片基融为一体；

9.根据权利要求1所述的试剂盒，至少装有一张细胞片，并与下述成分或试剂分别或共同组成不同的试剂盒，这些成分或试剂可以是液体、固体、干粉或胶体：

①至少有一管组织/细胞或微生物样品处理液，用于核酸、蛋白、多糖的分离；

②至少有一种样品标记试剂，其中含指示性或示踪性标记分子或其标记物；

③至少有一管为洗涤液、稀释液或其浓缩液；

④至少有一管为核酸探针、抗原或抗体、蛋白、多糖或凝集素，或其标记物；

⑤至少有一管为蛋白、核酸、脂或酯、糖和多糖等的浓度测定或分析试剂；

⑥在标记物为酶类时，至少有一种显色底物或发光底物；

⑦至少有一管为PCR或RT-PCR引物、核酸探针、分子杂交液；

⑧至少有一管为核酸聚合酶、蛋白水解酶蛋白酶抑制剂或聚合酶底物；

⑨至少有一管为细胞微球；

⑩至少有一管为组织细胞染色液；

10.根据权利要求1和权利要求9所述的检测方法和试剂盒，可以用试剂盒中的试剂通过下述不同的方法对样品或细胞片不同细胞点中的细胞及其所结合的样品成分分别做PCR、RT-PCR、基因克隆、质谱分析、序列测定、电泳等进一步分析或分析前的处理：

①直接在感兴趣的细胞点中加入PCR试剂或电泳样品缓冲液、染色液等试剂，对结合物在原位做进一步分析前的样品处理；

②将细胞片上的细胞取出，在微量反应器中加入PCR试剂或电泳样品缓冲液或染色液等试剂对结合物做进一步分析前的样品处理；

③将新鲜样品分别与感兴趣细胞点的生物微球或包被相同结合特性分子单体的微球共育，以同样的条件重复细胞片的操作步骤，将样品中感兴趣的成分吸附在生物微球上，充分漂洗去除未结合的样品混合物，加入PCR试剂、核酸内切酶或蛋白水解酶、磷酸酶、电泳样品缓冲液、蛋白质糖基化分析或染色液等试剂，对结合物做进一步分析或分析前的处理；

④样品的PCR，RT-PCR扩增反应和标记等处理可在试管中进行，也可在细胞片上进行。

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