BR112014031143B1

BR112014031143B1 - Método para quantificar células imunes em tecidos tumorais e suas aplicações

Info

Publication number: BR112014031143B1
Application number: BR112014031143-9A
Authority: BR
Inventors: Bernhard Milecnik; Jérôme Galon; Franck Pagès
Original assignee: Universite Paris Descartes; INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale); Assistance Publique Hopitaux De Paris
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2022-03-03
Also published as: KR20150023760A; EP2861986A1; CA2873278C; ES2902879T3; JP2015525349A; WO2013186374A1; US10317408B2; IL235738A0; CN104541167A; BR112014031143A2; EP2861986B1; AU2013276470B2; DE13731071T1; US20150153349A1; IL235738B; BR112014031143B8; CN104541167B; AU2013276470A1; CA2873278A1; KR102179848B1

Abstract

MÉTODO PARA QUANTIFICAR CÉLULAS IMUNES EM TECIDOS TUMORAIS E SUAS APLICAÇÕES. Um método para avaliação de um número ou a densidade de células imunológicas em tecidos tumorais compreendendo as etapas que consistem em: a. fornecer uma ou mais lâminas imunocoradas de secção de tecido obtidas por um sistema de coloração de lâminas automatizado usando anticorpos que se ligam especificamente a antígenos (marcadores) expressos pelas células imunológicas. b. proceder à digitalização das lâminas da etapa a. pela captura de imagem alta resolução, pelo qual uma imagem digital de alta definição (4,6 mm / pixel ou melhor) da lâmina a ser analisada é obtida, c. detectar a porção de corte de tecido sobre a imagem digital d. analisar a porção da seção de tecido para a definição (i) do tumor (TC) e (ii) da margem invasiva do tumor (IM), e. fornecer uma grade de referência de tamanho com unidades uniformemente distribuídas tendo uma mesma superfície, a dita grade sendo adaptada ao tamanho do tumor a ser analisado, e1. verificar a qualidade da immunocoloração, f. detectar e quantificar as células coradas de cada unidade em que o número ou a densidade de células imunológicas coradas de cada unidade é avaliada.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um método para a quantificação de células imunes em tecidos tumorais e suas aplicações.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os documentos EP-A-EP1943520 e WO 2007045996 descrevem um método in vitro para o prognóstico de pacientes para a progressão de um câncer e / ou da sobrevivência e / ou a previsão da resposta ao tratamento (quimioterapia, radioterapia, bioterapia, imunoterapia) cujo método compreende as seguintes etapas: a) quantificar, em uma amostra de tecido tumoral a partir do referido paciente, pelo menos, um marcador biológico indicativo do estado da reação imune adaptativa local do referido paciente; e b) comparar o valor obtido na etapa a) para o referido pelo menos um marcador biológico com um valor de referência pré-determinado para o mesmo marcador biológico; em que o valor de referência predeterminado está correlacionado com um prognóstico especifico de progressão do referido câncer ou sobrevivência do referido paciente ou previsão da resposta ao tratamento (por exemplo, quimioterapia, radioterapia, bioterapia, imunoterapia) para antecipar o "bom respondedor" vs "mau respondedor".

[003] A amostra de tecido tumoral pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em (i) um tumor primário global (como um todo), (ii) uma amostra de tecido tumoral, (iii) uma amostra de tecido a partir do tecido circundante diretamente ao tecido tumoral, o qual pode ser, mais especificamente, chamado "margem invasiva" do tumor, (iv) ilhotas linfóides em estreita proximidade com o tumor, antes da cirurgia (v) gânglios linfáticos localizados na proximidade mais próximo do tumor, (vi) uma biopsia do tumor realizada e (vii) uma metástase distante.

[004] 0 marcador biológico é, preferencialmente, quantificado, na etapa a), em amostras de tumor recolhidas a partir de duas regiões do tumor, respectivamente, (i) o tumor (TC) e (ii) da margem invasiva do tumor (IM).

[005] O método acima foi implementado em microarrays de tecido (TMAs). No entanto, a maior parte das etapas do processo são executados manualmente e problemas com a reprodutibilidade das medições pode ser observada. Por exemplo, as diferenças entre os patologistas para a selecção de áreas tumorais para perfurar podem ocorrer, com base no exame de contraste Hematoxilina-Eosina. Além disso, uma dificuldade para perfurar exatamente a área selecionada pelo patologista é observada. Tais erros tipicos podem ocorrer em cada etapao. Embora o método descrito nestes documentos torna possível obter alto desempenho para prever a sobrevida de pacientes com câncer, a investigação ainda está ainda em curso em métodos com melhores qualidades, nomeadamente, no que respeita a reprodutibilidade automação e comparabilidade dos resultados.

[006] Conforme destacado por Halama et al., em Quantification of prognostic immune cell markers in colorectal cancer using whole slide imagining tumour maps, analytical and quantitative cytology and histology, Vol. 32, 6, Dec 2010, pp.333-340, a amostragem de sondas histológicas utilizando micro-matrizes de tecido (TMAs) é, especialmente, problemático no caso de uma heterogeneidade espacial da molécula alvo, como é, frequentemente, observada em tecido canceroso. Halama et al., propõe lâmina de microscopia, tecido completo para aquisição de dados. No entanto, o estudo não demonstra um algoritmo de diagnóstico específico produzindo um parâmetro capaz de interpretar a heterogeneidade espacial do tumor. Ele conclui que, até que este algoritmo de diagnóstico seja criado e um estudo de acompanhamento seja realizado, ele não pode saber se o mapa tumoral terá valor prognóstico em um único paciente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Agora, o requerente descobriu um método para a avaliação de um número ou a densidade de células imunes em tecidos tumorais, para a obtenção de uma pontuação imunológica (ou immunoscore) de pacientes sofrendo de um câncer.

[008] Tem sido observado de uma forma surpreendente e inesperada que a utilização do novo método para avaliação de um número ou a densidade de células imunes em tecidos tumorais assegura a automação, repetibilidade e reprodutibilidade do método descrito no documento WO 2007045996 e, portanto, proporciona um método de ensaio padrão para ensaios interlaboratoriais para prever a sobrevida e resposta ao tratamento de pacientes com câncer.

[009] O novo método tem, particularmente, menos problemas com a repetibilidade e reprodutibilidade, quando comparados com o método dos documentos EP-A-EP1943520 e WO 2007045996

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

[0010] Um objetivo do presente pedido é, por conseguinte, um método para avaliação de um número ou a densidade de células imunes em tecidos tumorais compreendendo as etapas que consistem em: a. fornecer um ou mais pedaçoes imunocorados da seção de tecido obtidas por um sistema de ligação-coloração automatizado usando anticorpos que se ligam especificamente a antigenos expressos pelas células imunes. b. proceder à digitalização dos pedaçoes da etapa (a) pela captura de varredura de alta resolução, em que uma alta definição (4,6 μm / pixel ou melhor) de imagem digital do pedaço a ser analisado é obtida, c. detectar o pedaço de corte de tecido sobre o retrato digital d. analisar o pedaço da secção de tecido para definir (i) o tumor (TC) e (ii) a margem invasiva do tumor (IM), e. fornecer uma grade de referência com tamanho de unidades uniformemente distribuídas tendo uma mesma superfície, a dita grade sendo adaptada ao tamanho do tumor a ser analisado, f. detectar e quantificar as células coradas de cada unidade, em que o número ou a densidade de células imunes coradas de cada unidade é avaliada.

[0011] Tipicamente, os anticorpos são específicos para uma proteina expressa por uma célula imune e, mais particularmente, são específicos para um marcador de superfície de células imunes. Por exemplo, os anticorpos podem ser específicos para um marcador, tal como descrito no documento WO 2007045996, células do sistema imunológico podem ser consideradas as células B e as células T de um modo preferido. Por exemplo, as células T da invenção são as células T de sub-grupos de células CD3 + (células T) , as células CD8 + ou células GZMB + (células T citotóxicas), células T CD4 + (células T auxiliares) , células CD45RO + (células T de memória). Em uma concretização particular, os anticorpos são específicos para marcadores CD3, CD4, CD8, CD20, CD45RO, e GZMB.

[0012] Quando dois ou mais marcadores são usados, as etapas acima são, de preferência, implementados separadamente para cada marcador. Por exemplo, anticorpos anti-CD3 são utilizados para uma fatia de tecido e anticorpos anti-CD8, para uma outra fatia de tecido, de preferência, uma fatia de tecido adjacente. Um múltiplo, por exemplo, par de detecção pode, alternativamente, ser feito quando os anticorpos utilizados para a detecção de marcadores diferentes estão marcados de forma diferente. Um sinal detectável é, por conseguinte, disponível para cada marcador.

[0013] A imunohistoquimica ou IHC refere-se ao processo convencional de detecção de antigenos (em geral, proteinas) nas células de uma secção de tecido, utilizando o principio de anticorpos que se ligam especificamente a antigenos em tecidos biológicos. A coloração imunohistoquimica permite a visualização de uma interação anticorpo-antigeno. Ele pode ser implementado em um número de maneiras. No caso mais comum, um anticorpo é conjugado com uma enzima, tal como peroxidase, que pode catalisar uma reação produtora de cor. Alternativamente, o anticorpo também pode ser marcado com um fluoróforo, tais como fluoresceina ou rodamina.

[0014] Os anticorpos utilizados na presente invenção estão normalmente disponíveis comercialmente. Em particular, quando os marcadores CD3 é selecionado para a execução do método da invenção, o anticorpo 2GV6 comercialmente disponível a partir de Roche Ventana (Tucson, AZ, EUA) pode ser adequado (Chetty R, et al, J Pathol 173 (4): 303 - 307, 1994). Em particular, quando o marcador CD8 é selecionado para a execução do método da invenção, anticorpo C8 / 144B comercialmente disponível a partir de Dako (Dinamarca) pode ser adequado (Mason DY, Cordell JL, Gaulard P, Tse AGD, Brown MH. Detecção imuno citotóxica humano / células T supressoras, utilizando anticorpos para uma sequência de péptido de CD8 J Clin Pathol 1992:45: 1084 - 8).

[0015] Dois ou mais marcadores podem ser detectados durante a execução do processo. Em uma concretização particular, podem ser utilizadas as seguintes combinações: CD3 + CD8, CD3 + CD45RO, CD3 + CD20, CD3 + GZMB, CD8 +, CD20, CD8 + GZMB, CD8 + CD45RO, CD20 + GZMB, CD20 + CD45RO, GZMB + CD45RO, CD4 + CD8 +, CD4 + CD45RO, CD4 + GZMB, CD4 + CD20, e todas as combinações de 3 marcadores entre a CD3, CD8, CD20, CD45RO, CD4 e marcadores GZMB. Em condições preferidas para a realização da invenção, as combinações CD3 + CD45RO, CD8 + CD45RO e CD3 + CD8 são as mais preferidas, mais particularmente, a última, por causa da baixa coloração de fundo obtidas com estes anticorpos.

[0016] As secções de tecido de diferentes tipos de tumores podem ser utilizadas no presente processo. Uma amostra de tecido tumoralabrange (i) um tumor primário global (como um todo), (ii) uma amostra de tecido (biópsia) a partir do tumor, (iii) uma amostra de tumor ressecado, e (iv) uma amostra de metástases distantes.

[0017] Um ou mais pedações fornecidos com uma fatia da secção de tecido marcado -pode ser usado no presente método. Normalmente, um único pedaço é suficiente para um marcador, a menos gue uma coloração fraca seja obtida.

[0018] Por exemplo, um automatizador IHC como Benchmark® XT permitindo preparação automática de pedações corados pode ser utilizado para a aplicação da coloração imunohistoquimica da etapa (a).

[0019] A digitalização dos pedações da etapa (a) é feito pela captura de digitalização, por exemplo, com um scanner Hamamatsu NanoZoomer® de alta resolução de 2,0-HT permitindo a digitalização de pedações de tamanho padrão (26 mm x 76 mm). Este scanner oferece alta definição de imagens digitais (x20: 0,46 μm / pixel, de preferência) e (x40: 0,23 μm / pixel).

[0020] A detecção, ou seja, a definição dos limites do pedaço da secção de tecido na imagem digital pode ser feita por um técnico especializado no assunto, geralmente um médico, ou pode ser implementado por software apropriado.

[0021] Analisando o pedaço da secção de tecido para definição dos limites de (i) o tumor (TC) e (ii) da margem invasiva do tumor (IM) podem também ser por um médico clinico, ou pode ser implementado por software adequado. Três áreas são geralmente obtidas, correspondente ao tecido saudável, tumor invasivo e margem entre as mesmas.

[0022] De preferência, antes dessa etapa, o pedaço da secção de tecido é dividida em áreas de propriedades semelhantes, de acordo com critérios como a uma ou mais das cores, intensidade, compacidade, vazio, densidade do tecido, densidade nuclear usando contra-coloração, granulometria, forma, tamanho e área de elementos detectados.

[0023] Na etapa e. uma grade de referência adaptada para o tamanho do tumor a ser analisado é fornecida. Uma grade de malha, de preferência, hexagonal, quadrada ou retangular é usada. Uma grade de malha quadrada é particularmente preferida.

[0024] A superfície de uma malha individual, daqui em diante "unidade", deve ser, por exemplo, de 2,5 a IO-9 m2 a 25 de IO-6 m2, de preferência, de 10 IO*9 m 2 a 1000 10-9 m2, em particular, de 100 10-9 m 2 a 1000 10-9 m2, mais particularmente, de 300 IO-9 m 2 a 800 IO-9 m2, e muito particularmente, de cerca de 650 10-9 m2.

[0025] Unidades Hexagonais, quadradas ou retangulares, com uma superfície de 10 IO-9 m2 a 1000 10-9 m2, em particular, de 100 a IO-9 m2 a 1000 IO-9 m2, mais particularmente, de 300 a IO-9 m2 para 800 10-9 m2, e muito particularmente, de cerca de 10 650-9 m2 são preferidos.

[0026] Uma grade de malha quadrada, de referência, em que os lados de 500 a 1000 μm de comprimento, de preferência, cerca de 800 μm, é mais preferido devido ao meio significativo representativo apropriado de células imunes em tal área, no intervalo de 1 a 5000 células.

[0027] Uma grade de referência preferida está prevista, por exemplo, com 2 a 5000, de preferência de 10 a 2000, particularmente, 100 a 1000, mais particularmente 400 a 700 unidades.

[0028] Uma grade com 400 a 700 unidades de forma quadrada tendo lados de cerca de 800 μm em comprimento é o mais preferido.

[0029] As unidades cobrem toda a superfície da amostra.

[0030] A densidade de células de interesse pode ser expressa como o número das ditas células de interesse que são contadas por unidade de área de superfície da amostra de tecido, por exemplo, por mm2. A densidade de células de interesse pode também consistir da percentagem de um subconjunto especifico de células (por exemplo, células T CD3 +) por células totais ou subpopulação celular total (fixado em 100%) . A obtenção de, na etapa (g) do método, mais do que um valor de quantificação para cada marcador biológico que é utilizado permite um prognóstico mais preciso do câncer definitivo ou previsão de uma resposta ao tratamento do que quando apenas um valor de quantificação por marcador biológico é determinado.

[0031] Quando o método para avaliação de um número ou a densidade de células imunes em tecidos tumorais é seguido por etapas adicionais, onde a qualidade de coloração pode ser um parâmetro importante para a exatidão dos resultados obtidos, é importante verificar a qualidade da coloração do pedaço de tecido.

[0032] Por conseguinte, sob condições preferidas para a realização da invenção, o método compreende ainda uma etapa (el) , de verificar a qualidade da coloração do pedaço de tecido.

[0033] Verificação da qualidade da coloração pode ser implementada pelo cálculo, de preferência, com um software apropriado, a distribuição da intensidade de coloração de células positivas detectadas para cada unidade e para a totalidade da região de tumor, representando a dita distribuição.

[0034] A média, mediana, minimo e máximo da coloração de intensidade relevante (por exemplo, marrom) de todas as células coradas positivas detectadas nas regiões tumorais podem ser calculadas e fornecidas para cada pedaço analisado.

[0035] Os valores e a distribuição da intensidade da coloração podem ser comparados a uma referência (intensidade de intervalo normal) determinada para cada marcador.

[0036] Na etapa de detecção (f), o número de células positivas de cada unidade é contado. Uma vez que a superfície de cada unidade é conhecida, a densidade de células positivas por unidade de superfície é também conhecida. A etapa (f) pode ser feita por um técnico versado no assunto, geralmente um médico, ou pode ser implementado por software apropriado. O método permite quantificar, em uma amostra de tecido tumoralde um paciente, pelo menos, um marcador biológico indicativo do estado da reação imunológica do referido doente contra o câncer.

[0037] O método acima pode ser utilizado para segregar pacientes em grupos de acordo com a sua sobrevivência esperada ou a sua resposta a um tratamento contra o câncer. O valor aqui anteriormente pode ser comparado, para cada marcador biológico utilizado, com um valor de referência pré-determinado para o mesmo marcador biológico; que o valor de referência predeterminado está correlacionado com um prognóstico específico de progressão do referido câncer e/ ou a sobrevivência do paciente e/ ou resposta a um tratamento do câncer ("bom respondedor" vs "mau respondedor")

[0038] Os seguintes parâmetros podem ser utilizados para quantificar as células coradas de cada unidade, para um dado marcador: - O número total de células coradas - Densidade de células coradas por unidade de superfície O número total de células coradas isoladas (sem contato com outras células coradas) o número total de células marcadas dentro de um aglomerado de células coradas (onde pelo menos uma célula corada está em contato com um min. de 3 células coradas).

[0039] Sob condições preferidas para a realização da invenção, - Cada região (CT e IM) de um tumor é analisada. - A densidade de células coradas de cada unidade é determinada. - A cor é atribuida a cada unidade, de acordo com a densidade de células coradas e detectadas de acordo com uma gradação, por exemplo, verde para vermelho (densidade minima à densidade máxima). Estas etapas são de preferência implementadas por software apropriado.

[0040] De preferência, a densidade de células coradas em cada região do tumor (CT e IM) é determinado pela densidade média de 1 a 1000 unidades, de preferência, 2 a 100 unidades, mais preferencialmente, de 3 a 10 unidades, muito preferivelmente, de 3 unidades, sendo o valor máximo de densidade. A seleção de unidades com a densidade máxima é, de preferência, implementado por software apropriado. Um valor é obtido para cada uma das áreas de TC e IM. Se os valores estão acima de um valor limiar, a amostra é considerada positiva. Portanto, para um único marcador, quatro possibilidades são possiveis: CT + e IM +, CT-e IM-, CT + e IM-, CT- e IM +. Quando dois ou mais marcadores CD3, CD8, CD20, CD45RO, e GZMB são usados, as mesmas possibilidades são possiveis para o segundo marcador.

[0041] Os inventores verificaram que o método é de confiança, se 30% ou mais, de preferência, 40% ou mais da superficie de uma unidade de tomadas em consideração é preenchido com células.

[0042] Outros critérios além da densidade média de várias unidades são possiveis, de preferência, com base em combinações de sub-critérios dos grupos A, B e C

[0043] Grupo A 1. O número máximo de células positivas (células positivas refere-se a células coradas detectadas pelo software) 2. A densidade máxima de células positivas 3. Soma do número de células positivas 4. Soma da superficie das células positivas 5. Soma das densidades de células positivas 6. Número significativo de células positivas 7. Densidade média de células positivas 8. Número máximo de células positivas 9. Mediana do número de células positivas 10. Densidade média de células positivas

[0044] No grupo A, critérios 2, 5, 7 e 10 são preferidos porque eles têm em conta a superficie do tecido analisado.

[0045] Grupo B 1. Células positivas individuais 2. Células positivas em aglomerados que contêm pelo menos 3 células positivas 3. Células positivas individuais ou agregados contendo pelo menos 3 células positivas 4. Células todas positivos 5. Unidades mais positivas, de preferência, três (3) unidades positivas 6. Unidades aleatórias, de preferência, três (3) unidades aleatórias.

[0046] No grupo B, os critérios 4 e 5 são preferidos porque o critério leva em conta todas as células positivas detectadas, e reduz a heterogeneidade selecionando as três unidades mais coradas. Por outro lado, usando 3-50 unidades aleatórias permite a obtenção de resultados muito rápidos dado que este procedimento pode evitar quantificar todo o tumor. O resultado da análise de uma lâmina corada é 10 - 100 vezes mais rápido.

[0047] Grupo C 1. Região tumor CT 2. Região tumor IM 3. Regiões tumorais CT e IM

[0048] No grupo C, o critério 3: "regiões tumorais CT e IM" é preferido porque este método é o mais poderoso em discriminar os pacientes, e onde a taxa de risco entre os grupos são as mais elevadas.

[0049] Exemplos de combinações de tais critérios incluem, por exemplo, marcadores de células, tais como CD3:

[0050) Outros exemplos de combinações de tais critérios, em que o sub-critério do grupo A é o número médio de células positivas incluem, por exemplo: 1 - número médio de células positivas (células individuais ou grupos que contenham pelo menos 3 células) nas unidades com uma superfície de tecido maior do que ou igual a 40% da superfície total da unidade nas regiões tumorais TC e IM 2- número de células positivas (células isoladas) nas unidades com uma superfície de tecido maior do que ou igual a 40% da superfície total da unidade nas regiões tumorais TC e IM, 3- mediana do número de células positivas (nos grupos que contenham pelo menos 3 células) nas unidades com uma superfície de tecido maior do que ou igual a 40% da superfície total da unidade nas regiões tumorais TC e IM, 4 - média da densidade de células positivas (células individuais ou grupos que contenham pelo menos 3 células) nas unidades com uma superfície de tecido maior do que ou igual a 40% da superfície total da unidade nas regiões tumorais TC e IM, 5 - mediana da soma do número de células positivas (células individuais ou em grupos que contêm pelo menos 3 células) nas unidades com uma superfície de tecido maior do que ou igual a 40% da superfície total da unidade nas regiões tumorais CT e IM, 6 - mediana da soma do número de células positivas (células isoladas) nas unidades com uma superfície de tecido maior do que ou igual a 40% da superfície total da unidade nas regiões tumorais TC e IM 7 - mediana da soma do número de células positivas (nos grupos contendo pelo menos 3 células) nas unidades com uma superfície de tecido maior do que ou igual a 40% da superfície total da unidade nas regiões tumorais TC e IM 8 - média da soma de a densidade de células positivas (células individuais ou em grupos que contêm pelo menos 3 células) nas unidades com uma superfície de tecido maior do que ou igual a 40% da superfície total da unidade nas regiões tumorais CT e IM 9 - média do número médio de células (células positivas individuais ou em grupos que contêm pelo menos 3 células) nas unidades com uma superfície de tecido maior do que ou igual a 40% da superfície total da unidade nas regiões tumorais TC e IM 10 - média do número médio de células positivas (células isoladas) nas unidades com uma superfície de tecido maior do que ou igual a 40% da superfície total da unidade nas regiões tumorais TC e IM

[0051] Para cada uma das combinações de critérios acima, e para cada marcador (por exemplo, marcador CD3, CD4, CDS, CD20, CD45RO, ou GZMB), um valor de limiar é determinado permitindo que se encontrar a amostra é considerada como positiva ou negativa sobre este critério.

[0052] Um valor de limiar, para cada marcador, em cada região, para cada método, é determinado. O valor do limiar é determinado utilizando corte de pacientes com o referido câncer, e tendo um limite arbitrário, o limiar para a média ou o valor médio do grupo, ou, de preferência, utilizando o p-valor ideal discrimina os pacientes, ou a proporção ideal de perigo discrimina os pacientes, ou o valor IAUC ideal discriminar os pacientes,

[0053] Para CD3, por exemplo, os valores adequados são cerca de:

[0054] Estes valores estão sujeitos a alterações, de acordo com os ajustes de calibragem do software utilizado como limiar de intensidade de sinal ou de detecção de células, e os ajustes com base no tipo de paciente analisados (tumor primário, metástase, estágios do câncer I, II, III, IV, tipo de tumor estudado (cólon, mama, pulmão, melanoma, etc.).

[0055] Cada valor de limiar de referência para cada marcador pode ser pré-determinado por realização de um método compreendendo as etapas de: m) fornecer pelo menos uma coleção de amostras de tecido tumoralselecionada a partir do grupo que consiste em: i) um conjunto de amostras de tecido tumoral de doentes de câncer convencionalmente classificados como Tis ou Tl, ou T2, ou T3 ou T4 e NO, ou Nl, ou N2, N3 e ou MO ou Ml, tendo sofrido um tratamento anti-câncer, e, posteriormente, não tendo a reincidência do câncer ou nenhuma recorrência do câncer após o tratamento antineoplásico; ii) uma coleção de amostras de tecido tumoral de pacientes com câncer convencionalmente classificados como Tis ou Tl, ou T2, ou T3 ou T4 e NO, ou Nl ou N2, N3 e ou MO ou Ml, depois de ter sido submetido a tratamento anti-câncer, e posteriormente ter recaidas de câncer ou recorrências após o tratamento antineoplásico. n) para a quantificação de cada amostra de tecido tumoral num composto de coleção de amostras de tecido tumoral fornecidos na etapa m), o referido marcador biológico, em que um grupo de valores de quantificação para o dito marcador biológico e para o referido conjunto de amostras de tecido tumoral seja obtido; o) o cálculo, a partir do dito conjunto de valores de quantificação obtidos no final da etapa n) , o valor médio para a quantificação do dito marcador biológico, segundo o qual um valor de referência pré-determinado para o referido marcador biológico que está correlacionado com um prognóstico do câncer especifico ou uma resposta para tratamento é obtido. 0 "tratamento anti-câncer", que é referido na definição da etapa m) acima referem-se a qualquer tipo de terapia do câncer sofrido por pacientes com câncer antes da coleção das amostras de tecido tumoral, incluindo radioterapia, quimioterapia, bioterapia, imunoterapia e cirurgia, por exemplo, a ressecção cirúrgica do tumor.

[0056] Em vista de um valor minimo de significância estatística, o valor de referência de limiar pode ser um intervalo de valores. Por exemplo, em uma escala hipotética de 1 a 10, se o limiar é ideal 5, uma gama adequada (exemplo) pode ser de 4 - 6. Portanto, um paciente pode ser avaliado comparando os valores onde os valores superiores a 5, por exemplo, indicar um bom prognóstico e valores inferiores a 5 indicam, por exemplo, um prognóstico ruim; ou um paciente pode ser avaliado comparando os valores e comparando os valores em uma escala, em que os valores acima da faixa de 4 -6, por exemplo, indicam um bom prognóstico e valores abaixo da faixa de 4-6, por exemplo, indicar um mau prognóstico, com valores caindo dentro da faixa de 4 - 6, indicando um prognóstico intermediário.

[0057] Em certas concretizações preferidas da etapa o), o método para determinação de valores de limiar acima, a referida informação relacionada com a evolução clinica real dos pacientes são selecionados a partir do grupo que consiste de (i) a duração da sobrevivência livre de doença (DES) e (ii) a sobrevida global (OS).

[0058] Para segregar os pacientes em grupos, de acordo com a sua sobrevivência esperada, a disponibilidade de um valor de referência pré-determinada para mais de um marcador biológico é o preferido. Assim, em geral, um valor de referência ou mais predeterminado (s) é (são) determinado por uma pluralidade de marcadores biológicos indicativos do estado da resposta imune contra o câncer que estão aqui abrangidos, por simplesmente repetindo qualquer um dos métodos para a obtenção ds valores de referência predeterminado que são descritos acima, para a pluralidade de marcadores biológicos.

[0059] O valor de referência predeterminado preferido consiste em um valor médio para a quantificação do marcador biológico de interesse que distingue o prognóstico do câncer de mau e bom prognóstico da doença.

[0060] A precisão de um valor de referência pré- determinado especifico aumenta com o número de amostras de tecidos que são utilizados para a obtenção de valores de quantificação para um marcador biológico especifico e, assim, para o cálculo de um valor médio (valor de referência predeterminado) , que está associado com um resultado câncer especifico. De um modo preferido, tendo em vista a obtenção de valores de referência predeterminados altamente relevantes para cada marcador biológico de interesse, os referidos valores de referência predeterminados correspondem ao valor médio de uma pluralidade de valores de quantificação do referido marcador medido em amostras de tecidos originários do mesmo número pluralidade de câncer de pacientes que se submeteram a um resultado clinico especifico.

[0061] Mais de preferência, para avaliar valores de referência predeterminados precisos, os valores de referência são pré-determinados a partir de pelo menos 50 valores de quantificação, por um marcador biológico especifico, assim, usando amostras de tecidos provenientes de pelo menos 50 pacientes portadores de câncer que se submeteram a um resultado clinico especifico ruim ou bom, por exemplo, DES ou OS de mais de 5 anos após o diagnóstico. Em concretizações preferidas, um valor de referência pré-determinado é obtido a partir pelo menos, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480 , 490, 500 ou mais valores de quantificação para um marcador biológico especifico.

[0062] Outras concretizações para predeterminar um valor de referência estão descritas nos documentos EP-A- EP1943520 e WO 2007045996.

[0063] Um método mais preferido da invenção é um método totalmente computorizado.

[0064] O método acima pode ser implementado como se segue:

[0065] Uma amostra de tecido tumoral é preparada. A amostra de tecido tumoral é, de preferência, fixado em formalina e embebidos em fixador rigido, tal como parafina (cera) ou epóxi, o qual é colocado num molde e, posteriormente endurecido para produzir um bloco, que é facilmente cortado. Os pedaços finos de material são preparados utilizando um micrótomo, colocados em uma lâmina de vidro e submetidos a imuno-histoquimica, por exemplo, utilizando um IHC automatizar, tal como Benchmark® XT, para a obtenção de lâminas coradas. Se vários marcadores devem ser considerados, diferentes lâminas coradas são preparadas.

[0066] Quando o número ou a densidade de células imunes intratumorais de cada unidade foi avaliada de acordo com o método anterior, uma das combinações acima dos critérios é selecionar um valor que é obtido para o marcador ou cada marcador. O valor obtido é comparado com o valor limiar / referência do marcador e da combinação de critérios.

[0067] Se o valor obtido é superior ao valor de limiar / referência, o tumor é atribuido uma cotação tais como "+" ou "elevada", e se o valor obtido é sub o valor de limiar / referência, o tumor é atribuido uma cotação tais como " ou " baixo".

[0068] Ao implementar o método acima com um único marcador e considerando separadamente CT e do IM, o tumor e, portanto, o paciente pode ser alta / alta, alta / baixa, baixa / alta, baixa / baixa. Três categorias de pacientes podem ser obtidos: "2 elevado", "1 alto", "0 alto". Em tal caso, uma avaliação imunológica (ou immunoscore) de 0 a 2, pode ser obtida.

[0069] Ao implementar o método acima com um marcador de dois e considerando quer (e de preferência) o CT ou o IM, o tumor e, portanto, o paciente também pode ser alta / alta, alta / baixa, baixa / alta, baixa / baixa. Três categorias de pacientes podem ser obtidas: "2 elevado", "1 alta", "0 alto". Além disso, em tal caso, uma avaliação imunológica (ou immunoscore) de 0 a 2, podem ser obtidos.

[0070] Ao implementar o método acima com dois marcadores e considerando separadamente do CT e do IM, o tumor e, portanto, o paciente pode ser alta / alta / alta / alta, baixa / baixa / baixa / baixa, alta / alta / alta / baixa, de alta / alto / baixo / baixo e alto / baixo / baixo / baixo. Para os três últimos, a avaliação pode ser independentemente do marcador e da área positivo CT ou IM.

[0071] Qualquer convenção pode ser usada. Por exemplo, "+", "positivo", "alto", "Hi" são equivalentes para avaliar o mesmo resultado (muitas células coradas).

[0072] Em tal caso, uma avaliação imunológica (ou immunoscore) num intervalo de 0 a 4 podem ser resumidos como se segue: Classificação 4: 4 (quatro) avaliações "altas" Classificação 3: 3 (três) avaliações "altos" Classificação 2: Dois (2) avaliação "alta" Classificação 1: Um (1) avaliação "alta" Classificação 0: Zero (0) avaliação "alta".

[0073] O método, de acordo com a invenção, tem propriedades vantajosas por causa da sua reprodutibilidade, repetibilidade, e a possibilidade de realizar o método em prática de rotina.

[0074] 0 presente processo permite a obtenção de valores numéricos para todo o tumor se desejar, e não apenas informações limitadas a microarrays de tecido (TMA).

[0075] O escopo da invenção pode ser melhor compreendido por referência aos exemplos dados abaixo, cujo objetivo é explicar as vantagens da invenção.

[0076] Um objeto da presente invenção é também um kit para a implementação do método acima, compreendendo um suporte que compreende os valores de limiar de referência.

[0077] Um outro objeto da presente invenção é um computador dotado de um software para implementar o método acima.

[0078] As condições preferidas para implementar os métodos descritos acima também se aplicam aos outros assuntos da invenção previsto acima, particularmente, os kits para a execução dos ditos métodos acimas. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0079] A Figura 1 representa uma imagem de um pedaço de corte de tecido detectada em uma imagem digital.

[0080] A Figura 2 mostra a imagem de um pedaço da secção de tecido da Figura 1 dividido em áreas de propriedades similares, de acordo com um ou vários critérios.

[0081] A Figura 3 é uma fotografia similar à figura 2, em que o tumor e a margem invasiva do tumor foram definidos.

[0082] A Figura 4 é uma imagem que mostra três áreas de secção de tecido: Tumor no tecido superior, saudável e na parte inferior da margem invasiva entre estas áreas.

[0083] A Figura 5 mostra uma grade de referência de tamanho com unidades de forma quadrada, adaptada ao tamanho do tumor analisado (tumor e margem invasiva). O tumor está na cor cinza e está na forma V.

[0084] A Figura 6 é uma imagem de uma unidade tipica. Os pontos pretos correspondem a células coradas, ou seja, células que contêm o marcador.

[0085] A Figura 7 mostra uma curva representativa que mostra a qualidade da coloração obtidoa para uma unidade de grade como uma função da intensidade da coloração castanha para todas as células positivas detectadas pelo software. A avaliação da qualidade da coloração é, preferencialmente, implementado em todas as unidades de uma secção de tecido.

[0086] A Figura 8 é uma imagem do tumor. De acordo com o número de células coradas em uma dada unidade, de uma cor mais ou menos escura foi atribuido pelo software.

[0087] A Figura 9 é uma ampliação de uma parte da Figura 6, em que as células coradas (pretas) são melhor evidenciadas.

[0088] A Figura 10 é um diagrama de blocos de um sistema para a realização da invenção.

[0089] As Figuras 11 e 12 são diagramas de fluxo que ilustram um exemplo de programação de um procedimento para a execução de etapas do método, de acordo com a invenção.

[0090] A Figura 13 ilustra o método de quantificação do exemplo 2 e, particularmente, uma detecção de células CD3+ em uma seção do tumor (análise de um conjunto de diapositivos câncer colo-retal). Desenho superior: limites da amostra de tecido, tumor e margens mais próximo desenho da secção de tecido é dividido em três áreas: tumor no canto superior direito, o tecido saudável à direita esquerda e inferior e invasivo margem área mais clara.

[0091] A Figura 14 ilustra o método de quantificação do exemplo 2 e, particularmente, uma detecção de células CD8 + em uma secção do tumor (análise de um conjunto de diapositivos câncer colo-rectal). Desenho superior: limites da amostra de tecido, tumor e margens mais próximo desenho da secção de tecido é dividido em três áreas: tumor no canto superior direito, o tecido saudável à direita esquerda e inferior e área da margem invasiva mais clara.

[0092] A Figura 15 ilustra um cálculo de um valor limite ideal, de acordo com os associados os valores de p para a sobrevivência livre de doença (testes de log rank) e mostra os valores de p versus uma densidade de 20 - 2000 células CD3 + / mm2.

[0093] A Figura 16 ilustra a percentagem de histogramas de distribuição da intensidade da coloração para CD3 e CD8 durante dez unidades diferentes de uma fatia de tumor coradas.

[0094] As Figuras 17 - 19 ilustram histogramas que representam a percentagem de células positivas na detecção de MI de TC e regiões tumorais que diz respeito à intensidade de coloração das células, depois de imunocoloração CD3.

[0095] Um procedimento de acordo com a invenção para a obtenção de uma imagem que mostra três áreas de uma secção de tecido de um tumor é mostrada na Figura 10.

[0096] 0 procedimento começa na etapa 10 "delimitação das fronteiras do tecido", quando uma foto digital de um pedaço é analisada para a obtenção dos limites da secção de tecido.

[0097] Em seguida, na etapa 12 "segmentação da amostra de tecido em áreas homogêneas", parâmetros como cor da área, a intensidade de contra-coloração, a densidade da área para núcleos, compacidade, vazio, a densidade do tecido, granulometria, forma, tamanho dos elementos detectados e área, ou vários destes parâmetros são analisados e a secção de tecido é dividida em áreas homogêneas de propriedades semelhantes, de acordo com os referidos parâmetros. Normalmente, para uma amostra de tecido que tem uma superfície de cerca de 1 - 10 cm2, 100 - 10.000 áreas, tipicamente 2.000-4.000 áreas homogêneas são obtidas.

[0098] Em seguida, na etapa 14 "delimitação de tumor", o computador (ou um técnico versado no assunto, geralmente, um médico), digitalmente delimita o tumor e da margem invasiva em vista do resultado da etapa 12, tendo em consideração parâmetros como o tamanho e morfologia do núcleo da célula, cor de núcleo da célula, etc. Quando um técnico versado no assunto implementa esta etapa, por exemplo, ele pode utilizar o mouse do computador ou um estilo para os mesmos.

[0099] Em seguida, na etapa 16 "delimitação do centro do tumor e margem invasiva", a secção de tecido é dividida em três áreas: o tumor, o tecido saudável e margem invasiva. O software define um espaço intermediário denominado "margem invasiva" entre tecido saudável e o tumor, por exemplo, 500 μm de largura de cada lado do limite do tumor, por conseguinte, tendo uma largura de 1 mm. Na verdade longos estudos feitos pelos inventores têm evidenciado que a largura de 1 mm é a mais representativa da margem invasiva.

[00100] Na etapa 18 de "fornecimento de uma grade adaptada ao tamanho do tumor", uma grade retangular adaptada ao tamanho do tumor, e margem invasiva é criada. A grade retangular é composta de unidades de forma quadrada tendo lados tipicamente de 500 a 1000 μm de comprimento, de preferência, cerca de 800 μm.

[00101] Na etapa 20 "contagem de unidade de células marcadas por unidade", células coradas são contadas levando em consideração parâmetros, tais como a cor de células, o tamanho esperado de uma única célula, a forma das células, ou a intensidade da coloração.

[00102] Na etapa 22 "divisão do número de células marcadas por unidade de superficie", o número de células coradas (positivas) é dividido pela área da superficie de uma unidade (por exemplo, 0,64 a 10'6 m2 para um quadrado com lados de 800 μm em comprimento. A densidade de células coradas (positivas) por unidade de superficie é assim obtida.

[00103] Na etapa 24, "atribuição de cor para cada unidade de acordo com a densidade de células coradas", o software atribui uma cor a cada unidade como uma função da densidade, por exemplo, de amarelo claro para vermelho escuro.

[00104] Como mencionado anteriormente, este procedimento pode ser aplicado separadamente para cada marcador, se mais do que um marcador é utilizado no método, por exemplo, o procedimento é executado para as células CD3 e, em seguida, para as células CD8.

[00105] Um procedimento, de acordo com a invenção para segregar pacientes em grupos é mostrado na Figura 12. Neste exemplo, a seguinte combinação de parâmetros tem sido selecionado: Uma densidade média de células positivas para B, três unidades mais manchada e as regiões C do tumor TC e IM.

[00106] O procedimento começa na etapa 30 "Detecção das 3 unidades mais manchadas no centro tumor". "Tumor centro" é utilizado, em contraste com a "margem de tumor". O software detecta as 3 unidades mais manchada (por exemplo unidades de vermelho mais escuro) de acordo com os dados da etapa 24, acima.

[00107] Na etapa 32 "Cálculo de densidade média de células positivas no centro do tumor", a densidade média de células coradas (positivas) é calculada.

[00108] Na etapa 34 "valor de referência para a densidade média de células positivas no centro do tumor", o valor / referência de limiar é fornecido por uma base de dados contendo o valor limiar / referência para a referida combinação de parâmetros e o referido marcador. A base de dados compreende, preferencialmente, o valor de limiar / referência para cada combinação de parâmetros e cada marcador.

[00109] Na etapa 36 "Comparação de densidade média de células positivas no centro do tumor com o valor de referência", o valor da etapa 32 é comparado com o valor limiar / referência da etapa 34 e fornece as informações necessárias. Se o valor da etapa 32 está acima do valor de limiar / referência da etapa 34, a amostra é considerada como "ALTA", por exemplo, como "BAIXA" no caso oposto.

[00110] O procedimento é implementado, por exemplo, para os dois indicadores, para as regiões de tumor CT e IM.

[00111] Uma pontuação pode ser obtida a partir da referida informação e a sobrevivência esperada de um paciente pode ser avaliado de um modo confiável por causa da intervenção humana e de avaliação estando limitada ao minimo. EXEMPLOS Exemplo 1: FABRICAÇÃO DE PEDAÇOS CORADOS DE TECIDO TUMORAL

[00112] Duas seções de parafina de tecido de 4-microns de bloco de tumor selecionados foram feitas e depositadas em água deionizada em lâminas de microscópio (Superfrost- além de slides) para imunohistoquimica. Cortes de parafina do tecido foi seco a temperatura ambiente e incubados a 56° C - 58 ° C durante a noite.

[00113] Imunomarcações foi realizada com anticorpos certificadas IVD para CD3 e CD8 (CONFIRMAR CD3 (2GV6, Ventana) e CD8 (C8 / 144B; Dako) ) . O protocolo associado continha as principais etapas de bloqueio, a recuperação de epitopos e detecção. A hematoxilina de Mayer modificado destinado a coloração núcleos celulares em pedaços foi aplicado (Hematoxilina II, Ventana) para detectar de forma otimizada as células marcadas com o software. O protocolo usado com o automatizor XT Referencial (Roche- Ventana) foi:

[00114] CC1 é um tampão de tris com um pH ligeiramente básico. O diluente de anticorpo primário para CD8 foi K004 (Clinisciences).

[00115] PEDAÇOS CORADOS DIGITALIZADOS DE TECIDO TUMORAL PARA OBTENÇÃO DE FOTOS DIGITAIS

[00116] Uma numeração das lâminas de imagem digital foi realizada com um scanner (NanoZoomer 2,0-HT, Hamamatsu) em um modo de 20X. O formato da imagem digital era compativel com o sistema de análise de imagem desenvolvedor XD Definiens. Para evitar cores não homogêneas nas imagens digitalizadas, a calibração foi feita para o balanço de branco, Dark & Brilhante e para o sombreamento. Exemplo 2: ANÁLISE DOS PEDAÇOS CORADOS POR TRATAMENTO POR SOFTWARE

[00117] . Um patologista submeteu a imagem digital de cada imunohistoquimica para CD3 e CD8 e começou a análise com um software dedicado a análise de imagem (Definiens desenvolvedor XD)

[00118] . O processo semi-automático contém uma etapa para:

[00119] - A detecção automática do tecido,

[00120] - A segmentação automática do tecido em unidades,

[00121] - A remoção manual dos artefatos (dobras, rasgos, bolhas, . . . ) ,

[00122] - A seleção manual da área de tumor pelo patologista, utilizando uma escova como ferramenta digital,

[00123] - A detecção automática da margem invasiva,

[00124] - A detecção automática das células coradas em cada unidade do tumor,

[00125] - A análise do gráfico para a distribuição, a média e mediana das intensidades de coloração de células positivas detectadas pelo software, a fim de validar a imunocoloração e a quantificação de células coradas; esta análise é implementado em cada unidade, em todas as unidades da secção de tecido,

[00126] - Os valores e a distribuição das intensidades de coloração é comparado com um valor de referência, respectivamente, para CD3 e CD8; se as intensidades de coloração têm valores semelhantes (mesmo valor de mais ou menos cerca de 20%), o tecido amostra é considerada a maior precisão manchado; um exemplo é dado a seguir,

[00127] - A identificação e validação das três unidades mais infiltradas em cada região do tumor (TC e IM),

[00128] - O cálculo da densidade média das três unidades mais infiltradas em cada região do tumor. Análise CD3 IHC

Análises IHC CD8

[00129] Para determinar se o paciente é ou Hi ou Lo para cada marcador, em cada região do tumor, a densidade média de mais de 3 unidades infiltradas são comparadas com a densidade média do limiar ideal, anteriormente definida no estudo da coorte referente.

[00130] Na coorte referente de cânceres colorretais clinicamente localizadas (UICC TNM fase 1-11), o limiar ideal para discriminar os pacientes para a sobrevida livre de doença são:

[00131] Para o caso em análise, o tumor é Hi / Hi para CD3 Hi / Hi para CD8

[00132] Por conseguinte, o Immunoscore é 1 - 4 Exemplo 3: EXEMPLO DE CÁLCULO DE UM VALOR DE LIMIAR IDEAL DE ACORDO COM OS VALORES P ASSOCIADOS PARA SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA (TESTES DE LOG RANK)

[00133] Cálculo do valor de p para a doença de sobrevivência livre (testes de log rank) para cada valor 20 - 2000 células CD3+ / mm2, o número de pacientes (proporcionando assim grupos de pacientes), com uma densidade de células CD3 + no tumor (CT região) (circulos pontos em curva inferior) menos do que o referido valor foi determinado.

[00134] O valor de p para os testes de log rank comparando grupos de pacientes para cada valor limite 20 - 2000 CD3 + células / mm 2 no tumor (circulo pontos e respectiva curva) foi calculado.

[00135] Os resultados são apresentados na figura 15.

[00136] O eixo dos X representa células densidades expressos em células / mm2, o eixo Y representa os valores de classificação P-Log (circulo pontos e curva correspondente na parte inferior da figura). A taxa de risco (pontos quadrados e respectiva curva) e indice de concordância IAUC (curva fine) também estão representados.

[00137] Os pacientes são classificados como "Lo" (abaixo de um determinado ponto de corte), e como "Oi" (acima deste ponto de corte). Valores entre 20 e 2000 células / mm2 são testadas neste exemplo. Por exemplo, para o valor de 100 células / mm2, os doentes com menos de 100 células CD3 + células / mm 2 são no grupo "Lo", e os pacientes com células 100 ou mais CD3 + / mm 2 são no grupo "Oi". As curvas de Kaplan-Meier são plotadas comparando Hi e pacientes Lo, e posto Log P-valor é calculado (P = 0,01, neste exemplo).

[00138] Os resultados mostram (ver Fig. 15) que valoriza entre 70 e 700 células / mm2 são significativas para CD3 + no tumor (parcelas redondas) (P <0,05). O limiar de P- valor ideal é fornecido pelo valor correspondente ao valor minimo de P, que se encontra, neste exemplo, a 200 células / mm2. Por conseguinte, o valor do limiar óptimo é estabelecido em 200 células / mm2.

[00139] Um valor limiar ideal pode ser determinado utilizando uma abordagem semelhante para cada marcador, em cada região do tumor, para outros do que a densidade de células positivas valores. Exemplo 4: REPETIBILIDADE E REPRODUTIBILIDADE DA IMUNOHISTOQUÍMICA

[00140] A repetibilidade e reprodutibilidade para CD3 e CD8 imunohistoquimica foram estudados, de acordo com métodos diferentes. (Critério das três unidades mais coradas). Repetibilidade do método 1:

[00141] Uma lâmina de um tumor é imunocorados (para CD3 ou CD8) e numerado com o scanner. A imagem digital é analisada 10 vezes com o software de análise de imagem por um mesmo operador (por outras palavras, 10 análises da mesma imunocoloração são feitos por um mesmo operador). O coeficiente de variação (CV) é determinado.

[00142] Resultados: CD3; O CV para a região do CT é de 3,20%. O CV para a região do IM é de 7,1 a 1%. O CV para a análise do tumor (CT e IM) é 5,16%. CD8; O CV para a região do CT é um 0,88%. O CV para a região do IM é de 3,07%. O CV para a análise do tumor (CT e IM) é 2,48% Repetibilidade do método 2:

[00143] São analisadas quatro amostras de tumor. Para cada amostra de tumor, quatro lâminas adjacentes são executados. Os pedaços são imunocorados (para CD3 ou CD8) na mesma experiência e numerized com o scanner em uma mesma corrida. As imagens digitais são analisadas com o software de análise de imagem em uma mesma corrida por um mesmo operador. O coeficiente de variação (CV) é determinado para cada IHC (CD3 ou CD8) entre as lâminas adjacentes.

[00144] Resultados: CD3; Tumor #1-4 O CV para a região do CT é 5,41%. 0 CV para a região do IM é 10,59%. 0 CV para a análise do tumor (CT e IM) é 8,00%. CD8; Tumor #1-4 0 CV para a região do CT é de 8,73%. 0 CV para a região do IM é de 9,09%. 0 CV para a análise do tumor (CT e IM) é 8,91%. Reprodutibilidade do método 1:

[00145] - Um pedaço de uma amostra de tumor a partir de uma matriz TissueMicro (TMA) é analisado. - O pedaço é imunocorado (para CD3 ou CD8) e numerado com um scanner. - As imagens digitais são analisadas com o software de análise de imagem em 12 pistas para CD3 e 24 pistas por um mesmo operador (por outras palavras, 12 análises da mesma imunocoloração são feitos por um mesmo operador).

[00146] - O coeficiente de variação (CV) é determinado.

[00147] Resultados: CD3; O CV para o local TMA é <1%. CD8; O CV para o local TMA é <1%. Reprodutibilidade do método 2:

[00148] - Um pedaço de uma amostra de tumor é imunocorada (para CD3 ou CD8) e numerada com o scanner. A imagem digital é analisada 10 vezes com o software de análise de imagem por dois operadores. 0 coeficiente de variação (CV) é determinado entre ambos os operadores.

[00149] Resultados: CD3; O CV para a região do CT é de 3,42%. O CV para a região do IM é 7,03%. O CV para a análise do tumor (CT e IM) é 5,23%. CD8; O CV para a região do CT é de 2,72%. O CV para a região do IM não é aplicável (não detectável IM). O CV para a análise do tumor (CT) é 2,72% Reprodutibilidade do método 3:

[00150] - São analisadas duas amostras de tumor. Para cada amostra de tumor, cinco lâminas adjacentes são executadas (C1-C5). Os pedaços são imunocorados (CD3 e CD8) em corridas diferentes e numerados em corridas diferentes. As imagens digitais são analisadas com o software de análise de imagem por dois operadores (operador N° 1 para pedaços Cl, C3 e C5; operador N° 2 para pedaços C2 e C4). 0 coeficiente de variação (CV) é determinado para cada IHC (CD3 e CD8) entre ambos os operadores de lâminas adjacentes.

[00151] Resultados: CD3; O CV para a região do CT é 17,89%. O CV para a região do IM é de 5,37%. O CV para a análise do tumor (CT e IM) é de 11,68%. CD8; 0 CV para a região do CT é 14,90%. 0 CV para a região do IM é 8,71%. 0 CV para a análise do tumor (CT e IM) é 2,72% Exemplo 5: EXEMPLOS DETALHADOS DE IMPLEMENTAÇÃO DO CONTROLE DE QUALIDADE DA IMUNOCOLORAÇÃO PARA CD3 E CD8

[00152] 10 unidades imunocoradas para CD3 e CD8, em conformidade com o exemplo 1 foram selecionadas aleatoriamente. Foram determinadas as intensidades médias das unidades de +/- 1 SD.

[00153] Os valores médios obtidos são: CD3: 239 +/- 43 (intervalo: 282-196), CD8: 217 +/- 44 (intervalo: 261 -173). Os referidos valores são considerados como valores de referência para a validação da qualidade de imunocoloração de cada amostra de um determinado paciente. As faixas acima correspondem a uma diferença de mais ou menos 20% do valor de referência. O técnico versado no assunto entende que, por várias razões, o limiar de tolerância pode ser ampliado (por exemplo, mais ou menos 22% ou 25%), ou, de preferência, estreitado (por exemplo, mais ou menos 5%, 8%, 10%, 15 %). Equipe 1

[00154] 10 unidades imunocoradas para CD3 de acordo com o exemplo 1 foram selecionadas aleatoriamente. Foram determinadas as intensidades médias das unidades de +/- 1 SD. O resultado obtido é: média = 234 +/- 64. O histograma para a distribuição da intensidade de coloração para CD3 mostra que a intensidade da coloração de CD3 obtido é próximo da intensidade da coloração de CD3 referência, dentro do intervalo: 282 - 196.

[00155] A amostra é, portanto, considerada como corretamente imunocorada. A densidade de células imunes coradas medida pela equipa 1: CT: 1795 células / mm2, IM: 2319 células / mm 2 é validado. Equipe 2

[00156] O mesmo protocolo foi implementado por uma segunda equipe que trabalha no pedaço ao lado do pedaço examinado pela equipe 1.

[00157] 0 resultado obtido é: média = 251 +/- 56, dentro do intervalo: 282 - 196. Tendo em vista o valor de referência acima, a amostra é, portanto, considerada como corretamente imunocorada.

[00158] A densidade de células imunes coradas medida pela equipa 1: CT: 1665 células / mm2, IM: 2198 células /mm 2 é validado.

[00159] Os valores de densidades de CD3 em regiões tumorais [núcleo do tumor (CT) e da margem invasiva (IM)] obtido por equipes 1 e 2 para pedaços adjacentes são de fato similar. Equipe 3

[00160] 0 mesmo protocolo foi implementado por uma terceira equipe que trabalha no outro pedaço adjacente ao pedaço examinado pela equipe 1. 0 resultado obtido é: média = 148 +/- 27. 0 histograma para a distribuição da intensidade de coloração para CD3 mostra que a intensidade da coloração de CD3 obtido é remota à intensidade da coloração do CD3 de referência (fora da faixa: 282 - 196).

[00161] A amostra é, portanto, considerada como incorretamente imunocorada.

[00162] A densidade de células imunes coradas medida pela equipa 3: CT: 914 células / mm2, IM: 1707 células / mm2 não é validada.

[00163] Os resultados anteriores mostram que, na ausência de uma referência e de um controle de qualidade de imunocoloração, resultados muito diferentes e imprecisos podem ser obtidos.

Claims

1. Método para avaliação de um número ou a densidade de células imunológicas em tecidos tumorais caracterizado pelo fato de que compreende as etapas que consistem em: a. fornecer uma ou mais fatias imunocoradas de seção de tecido obtidas por um sistema automatizado de coloração de lâminas usando anticorpos que se ligam especificamente a marcadores expressos pelas células imunológicas, b. proceder à digitalização das lâminas da etapa a. pela captura de varredura de alta resolução, em que uma imagem digital de alta definição da lâmina a ser analisada é obtida, c. detectar a porção da seção de tecido sobre a imagem digital, d. analisar a porção da secção de tecido para definir (i) um tumor (CT) e (ii) uma margem invasiva do tumor (IM), e. fornecer uma grade de tamanhos de referência com unidades uniformemente distribuídas tendo uma mesma superfície, a dita grade sendo adaptada ao tamanho do tumor a ser analisado, e1. verificar a qualidade da immunocoloração, por meio de: f. calcular a distribuição da intensidade de coração de células positivas detectadas para cada unidade da grade e para e região total do tumor, representando a referida distribuição, g. para cada fatia, calcular os valores da média, mediana, mínimo e/ou máximo da intensidade de coração de todas as células positivas detectadas, h. comparar os valores e a distribuição da intensidade de coração com uma referência de faixa de intensidade normal determinada para cada marcador, e f. detectar e quantificar as células coradas de cada unidade, em que o número ou a densidade de células imunológicas coradas de cada unidade é avaliada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção e quantificação de células coradas de cada unidade é implementada separadamente no tumor (CT) e na margem invasiva do tumor (IM).

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que os anticorpos são selecionados no grupo constituído por anticorpos específicos para marcadores CD3, CD4, CD8, CD20, CD45RO ou GZMB.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que dois ou três anticorpos selecionados no grupo que consiste nas seguintes combinações: CD3+CD8, CD3+CD45RO, CD3+CD20, CD3+GZMB, CD8+CD20, CD8+GZMB, CD8+CD45RO, CD20+GZMB, CD20+CD45RO, GZMB+CD45RO, CD4+CD8, CD4+CD45RO, CD4+GZMB, CD4+CD20, e todas as combinações de 3 marcadores entre os marcadores CD3, CD8, CD20, CD45RO, CD4 e GZMB são utilizados.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que um IHC automatizado é usado para implementar a etapa a).

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a análise da porção da seção de tecido para definição dos limites (i) do tumor (TC) e (ii) da margem invasiva do tumor (IM) é implementado por um software apropriado.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as unidades hexagonais, quadradas ou retangulares tendo uma superfície de 10 10-9 m 2 a 1000 10-9 m2 são usados.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o número ou densidade avaliado de células imunológicas coradas de cada unidade é selecionado a partir dos valores do grupo A: - número máximo de células coradas, - densidade máxima de células coradas, - soma do número de células coradas, - soma da superfície de células coradas, - soma das densidades de células coradas, - número médio de células coradas, - densidade média de células coradas, - número máximo de células coradas, - média do número de células coradas.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado pelo fato de que compreende ainda a detecção de células ou de unidades de acordo com um critério de Grupo B, consistindo de: - células coradas individuais, - células coradas em clusters contendo pelo menos 3 células coradas, - células coradas individuais ou grupos contendo, pelo menos 3 células coradas, - todas as células coradas, - unidades mais coradas, - unidades aleatórias.