CN109557165A - 用于监控质谱成像制备工作流程的质量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法，其使用在同一样品支持物上与分析组织切片一同待处理和测量的对照样品来监控用于质谱成像的分析组织切片的制备工作流程的质量，并确定对照样品测量结果的特征是否符合来自相同类型的对照样品的单独参考测量结果的特征范围。本发明可以借助于对照样品中的特定质量信号特征，使用多变量特征分析方法监控样品制备步骤中组织的准确处理。

Description

用于监控质谱成像制备工作流程的质量的方法
技术领域
本发明涉及质谱成像(MSI)领域，特别是使用MALDI(基质辅助激光解吸/电离)作为电离技术和飞行时间(TOF)分析仪的质谱成像。
背景技术
质谱成像，其MALDI变化形式由Richard M.Caprioli开创(参见例如US 5,808,300，其整体内容通过引用并入本文)，是一种越来越多地用于基于组织的研究的技术，并且期望该技术也可以有助于组织诊断或分类。用于组织诊断的现有方法，如化学染色或免疫染色的组织切片的显微镜分析是通过人为观察而进行的，因而具有非理想的主观性成分。由于质谱图可被客观地测量，因此期望MSI可以有助于客观的组织分类或诊断。
质谱分析已被用于微生物的鉴定，参见例如“C.Fenselau et al.，MassSpectrometry Reviews,2001,20,157-171”。对于该鉴定，将微生物培养，然后进行用于质谱的制备，并在质谱仪中进行检测。然后将得到的质谱与波谱库的参考波谱进行比较，研究特征质量信号的存在和波谱的形状，并给出测量波谱和参考波谱之间一致性的评分。如果在库中没有找到相关的参考波谱，则评分低，有效地报告为未识别。在微生物的情况下，这种方法可行，因为所得的质谱在很大程度上与样品制备条件无关。该方法已经商业化，例如，由Bruker Daltonics Inc.公司(比勒利卡，MA)销售的MALDI系统。
在基于质谱的组织分类的情况下，例如对于从健康组织中区分患病组织或者区分不同类型的患病组织，如用于微生物的简单图库方法通常不可行。其原因在于，在相关组织中，必须考虑到不同细胞类型的贡献；换句话说，很少会看到较大区域中的“纯的”细胞群。例如，在实体肿瘤的分析中，肿瘤细胞仅占一定百分比，可能对炎症过程产生不同的影响，如对被结缔组织包围的淋巴细胞的浸润。所有这些不同的细胞将给出其自己的质谱图，并且在许多应用中，MSI测量的空间分辨率不足以分辨单独的细胞。还存在生物学变量，因为不同的患者以及不同的肿瘤具有不同的遗传背景，这将反映在质谱表型中。
本领域技术人员还将理解的是，用质谱成像研究的组织样本对于精确的样品制备和处理条件更加敏感，使得与预知方案的细微差异和较大像差可以(并且经常地)导致目标分析物的显著改变的和失真的图像。不言而喻，这些非理想的过程使有意义的分析，尤其是此类数据的可比性复杂化。
M.Reid Groseclose和Stephen Castellino报道了一种模拟组织模型的用途，该模拟组织模型包含一组掺有一系列不同浓度药物的组织匀浆，其已被冷冻到聚合物支持模具中。该模型用于模拟给药的组织对分析物提取和离子抑制的影响。据称，对来自组织模型和所给药的组织的切片进行平行制备和分析能够对药物的分布进行定量(“A MimeticTissue Model for the Quantification of Drug Distributions by MALDI ImagingMass Spectrometry”；Anal Chem.2013Nov 5；85(21):10099-10106)。
鉴于前述内容，仍然需要监控MSI样品制备工作流程的准确性，特别是对由用于质谱成像的此类样品制备工作流程中的不期望和非理想的变化所引起的错误分类进行识别。
发明内容
本公开总体上涉及一种监控用于质谱成像的分析组织切片的制备工作流程的质量的方法。
本发明的最基本原理为将合适的对照样品与待研究的分析组织切片(或多个此类分析组织切片)一同进行制备和测量。这样一来，可以借助于对照样品中的特定质量信号特征，使用多变量特征分析方法监控样品制备步骤中组织的准确处理。在来自相同的对照样品类型的样本的大量单独的测量结果中识别这些特征，这些测量在基本相同的制备条件下进行，以建立可比性。
本发明大体上涉及一种监控用于质谱成像的分析组织切片的样品制备工作流程的质量的方法，包括提供适合于质谱成像的样品支持物，如平的导电板(例如不锈钢板、涂覆有导电层的玻璃/陶瓷板等)；将分析组织切片和对照样品置于样品支持物上，其中对照样品包含优选基本上均匀的组织(并且其中组织可以被理解为来自共同完成特定功能的相同来源的相似细胞的集合)；在预定条件下共同制备用于分析的分析组织切片和对照样品，所述条件可包括将对照样品和一个或多个分析组织切片暴露于液体和湿化学品中的至少一者；在同一测量运行中，获取来自对照样品的(空间分辨)质谱并获取来自分析组织切片的空间分辨质谱；对所述对照样品质谱进行多变量特征分析；确定多变量特征分析的结果是否符合通过对一组参考对照质谱进行相同的多变量特征分析所确定的结果的范围，所述参考对照质谱是由(预先)在基本上相同的预定条件下制备的相同类型的对照样品获得的；以及以所述确定的结果标记由分析组织切片的空间分辨质谱生成的质谱图像，如选自下列类别中的一者：“可信的”(质量好)、“适度可信的”、“可疑的”和“不可信的”(质量差)。
在各种实施方案中，可使用下列至少一者作为对照样品：肾脏切片、肝脏切片、肌肉切片和来自包含培养细胞的组织替代物的切片。这些示例性组织类型的优点为其可以以非常一致的质量被大量供应，这在对大批的分析组织进行质谱检测时可能是有益的。虽然在任何情况下必须逐个像素地扫描各分析组织切片以便保留分析物的位置信息并且便于绘制分布图，但是从对照样品获取的质谱不一定必须是空间分辨的，特别是当使用仅包含一种同类组织类型的对照样品时不是这样。然而，在一些情况下，也可以有利地获取来自对照样品的空间分辨质谱，例如，以便可以使用统一的栅格对载有对照样品和一个或多个分析组织切片的样品支持板进行处理，并可以避免不同栅格模式之间的复杂切换。
在各种实施方案中，可以对来自当前对照样品的质谱和参考对照质谱单独地或共同地进行多变量特征分析，并且所述确定可以包括核对多变量特征分析的结果是否落入多变量特征空间的同一区域。在一些变化形式中，单独的多变量特征分析可以包括使用单类支持向量机和密度估计器中的至少一者。在其他变化形式中，共同的多变量特征分析可以包括使用主成分分析、k均值聚类和分层聚类中的至少一者。应当理解，本领域的技术人员熟悉这种数学算法，因此这里不必对其进行详细描述。此外，共同的多变量特征分析可以仅采用参考对照质谱的随机选择的子集，以便缩短计算时间。
在各种实施方案中，制备用于参考对照质谱的相同类型的对照样品的预定条件可以包括使用不同批次的相同化学试剂和不同实施方案的相同仪器类型或模式。凭借具体制备方案的这些细微变化，可以考虑到工作流程中的微小的未预见到的变化(其可能发生在日常实验室工作中)，以确保接受的范围(表示可信的(质量好)结果)不被限定得太窄。
在优选实施方案中，所述方法还可以包括获得来自相同(优选均质的)类型的参考对照样品的参考对照质谱，所述相同类型的参考对照样品与在同一样品支持物上各自与相应的对照样品一同制备的训练组织切片一起测量，其中基于特征质量信号曲线，使用来自训练组织切片的测量结果来限定组织特异性分析分类器。分析分类器可以应用于来自与训练组织切片相同组织类型的分析组织切片的空间分辨质谱(其目标区域)中。限定分析分类器可以包括使用下列至少一者：基于主成分分析的模式、线性判别分析、支持向量机、遗传算法、神经网络、决策树和随机森林算法。应当理解，本领域的技术人员熟悉这种数学算法，因此这里不必对其进行详细描述。
优选地，在获取来自(待分类的)分析组织切片的空间分辨质谱之前，获取来自对照样品的质谱的第一部分，并在获取来自(待分类的)分析组织切片的空间分辨质谱之后，获取来自对照样品的质谱的第二部分，并且其中仅在获取来自分析组织切片的空间分辨质谱之前和之后的两部分对照样品数据均符合参考对照样品数据时，质谱图像或通过将分析分类器应用于分析组织切片而得到的分类才可被接受为可信的。
在各种实施方案中，共同制备用于分析的分析组织切片和对照样品可以包括冷冻和福尔马林固定中的一者。此外，共同制备用于分析的分析组织切片和对照样品可以包括抗原修复(“解交联”)，以便获得某些目标分析物(如肽和蛋白质)，否则将无法获得某些目标分析物。另一方面，脂质通常不需要任何特殊处理，而可以或多或少地直接从组织中分析。
在各种实施方案中，共同制备用于分析的分析组织切片和对照样品可以包括将用于基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的基质物质(如α-氰基-4-羟基肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸或芥子酸)的层施加到分析组织切片和对照样品上。
在各种实施方案中，共同制备用于分析的分析组织切片和对照样品可以包括对其进行酶促消化，如胰蛋白酶消化或聚糖消化，该酶促消化基本上保持空间分布。
在各种实施方案中，可以随时间推移从不同批次的参考对照样品中反复地获得参考对照质谱，并且其中出现的任何多变量特征变化可以在数学上彼此匹配或映射。该行为过程能够跟踪随时间推移的对照样品中的多变量特征偏移(如果有的话)。
附图简要说明
通过参考以下附图能够更好地理解本发明。附图中的元件不一定按比例绘制，而是将重点放在说明本发明的原理上(通常示意性地)。
图1示出了根据本发明原理的基本方法的第一部分的示意图。
图2通过示出第二部分而接续图1的基本方法的示意图。
图3示出了如图2所示的第二部分的替代方案。
图4示出用于鉴别诊断乳腺癌组织的可能的分类器质量信号，其基于现有技术中已知的m/z 8345至8640之间的范围内的质量峰。
图5示出了使用对照样品并包括分类器训练的监控工作流程的第一部分的示意图。
图6通过示出包括实际分类器应用的第二部分而接续图5的监控工作流程的示意图。
具体实施方式
虽然已经参照本发明的许多不同的实施方案示出并描述了本发明，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离如所附权利要求所限定的本发明的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。
改进MSI样本制备工作流程监控的基本方法可以如图1所示进行，用于示例性生成用于限定接受标准的多变量特征分析的结果集(统计模式方法)。
步骤A)：优选在略微变化的条件下，在样品支持物上制备具有相同组织结构的若干参考对照样品(RCS)，所述条件例如为使用不同批次的相同化学试剂或不同实施方案的可能具有标度变化的特定仪器类型或模式，如孵育室、MALDI基质的分配器等。这样一来，所有参考对照样品均通过基本相同的样品制备方案处理，并使用预定的仪器设置在质谱仪中进行测量，如飞行时间质谱仪(qTOF、OTOF等)。为了完整起见，提出可以使用除飞行时间之外的其他原理的质量分析仪来获取质谱，如傅立叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱仪、Kingdon型质谱仪(例如购于Thermo Fisher Scientific Inc.公司的)、四极离子阱和质量过滤器，如三重四极杆质量过滤器组件。本领域技术人员应理解，本公开在这方面不应局限于任何特定的质量分析器。
优选地，合适的(参考)对照样品包括至少一小块组织，其只有极少的或理想地没有空间结构。(参考)对照样品还可以包括一种以上的组织类型，但至少一种组织类型应当理想地没有空间结构。在通常使用的1微米和100微米之间的MSI像素尺寸的规格内，具有极少空间结构的组织为(例如)来自啮齿动物的肝脏切片或肌肉切片。
有利地，用于(参考)对照样品的所讨论的组织应当以一致的质量以几乎无限的量供应。用于该目的的良好组织的最可能的选择为来自保持在标准条件下的近交啮齿动物的器官或由培养细胞制备的组织替代物。可以将此类培养细胞悬浮并旋转(或以其他方式压缩)成小球，随后(例如)通过冷冻或化学固定(如福尔马林固定)对其进行类似于待研究的分析组织切片的处理，然后将其切片以获得平的样本。如果用作参考对照样品的后期批次的组织表现出与最初使用的批次略有不同的质量信号特征，则可以使用数学变换将由新批次测量的波谱限定的多变量特征空间的区域对齐或映射到由旧批次测量的波谱限定的多变量特征空间的区域。优选地，使用来自旧批次的参考对照样品与来自新批次的参考对照样品一起进行足够数量的测量以确保一致性。
步骤B)：从不同的参考对照样品获取参考对照质谱，对于参考对照样品中的特定组织，每个参考对照样品(应该)显示出基本相同的质量信号曲线特征。质量信号曲线可能由于故意改变的制备条件而略微变化，以便考虑到实验室中的日常情况(其中也可能发生工作流程中的轻微变化)，从而确保接受标准不是太窄并且仍然有意义。
步骤C)：从参考对照样品获取的参考对照质谱现在可以用于限定来源于多变量特征分析的接受标准(虚线椭圆)，在所描述的情况下，该标准在独立分析结果(空心圆)的集合周围绘制出紧密边界。为了简化，仅示出来源于参考对照质谱中的数据的多维空间的两个维度(多变量特征：MF#1和MF#2)。然而，所提出的行为方案可以很容易地推广到具有更多维度的特征空间，如n维，其中n＝2、3、4、5......在某些(尽管不太可能)情况下，也可以将特征质量信号曲线建立在单个特征上，如参考对照质谱中是否存在单个质量峰(n＝1)。
步骤D)：储存所述接受标准以供将来使用。除了仅存储来自参考对照质谱的数据(如接受标准)，还可以另外储存原始参考对照质谱(或至少其代表性子集)，或替代地仅储存原始参考对照质谱(或至少其代表性子集)，例如，如果旨在将新获取的对照样品质谱与参考对照质谱一起进行共同多变量特征分析(参见下面的图3)。
图2示出了示例性质量监控工作流程。
步骤A)：在同一样品支持物上，将待确定质谱图像的(大部分)未知分析物组成的分析组织切片(ATS)与对照样品(CS)一起制备，该对照样品包含与先前用于测量参考对照质谱和接受标准(图1)的参考物质相同类型的参考物质。通过样品制备将它们一起处理并且在质谱仪中一起测量，样品制备包括与之前获取参考对照质谱期间基本相同的条件。同时获取分析组织切片(ATS)的空间分辨质谱会得到一个或多个目标分析物的空间映射，这里通过显示不同区域和/或特定目标区域中的不同组织类型分类的脑部切片来举例说明，对平行对照样品的研究原则上可以导致以下三种情况。
情况B1)：当前的多变量特征分析结果很好地符合先前基于来自相同类型的对照样品的测量(图1)而建立的接受区域，在这种情况下，可以将平行测量的分析组织切片的质谱图像标记为质量好或可信的(√)。
情况B2)：当前的多变量特征分析结果部分地落在接受区域以内并且部分地落在接受区域之外，因而不可能直接地将其拒绝或接受，在这种情况下，必须将平行质谱图像的质量至少标记为中等可信的或可疑的(？)。然而，如果应用非常严格的标准，则这种情况可能也被视为失败的质量试验。
情况B3)：当前的多变量特征分析结果明显在接受区域之外，因而无论如何都必须将质谱图像标记为不可信的或质量差(X)。
不言而喻，仅以示意的方式选择通过情况B1)至B3)描述示例性脑部切片，其中随着当前多变量特征分析结果与一组由接受标准限定的多变量特征分析结果的接近度增加，模糊程度增加。可能由样品制备过程中的不可预见的变化导致的分析组织切片的质量劣化可以以不同的方式表现出来，如衰落的分析物信号、降低的信噪比等。
图3示出了替代的质量评价工作流程(以及分析方法)：不是将用于测试参考对照样品的接受标准或质量标准限定为统计模型，而是还可以使用来自参考对照测量的原始参考对照质谱(上部的图)，参见图1的步骤C。然后可以将这些与获取自当前所研究的并且与未知分析物组成的分析组织切片一同测量的对照样品的对照样品波谱(CS)进行直接比较。
中部的图示出了这样的情况：所研究的对照样品测量结果很好地符合由先前获取的参考对照数据所建立的特征空间区域。在这种情况下，没有迹象表明样品制备工作流程为有缺陷的或不恰当的，并且就此而言，可以将分析组织切片的平行测量结果以及由此得到的图像标记为可信的或质量好。另一方面，下部的图示出了这样的情况：所研究的对照测量结果位于接受区域之外，从而得到这样的假设：在处理样品期间发生了不利的或至少意外的事情，作为结果，可将相关的分析组织测量结果标记为可疑的或甚至不可信的。如上所述，为此目的可以不使用所有参考对照质谱，而是还可以将数量限制为足够大的随机选择的子集，从而有利于计算时间。
图3中未示出的情况为，当前所研究的对照样品质谱的多变量特征云不是在参考对照样品云的子集中，而是部分地与其重叠。如前所述，这种情况可以导致标记为适度可信的、可疑的，或者如果应用非常严格的标准，则也为不可信的。
从该前述基本方法更进一步看来，MSI领域的技术人员应理解的是，病理学中的大多数诊断为鉴别诊断。此类鉴别诊断的一个实例为来自分析组织切片的目标区域中乳腺癌的人表皮生长因子受体2(“Her2”)状态的阳性或阴性分类，参见例如US 9,164,098B2，其整体公开内容通过引用并入本文。这种分类对随后的诊断步骤和/或患者的治疗产生影响，因而其质量非常重要。
图4以示例的方式示出了来自US 9,164,098B2的公开内容的m/z 8345至8640的质量范围内Her2阳性(n＝15)和Her2阴性(n＝15)的乳腺癌组织(发现组)的平均MALDI-TOF质谱。箭头标示了Her2阳性组和Her2阴性组之间显著不同的六个峰，质心质量为m/z 8404、8419、8455、8570、8607和8626，表明在特定组织类型的样本上训练(train)时，这些峰(无论单独地或组合地)作为生物标志物的适合性。
鉴别诊断的其他实例包括“R.Casadonte et al.，Proteomics 2014,14,956-964”，其中通过MALDI MSI研究多组织石蜡块，以用于特定肿瘤类型和鉴定预测模式，其可以从胰腺癌中辨别转移性乳腺癌，以及“S.Steurer et al.，Int.J.Cancer:133,920-928(2013)”，其中MALDI MSI已经基于患者样品在前列腺癌组织微阵列中鉴定了与TMPRSS2-ERG基因融合相关的m/z信号。所有这些示例性出版物均通过引用整体并入本文。
如果此类鉴别诊断用MSI数据完成，那么如背景技术中所述用于细菌鉴定的简单库方法不可行。相反，使用的统计方法涉及机器学习。在这些方法中，使用具有已知类别身份的训练数据。然后创建统计模型，其试图在数据中的通常技术和生物变化的背景中在不同已知类别的训练波谱之间找到特征性差别特性。为了对未知波谱进行分类，如从质谱图像的目标区域中区分健康组织和患病组织或者区分不同类型的患病组织，使用该模型来预测未知波谱的类别身份。可用于此目的的模型为基于主成分分析的模型、线性判别分析、支持向量机、遗传算法、神经网络、决策树或随机森林算法。
所述算法均为多变量技术。质谱被视为多变量数据，由于其由质谱仪的数字转换器检测，因而在最低水平上作为单个数据点的矢量。由于这些数据点彼此不是独立的，而是若干数据点一起描述了质谱信号，因而通常进行特征检测，其检测质谱信号并将信息减少至仅为检测到的信号的信息。在US 6,288,389B1中描述了这样做的一种可能的方式，其内容通过引用整体并入本文。此类“峰值检测”或“峰值拾取”对于以下解释不是严格必需的，但可能是有益的并且因此为通常所做的。
质谱的所有特征跨越多变量特征空间，每个特征限定该空间中的一个坐标。然后，训练数据集的每个质谱占据该多变量空间中的一个独立点。在分类器的训练期间，以使不同类别的训练数据能够分开的方式对多变量空间进行划分。或者换句话说，对于未知波谱的分类，测试先前已发现的指示特定组织状态的特征性质量特征是否存在于当前所研究的未知波谱中，将该波谱被映射在相同的多变量空间中，并核对该波谱位于空间的哪个分区。然后相应地对波谱进行分类。
所使用的算法(如线性判别分析)可以划分整个特征空间。在这种情况下，空间以这样的方式映射以使得有利于区分训练数据的特征被赋予高权重，并且对于区分没有贡献的特征被赋予低权重。在其他情况下，通常使用原始特征空间的子空间，其仅基于支持训练类别的区分的特征；然后忽略所有其他特征。
用于分类的常用算法划分整个多变量空间，因此会始终对其所应用的任何质谱进行分类，即使待分类的波谱与最初使用的训练数据没有相似性。这可能导致不同种类的感知到的或实际的错误分类，这对于诊断过程是不理想的。以下类型的明显错误分类或实际错误分类是可能的：
(i)应用于错误组织类型的分类：如果将分类器应用于来自未用于分类器训练的组织类型的波谱，那么即使组织类型不相关，也会分类为用于训练的类别之一。对于普通观察者来说，这似乎是一种错误的分类，但事实并非如此。这是将统计模型应用于最初未经过训练的事项的结果。在组织诊断的情况下，病理学家有责任确保分类器仅应用于正确的事项。
(ii)样品的问题：样品的预分析处理存在一些影响，其不是始终受控的，但其可能对质谱图的形状有影响。在福尔马林固定的样品的情况下，该问题可以(例如)为组织样品太大以至于未被福尔马林完全渗透。在这种情况下，质谱信号可能出现在之前未见过的区域，或者峰强度可能会发生很大变化。在这种情况下，分类器可能应用于正确的分类事项，但仍然可能被分类为错误的类别。由于分类器丢失了质谱信号的原始形状的信息，从而给出低的重点或完全忽略对分类没有贡献的特征，因而其不能检测波谱形状是否不同。为了克服这个问题，有必要独立地应用已知的方法，这些方法可以判断待分类的波谱是否与训练数据有足够高的整体相似性。
(iii)工作流程的分析性能的变化：用于质谱成像的样品的制备可涉及许多步骤。这些步骤可包括抗原修复、组织的酶促消化以释放肽或其他分析物、在MALDI的情况中施加基质层，当然还包括在质谱仪中的测量。以下出版物通过实例的方式很好地说明了MSI样品制备中的各个步骤：“K.Gorzolka et al.,Histology and Histopathology 19May 2014,29(11),1365-1376”中的图1；以及“A.Ly et al.,Nature Protocols,11,1428–1443(2016)”中的图2。所有这些步骤中的意外变化，如归因于使用不同批次的化学试剂或不同实施方案的相同仪器(其校准可能有略微偏差)，可能导致用于分类的质谱图或强度比的变化。这些变化可能不会引起注意。在这种情况下，分类器可能会应用于正确的事项和正确的样品，但仍然会给出错误的分类。
由于MSI中的分析工作流程的变化可能对质谱图的形状产生影响，因此其可能导致基于分类的分析中的错误分类。仅基于质谱图的形状或待分类的样品是不能验证从采样(如从组织块切割切片)经过样品制备到质谱测量和分类的整个工作流程的分析完整性的。这主要是因为这些样品(很大程度上)具有未知的分析物组成，并且有多种原因可以解释为什么结果可以表明分析工作流程中的问题，即使没有问题也是如此。还有一种可能性，各类别的训练波谱之间的差异非常小，而制备或测量条件中的变化可能会推动波谱跨越分类边界。在这种情况下，质谱可能与训练数据足够相似，但仍导致错误的分类。
由于所有这些原因，有利的是利用众所周知并且特征化的质谱图来判断针对(优选均质的)对照样品的工作流程的分析完整性。
可以紧邻各样品制备对照样品，其用于产生用于分类器以及待分类的未知分析物组成的分析组织切片的训练数据。还可以提供质谱样品支持物作为消耗品，其作为即用型套件已经载有此类对照样品。
然后，在同一样品支持物上，通过从制备到质谱测量的整个分析工作流程，将对照样品与分析组织切片一同进行处理，以使得(以呈现事物的方式)相同的偏差和像差(如果有的话)会以某种方式沉积在对照样品的质量特征中。
从生成分类器到分类器的诊断应用的诊断工作流程的一般方案可以如下。
在第一步骤中，对于训练群组的各测量，将训练样品与相同类型的参考对照样品一起进行处理。来自训练样品的数据用于构建分类器，如用于Her2阳性和Her2阴性状态或任何其他合适的诊断目标。保存来自参考对照样品的参考对照质谱，以便稍后在(参考)对照样品的特征空间中限定可用于比较来自当前对照样品的波谱的区域，所述当前对照样品与待使用分类器研究的分析组织切片一同测量。
当将分析组织切片分类时，如上所述，对紧临分析组织切片的相同类型的对照样品进行测量。将分类器应用于分析组织切片并产生分类，其可以将分析组织切片的某些区域与其周围区域区分开。将来自同一测量的对照样品与来自在分类器的生成期间测量的参考对照样品的参考对照质谱进行比较。如果当前对照样品所属的分析组织切片的测量结果与原始参考对照测量结果足够相似，则将分类评分为可信的或质量好，否则可将其标记为不可信的或质量差。
根据用于计算多变量特征空间中的距离的措施，还可以存在更详细的尺度用于未知组成的分析组织切片的分类的可信度，如“高度可信的”、“适度可信的”、“可疑的”和“不可信的”。甚至可以考虑连续评分。这种评分方案可以引导病理学家使用其他诊断方法进行最终诊断。由于来自分类器生成的参考对照测量和来自分析组织切片的空间分辨质谱两者都包含多个质谱，因而还有一种可能是，来自与分析组织切片一起测量的对照样品的一些质谱符合接受标准，而有些则不符合。可信度(质量)评分还可以反映能够落在置信/接受区域之外的波谱的百分比，例如，如图2的情况B2中所示。
如何确定(参考)对照测量结果彼此之间的相似性存在几种可能性。一种简单的可能性为使用单类支持向量机或(核)密度估计器建立统计模型。然后独立地对参考对照质谱进行多变量特征分析，以限定统计模型的标准，并核对当前所研究的对照质谱的相同多变量特征分析的结果是否符合该统计模型。在另外的实施方案或替代实施方案中，还可以将原始参考对照测量结果(或其代表性子集以加速计算)与新数据一起进行主成分分析，并核对两种类型的波谱是否落入特征空间的同一多维区域(类似于图3)。类似的方法可以通过聚类方法来完成，如在使用或者不使用前述的主成分分析的情况下，对参考对照数据与新数据进行k均值聚类或分层聚类。
在质谱成像领域之外，Petricoin及其同事(Petricoin et al.,The Lancet·Vol359·February 16,2002,572-577)描述了用于在患病的血清的分类中发现异常值的相关方法。然而，他们仅在用于构建分类器的原始特征空间的子空间上进行了相似性测量。因此，该方法无法看到训练数据与出现在波谱的其他区域的待分类数据之间的主要差异。
除了评价训练数据集的参考对照测量结果与待分类的波谱的对照测量结果之间的多变量相似性之外，该数据还可以用于建立和评价能够评价质谱的质量和质谱仪的性能的其他质量标准。这可以包括这些措施，如高于特定强度或信噪比阈值的质谱信号数量的集中趋势、测量期间可接受的强度偏移范围、直方图的形状或总离子数的分布密度、邻近像素中的波谱或单个质量信号的强度变化。
由于在较长的MSI测量期间(其可能适当地需要长达12小时或甚至更长时间)可能发生一些技术变化或缺陷，因而还可以在(待分类的)分析组织切片之前测量对照样品的一部分，并且在(待分类的)分析组织切片之后测量对照样品的一部分。然后，仅在测量未知的分析组织切片之前和之后的对照样品数据均通过参考对照测量结果的质量检查时，才接受数据集显示为可信的分析物分布(图像)或分类。
鉴于前述说明，可以使用可能的方式来改进用于鉴别诊断的质谱成像样品制备工作流程监控，如图5所示的示例性生成分类器和参考对照数据。
步骤A)：在同一样品支持物上，将具有已知组织类型和已知分类器状态的训练群组(TrS)的样品与对照样品(CS)一起制备。通过样品制备将TrS和CS一起进行处理并在质谱仪中一起测量，以生成参考对照质谱和相应的分类器训练质谱(未示出)。
步骤B)：来自训练类别的波谱的多变量特征分析结果(由正方形和圆形表示)用于生成分类器(虚线对角线)。为简化起见，仅示出来源于波谱数据的多维空间的两个维度(分类器多变量特征：Cl-MF#1和Cl-MF#2)。然而，所提出的行为方案可以容易地推广到更高维度的空间。
步骤C)：储存该分类器，以便将来用于鉴定其的相同类型的组织。
步骤D)：如前所述，将来自对照样品的参考对照质谱再次用于在统计模型方法中限定接受标准(虚线椭圆)。
步骤E)：储存该接受标准，以便将来用于得到其的相同类型的对照组织。
图6示出了示例性分类工作流程，其使用如先前得到的测量结果和定义。
步骤A)：在同一样品支持物上，将未知分析物组成的分析组织切片(ATS)与对照样品(CS)一起制备，所述分析组织切片包含与训练群组相同的组织类型，所述对照样品同样包含相同类型的参考对照物质。通过样品制备将ATS与CS一起进行处理并在质谱仪中一起测量。
步骤B)：将来自分析组织切片的空间分辨质谱(其多变量特征由三角形表示)用来自图5的步骤A)至C)的分类器进行分类，并产生清晰的分类结果。在一些情况下，分类结果也可能是不确定的，例如，当多变量特征群跨越不同类别之间的边界线时(图中未示出的情况)。
步骤C)：将来自对照样品的波谱与来自图5的步骤A)、D)和E)的接受/质量标准进行匹配。基于此结果，然后确定分析组织切片的分类结果是否为可信的。如前所述，参照图3的描述，不是使用统计模型作为单独的多变量特征分析的结果，而是可以对来自当前对照样品的质谱和来自参考对照样品的质谱共同进行多变量特征分析。
在以上描述中特别强调了FFPE组织切片的MALDI质谱成像。然而，本领域技术人员应理解的是，本公开的原理可以同样地应用于其他样品类型(如冷冻组织切片)以及其他电离技术(如解吸电喷雾电离(DESI)和二次离子质谱法(SIMS))，仅举几例。
大体上，以上已经参照本发明的若干不同的实施方案对本发明进行了解释和描述。然而，本领域技术人员应理解的是，在不脱离本发明的范围的情况下，如果可行的话，可以对本发明的各种方面或细节进行改变，或者可以对不同的实施方案的各种方面或细节进行任意组合。通常，前面的描述仅出于说明的目的，而不是为了限制本发明，本发明仅由所附权利要求限定，根据具体情况包括任何等同的实施方式。

Claims (20)

1.一种监控用于质谱成像的分析组织切片的样品制备工作流程的质量的方法，包括：
-提供适合于质谱成像的样品支持物；
-将所述分析组织切片和对照样品置于所述样品支持物上；
-在预定条件下共同制备用于分析的所述分析组织切片和所述对照样品；
-在同一测量运行中，获取来自所述对照样品的质谱并获取来自所述分析组织切片的空间分辨质谱；
-对所述对照样品的质谱进行多变量特征分析；
-确定所述多变量特征分析的结果是否符合通过对一组参考对照质谱进行相同的多变量特征分析所确定的结果的范围，所述参考对照质谱是由在基本上相同的预定条件下制备的相同类型的对照样品获得的，以及
-以所述确定的结果标记由所述分析组织切片的空间分辨质谱生成的质谱图像。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括使用基本上匀质的组织作为所述对照样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中使用下列至少一者作为所述对照样品：肾脏切片、肝脏切片、肌肉切片和来自包含培养细胞的组织替代物的切片。
4.根据权利要求1所述的方法，其中对来自当前对照样品的质谱和所述参考对照质谱单独地或共同地进行所述多变量特征分析，并且所述确定包括核对所述多变量特征分析的结果是否落入多变量特征空间的同一区域。
5.根据权利要求4所述的方法，其中单独的多变量特征分析包括使用单类支持向量机和密度估计器中的至少一者。
6.根据权利要求4所述的方法，其中共同的多变量特征分析包括使用主成分分析、k均值聚类和分层聚类中的至少一者。
7.根据权利要求4所述的方法，其中共同的多变量特征分析采用所述参考对照质谱的随机选择的子集，以便缩短计算时间。
8.根据权利要求1所述的方法，其中制备用于所述参考对照质谱的所述相同类型的对照样品的预定条件包括使用不同批次的相同化学试剂和不同实施方案的相同仪器类型或模式。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定条件包括暴露于液体和湿化学品中的至少一者。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在获取来自所述分析组织切片的所述空间分辨质谱之前，获取来自所述对照样品的质谱的第一部分，并在获取来自所述分析组织切片的所述空间分辨质谱之后，获取来自所述对照样品的质谱的第二部分，并且其中仅在获取来自所述分析组织切片的空间分辨质谱之前和之后的两部分对照样品数据均符合参考对照样品数据时，质谱图像才被接受为可信的。
11.根据权利要求1所述的方法，还包括获得来自相同类型的对照样品的参考对照质谱，所述相同类型的对照样品与在同一样品支持物上各自与相应的对照样品一同制备的训练组织切片一起测量，其中基于特征质量信号曲线，使用来自所述训练组织切片的测量结果来限定组织特异性分析分类器。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述分析分类器应用于来自与所述训练组织切片相同组织类型的分析组织切片的空间分辨质谱。
13.根据权利要求11所述的方法，其中限定所述分析分类器包括使用下列至少一者：基于主成分分析的模式、线性判别分析、支持向量机、遗传算法、神经网络、决策树和随机森林算法。
14.根据权利要求1所述的方法，其中共同制备用于分析的所述分析组织切片和所述对照样品包括冷冻和福尔马林固定中的一者。
15.根据权利要求14所述的方法，其中共同制备用于分析的所述分析组织切片和所述对照样品包括抗原修复。
16.根据权利要求1所述的方法，其中共同制备用于分析的所述分析组织切片和所述对照样品包括将用于基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的基质物质的层施加到所述分析组织切片和所述对照样品上。
17.根据权利要求1所述的方法，其中共同制备用于分析的所述分析组织切片和所述对照样品包括对其进行酶促消化，该酶促消化基本上保留空间分布。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述酶促消化为胰蛋白酶消化或聚糖消化。
19.根据权利要求1所述的方法，其中随时间推移从不同批次的参考对照样品反复地获得所述参考对照质谱，并且其中呈现的任何多变量特征变化在数学上彼此映射。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记选自下列类别中的一者：“可信的”、“适度可信的”、“可疑的”和“不可信的”。
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