KR20150023760A - 종양 조직 중 면역 세포를 정량화하는 방법 및 이의 사용 - Google Patents
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Abstract
하기 단계를 포함하는, 종양 조직에서 면역 세포의 수 또는 밀도를 평가하는 방법:
a) 면역 세포에 의해 발현되는 항원(마커)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여, 자동화된 슬라이드-염색 시스템에 의해 획득되는 조직 절편의 하나 이상의 면역염색된 슬라이스를 제공하는 단계;
b) 고해상 스캔 캡쳐에 의해 상기 a) 단계의 슬라이드의 디지털화를 수행하여, 분석하려는 슬라이드의 고화질(4.6 μm/픽셀 또는 그 이상) 디지털 픽쳐를 획득하는 단계;
c) 상기 디지털 픽쳐에서 조직 절편의 슬라이스를 검출하는 단계;
d) (i) 종양(CT) 및 (ii) 종양의 침습성 주변부(IM)를 규정하기 위해 조직 절편의 슬라이스를 분석하는 단계;
e) 동일한 표면을 갖는 균일분포된 유닛을 가진 크기 기준 격자를 제공하는 단계, 이때 상기 격자는 분석하려는 종양의 크기로 조정됨;
e1) 면역염색의 품질을 체크하는 단계,
f) 각 유닛의 염색된 세포를 검출하고 정량화하여, 각 유닛의 염색된 면역 세포의 수 또는 밀도를 평가하는 단계.
a) 면역 세포에 의해 발현되는 항원(마커)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여, 자동화된 슬라이드-염색 시스템에 의해 획득되는 조직 절편의 하나 이상의 면역염색된 슬라이스를 제공하는 단계;
b) 고해상 스캔 캡쳐에 의해 상기 a) 단계의 슬라이드의 디지털화를 수행하여, 분석하려는 슬라이드의 고화질(4.6 μm/픽셀 또는 그 이상) 디지털 픽쳐를 획득하는 단계;
c) 상기 디지털 픽쳐에서 조직 절편의 슬라이스를 검출하는 단계;
d) (i) 종양(CT) 및 (ii) 종양의 침습성 주변부(IM)를 규정하기 위해 조직 절편의 슬라이스를 분석하는 단계;
e) 동일한 표면을 갖는 균일분포된 유닛을 가진 크기 기준 격자를 제공하는 단계, 이때 상기 격자는 분석하려는 종양의 크기로 조정됨;
e1) 면역염색의 품질을 체크하는 단계,
f) 각 유닛의 염색된 세포를 검출하고 정량화하여, 각 유닛의 염색된 면역 세포의 수 또는 밀도를 평가하는 단계.
Description
본 발명은 종양 조직 중 면역 세포를 정량화하는 방법 및 이의 사용에 관한 것이다.
EP-A-EP1943520 및 WO2007045996에는 생존 및/또는 암의 진행에 대한 환자의 예후 및/또는 치료(화학요법, 방사선요법, 생물학적요법, 면역요법)에 대한 반응의 예측을 위한 시험관내 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 상기 환자의 종양 조직 샘플에서 상기 환자의 국소 적응 면역반응의 상태를 나타내는 하나 이상의 생물학적 마커를 정량화하는 단계; 및
b) 상기 하나 이상의 생물학적 마커에 대해 a) 단계에서 수득된 값을 동일한 생물학적 마커에 대해 기정된 기준값과 비교하는 단계, 이때 기정된 기준값은 "양호한(good) 반응자" vs "불량한(bad) 반응자"를 예상하기 위한 치료 반응(예컨대, 화학요법, 방사선요법, 생물학적요법, 면역요법)의 예측 또는 상기 환자의 생존 또는 상기 암의 진행의 특이적 예후와 상관(correlation)된 것임.
종양 조직 샘플은 (i) 전역적 원발성 종양(전체로서), (ii) 종양의 조직 샘플, (iii) 종양을 직접 둘러싼 조직의 조직 샘플, 보다 구체적으로 종양의 "침습성 주변부(invasive margin)"이라고 지칭될 수 있는 조직, (iv) 종양과 인접한 림프섬, (v) 종양과 가장 인접하여 위치한 림프절, (vi) 수술 전에 수행되는 종양 생검, 및 (vii) 원거리 전이(distant metastasis)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
생물학적 마커는 바람직하게는 a) 단계에서 종양의 2개 영역, 각각 (i) 종양(CT) 및 (ii) 종양의 침습성 주변부(IM)로부터 수집된 종양 샘플에서 정량화된다.
상기 방법은 조직 마이크로어레이(TMA)상에서 실행된다. 그러나, 상기 방법의 단계 대부분은 수동적으로 실행되며, 측정의 재현성에 대한 문제점이 관찰될 수 있다. 예를 들어 천공(punch)할 종양 영역을 선택하기 위한 병리학자들 사이에서의 차이가 헤마톡실린-에오신 대비염색 조사에 기초하여 발생할 수 있다. 또한, 병리학자에 의해 선택된 영역을 정확하게 천공하는 어려움이 관찰된다. 이와 같이 전형적인 에러가 각 단계에서 발생될 수 있다. 상기 문헌에 개시된 방법이 암 환자의 생존을 예상하기 위한 고성능을 달성할 수 있도록 할지라도, 훨씬 더 나은 품질, 특히 자동화 재현성 및 결과의 비교가능성에 관한 품질을 가진 방법들에 대한 연구가 여전히 지속되고 있다.
문헌 [Quantification of prognostic immune cell markers in colorectal cancer using whole slide imagining tumour maps, Analytical and Quantitative Cytology and Histology, Vol. 32, 6, Dec 2010, pp.333-340]에서 Halama 등이 강조한 바와 같이, 조직 마이크로어레이(TMA)를 이용한 조직학적 프로브의 샘플링은 암 조직에서 종종 관찰되는 바와 같이 표적 분자의 공간적 이질성의 경우 특히 문제된다. Halama 등은 데이터 획득을 위해 완전(full) 조직 슬라이드 현미경검사를 제안한다. 그러나, 상기 연구는 종양의 공간적 이질성을 설명할 수 있는 파라미터를 만들어내는 특이적 진단 알고리즘을 입증하지 못한다. 상기 연구자는 이러한 진단 알고리즘이 생성되고 후속 연구가 수행되기 전까지는 종양 맵(map)이 단일 환자에게서 예후 값을 가질지 여부를 알 수 없다는 결론을 내렸다.
Quantification of prognostic immune cell markers in colorectal cancer using whole slide imagining tumour maps, Analytical and Quantitative Cytology and Histology, Vol. 32, 6, Dec 2010, pp.333-340
본 출원인은 암을 앓는 환자의 면역 스코어(immune score)(또는 면역스코어(immunoscore))를 획득하기 위해 종양 조직에서 면역 세포의 수 또는 밀도를 평가(assessment)하는 방법을 개발하였다.
종양 조직에서 면역 세포의 수 또는 밀도를 평가하는 새로운 방법을 사용할 경우 WO2007045996에 개시된 방법의 자동화, 반복성 및 재현성이 보장되며, 이에 따라 암 환자의 생존 및 치료 반응을 예상하기 위한 연구실간 테스트를 위한 표준 테스트 방법이 제공된다는 것은 놀랍고도 예측할 수 없는 것이다.
상기 새로운 방법은 특히 EP-A-EP1943520 및 WO2007045996의 방법과 비교할 때 반복성 및 재현성에 대해 특히 문제점이 거의 없다.
따라서, 본 발명의 주제는 종양 조직에서 면역 세포의 수 또는 밀도를 평가하는 방법이며, 하기 단계를 포함한다:
a) 면역 세포에 의해 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여, 자동화된 슬라이드-염색 시스템에 의해 획득되는 조직 절편(section)의 하나 이상의 면역염색된(immunostained) 슬라이스를 제공하는 단계;
b) 고해상(high resolution) 스캔 캡쳐에 의해 상기 a) 단계의 슬라이드의 디지털화를 수행하여, 분석하려는 슬라이드의 고화질(high definition)(4.6 μm/픽셀 또는 그 이상) 디지털 픽쳐(digital picture)를 획득하는 단계;
c) 상기 디지털 픽쳐에서 조직 절편의 슬라이스를 검출하는 단계;
d) (i) 종양(CT) 및 (ii) 종양의 침습성 주변부(IM)를 규정(defining)하기 위해 조직 절편의 슬라이스를 분석하는 단계;
e) 동일한 표면을 가진 균일분포된(uniformly distributed) 유닛(unit)을 가진 크기 기준 격자(grid)를 제공하는 단계, 이때 상기 격자는 분석하려는 종양의 크기로 조정됨;
f) 각 유닛의 염색된 세포를 검출하고 정량화하여, 각 유닛의 염색된 면역 세포의 수 또는 밀도를 평가하는 단계.
통상적으로 상기 항체는 면역 세포에 의해 발현되는 단백질에 대해 특이적이며, 특히 면역 세포 표면 마커에 대해 특이적이다. 예를 들어, 항체는 WO2007045996에 개시된 바와 같은 마커에 대해 특이적일 수 있으며, 고려되는 면역 세포는 B 세포, 바람직하게는 T 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 T 세포는 하위그룹 CD3+ 세포(T 세포), CD8+ 세포 또는 GZMB+ 세포(세포독성 T 세포), CD4+ 세포(T 헬퍼 세포), CD45RO+ 세포(기억 T 세포)의 T 세포이다. 특정 구현예에서, 항체는 CD3, CD4, CD8, CD20, CD45RO, 및 GZMB 마커에 대해 특이적이다.
둘 이상의 마커들이 사용될 때, 상기 단계들은 바람직하게는 각각의 마커에 대해 개별적으로 실행된다. 예를 들어, 항-CD3 항체가 조직의 하나의 슬라이스에 대해 사용되고, 조직의 다른 슬라이스, 바람직하게는 조직의 인접 슬라이스에 대해 항-CD8 항체가 사용된다. 다른 마커를 검출하기 위해 사용되는 항체가 다르게 염색되는 경우, 복수(예를 들어, 이중) 검출이 선택적으로 행해질 수 있다. 따라서, 하나의 검출가능한 시그널은 각각의 마커에 대해 이용가능하다.
면역조직화학 또는 IHC는 생물학적 조직에서 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항체의 원리를 이용하여, 조직 절편의 세포에서 항원(일반적으로, 단백질)을 검출하는 통상의 방법을 나타낸다. 면역조직화학 염색에 의해 항체-항원 상호작용을 가시화할 수 있다. 이는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 가장 흔한 경우에, 항체는 색-생성 반응을 촉매할 수 있는 효소, 페록시다아제에 컨쥬게이트될 수 있다. 선택적으로, 항체는 플루오레세인 또는 로다민과 같은 형광단에 태그될 수도 있다.
통상적으로, 본 발명에서 사용되는 항체는 상업적으로 이용가능하다. 특히, 본 발명의 방법을 수행하기 위해 CD3 마커가 선택될 때, Roche Ventana(Tucson, AZ, USA)에서 시판되는 2GV6 항체가 적합할 수 있다(Chetty R, et al., J Pathol. 173(4): 303-307, 1994). 특히, 본 발명의 방법을 수행하기 위해 CD8 마커가 선택될 때, Dako(Denmark)에서 시판되는 C8/144B 항체가 적합할 수 있다(Mason DY, Cordell JL, Gaulard P, Tse AGD, Brown MH. Immunohistological detection of human cytotoxic/suppressor T cells using antibodies to a CD8 peptide sequence. J Clin Pathol 1992:45:1084-8).
본 방법을 수행할 때 둘 이상의 마커가 검출될 수 있다. 특정 구현예에서, 다음과 같은 조합들이 사용될 수 있다: CD3+CD8, CD3+CD45RO, CD3+CD20, CD3+GZMB, CD8+CD20, CD8+GZMB, CD8+CD45RO, CD20+GZMB, CD20+CD45RO, GZMB+CD45RO, CD4+CD8, CD4+CD45RO, CD4+GZMB, CD4+CD20, 및 CD3, CD8, CD20, CD45RO, CD4 및 GZMB 마커 중에서 3개 마커의 모든 조합들. 본 발명을 수행하기 위한 바람직한 조건하에서, CD3+CD45RO, CD8+CD45RO 및 CD3+CD8 조합들이 가장 바람직하며, 특히 후자가 더 바람직하며, 그 이유는 항체와 함께 획득되는 낮은 백그라운드 염색에 기인한 것이다.
다양한 종류의 종양들의 조직 절편이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 종양 조직 샘플에는 (i) 전역적(global) 원발성 종양(전체로서), (ii) 종양의 조직 샘플(생검), (iii) 절제된(resected) 종양 샘플, 및 (iv) 원거리 전이 샘플이 포함된다.
조직 절편의 염색된 슬라이스로 제공되는 하나 이상의 슬라이드가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일반적으로, 염색이 불량하게 나타나지 않는다면, 하나의 단일 슬라이드가 하나의 마커에 대해 충분하다.
예를 들어, 자동화 염색된 슬라이드 제조가 가능한 BenchMark® XT와 같은 IHC 자동화가 상기 a) 면역조직화학 염색 단계를 수행하기 위해 사용될 수 있다.
상기 a) 단계의 슬라이드의 디지털화는, 표준크기(26 mm x 76 mm) 슬라이드를 스캐닝할 수 있는 예를 들어 고해상 Hamamatsu NanoZoomer® 2.0-HT 스캐너를 이용하여 스캔 캡쳐에 의해 수행된다. 이러한 스캐너는 고화질 디지털 픽쳐(x20: 0.46 μm/픽셀이 바람직함) 및 (x40: 0.23 μm/픽셀)을 제공한다.
검출, 즉 디지털 픽쳐상에서 조직 절편의 슬라이스의 경계를 규정하는 것은 당업계의 통상의 기술자, 일반적으로 의사에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 적합한 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다.
(i) 종양(CT) 및 (ii) 종양의 침습성 주변부(IM)의 경계를 규정하기 위해 조직 절편의 슬라이스를 분석하는 것도 의사에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 적합한 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 건강한 조직, 종양, 및 그들 사이의 침습성 주변부에 상응하는 3개의 영역이 일반적으로 획득된다.
바람직하게는, 상기 단계 이전에, 조직 절편의 슬라이스는 검출되는 요소 및 영역의 입상도, 형태, 크기, 대비염색을 이용하여 색상, 강도, 조밀도, 기공도(emptiness), 조직 밀도, 핵 밀도의 하나 이상과 같은 기준에 따라 성질이 유사한 영역들로 나누어진다.
e) 단계에서, 분석하려는 종양의 크기로 조정된(adapted) 기준 격자가 제공된다. 바람직하게는 육각형, 정사각형 또는 직사각형 메시 격자가 사용된다. 정사각형 메시 격자가 특히 바람직하다.
하기에서는 "유닛(unit)"이라고 지칭될 개별 메시(mesh)의 표면은 예를 들어 2.5·10-9 m2 내지 25·10-6 m2, 바람직하게는 10·10-9 m2 내지 1000·10-9 m2, 특히 100·10-9 m2 내지 1000·10-9 m2, 더욱 특히 300·10-9 m2 내지 800·10-9 m2, 및 매우 특히 약 650·10-9 m2이다.
10·10-9 m2 내지 1000·10-9 m2, 특히 100·10-9 m2 내지 1000·10-9 m2, 더욱 특히 300·10-9 m2 내지 800·10-9 m2, 매우 특히 약 650·10-9 m2의 표면을 갖는 육각형, 정사각형 또는 직사각형 유닛이 바람직하다.
길이 500 내지 1000 μm, 바람직하게는 약 800 μm의 사이드(side)를 가진 정사각형 메시 기준 격자가 가장 바람직하며, 그 이유는 상기 영역에서 면역 세포의 적절하게 대표적인 평균이 1 내지 5000개 세포이기 때문이다.
바람직한 기준 격자는 예를 들어 2 내지 5000개, 바람직하게는 10 내지 2000개, 특히 100 내지 1000개, 더욱 특히 400 내지 700개 유닛을 제공한다.
길이 약 800 μm의 사이드를 가진 400 내지 700 정사각형 형태의 유닛들이 있는 격자가 가장 바람직하다.
상기 유닛은 샘플의 전 표면을 커버한다.
관심대상인 세포의 밀도는 조직 샘플의 표면적의 유닛 당, 예를 들어 mm2당, 카운팅되는 상기 관심대상 세포의 수로서 표현될 수 있다. 또한, 관심대상인 세포의 밀도는 총 세포 또는 총 세포 부분모집단(100%로 설정됨) 당 특이적 세포 부분집합(예컨대 CD3+ T 세포)의 퍼센트로 이루어질 수 있다. 본 발명의 방법의 g) 단계에서, 사용되는 각각의 생물학적 마커에 대해 하나보다 많은 정량화 값을 획득하는 것은, 생물학적 마커 당 오직 하나의 정량화 값이 결정되는 경우에 비해, 더 정확한 최종 암 예후 또는 치료 반응의 예측을 가능하게 한다.
종양 조직에서 면역 세포의 수 또는 밀도를 평가하는 방법에 대해, 염색의 품질이 획득된 결과들의 정확도를 위한 중요한 파라미터일 수 있는 추가 단계가 후속되는 경우, 조직의 슬라이스를 염색하는 품질을 체크하는 것은 중요하다.
따라서, 본 발명을 수행하는 바람직한 조건하에서, 상기 방법에는 조직의 슬라이스를 염색하는 품질을 체크하는 e1) 단계가 더 포함된다.
염색의 품질을 체크하는 것은, 바람직하게는 적합한 소프트웨어를 이용하여, 각각의 유닛에 대해 검출되는 양성 세포의 염색 강도(intensity)의 분포를 산출함으로써 그리고 상기 분포를 나타내는 전체 종양 영역에 대해 산출함으로써 수행될 수 있다.
종양 영역에서 검출되는 모든 양성 염색 세포들의 관련(예컨대, 갈색) 염색 강도의 평균값, 중간값(median), 최소값 및 최대값은 분석하려는 각 슬라이드에 대해 산출되고 제공될 수 있다.
염색 강도의 값 및 분포는 각 마커에 대해 결정되는 기준(정상(normal) 범위 강도)와 비교될 수 있다.
검출 단계 f)에서, 각 유닛의 양성 세포의 수가 카운팅된다. 각 유닛의 표면이 알려지므로, 표면 유닛 당 양성 세포의 밀도가 또한 알려진다. f) 단계는 당업계의 통상의 기술자, 일반적으로 의사에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 적합한 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법에 의해, 환자의 종양 조직 샘플에서, 암에 대한 상기 환자의 면역반응 상태를 나타내는 하나 이상의 생물학적 마커를 정량화할 수 있다.
상기 방법은 기대 생존에 따라 또는 암 치료에 대한 반응에 따라 환자들을 그룹으로 분리하기 위해 사용될 수 있다. 상기 값은, 사용된 각각의 생물학적 마커에 대해, 동일한 생물학적 마커에 대한 기정된 기준값(predetermined reference value)과 비교될 수 있으며; 이때 기정된 기준값은 상기 암의 진행의 특이적 예후 및/또는 환자의 생존 및/또는 암 치료에 대한 반응("양호한(good) 반응자" vs "불량한(bad) 반응자")과 상관된 것이다.
하기의 파라미터가 주어진 마커에 대해 각 유닛의 염색된 세포를 정량화하기 위해 사용될 수 있다:
- 염색된 세포의 총 수
- 표면 유닛(surface unit) 당 염색된 세포의 밀도
- 단리된 염색된 세포(다른 염색된 세포와 접촉되어 있지 않음)의 총 수
- 염색된 세포들의 클러스터(적어도 1개의 염색된 세포가 최소 3개의 염색된 세포와 접촉되어 있음) 내에서 염색된 세포의 총 수
본 발명을 수행하기 위해 바람직한 조건하에서,
- 종양의 각 영역(CT 및 IM)이 분석된다.
- 각 유닛의 염색된 세포의 밀도가 측정된다.
- 검출되는 염색된 세포의 밀도에 따라 그리고 단계적변화(gradation), 예를 들어 녹색에서 적색으로(최소 밀도로부터 최대 밀도까지)에 따라, 색이 각 유닛으로 할당된다. 이 단계들은 바람직하게는 적합한 소프트웨어에 의해 수행된다.
바람직하게는, 각 종양 영역(CT 및 IM)에서 염색된 세포의 밀도는, 최대 밀도를 가진, 1 내지 1000개의 유닛, 바람직하게는 2 내지 100개의 유닛, 더 바람직하게는 3 내지 10개의 유닛, 가장 바람직하게는 3개의 유닛의 평균 밀도에 의해 결정된다. 최대 밀도를 가진 유닛의 선택은 바람직하게는 적합한 소프트웨어에 의해 수행된다. 하나의 값이 CT 및 IM 영역의 각각에 대해 획득된다. 상기 값이 역치(threshold) 값보다 더 높다면, 샘플은 양성으로 고려된다. 따라서, 단일 마커에 대해, 4개의 가능성이 가능하다: CT+ 및 IM+, CT- 및 IM-, CT+ 및 IM-, CT- 및 IM+. 둘 이상의 CD3, CD8, CD20, CD45RO, 및 GZMB 마커가 사용될 때, 제2마커에 대해 동일한 가능성이 가능하다.
본 발명자들은, 참작되는 유닛의 표면의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상이 세포들로 채워진다면 상기 방법이 신뢰성있다는 점을 발견하였다.
여러 유닛들의 평균 밀도 외에 다른 기준들이 가능하며, 바람직하게는 A, B 및 C 그룹의 하위기준의 조합에 기초하는 기준이 가능하다.
A 그룹
1. 양성 세포의 최대 수(양성 세포는 소프트웨어에 의해 검출되는 염색된 세포를 나타냄)
2. 양성 세포의 최대 밀도
3. 양성 세포의 수의 합
4. 양성 세포의 표면의 합
5. 양성 세포의 밀도의 합
6. 양성 세포의 평균 수
7. 양성 세포의 평균 밀도
8. 양성 세포의 최대 수
9. 양성 세포의 중간(median) 수
10. 양성 세포의 중간(median) 밀도.
A 그룹에서, 기준 2, 5, 7 및 10이 바람직하며, 그 이유는 이 기준들이 분석되는 조직의 표면을 참작하기 때문이다.
B 그룹
1. 단일 양성 세포
2. 3개 이상의 양성 세포를 함유하는 클러스터에서 양성 세포
3. 3개 이상의 양성 세포를 함유하는 클러스터 또는 단일 양성 세포
4. 모든 양성 세포
5. 가장 양성인 유닛, 바람직하게는 3개의 양성 유닛
6. 랜덤 유닛, 바람직하게는 3개의 랜덤(random) 유닛.
B 그룹에서, 기준 4 및 5가 바람직하며, 그 이유는 이 기준들이 검출되는 모든 양성 세포를 참작하고 3개의 가장 염색된 유닛을 선택함으로써 이질성을 감소시키기 때문이다. 다른 측면에서, 50개의 랜덤 유닛에 대해 3개를 사용하는 것은 전체 종양을 정량화하는 것을 피할 수 있기 때문에 이러한 과정에 의해 매우 신속한 결과를 얻을 수 있다. 염색된 슬라이드의 분석 결과는 10-100배 더 빠르다.
C 그룹
1. 종양 영역 CT
2. 종양 영역 IM
3. 종양 영역들 CT 및 IM
C 그룹에서, 기준 3 "종양 영역들 CT 및 IM"이 바람직하며, 그 이유는 이 방법이 환자를 식별함에 있어서 가장 강력하기 때문이며, 그룹 중에서 위험 비율(Hazard Ratio)이 가장 높다.
상기 기준의 조합들의 예에는 예를 들어 CD3과 같은 세포 마커에 대해 하기의 것들이 포함된다:
| 기준의 조합 | A 그룹 | B 그룹 | C 그룹 |
| C1 | 7 | 4 | 3 |
| C2 | 7 | 5 | 3 |
| C3 | 10 | 4 | 3 |
| C4 | 10 | 5 | 3 |
| C5 | 6 | 4 | 3 |
| C6 | 6 | 5 | 3 |
| C7 | 9 | 4 | 3 |
| C8 | 9 | 5 | 3 |
| C9 | 4 | 4 | 3 |
| C10 | 4 | 5 | 3 |
| C11 | 3 | 4 | 3 |
| C12 | 3 | 5 | 3 |
| C13 | 5 | 4 | 3 |
| C14 | 5 | 5 | 3 |
| C15 | 7 | 4 | 2 |
A 그룹의 하위기준이 양성 세포의 중간 수인 기준의 조합의 다른 예에는, 예를 들어 다음의 것들이 포함된다:
1 - 종양 영역 CT 및 IM에서 유닛의 총 표면의 40% 이상인 조직 표면을 갖는 유닛에서, 양성 세포(단일 세포 또는 3개 이상의 세포를 함유하는 클러스터)의 중간 수
2 - 종양 영역 CT 및 IM에서 유닛의 총 표면의 40% 이상인 조직 표면을 갖는 유닛에서, 양성 세포(단일 세포)의 수
3 - 종양 영역 CT 및 IM에서 유닛의 총 표면의 40% 이상인 조직 표면을 갖는 유닛에서, 양성 세포(3개 이상의 세포를 함유하는 클러스터에서)의 중간 수
4 - 종양 영역 CT 및 IM에서 유닛의 총 표면의 40% 이상인 조직 표면을 갖는 유닛에서, 양성 세포(단일 세포 또는 3개 이상의 세포를 함유하는 클러스터)의 밀도의 중간값
5 - 종양 영역 CT 및 IM에서 유닛의 총 표면의 40% 이상인 조직 표면을 갖는 유닛에서, 양성 세포(단일 세포 또는 3개 이상의 세포를 함유하는 클러스터에서)의 수의 합의 중간값
6 - 종양 영역 CT 및 IM에서 유닛의 총 표면의 40% 이상인 조직 표면을 갖는 유닛에서, 양성 세포(단일 세포)의 수의 합의 중간값
7 - 종양 영역 CT 및 IM에서 유닛의 총 표면의 40% 이상인 조직 표면을 갖는 유닛에서, 양성 세포(3개 이상의 세포를 함유하는 클러스터에서)의 수의 합의 중간값
8 - 종양 영역 CT 및 IM에서 유닛의 총 표면의 40% 이상인 조직 표면을 갖는 유닛에서, 양성 세포(단일 세포 또는 3개 이상의 세포를 함유하는 클러스터에서)의 밀도의 합의 중간값
9 - 종양 영역 CT 및 IM에서 유닛의 총 표면의 40% 이상인 조직 표면을 갖는 유닛에서, 양성 세포(단일 세포 또는 3개 이상의 세포를 함유하는 클러스터에서)의 평균 수의 중간값
10 - 종양 영역 CT 및 IM에서 유닛의 총 표면의 40% 이상인 조직 표면을 갖는 유닛에서, 양성 세포(단일 세포)의 평균 수의 중간값.
상기 기준의 조합 각각에 대해, 그리고 각각의 마커(예컨대, CD3, CD4, CD8, CD20, CD45RO, 또는 GZMB 마커)에 대해, 샘플이 상기 기준에 양성 또는 음성으로서 고려되는지 여부를 알 수 있도록 하는 역치 값이 결정된다.
각 영역에서 각 마커에 대해, 각 방법에 대해, 역치 값이 결정된다. 역치 값은, 상기 암 환자의 코호트를 이용하여, 그리고 임의의 역치, 코호트(cohort)의 평균 또는 중간값에 대한 역치를 참작하여, 또는 바람직하게는 환자를 식별하는 최적의 p-값, 또는 환자를 식별하는 최적의 위험 비율, 또는 환자를 식별하는 최적의 iAUC 값을 이용하여, 결정된다.
예를 들어 CD3에 대해, 적절한 값들은 다음과 같다:
| 기준의 조합 번호 | 값 |
| C1 | 1232 |
| C2 | 463 |
| C3 | 368 |
| C4 | 2839. |
| C5 | 56198 |
이들 값들은 시그널 강도 역치 또는 세포 검출과 같이 사용되는 소프트웨어의 조정 보정(calibration), 및 분석하려는 환자의 유형(원발성 종양, 전이), 암 단계 I, II, III, IV, 시험되는 종양의 유형(결장, 유방, 폐, 흑색종 등)에 기초한 조정에 따라 변화된다.
각 마커에 대한 각각의 기준 역치 값은 하기 단계를 포함하는 방법을 수행하여 기정될 수 있다:
m) 하기로 이루어진 군에서 선택된 종양 조직 샘플의 하나 이상의 컬렉션(collection)을 제공하는 단계:
i) 항암 치료를 받고, 그 후 암 악화 또는 암 재발이 없는, Tis, 또는 T1, 또는 T2, 또는 T3 또는 T4 및 N0, 또는 N1, 또는 N2, 또는 N3 및 M0 또는 M1으로서 통상 분류되는 암 환자의 종양 조직 샘플의 컬렉션,
ii) 항암 치료를 받고, 그 후 암 악화 또는 재발이 있는, Tis, 또는 T1, 또는 T2, 또는 T3 또는 T4 및 N0, 또는 N1, 또는 N2, 또는 N3 및 M0 또는 M1으로서 통상 분류되는 암 환자의 종양 조직 샘플의 컬렉션;
n) 상기 m) 단계에서 제공된 종양 조직 샘플의 컬렉션에 포함되는 각각의 종양 조직 샘플에 대해 상기 생물학적 마커를 정량화하여, 상기 생물학적 마커 및 상기 종양 조직 샘플의 컬렉션에 대한 정량 값의 컬렉션을 획득하는 단계;
o) 상기 n) 단계의 말기에 획득된 상기 정량 값의 컬렉션으로부터 상기 생물학적 마커에 대한 평균 정량 값을 산출하여, 특이적 암 예후 또는 치료에 대한 반응과 상관되는 상기 생물학적 마커에 대한 기정된 기준값을 획득하는 단계. 상기 m) 단계의 정의와 관련하여 "항암 치료"는 방사선요법, 화학요법, 생물학적요법, 면역요법 및 수술, 예컨대 종양의 절제 수술을 포함하는, 종양 조직 샘플을 컬렉팅하는데 앞서 암 환자에게 행해진 임의 유형의 암 요법을 나타낸다.
최소 통계적 유의값의 측면에서, 역치 기준값은 일범위의 값일 수 있다. 예를 들어, 1 내지 10의 가상적 스케일에 대해, 이상적인 역치가 5라면, 적합한(본보기가 되는) 범위는 4-6일 수 있다. 따라서, 5보다 큰 값은 예를 들어 양호한 예후를 나타내고 5보다 적은 값은 예를 들어 불량한 예후를 나타내는 값들을 비교하여 환자가 평가될 수 있거나; 또는 4-6 범위보다 큰 값은 예를 들어 양호한 예후를 나타내고 4-6 범위보다 적은 값은 예를 들어 불량한 예후를 나타내고 4-6 범위 내에 있는 값은 중간 예후를 나타내는 값들을 스케일상에서 비교하여 환자가 평가될 수 있다.
상기 역치 값을 결정하기 위한 방법의 o) 단계의 바람직한 특정 구현예에서, 환자의 실제 임상 결과와 관련된 상기 정보는 (i) 무병 생존(disease-free survival: DFS)의 기간 및 (ii) 전체 생존(overall survival: OS)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
기대되는 생존에 따라 환자들을 분리하기 위하여, 하나보다 많은 생물학적 마커에 대한 기정된 기준값의 이용가능성이 바람직하다. 따라서, 일반적으로, 하나 이상의 기정된 기준값(들)은, 복수의 생물학적 마커들에 대해 전술한 기정된 기준값들을 얻기 위한 방법들 중 어느 하나를 단순 반복함으로써, 본 발명에 포함되는 암에 대한 면역 반응의 상태를 나타내는 복수의 생물학적 마커들에 대해 결정된다.
바람직한 기정된 기준값은, 불량한 암 예후와 양호한 암 예후 사이에서 구별하는 관심대상 생물학적 마커에 대해 중간 정량 값으로 이루어진다.
특이적인 기정된 기준값의 정확도는, 특이적 생물학적 마커에 대한 정량 값을 얻기 위해 그리고 이에 따라 특이적 암 결과와 연관되는 평균 값(기정된 기준값)을 산출하기 위해 사용되는 조직 샘플의 수에 따라 증가한다. 바람직하게는, 관심대상인 생물학적 마커 각각에 대해 고도로 관련되는 기정된 기준값을 얻기 위한 측면에서, 상기 기정된 기준값은 특이적 임상 결과를 겪었던 동일한 복수의 암 환자로부터 유래된 조직 샘플상에서 측정된 상기 마커의 복수의 정량 값의 평균 값으로 이루어진다.
더 바람직하게는, 정확한 기정된 기준값을 평가하기 위하여, 기준값은 특이적 생물학적 마커에 대해 50개 이상의 정량 값들로부터, 따라서 진단으로부터 5년 이상 후의 DFS 또는 OS와 같은 특이적인 양호 또는 불량 임상 결과를 겪었던 50명 이상의 암 환자로부터 유래된 조직 샘플을 이용하여, 기정된다. 바람직한 구현예에서, 기정된 기준값은 특이적 생물학적 마커에 대해 적어도 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 또는 그 이상의 정량 값들로부터 수득된다.
기준값을 기정하기 위한 또다른 구현예들은 EP-A-EP1943520 및 WO2007045996에 개시되어 있다.
본 발명의 가장 바람직한 방법은 완전 컴퓨터화된 방법이다.
상기 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다:
종양 조직 샘플이 제조된다. 상기 종양 조직 샘플은 바람직하게는 포르말린에 고정되고 파라핀(왁스) 또는 에폭시와 같은 리지드 정착액(rigid fixative)에 포매되고, 이는 주형내에 위치되고, 그 후 경화되어 용이하게 커팅되는 블록을 생성한다. 재료의 얇은 슬라이스가 마이크로톰을 이용하여 제조되고, 유리 슬라이드 위에 위치되고, 예를 들어 염색된 슬라이드를 얻기 위해 BenchMark® XT와 같은 IHC 자동화를 이용하여, 면역조직화학법이 행해진다. 만일 여러 마커들이 고려되어진다면, 다르게 염색된 슬라이드가 제조된다.
각각의 유닛의 종양내 면역 세포의 수 또는 밀도가 상기 방법에 따라 평가되었을 때, 상기 기준의 조합 중 하나가 선택되고, 마커 또는 각각의 마커에 대해 값이 수득된다. 상기 수득된 값은 기준의 조합 및 마커의 역치/기준값과 비교된다.
상기 수득된 값이 역치/기준값보다 크다면, 종양은 "+" 또는 "높음(high)"과 같은 인용구가 할당되고, 상기 수득된 값이 역치/기준값보다 작다면, 종양은 "-" 또는 "낮음(low)"과 같은 인용구가 할당된다.
단일 마커에 의해 상기 방법을 실행하고 CT와 IM을 개별적으로 고려할 때, 종양 및 따라서 환자는 높음/높음, 높음/낮음, 낮음/높음, 낮음/낮음일 수 있다. 환자의 3개 카테고리가 획득될 수 있다: "2 높음", "1 높음", "0 높음". 이러한 경우, 0에서 2까지의 면역 스코어(또는 면역스코어)가 획득될 수 있다.
2개 마커에 의해 상기 방법을 실행하고 (바람직하게는) CT 또는 IM을 고려할 때, 종양 및 따라서 환자는 또한 높음/높음, 높음/낮음, 낮음/높음, 낮음/낮음일 수 있다. 환자의 3개 카테고리가 획득될 수 있다: "2 높음", "1 높음", "0 높음". 이러한 경우에도, 0에서 2까지의 면역 스코어(또는 면역스코어)가 획득될 수 있다.
2개 마커에 의해 상기 방법을 실행하고 CT 및 IM을 개별적으로 고려할 때, 종양 및 따라서 환자는 높음/높음/높음/높음, 낮음/낮음/낮음/낮음, 높음/높음/높음/낮음, 높음/높음/낮음/낮음, 및 높음/낮음/낮음/낮음일 수 있다. 3개의 후자에 대해, 마커 및 양성 영역 CT 또는 IM과 무관하게 평가가 이루어질 수 있다.
임의의 관습이 사용될 수 있다. 예를 들어 "+", "양성", "높음", "Hi"는 동일한 결과(다수의 염색된 세포들)를 평가하기 위해 등가를 갖는다.
이러한 경우, 0 내지 4 범위의 면역 스코어(또는 면역스코어)가 다음과 같이 요약될 수 있다:
스코어 4: 4개의 "높음" 평가
스코어 3: 3개의 "높음" 평가
스코어 2: 2개의 "높음" 평가
스코어 1: 1개의 "높음" 평가
스코어 0: 0개의 "높음" 평가.
본 발명에 따른 방법은 재현성, 반복성, 및 규칙적인 방식으로 본 방법을 수행하는 가능성 때문에 유리한 특질을 갖는다.
본 발명의 방법에 의해, 조직 마이크로어레이(TMA)로 제한되는 정보 뿐만 아니라 원한다면 전체 종양에 대한 수치 값들을 얻을 수 있다.
본 발명의 범위는 하기에 주어지는 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 수 있을 것이며, 실시예는 본 발명의 이점을 설명하기 위한 목적으로 제시된다.
본 발명의 주제는 또한 기준 역치 값을 포함하는 지지체(support)를 포함하는 상기 방법을 실행하기 위한 키트이다.
본 발명의 추가적인 주제는 상기 방법을 실행하기 위한 소프트웨어를 제공하는 컴퓨터이다.
전술한 방법을 실행하기 위한 바람직한 조건들은 또한 상기에서 고려되는 본 발명의 다른 주제들, 특히 상기 방법을 실행하기 위한 키트에 적용된다.
도 1은 디지털 픽쳐상에서 검출된 조직 절편의 슬라이스의 사진을 나타낸다.
도 2는 하나 또는 수개의 기준에 따라, 유사한 성질의 영역들로 나눠진 도 1의 조직 절편의 슬라이스의 사진을 보여준다.
도 3은 종양과 종양의 침습성 주변부가 규정된 사진 2와 유사한 사진이다.
도 4는 조직 절편의 3개 영역, 즉 상단부에서 종양, 하단부에서 건강한 조직, 및 이들 영역 사이에서 침습성 주변부를 보여주는 사진이다.
도 5는 분석하려는 종양(종양 및 침습성 주변부)의 크기로 조정된 정사각형 형태의 유닛을 가진 크기 기준 격자를 보여준다. 종양은 회색이고, V 형태이다.
도 6은 전형적 유닛의 사진이다. 검은 도트(dot)는 염색된 세포, 즉 마커를 함유하는 세포에 상응한다.
도 7은 소프트웨어에 의해 검출된 모든 양성 세포에 대한 갈색 염색의 강도의 함수로서 하나의 격자 유닛에 대해 획득된 염색의 품질을 보여주는 대표적 커브를 나타낸다. 염색 품질의 평가는 바람직하게는 조직 절편의 모든 유닛들에 대해 실행된다.
도 8은 종양의 사진이다. 주어진 유닛에서 염색된 세포의 수에 따라, 다소간 어두운 색이 소프트웨어에 의해 할당되었다.
도 9는 도 6의 부분 확대도이며, 염색된 세포(검은색)가 더 잘 입증된다.
도 10은 본 발명을 수행하기 위한 시스템의 블록 다이아그램이다.
도 11 및 12는 본 발명에 따른 방법의 단계들을 실행하기 위한 과정의 하나의 예를 나타내는 프로그래밍 플로우 다이아그램이다.
도 13은 실시예 2의 정량화 방법, 특히 종양 절편에서 CD3+ 세포의 검출을 나타낸다(결장암의 전체 슬라이드 분석). 상단부 도면: 조직 샘플, 종양 및 침습성 주변부의 경계, 다음 도면 조직 절편은 3개의 영역, 즉 상단부 우측에서 종양, 좌측 및 하단부 우측에서 건강한 조직, 및 가장 밝은 영역에서 침습성 주변부로 나누어진다.
도 14는 실시예 2의 정량화 방법, 특히 종양 절편에서 CD8+ 세포의 검출을 나타낸다(결장암의 전체 슬라이드 분석). 상단부 도면: 조직 샘플, 종양 및 침습성 주변부의 경계, 다음 도면 조직 절편은 3개의 영역, 즉 상단부 우측에서 종양, 좌측 및 하단부 우측에서 건강한 조직, 및 가장 밝은 영역에서 침습성 주변부로 나누어진다.
도 15는 무병 생존에 대한 p 값의 연관에 따른 최적의 역치 값의 산출을 나타내며(로그 순위 검정), p 값 vs 20 내지 2000개 CD3+세포/mm2의 밀도를 보여준다.
도 16은 종양의 염색된 슬라이스의 10개의 다른 유닛에 대해 CD3 및 CD8에 대한 염색 강도의 분포 퍼센트 히스토그램을 나타낸다.
도 17-19는 CD3 면역염색 이후, 세포의 염색 강도와 관련하여 CT 및 IM 종양 영역에서 검출되는 양성 세포의 퍼센트를 나타내는 히스트그램이다.
종양의 조직 절편의 3개 영역을 보여주는 사진을 얻기 위한 본 발명에 따른 하나의 과정이 도 10에서 보여진다.
상기 과정은, 슬라이드의 디지털 픽쳐가 조직 절편의 경계를 획득하기 위해 분석될 때 단계 10 "조직의 경계의 획정(delimitation)"에서 시작한다.
그 후, 단계 12 "조직 샘플을 균질 영역들로 분할(segmentation)"에서, 검출되는 요소 및 영역의 영역 색상, 대비염색의 강도, 핵에 대한 영역의 밀도, 조밀도(compactness), 기공도(emptiness), 조직 밀도, 입상도(granulosity), 형태, 크기와 같은 파라미터, 또는 상기 파라미터 여러개가 분석되며, 조직 절편은 상기 파라미터에 따라 유사한 성질의 균질 영역들로 나누어진다. 일반적으로, 약 1-10 cm2의 표면을 갖는 조직 샘플에 대해, 100 내지 10000개의 영역, 통상적으로 2000 내지 4000개의 균질 영역이 획득된다.
그 후, 단계 14 "종양의 획정"에서, 컴퓨터(또는 당업계의 통상의 기술자, 일반적으로 의사)는 세포 핵의 크기 및 형태학, 세포 핵의 색 등과 같은 파라미터들을 참작하여 단계 12의 결과를 고려하여 종양 및 침습성 주변부를 디지털적으로 획정한다. 당업계의 통상의 기술자가 이 단계를 실행할 때, 예를 들어 컴퓨터의 마우스 또는 이를 위한 스타일러스가 사용될 수 있다.
그 후, 단계 16 "종양 중심 및 침습성 주변부의 획정"에서, 조직 절편은 3개의 영역, 즉 종양, 건강한 조직 및 침습성 주변부로 나누어진다. 소프트웨어에 의해 건강한 조직과 종양 사이에 "침습성 주변부"라고 지칭되는 중간 영역이 규정되며, 이는 예를 들어 종양의 경계의 양 사이드에 500 μm 폭, 따라서 1 mm의 폭을 갖는다. 실제로 본 발명자들에 의해 행해진 장기간 연구들에 따르면, 1 mm의 폭이 침습성 주변부를 가장 잘 대표하였다는 점이 입증되었다.
단계 18 "종양의 크기로 조정된 격자의 제공"에서, 침습성 주변부, 및 종양의 크기로 조정된 직사각형 격자가 만들어진다. 직사각형 격자는 길이 500 내지 1000 μm, 바람직하게는 약 800 μm의 사이드를 통상적으로 갖는 정사각형 형태의 유닛으로 구성된다.
단계 20 "유닛 당 염색된 세포 유닛의 카운팅"에서, 염색된 세포는 세포의 색, 단일 세포의 예상 크기, 세포의 형태, 또는 염색의 강도와 같은 파라미터들을 참작하여 카운팅된다.
단계 22 "유닛의 표면으로 염색된 세포의 수를 나누기"에서, 염색된(양성) 세포의 수를 유닛의 표면적(예를 들어, 길이 800 μm의 사이드를 가진 정사각형에 대해 0.64·10-6 m2)으로 나눈다. 이에 따라, 표면 유닛에 의한 염색된(양성) 세포의 밀도가 획득된다.
단계 24 "염색된 세포의 밀도에 따른 각 유닛에 대한 색의 할당(allocation)"에서, 소프트웨어에 의해 밀도의 함수로서 각각의 유닛에 색이 할당되며, 예를 들어 담황색에서 암적색까지의 색이 할당된다.
전술한 바와 같이, 본 방법에서 하나보다 많은 마커가 사용된다면, 본 과정은 각 마커에 대해 개별적으로 실행될 수 있다. 예를 들어 과정이 CD3 세포에 대해 실행되고, 이어서 CD8 세포에 대해 실행된다.
환자들을 그룹으로 분리하기 위한 본 발명에 따른 일 과정이 도 12에 나타나있다. 이 예에서, 다음과 같은 파라미터의 조합이 선택되었다: A 양성 세포의 평균 밀도, B 3개의 가장 염색된 유닛, 및 C 종양 영역 CT 및 IM.
상기 과정은 단계 30 "종양 중심에서 3개의 가장 염색된 유닛의 검출"에서 시작한다. "종양 중심(centre)"은 "종양 주변부(margin)와 대조되어 사용된다". 소프트웨어에 의해 상기 단계 24의 데이터에 따라 3개의 가장 염색된 유닛(예를 들어 가장 어두운 적색 유닛들)이 검출된다.
단계 32 "종양 중심에서 양성 세포의 평균 밀도의 산출"에서, 염색된(양성) 세포의 평균 밀도가 산출된다.
단계 34 "종양 중심에서 양성 세포의 평균 밀도에 대한 기준값"에서, 역치/기준값은 상기 파라미터의 조합 및 상기 마커에 대한 역치/기준값을 포함하는 데이터베이스에 의해 제공된다. 상기 데이터베이스는 바람직하게는 각각의 파라미터 조합 및 각각의 마커에 대한 역치/기준값을 포함한다.
단계 36 "기준값과 종양 중심에서 양성 세포의 평균 밀도의 비교"에서, 단계 32의 값은 단계 34의 역치/기준값과 비교되며, 필요한 정보를 제공한다. 만일 단계 32의 값이 단계 34의 역치/기준값보다 크다면, 샘플은 예를 들어 "높음"으로 고려되며, 반대의 경우에는 "낮음"으로 고려된다.
상기 과정은 예를 들어 2개의 마커에 대해 그리고 종양 영역 CT 및 IM에 대해 실행된다.
상기 정보로부터 스코어가 획득될 수 있으며, 환자의 기대되는 생존은 신뢰성있는 방식으로 평가될 수 있는데, 그 이유는 인간의 개입 및 평가가 최소로 제한되기 때문이다.
도 2는 하나 또는 수개의 기준에 따라, 유사한 성질의 영역들로 나눠진 도 1의 조직 절편의 슬라이스의 사진을 보여준다.
도 3은 종양과 종양의 침습성 주변부가 규정된 사진 2와 유사한 사진이다.
도 4는 조직 절편의 3개 영역, 즉 상단부에서 종양, 하단부에서 건강한 조직, 및 이들 영역 사이에서 침습성 주변부를 보여주는 사진이다.
도 5는 분석하려는 종양(종양 및 침습성 주변부)의 크기로 조정된 정사각형 형태의 유닛을 가진 크기 기준 격자를 보여준다. 종양은 회색이고, V 형태이다.
도 6은 전형적 유닛의 사진이다. 검은 도트(dot)는 염색된 세포, 즉 마커를 함유하는 세포에 상응한다.
도 7은 소프트웨어에 의해 검출된 모든 양성 세포에 대한 갈색 염색의 강도의 함수로서 하나의 격자 유닛에 대해 획득된 염색의 품질을 보여주는 대표적 커브를 나타낸다. 염색 품질의 평가는 바람직하게는 조직 절편의 모든 유닛들에 대해 실행된다.
도 8은 종양의 사진이다. 주어진 유닛에서 염색된 세포의 수에 따라, 다소간 어두운 색이 소프트웨어에 의해 할당되었다.
도 9는 도 6의 부분 확대도이며, 염색된 세포(검은색)가 더 잘 입증된다.
도 10은 본 발명을 수행하기 위한 시스템의 블록 다이아그램이다.
도 11 및 12는 본 발명에 따른 방법의 단계들을 실행하기 위한 과정의 하나의 예를 나타내는 프로그래밍 플로우 다이아그램이다.
도 13은 실시예 2의 정량화 방법, 특히 종양 절편에서 CD3+ 세포의 검출을 나타낸다(결장암의 전체 슬라이드 분석). 상단부 도면: 조직 샘플, 종양 및 침습성 주변부의 경계, 다음 도면 조직 절편은 3개의 영역, 즉 상단부 우측에서 종양, 좌측 및 하단부 우측에서 건강한 조직, 및 가장 밝은 영역에서 침습성 주변부로 나누어진다.
도 14는 실시예 2의 정량화 방법, 특히 종양 절편에서 CD8+ 세포의 검출을 나타낸다(결장암의 전체 슬라이드 분석). 상단부 도면: 조직 샘플, 종양 및 침습성 주변부의 경계, 다음 도면 조직 절편은 3개의 영역, 즉 상단부 우측에서 종양, 좌측 및 하단부 우측에서 건강한 조직, 및 가장 밝은 영역에서 침습성 주변부로 나누어진다.
도 15는 무병 생존에 대한 p 값의 연관에 따른 최적의 역치 값의 산출을 나타내며(로그 순위 검정), p 값 vs 20 내지 2000개 CD3+세포/mm2의 밀도를 보여준다.
도 16은 종양의 염색된 슬라이스의 10개의 다른 유닛에 대해 CD3 및 CD8에 대한 염색 강도의 분포 퍼센트 히스토그램을 나타낸다.
도 17-19는 CD3 면역염색 이후, 세포의 염색 강도와 관련하여 CT 및 IM 종양 영역에서 검출되는 양성 세포의 퍼센트를 나타내는 히스트그램이다.
종양의 조직 절편의 3개 영역을 보여주는 사진을 얻기 위한 본 발명에 따른 하나의 과정이 도 10에서 보여진다.
상기 과정은, 슬라이드의 디지털 픽쳐가 조직 절편의 경계를 획득하기 위해 분석될 때 단계 10 "조직의 경계의 획정(delimitation)"에서 시작한다.
그 후, 단계 12 "조직 샘플을 균질 영역들로 분할(segmentation)"에서, 검출되는 요소 및 영역의 영역 색상, 대비염색의 강도, 핵에 대한 영역의 밀도, 조밀도(compactness), 기공도(emptiness), 조직 밀도, 입상도(granulosity), 형태, 크기와 같은 파라미터, 또는 상기 파라미터 여러개가 분석되며, 조직 절편은 상기 파라미터에 따라 유사한 성질의 균질 영역들로 나누어진다. 일반적으로, 약 1-10 cm2의 표면을 갖는 조직 샘플에 대해, 100 내지 10000개의 영역, 통상적으로 2000 내지 4000개의 균질 영역이 획득된다.
그 후, 단계 14 "종양의 획정"에서, 컴퓨터(또는 당업계의 통상의 기술자, 일반적으로 의사)는 세포 핵의 크기 및 형태학, 세포 핵의 색 등과 같은 파라미터들을 참작하여 단계 12의 결과를 고려하여 종양 및 침습성 주변부를 디지털적으로 획정한다. 당업계의 통상의 기술자가 이 단계를 실행할 때, 예를 들어 컴퓨터의 마우스 또는 이를 위한 스타일러스가 사용될 수 있다.
그 후, 단계 16 "종양 중심 및 침습성 주변부의 획정"에서, 조직 절편은 3개의 영역, 즉 종양, 건강한 조직 및 침습성 주변부로 나누어진다. 소프트웨어에 의해 건강한 조직과 종양 사이에 "침습성 주변부"라고 지칭되는 중간 영역이 규정되며, 이는 예를 들어 종양의 경계의 양 사이드에 500 μm 폭, 따라서 1 mm의 폭을 갖는다. 실제로 본 발명자들에 의해 행해진 장기간 연구들에 따르면, 1 mm의 폭이 침습성 주변부를 가장 잘 대표하였다는 점이 입증되었다.
단계 18 "종양의 크기로 조정된 격자의 제공"에서, 침습성 주변부, 및 종양의 크기로 조정된 직사각형 격자가 만들어진다. 직사각형 격자는 길이 500 내지 1000 μm, 바람직하게는 약 800 μm의 사이드를 통상적으로 갖는 정사각형 형태의 유닛으로 구성된다.
단계 20 "유닛 당 염색된 세포 유닛의 카운팅"에서, 염색된 세포는 세포의 색, 단일 세포의 예상 크기, 세포의 형태, 또는 염색의 강도와 같은 파라미터들을 참작하여 카운팅된다.
단계 22 "유닛의 표면으로 염색된 세포의 수를 나누기"에서, 염색된(양성) 세포의 수를 유닛의 표면적(예를 들어, 길이 800 μm의 사이드를 가진 정사각형에 대해 0.64·10-6 m2)으로 나눈다. 이에 따라, 표면 유닛에 의한 염색된(양성) 세포의 밀도가 획득된다.
단계 24 "염색된 세포의 밀도에 따른 각 유닛에 대한 색의 할당(allocation)"에서, 소프트웨어에 의해 밀도의 함수로서 각각의 유닛에 색이 할당되며, 예를 들어 담황색에서 암적색까지의 색이 할당된다.
전술한 바와 같이, 본 방법에서 하나보다 많은 마커가 사용된다면, 본 과정은 각 마커에 대해 개별적으로 실행될 수 있다. 예를 들어 과정이 CD3 세포에 대해 실행되고, 이어서 CD8 세포에 대해 실행된다.
환자들을 그룹으로 분리하기 위한 본 발명에 따른 일 과정이 도 12에 나타나있다. 이 예에서, 다음과 같은 파라미터의 조합이 선택되었다: A 양성 세포의 평균 밀도, B 3개의 가장 염색된 유닛, 및 C 종양 영역 CT 및 IM.
상기 과정은 단계 30 "종양 중심에서 3개의 가장 염색된 유닛의 검출"에서 시작한다. "종양 중심(centre)"은 "종양 주변부(margin)와 대조되어 사용된다". 소프트웨어에 의해 상기 단계 24의 데이터에 따라 3개의 가장 염색된 유닛(예를 들어 가장 어두운 적색 유닛들)이 검출된다.
단계 32 "종양 중심에서 양성 세포의 평균 밀도의 산출"에서, 염색된(양성) 세포의 평균 밀도가 산출된다.
단계 34 "종양 중심에서 양성 세포의 평균 밀도에 대한 기준값"에서, 역치/기준값은 상기 파라미터의 조합 및 상기 마커에 대한 역치/기준값을 포함하는 데이터베이스에 의해 제공된다. 상기 데이터베이스는 바람직하게는 각각의 파라미터 조합 및 각각의 마커에 대한 역치/기준값을 포함한다.
단계 36 "기준값과 종양 중심에서 양성 세포의 평균 밀도의 비교"에서, 단계 32의 값은 단계 34의 역치/기준값과 비교되며, 필요한 정보를 제공한다. 만일 단계 32의 값이 단계 34의 역치/기준값보다 크다면, 샘플은 예를 들어 "높음"으로 고려되며, 반대의 경우에는 "낮음"으로 고려된다.
상기 과정은 예를 들어 2개의 마커에 대해 그리고 종양 영역 CT 및 IM에 대해 실행된다.
상기 정보로부터 스코어가 획득될 수 있으며, 환자의 기대되는 생존은 신뢰성있는 방식으로 평가될 수 있는데, 그 이유는 인간의 개입 및 평가가 최소로 제한되기 때문이다.
실시예 1: 종양 조직의 염색된 슬라이드의 제조
선택된 종양 블록의 4-미크론의 2개 조직 파라핀 절편들이 만들어졌으며, 면역조직화학법을 위해 현미경 슬라이드(Superfrost- plus slides)상에 탈염수 중 디포지션되었다. 조직 파라핀 절편은 실온에서 건조되었으며, 밤새 56℃-58℃에서 인큐베이션되었다.
CD3 및 CD8(CONFIRM CD3(2GV6, Ventana) 및 CD8(C8/144B; Dako))에 대해 IVD 인증 항체를 이용하여 면역염색이 수행되었다. 관련 프로토콜에는 블로킹, 에피토프 회수, 및 검출의 주요 단계가 포함되었다. 슬라이드상에서 세포 핵을 염색하기 위한 개질된 Mayer's 헤마톡실린이, 전용 소프트웨어에 의해 염색된 세포를 최적으로 검출하기 위해 적용되었다(Hematoxillin II, Ventana). Benchmark XT 자동화(Roche-Ventana)에 의해 사용되는 프로토콜은 다음과 같았다:
| 항체 | CD8 | CD3 VMS |
| 항체 희석 | 1/5O | 전희석(pre diluted) |
| 항체 최종 농도 | 3μg/ml(1/5O) | 0.4μg/ml(전희석) |
| 항체 회수(retrieval) | CC1 pH 8-6Omin | CC1 pH 8-6Omin |
| 항체 인큐베이션 | 32 mn 37℃ | 20 mn 37℃ |
| 염색 | Ultraview TM DAB | Ultraview TM DAB |
| 대비염색 | 4 mn | 4 mn |
| 블루잉(bluing) 시약 | 4 mn | 4 mn |
CC1은 약염기성 pH의 tris-염기 버퍼이다. CD8에 대한 일차 항체 희석제는 K004(Clinisciences)였다.
디지털 픽쳐를 얻기 위한 종양 조직의 염색된 슬라이드의 스캐닝
슬라이드를 디지털 이미지로 수치화(numerization)하는 것은 20X 모드의 스캐너(NanoZoomer 2.0-HT, Hamamatsu)를 이용하여 수행되었다. 디지털 이미지의 포맷은 Definiens Developer XD 이미지 분석 시스템과 호환되었다. 스캐닝된 이미지상에서 불균일 색을 방지하기 위하여, 화이트 밸런스, 다크 앤 브라이트(white Balance, Dark & Bright) 및 셰이딩(shading)에 대해 보정이 수행되었다.
실시예 2: 소프트웨어 처치에 의한 염색된 슬라이드의 분석
· 병리학자는 CD3 및 CD8에 대한 각 면역조직화학의 디지털 이미지를 업로드하였으며, 전용 이미지 분석 소프트웨어(Definiens Developer XD)에 의해 분석을 시작한다.
· 반자동 과정에는 하기를 위한 단계가 포함된다:
- 조직의 자동 검출,
- 조직을 유닛들로 자동 분할,
- 인공물(폴드(folds), 티어(tears), 버블(bubbles) 등)의 수동 제거
- 디지털 툴로서 브러쉬를 이용하여, 병리학자에 의한 종양 영역의 수동 선택,
- 침습성 주변부의 자동 검출,
- 종양의 각 유닛에서 염색된 세포의 자동 검출,
- 염색된 세포의 면역염색 및 정량화를 확인하기 위하여, 소프트웨어에 의해 검출되는 양성 세포의 염색 강도의 분포, 평균 및 중간값에 대한 그래프의 분석; 이 분석은 조직 절편의 모든 유닛들에 대해, 각각의 유닛에 대해 실행됨,
- 염색 강도의 값 및 분포가 CD3 및 CD8에 대해 각각의 기준값과 비교됨; 만일 염색 강도가 유사한 값(동일한 값, 약 ±20% )을 가진다면, 샘플 조직은 정확하게 염색된 것으로 여겨짐; 뒤에서 예가 주어짐,
- 각 종양 영역(CT 및 IM)에서 3개의 가장 침투된 유닛의 식별 및 확인,
- 각 종양 영역에서 3개의 가장 침투된 유닛의 평균 밀도의 산출.
CD3 IHC 분석
|
종양 영역 (CT) |
유닛#1 세포/mm 2 |
유닛#2 세포/mm 2 |
유닛#3 세포/mm 2 |
평균
3 유닛 CT 영역 (세포/mm 2 ) |
| C04H1807-13_n2 | 948.33 | 989.81 | 999.51 | 979.22 |
|
침습성 주변부 (IM) |
유닛#1 세포/mm 2 |
유닛#2 세포/mm 2 |
유닛#3 세포/mm 2 |
평균
3 유닛 IM 영역 (세포/mm 2 ) |
| C04H1807-13_n2 | 2349.21 | 2379.06 | 2567.92 | 2432.06 |
CD8 IHC 분석
|
종양 영역 (CT) |
유닛#1 세포/mm 2 |
유닛#2 세포/mm 2 |
유닛#3 세포/mm 2 |
평균
3 유닛 CT 영역 (세포/mm 2 ) |
| C04H1807-13_n1 | 680.37 | 780.87 | 911.66 | 790.97 |
|
침습성 주변부 (IM) |
유닛#1 세포/mm 2 |
유닛#2 세포/mm 2 |
유닛#3 세포/mm 2 |
평균
3 유닛 IM 영역 (세포/mm 2 ) |
| C04H1807-13_n1 | 1256.62 | 1540.49 | 2416.79 | 1737.97 |
환자가 각각의 종양 영역에서 각각의 마커에 대해 Hi 또는 Lo인지 여부를 결정하기 위하여, 가장 침투된 3개 유닛의 평균 밀도는, 기준 코호트의 연구에서 기 규정된, 최적 역치의 평균 밀도와 비교된다.
임상적 국소 결장암의 기준 코호트에서(UICC TNM 단계 I-II) 무병 생존에 대해 환자를 구별하는 최적 역치는 다음과 같다:
| 최적 역치 | CT 세포/mm2 |
IM 세포/mm2 |
| CD3 | 967 | 1163 |
| CD8 | 406 | 649 |
| CD45RO | 1548 | 1303 |
분석된 케이스에 대해, 종양은
CD3에 대해 Hi/Hi
CD8에 대해 Hi/Hi
결론적으로, 면역스코어는 I-4이다.
실시예 3: 무병 생존에 대한 p 값의 연관에 따른 최적의 역치 값의 산출 예(로그 순위 검정)
무병 생존에 대한 p 값의 산출(로그 순위 검정)
20 내지 2000 CD3+세포/mm2의 각 값에 대해, 상기 값보다 적은 종양(CT 영역)(하단부 커브에서 원형 도트)에서 CD3+세포의 밀도를 갖는 환자의 수(이에 따라 환자 그룹이 제공됨)가 결정되었다.
종양(원형 도트 및 상응 커브)에서 20 내지 2000 CD3+ 세포/mm2의 각 역치 값에 대해 환자 그룹을 비교하는 로그 순위 검정을 위한 p 값이 산출되었다.
그 결과는 도 15에 주어진다.
X-축은 세포/mm2로 표현되는 세포 밀도를 나타내고, Y-축은 로그 순위 P-값(도면의 하단부에서 원형 도트 및 상응 커브)을 나타낸다. 위험 비율(정사각형 도트 및 상응 커브) 및 iAUC 일치 인덱스(concordance index)(미세 커브)가 또한 보여진다.
환자들은 "Lo"(주어진 컷-지점(cut-point)보다 아래)로서 그리고 "Hi"(상기 컷-지점보다 위)로서 카테고리화된다. 20 내지 2000 세포s/mm2의 값이 본 실시예에서 테스트된다. 예를 들어, 100 세포/mm2 값에 대해, 100 CD3+ 세포/mm2 미만의 환자는 "Lo" 그룹이고, 100 CD3+ 세포/mm2 또는 그 이상의 환자는 "Hi" 그룹이다. Hi 및 Lo 환자를 비교하는 Kaplan Meier 커브가 플롯팅되고, 로그 순위 P-값이 산출된다(본 예에서는 P=0.01).
그 결과에 따르면(도 15 참조), 70 내지 700 세포/mm2의 값이 종양에서 CD3+에 대해 유의적이다(둥근 플롯)(P<0.05). 최적 P-값 역치는 본 예에서 200 세포s/mm2로 나타나는 최소 P-값에 상응하는 값에 의해 제공된다. 이에 따라, 최적(optimal) 역치 값은 200 세포/mm2로 설정된다.
최적 역치 값은, 양성 세포의 밀도 외의 다른 값들에 대해, 각 종양 영역에서 각 마커에 대해 유사한 접근법을 이용하여 결정될 수 있다.
실시예 4: 면역조직화학의 반복성 및 재현성
CD3 및 CD8 면역조직화학에 대한 반복성 및 재현성이 다양한 방법에 따라 시험되었다. (3개의 가장 염색된 유닛의 기준).
반복성 방법 1:
종양의 1개 슬라이드가 (CD3 또는 CD8에 대해) 면역염색되고, 스캐너로 수치화된다. 디지털 이미지는 동일한 운용자에 의해 이미지 분석 소프트웨어로 10회 분석된다(다른 측면에서, 동일한 면역염색의 10회 분석이 동일한 운용자에 의해 수행됨). 변동계수(CV)가 결정된다.
결과:
CD3;
CT 영역에 대한 CV는 3.20 %이다.
IM 영역에 대한 CV는 7.11 %이다.
종양(CT 및 IM)의 분석에 대한 CV는 5.16 %이다.
CD8;
CT 영역에 대한 CV는 1.88 %이다.
IM 영역에 대한 CV는 3.07 %이다.
종양(CT 및 IM)의 분석에 대한 CV는 2.48 %이다.
반복성 방법 2:
4개의 종양 샘플이 분석된다. 각각의 종양 샘플에 대해, 4개의 인접 슬라이드가 수행된다. 슬라이드는 동일한 실험에서 (CD3 또는 CD8에 대해) 면역염색되고, 동일한 런(run)에서 스캐너로 수치화된다. 디지털 이미지는 동일한 운용자에 의해 동일한 런에서 이미지 분석 소프트웨어로 분석된다. 변동계수(CV)가 인접 슬라이드 사이에서 각 IHC(CD3 또는 CD8)에 대해 결정된다.
결과:
CD3; 종양 #1-4
CT 영역에 대한 CV는 5.41 %이다.
IM 영역에 대한 CV는 10.59 %이다.
종양(CT 및 IM)의 분석에 대한 CV는 8.00 %이다.
CD8; 종양 #1-4
CT 영역에 대한 CV는 8.73 %이다.
IM 영역에 대한 CV는 9.09 %이다.
종양(CT 및 IM)의 분석에 대한 CV는 8.91 %이다.
재현성 방법 1:
- 조직 마이크로어레이(TMA)로부터의 종양 샘플의 1개 슬라이드가 분석된다.
- 슬라이드는 (CD3 또는 CD8에 대해) 면역염색되고, 스캐너로 수치화된다.
- 디지털 이미지는 동일한 운용자에 의해 CD3에 대해 12회 런 및 24회 런으로 이미지 분석 소프트웨어로 분석된다(다른 측면에서, 동일한 면역염색의 12회 분석이 동일한 운용자에 의해 수행됨).
- 변동계수(CV)가 결정된다.
결과:
CD3; TMA 스팟(spot)에 대한 CV는 < 1 %이다.
CD8; TMA 스팟에 대한 CV는 < 1 %이다.
재현성 방법 2:
- 종양 샘플의 1개 슬라이드가 (CD3 또는 CD8에 대해) 면역염색되고, 스캐너로 수치화된다. 디지털 이미지는 2명의 운용자에 의해 이미지 분석 소프트웨어로 10회 분석된다. 변동계수(CV)는 2명의 운용자 사이에서 결정된다.
결과:
CD3;
CT 영역에 대한 CV는 3.42 %이다.
IM 영역에 대한 CV는 7.03 %이다.
종양(CT 및 IM)의 분석에 대한 CV는 5.23 %이다.
CD8;
CT 영역에 대한 CV는 2.72 %이다.
IM 영역에 대한 CV는 적용될 수 없다(IM이 검출될 수 없음).
종양(CT)의 분석에 대한 CV는 2.72 %이다.
재현성 방법 3:
- 2개의 종양 샘플이 분석된다. 각각의 종양 샘플에 대해, 5개의 인접 슬라이드가 수행된다(C1-C5). 슬라이드는 다른 런에서 (CD3 및 CD8에 대해) 면역염색되고, 다른 런에서 수치화된다. 디지털 픽쳐는 2명의 운용자에 의해 이미지 분석 소프트웨어로 분석된다(슬라이드 C1, C3 및 C5에 대해 1번 운용자; 슬라이드 C2 및 C4에 대해 2번 운용자). 변동계수(CV)는 인접 슬라이드에 대해 2명의 조사관 사이에서 각 IHC(CD3 및 CD8)에 대해 결정된다.
결과:
CD3;
CT 영역에 대한 CV는 17.89 %이다.
IM 영역에 대한 CV는 5.37 %이다.
종양(CT 및 IM)의 분석에 대한 CV는 11.68 %이다.
CD8;
CT 영역에 대한 CV는 14.90 %이다.
IM 영역에 대한 CV는 8.71%이다.
종양(CT 및 IM)의 분석에 대한 CV는 2.72 %이다.
실시예 5: CD3 및 CD8에 대한 면역염색의 품질 조절을 실행하는 상세한 예들
실시예 1에 따라 CD3 및 CD8에 대해 면역염색된 10개의 유닛이 랜덤으로 선택되었다. 유닛의 평균 강도 ± 1 SD가 결정되었다.
수득된 평균 값은 다음과 같다: CD3: 239±43(범위: 282-196), CD8: 217±44(범위: 261-173). 상기 값은 주어진 환자의 각 샘플의 면역염색의 품질을 확인하기 위하여 기준값으로서 고려된다. 상기 범위는 기준 평균 값으로부터 ±20%의 차이에 상응한다. 당업계의 통상의 기술자라면, 다양한 이유들로 인해 용인(tolerance) 역치가 넓혀지거나(예를 들어 ± 22% 또는 25%), 또는 바람직하게는 좁혀질 수 있다(예를 들어 ± 5%, 8%, 10%, 15%)는 것을 이해한다.
제1팀
실시예 1에 따라 CD3에 대해 면역염색된 10개의 유닛이 랜덤으로 선택되었다. 유닛의 평균 강도 ± 1 SD가 결정되었다. 수득된 결과는 다음과 같다: 평균 = 234 ± 64. CD3에 대한 염색 강도의 분포에 대한 히스토그램은, 수득된 CD3의 염색 강도가 282-196의 범위 내에서 CD3의 기준 염색 강도에 가깝다는 것을 보여준다.
따라서, 샘플은 정확하게 면역염색된 것으로 고려된다.
제1팀에 의해 측정되는 염색된 면역 세포의 밀도: CT: 1795 세포/mm2, IM: 2319 세포/mm2이 확인된다.
제2팀
동일한 프로토콜이 제1팀에 의해 조사된 슬라이드에 인접한 슬라이드에 대해 두번째 팀 작업을 통해 실행되었다.
수득된 결과는 다음과 같다: 평균 = 251 ± 56, 282-196의 범위 내에서. 상기 기준값을 고려할 때, 샘플은 정확하게 면역염색된 것으로 고려된다.
제2팀에 의해 측정되는 염색된 면역 세포의 밀도: CT: 1665 세포/mm2, IM: 2198 세포/mm2이 확인된다.
인접 슬라이드에 대해 제1팀과 제2팀에 의해 획득된 종양 영역[종양의 코어(CT) 및 침습성 주변부(IM)]에서 CD3의 밀도 값은 실제로 유사하다.
제3팀
동일한 프로토콜이 제1팀에 의해 조사된 슬라이드에 인접한 다른 슬라이드에 대해 세번째 팀 작업을 통해 실행되었다. 수득된 결과는 다음과 같다: 평균 = 148 ± 27. CD3에 대한 염색 강도의 분포에 대한 히스토그램은, 수득된 CD3의 염색 강도가 CD3의 기준 염색 강도에 대해 멀리 있다는 것을 보여준다(282-196 범위의 밖).
따라서, 샘플은 부정확하게 면역염색된 것으로 고려된다.
제3팀에 의해 측정되는 염색된 면역 세포의 밀도: CT: 914 세포/mm2, IM: 1707 세포/mm2이 확인되지 않는다.
상기 결과들은, 기준 및 면역염색의 품질 조절의 부재하에서 매우 다르고 부정확한 결과들이 얻어질 수 있다는 것을 보여준다.
Claims (12)
- 하기 단계를 포함하는, 종양 조직에서 면역 세포의 수 또는 밀도를 평가하는 방법:
a) 면역 세포에 의해 발현되는 항원(마커)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여, 자동화된 슬라이드-염색 시스템에 의해 획득되는 조직 절편의 하나 이상의 면역염색된 슬라이스를 제공하는 단계;
b) 고해상 스캔 캡쳐에 의해 상기 a) 단계의 슬라이드의 디지털화를 수행하여, 분석하려는 슬라이드의 고화질(4.6 μm/픽셀 또는 그 이상) 디지털 픽쳐를 획득하는 단계;
c) 상기 디지털 픽쳐에서 조직 절편의 슬라이스를 검출하는 단계;
d) (i) 종양(CT) 및 (ii) 종양의 침습성 주변부(IM)를 규정하기 위해 조직 절편의 슬라이스를 분석하는 단계;
e) 동일한 표면을 갖는 균일분포된 유닛을 가진 크기 기준 격자를 제공하는 단계, 이때 상기 격자는 분석하려는 종양의 크기로 조정됨;
e1) 면역염색의 품질을 체크하는 단계,
f) 각 유닛의 염색된 세포를 검출하고 정량화하여, 각 유닛의 염색된 면역 세포의 수 또는 밀도를 평가하는 단계. - 제1항에 있어서,
각 유닛의 염색된 세포를 검출하고 정량화하는 것은 종양(CT) 및 (ii) 종양의 침습성 주변부(IM)에서 개별적으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
크기 기준 격자가 제공되지 않는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 CD3, CD4, CD8, CD20, CD45RO 또는 GZMB 마커에 대해 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
CD3+CD8, CD3+CD45RO, CD3+CD20, CD3+GZMB, CD8+CD20, CD8+GZMB, CD8+CD45RO, CD20+GZMB, CD20+CD45RO, GZMB+CD45RO, CD4+CD8, CD4+CD45RO, CD4+GZMB, CD4+CD20 조합들, 및 CD3, CD8, CD20, CD45RO, CD4 및 GZMB 마커 중에서 3개의 마커의 모든 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 또는 3개의 항체가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
IHC 자동화가 상기 a) 단계를 실행하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 종양(CT) 및 (ii) 종양의 침습성 주변부(IM)의 경계를 규정하기 위해 조직 절편의 슬라이스를 분석하는 것은 적합한 소프트웨어에 의해 실행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
10·10-9 m2 내지 1000·10-9 m2의 표면을 갖는 육각형, 정사각형 또는 직사각형 유닛이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
각 유닛의 염색된 면역 세포의 평가되는 수 또는 밀도는 하기 A 그룹의 값으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
- 염색된 세포의 최대 수
- 염색된 세포의 최대 밀도
- 염색된 세포의 수의 합
- 염색된 세포의 표면의 합
- 염색된 세포의 밀도의 합
- 염색된 세포의 평균 수
- 염색된 세포의 평균 밀도
- 염색된 세포의 최대 수
- 염색된 세포의 수의 중간값. - 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
하기로 이루어진 B 그룹의 기준에 따라 세포 또는 유닛을 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 단일 염색된 세포
- 3개 이상의 염색된 세포를 함유하는 클러스터에서 염색된 세포
- 3개 이상의 염색된 세포를 함유하는 클러스터 또는 단일 염색된 세포
- 모든 염색된 세포
- 가장 염색된 유닛
- 랜덤 유닛. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
기대 생존에 따라 또는 암 치료에 대한 반응에 따라 환자들을 그룹으로 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제11항에 있어서,
주어진 마커에 대한 면역 세포의 수 또는 밀도의 값이 상기 마커에 대한 기정된 기준값과 비교되고; 이때 기정된 기준값은 상기 암의 진행의 특이적 예후 및/또는 환자의 생존 및/또는 암 치료에 대한 반응과 상관된 것인 방법.
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