CN107209934B - 用于定量分析异质生物标志物分布的方法、系统和装置 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于检测和描述细胞样本中的异质性的方法、系统和装置。针对细胞样本的图像内的一个或多个感兴趣区域（AOI）生成多个视场（FOV）。来自每个FOV的超光谱或多光谱数据被组织到包含一个或多个z层的图像栈中，其中每个z层包含FOV中每个像素处的单一标志物的强度数据。聚类分析被应用于图像栈，其中聚类算法对跨z轴的各层具有相似比例的可检测标志物强度的像素进行分组，从而生成具有相似表达模式的多个聚类。

Description

用于定量分析异质生物标志物分布的方法、系统和装置
相关申请的交叉引用
在此要求2014年12月03日提交的美国临时专利申请62/086,840的权益，该美国临时专利申请的内容据此通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及自动图像采集和分析领域，特别地应用于疾病的微观评价。
背景技术
用于评价组织的历史上可用的技术已经允许仅孤立地常规评价单一基因或蛋白质表达/激活生物标志物。已经清楚的是，这些有价值的单一生物标志物不提供全貌(complete picture)。蛋白质表达和激活的测序技术和生物化学测量已聚焦于均质组织样本，并且在这种情况下，表达模式或基因变化的空间背景丢失。虽然通过生物化学测定（assay）和测序技术获得的信息是有用的，但是在信息内容中仍然存在重要的缺口，并且由来自许多细胞的蛋白质含量的平均化导致不完全了解肿瘤内的细胞的表达和激活模式。
现在最近的研究表明，存在由常规测定技术漏掉的重要的信息。一种这样的情况是肿瘤中存在多重基因重排或畸变，并认识到如果不同的重排出现在相同细胞中，它们可能具有协同效应（Zong等，2009，Goldstein等，2010）。已经报道了基因的肿瘤间和肿瘤内异质性，并且这种异质性被认为促成治疗失败和治疗中的耐药性（Gerlinger等，2012，Marusyk等，2012）。因此重要的是不仅认识到肿瘤具有多重基因重排或缺失，而且还认识到这些是发生在相同细胞、不同细胞还是各情况的组合中（Svensson等，2011）。表型异质性和蛋白质表达特征也已被表明是评价肿瘤组织中的生物标志物的重要考虑因素（Yap等，2012，Marusyk等，2012）。表型异质性可能由基因或后成（epigenetic）原因引起，并被认为促成耐药性和癌症生长的复发。
因此，表征组织中多个生物标志物并且测量组织内和组织间的所述生物标志物的存在和水平的异质性的能力将提供用于理解和表征各种疾病状态的重要信息。另外，识别和测量组织中具有重要生物标志物的不同分布的区域的能力可以提供重要信息，以告知靶向和组合疗法的发展。
其他人已尝试使用不同的聚类方法和替代复用方案来分析表达异质性（Gerdes等，2013；Qian等，2010）。层次聚类方法需要进行重大假设。知道确定要在哪里绘制边界以形成新聚类的各点之间的距离是分层聚类算法的关键参数。可替代地，一些分层算法（例如Ward的方法（Ward 1963））要求输入聚类数作为参数。然而，截止阈值（距离）和预期聚类的数量两者都是常常未知的参数。另外，一些算法强行要求关于偶数聚类大小（例如k-means）、作为不同聚类成员的点之间的距离（分层聚类）的假设或关于待发现的聚类的预期数量的假设（分层聚类，k均值）。尽管被广泛使用，但分层方法更适合于以不连续尺度（例如+，++，+++，++++）测量的变量。因此，分层聚类算法对于表达异质性分析的要求并不理想。替代的基于密度的工具，（诸如FLOCK（Qian等，2010）具有局限性，因为必须估计用于计算密度和密度截止阈值的超地带(hyper-region)的大小的参数，并将其输入到算法中以实现聚类确定。
最近，使用诸如SPADE（Qiu等，2012；Giesen等，2014）和viSNE（El-ad等，2013）之类的工具以用于映射具有高维度多参数表达模式的细胞聚类之间的分层关系。这种工具的重点是映射表达模式之间的相似关系，以及在这个意义上，向多参数表达异质性的性质提供不同而互补的窗口。诸如SPADE和viSNE的工具是在细胞计数法的背景下开发的，并且其更重视高维空间中细胞群体之间的映射关系，以便使组织中的表达模式的空间位置的背景之外的群体可视化并对其分类。在这个意义上，SPADE和viSNE代表映射工具，而不是聚类工具。
迄今为止，我们不知道在细胞和组织样本的原始空间环境中充分识别生物分子的表达、定位和/或激活的异质性的聚类的任何系统或方法。
在组织样品的多重载玻片(multiplex slide)中，用特定的生物标志物特异性染色剂同时对不同的细胞核和组织结构染色，这些染色剂可以是显色或荧光染料，每种荧光染料在光谱形状和扩散方面具有不同的光谱特征。不同生物标志物的光谱特征可以是宽或窄光谱带的并且在光谱上重叠。使用多光谱成像系统对含有样品（例如用某些染料组合来染色的肿瘤学样品）的载玻片成像。每个通道图像对应于一光谱带。因此，由成像系统产生的多光谱图像堆叠因此是潜在的组分生物标志物表达的混合，其在一些情况下可以被共同定位。最近，量子点由于其强烈和稳定的荧光而广泛用于感兴趣的生物标志物的免疫荧光染色。
识别针对生物标志物的个体成分染色及其出现在混合中的比例是使用光谱解混操作解决的基本挑战。光谱解混将多光谱图像的每个像素分解为组成光谱末端成员或分量的集合，以及来自它们中的每一个的多光谱图像中其强度贡献的分数。示例性光谱解混方法是在荧光和亮视场显微镜两者中通常使用的非负线性最小二乘法操作。WO 2015/101507（PCT / EP2014 / 078392）和WO 2015/124772（PCT / EP2015 / 053745）（其通过引用被整体并入本文）公开了用于解混多通道图像（也称为多光谱图像）的各种解混方法。
发明内容
本文提供了检测和描述包含用可检测标志物标记的至少一种分析物的细胞样本中的异质性的方法，所述方法包括在计算机装置上分析所述细胞样本的图像，所述计算机装置包括被编程为将聚类分析应用于从所述细胞样本的图像获得的数据集以创建包括表达模式的多个聚类的聚类图（cluster map）的计算机处理器，其中：
(a) 该数据集包括用于细胞样本的一个或多个感兴趣区域（AOI）内的多个视场（FOV）中的每个的图像栈，其中所述图像栈包括x轴、y轴和z轴，其中x轴和y轴表示所述场内的空间坐标；并且z轴包括一个或多个层，其中z轴的每个层包括在多个x、y坐标处的单一可检测标志物的强度数据；并且
(b) 该聚类分析包括将无监督（unsupervised）、的非参数的基于密度的聚类算法应用于所述图像栈，其中所述聚类算法将x、y坐标与跨所述z轴的各层具有相似比例的可检测标志物强度的其他x、y坐标分组从而产生具有相似表达模式的多个聚类。
如本文所理解的“细胞样本”是任何生物组织样本，例如用于解剖病理学的从人或动物体获得的外科样品。细胞样本可以是前列腺组织样本、乳腺组织样本、结肠组织样本或从另一个器官或身体地带获得的组织样本。
如本文所理解的“多光谱”或“多通道”像素涵盖从生物细胞样本获得的数字图像中包含的像素，其中不同的细胞核和组织结构同时被特定染料染色。
如本文所理解的“多通道图像”或“多光谱”图像涵盖由多光谱或多通道像素组成的图像。通过解混方法针对多通道图像的每个通道获得单通道图像。
在一个实施例中，基于密度的聚类算法是均值漂移聚类算法
在另一个实施例中，通过一种方法获得前述方法的数据集，所述方法包括：
(a1) 对图像中的多个AOI中的每一个计算FOV取样网格（其可选地包括跨AOI的规则间隔间距的多个FOV）；
(a2) 在每个FOV中的单个或多个z平面处自动收集多光谱数据和/或超光谱数据（其可选地可以自动保存在具有元数据属性的嵌套数据结构或数据库中，所述元数据属性包括患者、测定、活检、切片、AOI位置和/或FOV位置）；
（a3）从多光谱数据和/或超光谱数据计算地分割可检测标志物信号；
（a4）将在聚类分析中要作为一组进行比较的FOV选择到数据集结构中；其中，可选地，
（a4a）被选择要作为一组进行比较的FOV对应于相同组织切片中的不同肿瘤病灶，或者
（a4b）基于从相同患者取得的活体组织切片对FOV进行分组，以便与从相同患者取得的不同活体组织切片进行比较；或者
（a4c）基于肿瘤位置对FOV进行分组；或者
（a4d）基于患者对FOV进行分组，以与另一患者进行比较；或者
（a4e）基于肿瘤基因型对FOV进行分组；以及
(a5) 对所述数据集中的每个FOV的每个可检测标志物信号应用自动形态特征分割，所述特征分割可选地基于大小约束、强度约束或大小约束和强度约束的组合。
在另一个实施例中，用于获得上述方法的所述数据集的方法还包括：
（a6）手动指定一个或多个FOV中的地带，以包括或排除该聚类分析。
在另一个实施例中，上述方法的可检测标志物当被共同定位和可定量时基于光谱或其他物理特性产生可与其它标志物和组织分离的信号。在一个实施例中，可检测标志物附接至抗体或其抗原结合片段。在一个示例性实施例中，可检测标记物附接至与至少一种磷酸化蛋白质特异性结合的至少一种抗体（诸如例如，PI-3激酶信号转导途径或MAP激酶信号转导途径的成员（member））。在另一个实施例中，用抗磷酸抗体标记的细胞样本是使用双温固定来固定的组织。
本文还提供了根据肿瘤中的信号转导途径的生理状态表征肿瘤的方法，所述方法包括根据前述方法分析肿瘤样本的图像，其中：
•用可检测标志物标记两种或更多种分析物；
•用可检测标志物标记的分析物中的至少一种是磷酸化的信号转导蛋白质；以及
•在针对所述图像的每个FOV中的单个或多个z平面上收集超光谱或多光谱数据。
本文还提供了用于自动识别细胞样本中的异质性的系统，所述系统包括：
（a）分析性成像分析系统，其包括：
处理器；和
存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储用以计算机可执行指令，所述计算机可执行指令在由所述处理器执行时使所述处理器执行包括前述方法中的任何方法的操作；并且可选地，
（b）分析性成像硬件系统，所述分析性成像硬件系统适于从所述细胞样本捕获所述细胞样本的数字化图像和多光谱数据和/或超光谱数据，并将所述数字化图像传送到所述分析性成像分析系统；以及可选地，
(c) 关系数据库。
在示例性实施例中，前述系统还可以包括含有细胞样本的载玻片，其中用可检测标记物标记一个或多个感兴趣的分析物。在另一个实施例中，所述细胞样本是已经使用双温固定保藏的福尔马林固定的石蜡包埋的组织样本，并且所述可检测标记物附接至与至少一种磷酸化蛋白质特异性结合的至少一种抗体。
本文还提供了用于存储由处理器执行以实行操作的计算机可执行指令的非暂时计算机可读存储介质，所述操作包括前述方法中的任何方法。
附图说明
本专利或申请包含至少一个以彩色实现的绘图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将由专利局根据要求并支付必要的费用来提供。
图1：基本工作流程图，其用于组织解剖的数字化、可视化和注释（1，2，3），随后是在经注释的（annotated）视场中光谱数据集的收集（4），随后是多重标志物水平的计算定量分析（4）。
图2：用于异质性分析的示例性工作流程中的主要步骤。
图3：PI3K / AKT / mTOR和Ras / MAPK途径的图示。带圆圈的蛋白质指示如示例中所描述的被选择用于示例性研究的靶。
图4：在视场上系统的取样的图示（由覆盖到模拟亮视场中呈递的预扫描解剖图像上的矩形所指示的要使用光谱成像获取的地带）。
图5：图示在经注释的视场上的光谱采集概念的图。
图6：将自动多模态光谱数据采集与关系数据库和可视化和分析软件相结合的示例性实施例的图示。
图7：示例性自动特征选择的图示，该自动特征选择允许基于强度范围、尺寸和形状约束从分析中拒绝结构。
图8：用以设置用于特征分割的参数的示例性自动掩模设置对话界面的图示。
图9：示例性手动FOV注释和编辑工具的图示。
图10：图示用于加载数据集、确定多分析物表达聚类和呈现输出的示例性工作流程的流程图。
图11：用于异源表达的量化的聚类分析。1）解剖视场被数字注释，以便在注释地带中自动采集光谱数据。针对感兴趣区域中的每个视场所获取的数据通过z维被解混并投射以产生表示每个分析物的分析物强度的一组2D图像。2）在每个视场中针对每个分析物的2D图像被附加到来自所有其他视场的2D图像，以创建跨越整个数据集的图像，每个分析物被附加在z轴上以产生表示针对整个数据集上的每个分析物的分析物分布的3D图像。3）基于密度的聚类算法应用于上一步创建的3D数据集。聚类算法以3D数据集的x、y坐标创建一个新图像，并将每个像素分组成一个聚类，其中各成员在所有标志物上具有相似的表达模式。所创建的每个聚类具有用于多个标志物的、与其他标志物不同的表达模式。4）聚类图被着色以指示属于每个聚类的组织解剖结构的地带。5）从属于每个聚类的地带收集每种标志物的强度值，然后可以将这些强度值绘制或导出到电子表格。将针对每个聚类的生物标志物图并排放置促进确定彩色图上的哪些区域在针对感兴趣的生物标志物的表达方面高或低。6）生成指示数据集中针对每个聚类的比例区域的聚类直方图。这有助于简单确定哪些表达模式主导该区域，以及哪些表达模式代表整个细胞群体的较小比例。
图12：MAP-激酶和PI-3激酶途径的图示。
图13：PI-3激酶途径和相关激酶抑制剂的图示。
图14A-C ：通过免疫荧光评价的单一探针IHC（b）和通过光谱成像评价的六种半抗原化-磷酸抗体-QD探针的多重混合物（cocktail）（c）与半抗原化-磷酸抗体-QD探针的染色行为与参照免疫印迹（a）的比较。细胞模型是使用ATP竞争性AKT激酶抑制剂（GSK690693）在未处理（UT）和药物治疗条件（DT）中制备的SKBR3细胞的FFPE。a）使用未缀合的（unconjugated）第一抗体的免疫印迹示出未处理和药物处理（24小时）的SKBR3细胞中每种蛋白质种类的平均磷酸信号传导水平。微管蛋白示出为蛋白质负载的对照（control）。b）在UT和DT条件下，通过单一半抗原-抗体-QD标记的SKBR3细胞中每种磷蛋白质种类的磷酸信号传导活性的示例免疫荧光图像。c）在UT和DT条件下，通过所有半抗原-抗体-QD探针的组合染色标记的SKBR3细胞中每个磷蛋白质种类的磷酸信号传导活性的示例光谱解混图像。d）注意单一和多重标记两者的个体细胞中磷酸信号传导强度的异质性。在c）中对应于光谱数据的箱形图提供了来自几个ROI的数百个细胞平均的磷酸标志物强度的定量信息。箱形图用Tucey须线（whisker）示出分割的细胞（n = 5个ROI，171-414个分割特征/条件）。星号表示显著不同的条件（p>0.0001），ns =不显著。
图15A-B ：通过DAB IHC在未处理（UT）和pAKT抑制剂（GSK690693）药物处理（DT）的SKBR3细胞FFPE载玻片中使PI3K标志物活性染色来验证抗体探针特异性。（a）使用第一抗体的IHC染色，（b）以及与针对所有磷酸标志物抗体的对照细胞和组织相比，在LnCap细胞上使用单一未缀合的第一抗体的半抗原第一抗体示出在LY294002处理时和磷酸酶处理的Calu-3异种移植组织中所有PI3K标志物活性的预期的降低。
图16：使用FFPE制备的模型系统来优化光抗体染色条件：怀有pTEN缺失并具有过度激活的PI3K信号传导（McMenamin 1999，Cancer Res）和FFPE制备的Calu-3异种移植物的LnCap细胞系。在不存在和存在LY294002和磷酸酶的情况下分别处理LnCap细胞和Calu-3异种移植物以抑制PI3K信号传导。通过IHC在LnCap细胞系（左面板）和λ磷酸酶处理的Calu-3异种移植物（右面板）中使用磷酸抗体的IHC染色示出针对五种PI3K和一种MAPK途径效应物的优化条件。正如预期的那样，在用LY294002处理之后的LnCap细胞和λ磷酸酶处理的Calu-3异种移植物两者中，磷酸功能表达的广泛丧失是明显的。
图17A-D ：MTIP磷酸功能谱（profiling）和再现性。a）通过对应的H＆E载玻片（左上）在病理学家注释的乳腺肿瘤中随机获得用于光谱成像的ROI。左下图示出了来自一个ROI的6种解混的磷酸标志物图像的覆盖。右侧示出了对应于ROI的6种磷蛋白质通道的解混图像。刻度条为50μm。b）来自一个ROI的H＆E图像（左）以及解混的图像3磷酸标志物（H＆E图像的右侧）示出为指示肿瘤中的上皮和基质地带中的区别性的磷酸表达模式。c）箱形图（左）示出磷酸探针标记示出比对照更高的PI3K信号传导水平。5-CA，n = 8 ROI。C是在不存在第一抗体的情况下被染色的对照样品。箱形图（右图）示出，虽然PI3K信号传导可以区分肿瘤（T）区域相对非肿瘤相邻区域（TA），但非肿瘤相邻区域可以示出PI3K信号传导的相似性，表明伴随形态结构的磷酸谱信息的价值。各对之间的显著差异用星号指示（p>0.0001）。ns是非显著性。d）多光谱PP-QD测定在乳腺肿瘤样品中展示的再现性。在连续切割的患者肿瘤中测量PP活性，FFPE样品按一式三份载玻片/天，并重复连续3天。每个载玻片成像的ROI数量为7。左边的条形图示出连续3天（n = 3个载玻片/天，7个ROI/载玻片）测量的磷酸标志物强度的归一化平均值。每个磷酸标志物的强度在3天内归一化为该标志物的最高平均强度值。右边的条形图示出从9个连续载玻片（3个载玻片/天；7个ROI/载玻片）测量的磷酸标志物的绝对平均强度的CV％和归一化的平均强度。每个ROI的平均强度被归一化为每个载玻片中所有6种磷酸标志物的总强度。
图18A-C ：MTIP示出针对每种磷酸标志物类型和乳腺肿瘤组织的不同范围的信号传导水平。a）示例示出来自5例患者肿瘤的代表性肿瘤地带中的磷酸标志物表达。对图像进行相同处理以便比较强度。刻度条为50μm。b）箱形图示出5名Induvimed患者的6种磷酸标志物的平均强度。须线为1-99百分位。n = 8个ROI/肿瘤。C是在不存在第一抗体的情况下被染色的对照样品。c）评价乳腺肿瘤的突变和功能特征。方程是不明确的，其代表不确定的诊断。
图19A-D ：MTIP显示乳腺肿瘤中的PI3K网络信号传导的异质空间分布。a）代表性的H＆E图像和针对pAKT 473通道的相应的光谱数据示出在面板b中以黑色勾勒的聚类图的形态背景。b）聚类图示出了彩色编码的独特的磷酸表达模式。通过应用平均移位聚类分析算法对8个ROI /患者的磷酸标志物强度产生的聚类图（示出了4个代表性ROI）。a和b中刻度条为80μm。c）聚类图示出了每个聚类中的6个磷酸标志物强度的定量测量结果。针对每个患者示出3个代表性的聚类图。在聚类2-C1、2-C2、2-C6中每个磷酸标志物占据的组织面积分别为85.1％、4.09％、10.66％；在聚类3-C1、3-C2、3-C5中分别为26.6％、54.6％、1.43％；在聚类4-C1、4-C2、4-C5中分别为93.9％、3.89％、1.43％，以及在聚类5-C1、5-C2、5C3中分别为96.6％、3％和0.36％。d）树形图示出针对五个示例性乳腺肿瘤的网络信号传导聚类的分层分布（图4），并揭示类似基因型的聚类的分散分组。具有小于1%最大聚类的面积的聚类不包括在树形图分析中。每个聚类名称由肿瘤标识符号码表示，后面是聚类号C1、C2、C3等。WT是野生型，C是对照，其是在不存在第一抗体的情况下染色的FFPE样品。具有PIK3CA和AKT1突变以及WT和C的的聚类是彩色编码的。
图20A-E ：网络信号传导的定量分析揭示了不通过肿瘤突变分组的磷蛋白质表达的异质性。a) 用于光谱成像的肿瘤病变的连续切片（serial section）的H&E图像。H&E切片距离光谱图像切片4-16μm。b）光谱图像示出5个单独的磷酸标志物层的覆盖。光谱图像位于左侧面板上的H&E图像的相应位置。c）聚类图示出了彩色编码的独特的磷酸表达模式。具有高基质含量的聚类具有后缀“S”，以及具有高上皮含量的聚类具有后缀E。通过应用平均移位聚类分析算法对4个ROI /患者的磷酸标志物强度产生的聚类图。a、b、c和d中刻度条为80μm。d）聚类图示出了5个磷酸标志物强度的定量测量。针对每个病人示出4个代表性的主要聚类图。在聚类379-C1、C2、C3、C6中每个磷酸标志物占据的组织面积分别为60.1％、32.9％、6.15％、0.15％；在聚类307-C1、C2、C3、C4中分别为89.1％、9.7％、0.76％、0.47％；在聚类384-C1、C2、C3、C4中分别为44.8％、49.9％、4.92％。
具体实施方式
I. 缩写和定义
为了促进回顾本公开的各种示例，提供了缩写和具体术语的以下说明：
CISH: 显色原位杂交。
CRC: 结肠直肠癌。
FFPE组织：福尔马林固定的石蜡包埋组织。
FISH：荧光原位杂交。
H&E: 苏木精-伊红染色。
IHC: 免疫组织化学。
ISH: 原位杂交。
NBF:中性缓冲福尔马林溶液。
NSCLC: 非小细胞肺癌
PI3Ks: 磷脂酰肌醇 3-激酶。也称为磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶，磷脂酰肌（phosphatidylinositide）醇3-激酶，PI 3-激酶，PI（3）Ks和PI-3K。
TNBC：三阴性乳腺癌。
分析物：样本中特异性检测的分子或分子组。
分析物-结合实体：能够特异性结合分析物的任何物质。分析物结合实体的示例包括：结合靶抗原的抗体和抗体片段（包括单链抗体）；与MHC结合的T细胞受体（包括单链受体）：抗原复合物；MHC：肽多聚体（与特异性T细胞受体结合）；与特异性核酸或肽靶结合的适配体；与特异性核酸、肽和其他分子结合的锌指；与受体配体结合的受体复合物（包括单链受体和嵌合受体）；与受体复合物结合的受体配体；以及与特异性核酸杂交的核酸探针。
抗体：本文中术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）和抗体片段，只要它们表现出所期望的抗原结合活性即可。
抗体片段：除完整抗体外的分子，其包含结合完整抗体结合到的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2；双体；线性抗体；单链抗体分子（例如scFv）；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗磷酸抗体：与磷酸化蛋白质或氨基酸残基结合但不与非磷酸化形式的相同蛋白质或氨基酸残基结合的抗体或抗体片段。抗磷酸抗体的示例包括：
对特异性磷酸化氨基酸残基具有特异性的抗体，诸如磷酸化组氨酸（anti-phospho-His）、磷酸化丝氨酸（anti-phospho-Ser）、磷酸化苏氨酸（anti-phospho-Thr）和磷酸化酪氨酸（anti-phospho-Tyr）；以及
对含有磷酸化氨基酸的特定抗原具有特异性的抗体（例如在丝氨酸473磷酸化的Akt（抗磷酸-Kt（Ser473）））；PI3
抗原：可以特异性结合特异性体液或细胞免疫产物的化合物、组合物或物质，例如抗体分子或T细胞受体。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单中间代谢物、糖（例如寡糖）、脂类和激素以及大分子如复合碳水化合物（例如多糖）、磷脂、核酸和蛋白质。抗原的常见类型包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫性疾病、过敏和移植物排斥的抗原、毒素和其他各种抗原。在一个示例中，抗原是芽孢杆菌抗原，例如γPGA。
肽：术语“肽”旨在涵盖通过酰胺键结合在一起的两个或更多个氨基酸的任何排列，包括寡肽和多肽。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-旋光异构体或D-旋光异构体。
寡肽：长度为2至20个氨基酸的肽。
多肽：长度超过20个氨基酸的肽。本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”旨在涵盖任何氨基酸序列并且包括修饰的序列，例如糖蛋白质。
翻译后修饰：蛋白质在其翻译后的化学修饰。它是蛋白质生物合成中的稍后步骤之一，以及因此是针对许多蛋白质的基因表达。氨基酸的翻译后修饰通过将蛋白质附接到其他生物化学官能团（例如乙酸盐、磷酸盐、各种脂类和碳水化合物），改变氨基酸的化学性质（如瓜氨酸化），或进行结构改变（例如形成二硫桥）来扩展蛋白质的功能范围。此外，酶可以从蛋白质的氨基末端去除氨基酸，或者在中间切割肽链。例如，在形成二硫键之后切割肽激素胰岛素两次，并且从链中间除去前肽；所得蛋白质由两条通过二硫键连接的多肽链组成。此外，大多数初生多肽从氨基酸甲硫氨酸开始，因为mRNA上的“起始”密码子也编码该氨基酸。该氨基酸通常在翻译后修饰期间脱落。其他修饰，如磷酸化，是用于控制蛋白质行为的常见机制的一部分，例如激活或灭活酶。
样本：从含有基因组DNA、RNA（包括mRNA）、蛋白质或其组合的受试者获得的生物样品。示例包括但不限于外周血、尿液、唾液、组织活检、外科样品、羊膜穿刺术样本和尸体解剖材料。
特异性结合：当实体与样本中的分子结合以基本排除与其他分子的结合时，发生特异性结合。例如，实体当其具有比样本中其它分子的结合常数大至少103M-1、104M-1或105M-1的结合常数时可被认为特异性结合到给定分子。
双温固定：如本文所用，术语“双温固定”是指使用基于醛的固定剂的固定协议，其中首先将组织样本在没有充分固定组织样本的情况下在冷温度下浸入基于醛的固定剂中达足够的时间段以允许固定剂在整个组织中扩散，以及然后在高温下浸入醛基固定剂中达足够的时间段以允许醛固定组织样本。
像素：在二维网格图案中的规则间隔的坐标，其与表示该坐标处的样本的信号强度的数值相关联。
II. 引言
在肿瘤组织中表征多种生物标志物并且测量肿瘤组织内和肿瘤组织间的所述生物标志物的存在和水平的异质性的能力将提供用于适当选择患者疾病状态的可用靶向治疗剂的重要信息。适当组合疗法的开发和选择可能进一步成为防止复发的重要因素，以及识别和测量组织中具有关键生物标志物的不同分布的区域的能力将提供重要信息以确定组合疗法。
如图1所图示，基本工作流程依赖于细胞样本的数字化、可视化和注释，随后在经注释的视场中收集光谱数据集，随后对标志物水平进行计算定量分析。在图2处显示适用于组织样本的示例性工作流程。本公开涉及用于定量显微镜的数据采集和分析的新方法，其扩展定量多重平台以产生与生物标志物的表型异质性有关的重要信息。我们将新方法和仪器结合起来以实现允许在临床样本以及细胞系和组织阵列的大解剖学领域测量生物标志物水平和异质性的工作流程。
III. 样本
在可以使用本方法和系统之前，必须产生被可检测地标记以用于感兴趣的分析物的样本。原则上，本方法和系统可以与可以被标记并成像的任何类型的细胞样本一起使用。示例性样本包括：组织切片，例如由福尔马林固定的石蜡包埋组织样本或冷冻保存的组织块产生的组织切片；细胞涂片，如宫颈涂片；和细胞悬液，诸如使用例如Cytospi离心机固定在载玻片上的细胞悬液。
样本通常应以保藏待评价的分子细节的方式处理。因此，例如，当要通过免疫组织化学测量至少一种生物标志物时，应避免消除待检测的分析物的抗原性的固定剂和固定协议。例如，当待检测的待分析物之一是翻译后修饰的蛋白质（例如磷酸化蛋白质）时，应该对样本进行处理，使得最小化对翻译后修饰模式的改变。在例如US 2012-0214195 A1、WO2008-073187 A2、WO 2008-073187 A2和Lawson等中公开了用以最小化或消除翻译后修饰的这种变化的示例性处理方法。
在一个具体实施例中，样本含有或被怀疑含有磷酸化蛋白质，并且使用双温固定将样本固定在醛基固定剂（例如甲醛、戊二醛、乙二醛和丙烯醛）中。
双温固定的第一步是在有效地允许使组合物基本上完全扩散遍及样本的基本上整个横截面的条件下使组织样本经受高浓度的醛基固定剂。第一步的有效温度范围为从大于-20℃到至少15℃，优选大于0℃至更通常约10℃的较高温度，以及甚至更通常为约1℃至约7℃。对于工作实施例，温度通常为约4℃。第一处理步骤的时间段范围为从约15分钟直到约4小时，最通常为从大于15分钟至约3小时，其中通常通过进行固定组合物扩散步骤达约1.5小时至约2小时以获得良好的结果。尽管将扩散时间增加至4小时或更长通常几乎没有有益效果，但是将组织留在冷的福尔马林中达延长时间段（例如长达14天）通常对处理没有有害影响。对于特别厚的组织或对翻译后修饰的丧失特别敏感的样本，第一步中较高的醛浓度可以增加扩散到样本中的速率。因此，例如，双温固定的第一步使用从至少10％福尔马林至约50％福尔马林。
双温固定的第二步将组织浸入高温的醛基固定液中达足以允许交联以尽可能快的速率发生，而不会危害其中包含的分析物的组织形态或抗原性的时间段。与第二步骤相关联的温度通常高于环境，例如高于约22℃。对于工作实施例，温度通常大于环境高达至少55℃，更典型地从约35℃至约45℃，因为该温度范围足以增加交联动力学以允许相对快速的组织交联。然而，如果温度升高到约50℃以上，则样本通常开始降解，这可能对某些后续的组织学反应有有害影响。因此，选择上部温度和时间段以允许随后的成像过程步骤（诸如原位杂交、IHC和/或H＆E）以有效地进行。第二处理步骤的时间段范围为大于15分钟直到至少约5小时，更典型地为至少约1小时至约4小时，以及更典型地为从约2小时至约3小时。在某些实施例中，第二处理步骤在45℃下进行1.5小时。
关于双温固定的更多细节可以在US 2012-0214195 A1（通过引用以其整体并入本文）中找到。
然而，应当强调的是，本方法和系统与对标记细胞中感兴趣的分析物的方法（包括免疫组织化学方法、原位杂交法和针对形态学的染色/标记方法（诸如H＆E染色））敏感的任何样本相容。
样本可以被可视化，使得可以检测感兴趣的分析物——并且优选地被量化。可以使用标记样本或对比度形成的任何方法，包括例如免疫组织化学方法、原位杂交法（诸如FISH和CISH）、基因编码的报告基因（reporter）（例如GFP、YFP、CFP）或组成型荧光菌。
在一个实施例中，通过在足以允许分析物结合实体与感兴趣的分析物的特异性结合的条件下使样本与分析物结合实体接触来标记样本。分析物结合实体用可检测标记物进行标记，该可检测标记物可以直接附接到分析物结合实体（例如通过共价附接）或可以通过使样本与对该分析物结合实体特异的被可检测地标记的第二实体接触来应用。优选地，当共同定位时，可检测标记物可基于光谱或其他物理特性与其它标志物和组织分离，并且在所测量的信号量与存在于像素中的造影剂的量之间存在一致的关系的意义上可定量。标记物的动态范围可以是用于解决标志物水平的小变化的重要因素。标记物的动态范围描述强度的最小增加或减小，该强度的最小增加或减小可以被可靠地确定以反映样本中靶分子水平变化；动态范围是由标记系统和成像系统的组合噪声限制的品质因数。如果动态范围小，能够可靠测量的最小量与能够可靠测量的最大量之间的差也小。因此，标志物水平的相对小的变化变得难以或不可能辨别。高动态范围意味着可测量的最大值与可测量的最小值之间存在大的差异。因此，可以可靠地测量相对于最亮值的小变化。优选使用具有相对高动态范围的可检测标记物。满足这些参数的示例性可检测标记物包括半导体纳米晶体（量子点）；有机荧光标志物，诸如FITC、TRITC、CY3、CY3.5、德克萨斯红、CY5、荧光素、聚合染料（诸如US 8,354,239中公开的聚合染料）；显色团；光吸收染色剂；以及化学发光标志物（诸如荧光素）。
在一个示例性实施例中，使用标记方案，其中对分析物特异的第一抗体包含一种或多种特异性半抗原。然后可以使用对特异性半抗原特异的被可检测地标记的第二抗体来可检测地标记第一抗体。存在各种各样不同的半抗原-第二抗体对，从而允许分析物和可检测信号比传统的第一-第二抗体配对更广泛的复用。此外，由于可以将多个半抗原拷贝附接到每个第一抗体，所以与传统的第一-第二抗体配对相比，可以大大提高信号放大。示例性的半抗原-抗体组合在例如US 7,695,929、US 8,618,265和WO 2008-063378中公开，其各自的内容通过引用并入本文。
本方法和系统的一个特殊应用在于评价信号转导途径（诸如激酶级联）的激活中的异质性。因此，在一个实施例中，用多个分析物结合实体来标记样本，其中一个或多个分析物结合实体特异性地结合到磷酸化蛋白质，诸如抗磷酸抗体或其抗体片段。在一个实施例中，抗该磷酸抗体是抗磷酸-His、抗磷酸-Ser、抗磷酸-Thr或抗磷酸-Tyr。该实施例对于确定磷酸化的总体水平特别有用。在另一个实施例中，抗磷酸抗体对特定磷酸化蛋白质是特异的。该实施例对确定给定的激酶级联途径或这种途径的组中的异质性特别有用。例如，抗磷酸抗体可能对PI3K / AKT / mTOR途径或Ras / MAPK途径中涉及的磷酸化靶是特异的。这些途径如图3、12和13所图示。在一个实施例中，与抗磷酸抗体相关的可检测标记物是半导体荧光纳米颗粒（例如QUANTUM DOT），其信号用超光谱成像检测。半导体荧光纳米颗粒表现出强烈和稳定的发光强度，其可以被利用它来克服传统IC测定中荧光和基于光的染料的局限性（Watson等，2003；Bruchez等，2005；Michalet，X等，2005）。半导体荧光纳米颗粒已经超越传统测定：1）半导体荧光纳米颗粒具有增强的灵敏度；它们能够检测单一和小数目的蛋白质分子，2）半导体荧光纳米颗粒的明亮和离散发射可用于更准确地定量组织中的蛋白质水平，以及3）可以使用多种有色半导体荧光纳米颗粒来同时识别细胞和组织中的多种蛋白质群体（Fichter等，2010；Scholl等，2009；Sundara Rajan等，2006）。
IV. 图像采集和注释
本方法和系统应用于包含关于感兴趣的每个分析物的身份、位置和强度的数据的标记组织的图像。因此，包含细胞样本的形态特征的数字图像被捕获，并且针对感兴趣区域（AOI）被可选地注释，以及然后从AOI捕获与每个感兴趣的分析物相关联的每个可检测标记物的身份、位置和强度相关的多光谱数据和/或超光谱数据。用于此分析的基本工作流程的一个示例
A. 图像采集
首先捕获形态学图像，以及然后注释该形态学图像以识别针对异质性来评价的一个或多个感兴趣区域（AOI）。
一种有用的形态学图像是折射率对比图像。组织的折射率可以用于以足够的分辨率实施组织解剖，从而使用分析成像方法来识别待询问的解剖学标记和感兴趣区域。组织解剖的概述是通过平铺以放大倍率捕获的许多视场来提供的，这允许选择AOI以便进一步询问。通过使用基于组织的折射和散射性质的透射照明和对比度，可以显示出类似于伊红染色剂的图像，其可以任选地与用于确认病理学的实际H＆E染色连续切片进行比较。在近红外线中使用透射照明确保对组织、复染剂或报告基因的光损伤最小化，同时还允许足够亮的照明以允许快速曝光以便有效地产生扫描图像。使用折射对比的替代方式是使用组织自发荧光或荧光染色剂来突出组织结构，以及在已经与荧光组织切片一起登记的连续切片图像上指定AOI。在某些情况下，技术人员可以直接通过目镜在荧光组织切片上简单地找到解剖标志，并且在装备用于亮视场的单独的显微镜上观察的H＆E连续切片上确认形态。
B. 图像注释
1. 感兴趣区域注释
一旦收集了形态学图像，其就由有经验的用户（例如医师或病理学家）注释，以选择一个或多个AOI以便进一步询问。AOI的边界由计算机转换为平台坐标。在一个实施例中，AOI可以对应于整个图像，或者它可以被限制到图像的某一部分，例如图像的一部分具有某些形态特征。可以使用各种标准来注释图像，例如，注释可以基于医学训练来识别解剖结构，诸如腺体或诸如上皮之类的细胞类型，或者可以基于肿瘤相对基质的区别来区分。可以使用机器识别纹理特征、分割细胞的形态测量性质、来自登记到正在观看的切片的连续切片的数据或这些方法的组合来使注释自动化。在一个实施例中，基于组织解剖选择一个或多个AOI。
在一个实施例中，使用专门的观看者来注释组织的形态学图像。在示例性软件中，可以使用折射对比来对组织切片成像，并以黑色或白色形式显示为暗视场图像，或通过使用提供了在外观上与透射照明下观察到的伊红相似的色彩对比的颜色查找表来成像。软件允许组织切片的变焦和平移，使得解剖特征可以用足够的细节可视化以允许识别相关形态。在某些情况下，概述扫描可以与在亮视场获取的染色连续切片的图像一起登记，或者可以在提供与组织解剖结合的核复染色的2色图像的多个颜色通道中获取概述扫描，所述颜色通道例如DAPI通道和折射对比通道。软件用户界面提供绘图工具，这允许技术人员能够以更高分辨率对多重标记物进行成像的AOI进行划分。该软件提供了将这些AOI作为文件与图像一起保存以使得图像和AOI可以被重新加载和编辑的手段，并且还提供了将AOI的坐标从图像的坐标系转换到其上放置实际载玻片的平台的坐标系的手段。软件还提供了在组织图像上指定基准以使得来自一个切片的AOI文件可以通过手动或自动识别连续切片上的同源特征而被登记到不同的连续切片。
2. 视场注释
AOI被细分为多个FOV以产生FOV取样网格。生成FOV取样网格以便具有可以彼此比较的图像内的一组代表性地带。因此，FOV应当以捕获AOI内用于分析的相关地带的代表性样本的方式跨AOI分布。
可以实现这一点的一个方法是自动或手动生成规则间隔的FOV网格，以在AOI上提供无偏差的结构化取样。仪器操作员可以选择一定程度的覆盖范围，使得FOV覆盖AOI的100％，或者较低的百分比（例如覆盖范围为75％、覆盖范围为50％、覆盖范围为25％）。这在图4中图示出。可以使用系统随机取样的原理获取大的地带，以在降低的采集时间、分析时间和计算机存储器要求的情况下获得生物标志物水平和空间分布的忠实表示。能够指定较低覆盖范围的优点是该过程导致较小的数据集，并且可以更快地获取数据集。另外，在仅从FOV获取光谱数据的情况下，较少的组织面积暴露于照明，这允许对先前成像区域之间散布的区域进行再成像。这在报告基因的光漂白是一个问题的情况下非常有益。应选择足以提供整体AOI的准确表示的百分比覆盖范围。
可以实现这一点的另一种方法是将FOV分配给具有特定形态特征集合的AOI内的每个地带。例如，可以选择FOV仅对应于有核细胞，仅对应于肿瘤组织内的管状地带，仅对应于组织样本内的肿瘤地带等。对应于特定形态特征的FOV可以由熟练的用户手动选择，或者可以在自动形态学分析的基础上选择，例如在Parimi等和Nguyen等中所公开的内容。
在自动生成FOV取样网格的情况下，可以手动审查以根据用户期望来添加或去除FOV，这可以在光谱数据采集之前或之后进行。
通常选择AOI并用FOV对组织区域进行取样是有利的；这减少了要处理并存储的总体数据量，减少了计算开销，并提供了足够的数据来对跨整个AOI的表达的分布进行建模。
在一个实施例中，可以在注释之前为整个图像捕获形态学图像和光谱数据两者。可替代地，可以仅从每个AOI收集光谱数据。作为另一替代方式，可以仅从每个AOI内的一个或多个视场（FOV）收集光谱数据。
V. 数据集生成
来自FOV的数据被组织成包括在AOI内的每个FOV的多个图像栈的数据集。
A. 光谱数据收集
一旦已在AOI中选择了FOV，则从每个FOV收集多光谱和/或超光谱数据。可以重新收集此数据（即通过在FOV选择之后收集光谱数据），或者可以在选择FOV之后从预先收集的光谱数据集中提取该数据。然后从所收集的多光谱数据和/或超光谱数据对可检测标志物信号进行计算分割。
在光谱图像中，有3种用于获得2维空间中的光谱数据的一般策略。第一种策略是过滤由检测器成像的光谱的有限带宽，例如阵列检测器，诸如CCD或CMOS相机。相机收集在该光谱的此有限带宽内产生的图像，然后将滤波器带宽改变到光谱的相邻地带，并且重复该过程。该过程继续，直到已产生代表所需光谱范围的图像为止。这些图像被组合成具有2维空间的堆叠，以及第三维是光谱。第二种策略是大约基于从样品回来的光的路径上的色散元件。色散元件，例如棱镜或光栅，在空间上分离光的光谱分量。光圈用于选择要传送到检测器的光的特定带宽，或者可替代地，可以使用孔径来选择图像区域的薄片，然后将其分散在诸如CCD的二维检测器的第二维上。在获取每个图像之后可以移动样品或孔径，以逐渐建立代表具有第三光谱尺寸的二维区域的图像栈。用于获得光谱图像的第三种方法是在从样本到检测器的光的路径中使用Sagnac或Michelson干涉仪。在干涉仪的给定路径长度拍摄的图像实际上是2D干涉图。拍摄许多干涉图，每个都在不同的路径长度处，并且这些干涉图被组合成三维阵列，然后对该三维阵列进行傅里叶变换以产生具有二维的空间和在第三维中映射为波长的函数的强度值的图像栈。Garini等（2006）讨论了光谱成像捕获的示例性方法。
术语“超光谱”和“多光谱”是重叠的，并且通过采集达到的光谱分辨率的程度来区分。作为一般规则，术语“超光谱”是指在可见光范围内产生至少20纳米分辨率的连续光谱取样的形式。多光谱捕获可以指捕获在可见光范围内不连续的仅2至4个光谱带。
在一个实施例中，在单一组织深度或多个组织深度处收集多光谱数据和/或超光谱数据。在多个组织深度捕获数据确保通过组织厚度进行捕获，并减轻轴向色差（颜色在样品中在不同深度处聚焦）。可替代地，可以采用多焦点捕获设备，其将允许同时捕获样品中的多个深度以校正色差（Garsha等，2011）。
图5图示了在特定FOV上获取光谱数据的示例。覆盖AOI的FOV取样网格的坐标由数字注释确定，并用于在这些坐标处自动采集光谱数据立方体。在给定FOV处投射来自多个平面的光谱数据以提供一个3D数据集，其为信号层的光谱解混提供输入。
在获取光谱数据之后，分析物通道解混（去卷积）以提供纯分析物通道图像，其表示在标准化照明和曝光条件下捕获的每种标志物的染色强度。在Lett等2008，Garini等2006，Garsha等2013中公开了这样做的示例性方法，其各自的内容通过引用并入本文。从感兴趣的每种染色剂分离信号的过程可以在未处理的数据被获取之后、在未处理的数据的存储之前或之后的任何时间发生。
AOI中的各个FOV以AOI的视场被分组以便进一步分析的方式（例如，在图像数据库或专门的目录结构中）被收集和存储。理想地，数据组织将允许对视场分组，以便在来自单一AOI的视场之间进行比较，在共同组织切片的AOI之间进行比较，来自组织切片的全部或一些AOI与来自不同的组织切片的AOI进行比较，以及可以提供对研究者有用的信息的其他置换。在一个实施例中，所述多光谱数据和/或所述超光谱数据被自动保存在对患者、测定、活检、切片、AOI位置和/或FOV位置具有元数据属性的嵌套数据结构或数据库中。
B. 数据集创建
下一步骤是选择要包含在数据集中的各个FOV或整个AOI。术语“数据集”在这里用于描述为了与不同的“数据集”进行比较而分组的所获取视场的群体。这可能涉及来自一个肿瘤区域的视场的分组用于与来自相同组织的正常区域的视场进行比较，或者来自一个肿瘤的一组视场用于与来自相同患者的不同肿瘤的一组视场进行比较，或者来自一个患者的肿瘤的一组视场与来自不同患者的肿瘤的一组视场进行比较。另一个示例将是对针对微阵列的每个核心获取的视场进行分组，以便彼此比较，或对来自复制核心的视场进行分组以便与复制核心的其他“数据集”进行比较。这种用于数据分析的灵活的视场分组允许在不同水平上比较标志物表达：肿瘤间，肿瘤内，患者间，患者内，根据治疗组的多个患者，核心内微阵列。
对所获取的视场集合进行分组的这种能力需要可以通过诸如OMERO服务器（Allan等，2012）的关系数据库来促进获取数据的组织。使用关系数据库允许将获取的数据以不同的方式进行分组，以执行比较肿瘤内、肿瘤间或患者间的表达模式的分析。与图像数据库技术进行接口连接允许用于未来发展的可扩展性，以及用于多模态图像数据、数据挖掘、元数据和来自其他分析方法的数据的集中式仓库。理想的是，数据库技术能够存储异质数据以包括n维图像数据和关联的元数据（图像坐标、仪器参数、z平面、每层的波长通道、光学配置、曝光时间、照明水平和其他相关注释，诸如FOV）。数据库数据模型还应允许基于用于比较的元数据参数（诸如AOI、肿瘤、切片、患者）将数据链接到各组中。数据库和相关的可访问性层应能够通过计算机网络实现对大型数据集的分布式访问，并从采集中高效地上传大型图像数据。在Allen等（2012）中讨论了这些和其他所需的n维图像存入数据库的特征。
图6图示了将自动多模态光谱数据采集与关系数据库和可视化和分析软件相结合的示例性实施例。远程数据库通过高带宽网络连接，以及VAIS软件能够充当可远程访问数据库的客户端。以这种方式，VAIS分析软件可以上传或检索已经被获取以用于实验的特定数据集。VAIS软件被配置为使用允许将各种相关元数据参数链接到实际上传的图像数据的协议与数据库通信。这样的元数据参数可以包括特定项目和实验者的识别以及用于限制对敏感数据的访问的密码保护凭证。通过使用集中式仓库，可以在不同物理位置由多位研究人员远程高效地存储并访问大型和复杂的数据集。数据库接口封装了组织非常规嵌套数据的复杂性，这些非常规嵌套数据由许多维度和元数据标签（诸如多个波长、多个z平面、多个FOV、多个AOI、多个组织切片、多个活检、多个患者）组成。该数据可以是来自正交研究的相关联数据，例如测序或质谱；使用常规文件格式和目录结构保持这样的有组织的数据可能变得低效和麻烦。
虽然不太可取，灵活对视场分组的能力也可以通过创建将包括在分析中的文件和分析物列表的刚性目录结构和专门的软件浏览器来实现。示例VAIS分析软件提供数据库客户端功能和基于目录结构组织数据的能力两者。为了基于目录结构组织数据，浏览器界面必须识别通常分组的文件类型（例如，tiff图像或文本图像层）。我们的示例提供了浏览采集目录并选择FOV目录或单独的图像文件以便包含在数据集中的能力。FOV的集合可以选自待组合的不同的采集目录，并且在图像数据目录中识别相关的解混分析物层，并且可以基于针对分组到数据集中的给定FOV集合而创立的分析物层图像的列表中的检查框来包括（或不包括）该相关的解混分析物层。软件界面本身创建一组表示数据集的列表，该列表包括如由分析物层分组的数据集中每个图像文件的路径的这样的相关信息。这些列表可用于打开相应的文件，并在存储器中将它们组合成单一数据结构以便进行处理和分析。
C. 特征分割
可以可选地基于形态测量性质（尺寸、形状）或光度测量性质（信号强度范围），自动地对数据集中每个视场的解混染色通道进行进一步分割以选择感兴趣的特征。自动特征选择允许基于强度范围、尺寸和形状约束从分析中拒绝结构。这有助于将背景染色和噪音对分析的影响降保持在最低。这些分割作为数据集的一部分而持续存在，并且可以通过在专门的查看器中打开数据集并改变分割参数来重新分割和重写。
图7图示了其中已基于自动特征选择排除了某些特征的示例性图像。为了识别特征并对其进行排序，VAIS软件首先识别在作为配置设置提供的指定强度范围内的像素。在下一步中，软件识别强度窗口内的每个像素是否与强度窗口内的其他像素接触。在一像素接触其他像素的情况下，将那些像素分组到由像素坐标组成的对象中。对象的边框由像素落在指定强度窗口之外的点定义。接下来，软件将查看每个对象中的像素数以确定像素区域，并将像素区域与设置中指定的区域尺寸上的限制进行比较。大于或小于指定尺寸范围的对象将被识别并从将包含在进一步分析中的对象列表中去除。虽然这是一个基于尺寸和强度约束的简单示例，但是也可能存在诸如圆度或长度之类的形态约束，其包括为选择过程的一部分。这种类型的分割形成了用于自动选择相关解剖特征（诸如细胞核或不同细胞类型）的基础。
图8展示了用于设置特征分割参数的示例性用户界面。在此示例中，有一些复选框用以打开或关闭自动特征选择，并且还能够实现所选（绿色）和拒绝（红色）对象的可见颜色轮廓。对于强度范围选择，用户可以选择拒绝比指定上限更亮的像素的方法，或简单地将比指定限制更亮的所有像素值重新设置为限制值的方法。所使用的强度限制可以由可视化的设置来定义，或者可以通过使用标准化的强度阈值将限制设置为与显示不同。还有一个规定用以实现分水岭分割。分水岭分割可用于细分可能分开接触的结构的对象。例如，当细胞密集堆积在一起时，边界附近的强度可能有可见的变化，但是由于细胞正在接触，所以它们将被认为是单个物体。分水岭分割是一种用于将细胞拆分为似乎可信的单独对象的算法。界面中有一个规定用以设置将在下游分析中包含的特征的尺寸范围的限制。最后，有一个参数用于确定像素是否接触强度窗口内的其他像素。四连接确定将仅检查以查看被测像素的任何一侧是否接触其他亮的像素。八连接测试还将检查以查看被测像像素的角是否接触其他亮的像素。
分割特征可以由技术人员使用具有注释工具的专用查看器进一步编辑来标记用于分析的特征。例如，技术人员可能希望仅包括在视场内的腺体区域中的细胞，并且不包括基质细胞。可替代地，技术人员可以指定要从分析中排除的区域。例如，技术人员可能希望根据任何下游分析排除坏死区域。这些注释和分割然后作为数据集的一部分保留，并且可以由使用专门的查看器和适当的许可打开数据集的其他技术人员编辑。用于此减少以实践的VAIS分析软件是为多重数据提供这种类型的可视化和注释能力的软件的示例。
图9提供了用于手动编辑分割特征的示例性工具。该工具提供了在查看器中直接在图像上绘制地带的能力。通过选择布尔类型（'与'、'或'、'非'），绘制的地带可以指定要明确包含在分析中或明确不包含在分析中的区域。例如，“和”类型的FOV将包括FOV绘制内的所有区域，以及已自动分割以被包含的内部区域。换句话说，太小而不能包含在自动特征选择中的特征仍将被从分析拒绝。“非”类型的FOV将拒绝来自下游分析的指定FOV内的任何特征。“或”类型的FOV将包括在指定的FOV中的整个区域以及已自动选择为在FOV之外的区域，在这个意义上，它是用以覆盖自动分割以包括用于分析的地带的一种机制。可以在通过使用下拉列表创建FOV之后来删除或编辑FOV以选择感兴趣的FOV，然后调整FOV的顶点或从列表中删除FOV。手动FOV指定允许技术人员覆盖感兴趣区域内的自动特征分割，以根据分析来包括或排除相关的解剖地带。一旦创建FOV，可以编辑或删除FOV。可以根据情况添加不同类型的FOV（'与'、'或'、'非'），并且可以嵌套不同的FOV类型。FOV成为“数据集”描述的持续部分。可以打开数据集，并对FOV进行审核，并在随后的编辑会话中针对不同分析要求进行编辑。
VI. 聚类分析
为了确定细胞或组织样本内的异质性，将聚类分析应用于任选分割的数据集。上述数据集对象包含在分析中要包括哪些视场、分析中要包括的分析物以及要包括的每个视场的哪些区域（分割特征和注释）的信息。
图10图示了用于实行聚类分析的示例性工作流程。
用于分析的数据集被加载到异质性分析界面中，以及针对每个FOV的每个分析物被加载到图像“堆栈”（3D阵列）中以使得x轴和y轴是z轴包含的一个或多个层的空间坐标，每个层表示不同的分析物图。在图11中图示了示例性分析。由用户设置的参数控制z轴层中的像素是否受中值滤波器的影响以使给定覆盖区域上的信号均匀化，或者是否在给定的覆盖区域上对信号进行平均。这些参数确定输入到聚类算法的每个“像素”或单位区域的大小。例如，可能期望通过使信号在大致为细胞的大小的覆盖区上均匀化，使得具有细胞大小的地带被聚集成组。每个FOV图像栈在x或y边缘附加到在先的图像栈，使得这些视场被平铺成代表整个AOI的大的x、y、z图像。当每个分析物视场被加载时，先前已选择要被包括的FOV保持不变，并且其他区域被设置为零值。
将无监督的非参数聚类算法应用于图像栈以将类似表达模式的区域分组为“聚类”。优选地，使用可以缩放到相当大的数据的聚类算法，可以使假设最小化，并且具有尽可能少的参数要被输入。另外，优选具有用以找到将可从1种分析物扩展到许多种分析物的，并且使用在连续尺度上变化的单个或多个分析物强度值，并且可以具有针对每个分析物的值的不同形状的分布的表达模式的聚类算法。
在一个实施例中，聚类算法选自由DBSCAN（Ester等，1996，通过引用并入本文）、Affinity Propogation（Frey＆Dueck，2007，通过引用并入本文）和均值漂移（Comaniciu＆Meer，2002以及http://efavdb.com/mean-shift/，通过引用并入本文）组成的组。
在一个实施例中，通过描述分布截止的参数（称为“带宽”）来指定多-标志物表达中的用于相似性的截止。带宽影响结果中的聚类数。在一个实施例中，应用带宽估计器函数来确定要使用的带宽，其中带宽估计器函数获取待取样的像素数量和分位数参数的输入。带宽估计器从图像中对多个地带进行取样，并从样本和分位数确定带宽（0和1之间，0.5是取样值之间成对距离的中间值）。这使得能够调整聚类算法以强行要求更高的相似性或允许聚类成员之间相对较少的相似性，但是从样本本身确定“高”和“低”相似度的阈值。设置较高的分位数可以强行要求针对聚类成员的更大的相似性，这通常会导致更多的聚类，每个聚类都有更相似的更少的成员。
到聚类算法的输入是平铺数据集图像栈，以及输出是x、y阵列，其中x和y坐标是输入平铺图像栈的空间坐标，并且每个xy位置处的值是指示给定像素所属的聚类的标记（聚类输出阵列）。因此，例如，在聚类输出阵列中，具有值“1”的像素属于聚类号1，具有值“2”的像素属于聚类号2，对于已经被算法分割的多个聚类依此类推。
可以通过生成每个聚类占用的区域的相对比例的直方图来进一步分析聚类算法的聚类输出阵列。通过对属于每个聚类的像素数进行计数并除以xy平铺阵列中的像素总数来确定直方图。这产生了数据集中总面积的百分比，并且可以将其绘制在条形图中以指示哪些聚类是最大的。
也可以通过为聚类输出阵列中的每个聚类分配颜色并显示在计算机屏幕上来创建聚类图。以这种方式，与聚类'0'相关联的像素可以呈现为白色区域，与聚类'1'相关联的像素被着色为红色，与聚类'2'相关联的像素为黄色等等。分析物图像的聚类图和颜色叠加可以放置在专门的图像查看器的交替窗口中，以将各种聚类的空间区域与不同标志物的相对表达水平进行比较。聚类图有效地识别在解剖学背景中多重生物标志物的相似和不同表达或激活模式的区域。以这种方式，可以容易地使不同表达或激活的区域之间的关系可视化。
此外，聚类输出阵列可用来分割平铺的输入图像栈上的区域，并测量聚类区域中每个“像素”（单位区域）的针对每个分析物的值。以这种方式，给定生物标志物的强度值（与表达水平或激活成比例）的分布可以对每个分析物以每聚类方式使用箱形图（图11）来绘制，或保存到具有针对每个分析物的列和针对每个像素或单位区域的行的电子表格。该功能提供报告个体表达聚类中生物标志物水平的能力，并促进不同聚类中的表达水平的比较。
VII. 信号转导途径分析的应用
细胞通过受体在膜上接收化学和环境信号，以及这些信号通过蛋白质磷酸化级联来中继。该信号转导响应于刺激来调节基因机器以改变细胞行为。每个途径都可以影响几个生物学结果。这些信号传导途径的调节异常（由此可能不再需要外部刺激）可能导致病理畸变和癌症的发展。因此，许多靶向治疗剂已经朝着与肿瘤发生相关的信号传导途径发展，并且已经经历了临床试验（表1和2）。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表 1
试验 PI3K抑制剂 MEK抑制剂 患者群体
NCT01363232 BKM120 MEK162 晚期实体瘤，包括TNBC、胰腺癌、CRC、恶性黑素瘤、NSCLC和具有KRAS、BRAF和NRAS突变的其他癌症
NCT01337765 BEZ235 MEK162 晚期实体瘤，包括TNBC、胰腺癌、CRC、恶性黑素瘤、NSCLC和具有KRAS、BRAF和NRAS突变的其他癌症
NCT01390818 SAR245409 Pimasertib(MSC1936369B) 晚期实体瘤，包括以下中任一个：（1）用以下各项中的一种或多种中的改变来诊断的癌症：PTEN、BRAF、KRAS、NRAS、PI3KCA、ErbB1、ErbB2、MET、RET、cKIT、GNAQ、GNA11；或（2）以下癌症中的任一个：胰腺癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌或黑素瘤
NCT01347866 PF04691502或PF05212384 PD0325901 显示KRAS或BRAF突变的晚期癌症，以及具有KRAS突变证据的晚期CRC和不超过1个在先的系统治疗疗程的患者
NCT01155453 BKM120 曲美替尼(GSK1120212) 晚期实体瘤，包括由RAS或BRAF突变型晚期NSCLC、卵巢癌或胰腺癌组成的扩张臂
NCT01392521 BAY806946 BAY869766 晚期实体肿瘤
NCT01449058 BYL719 MEK162 晚期CRC、食管癌、胰腺癌、NSCLC或具有证明文件的RAS或BRAF突变的其他晚期实体瘤
NCT00996892 GDC0941 GDC0973 晚期实体肿瘤
NCT01248858 GSK2126458 曲美替尼(GSK1120212) 晚期实体肿瘤
表2。
通过使用目前公开的图像分析技术分析细胞样本（诸如肿瘤样本、细胞系和细胞涂片），被分割为聚类的区域可能具有显著不同的表达水平、磷酸化、或针对某些物标志物的激活，其以前在此工具的开发之前无法容易定量或传达。因此，可以如通过多重探测蛋白质激活或修饰（例如通过磷酸化）和/或转录因子表达、实体肿瘤组织和细胞制剂中的定位和/或易位所指示来分析异质模式。这种新颖的功能在继续开发下一代伴随诊断中有用，以用于了解新治疗剂的活性机制以及用于开发预后测定。
在一个实施例中，公开了根据肿瘤中的信号转导途径的激活状态来表征肿瘤的方法，所述方法包括根据本文公开的检测并描述细胞样本中的异质性的任何方法分析肿瘤样本的图像，其中用可检测标志物标记与信号转导途径相关的两种或多种分析物。标志物中的至少一种（以及优选地标志物中的多于一种）用分析物结合实体进行标记，所述分析物结合实体对于与信号转导途径相关的分析物的特定生理状态是特异的。因此，例如，可以使用抗磷酸抗体来特异地标记参与信号转导途径的蛋白质的磷酸化形式。在一些实施例中，磷酸化指示蛋白质的激活（诸如S6核糖体蛋白质的磷酸化）。在其他情况下，磷酸化表明蛋白质的失活（例如通过C末端Src激酶（Csk）的Src酪氨酸激酶的磷酸化，或通过Akt的糖原合酶激酶3（GSK-3）的磷酸化）。在另一示例性实施例中，标记是半导体荧光纳米颗粒（例如量子点），并且使用超光谱检测来检测来自该半导体荧光纳米颗粒的信号。
VIII.示例
为了举例说明目前描述的图像分析方法和系统，开发了六种抗磷酸抗体量子点缀合物对的面板以用于多重化，该面板由PI3K信号传导途径（pAKT473、pAKT308、pPRAS40、pS6、peIF4G）中的五个效应子组分和MAPK信号传导途径（pERK）中的一个输出效应子组分组成，涉及与PI3K信号传导相串扰的途径。
A. 抗体和生物缀合
表3列出了本研究中使用的所有第一抗体。所有的第一抗体购买为CellSignaling Technologies（丹佛斯，马萨诸塞州）的无BSA-叠氮化物制剂。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表3.评估的酪氨酸激酶途径靶和相关抗体的列表。
根据WO 2008-063378 A2中所描述的开发并利用第一抗体的半抗原生物缀合物。 在Ventana Medical Systems有限公司（图森，亚利桑那州）开发了抗半抗原特异性第二小 鼠单克隆抗体。量子点购自Thermo Fisher Scientific（尤金，俄勒冈州）。使用标准生物缀 合方法（Greg T.Hananson，Bioconjugate Techniques，第2版，2008）产生抗半抗原特异性 小鼠单克隆抗体-量子点缀合物，并按照描述（美国专利2008-0212866）使用。具体的生物缀 合物和相关的量子点标记的抗半抗原抗体如下表4所示。
第一抗体 半抗原生物缀合到第一抗体 相关抗半抗原：量子点缀合物
磷酸-AKT Ser473 DIG 抗-DIG:QUANTUM DOT565
磷酸-AKT Thr308 DNP 抗cDNP:QUANTUM DOT655
磷酸-PRAS40 Thr246 NP 抗-NP:QUANTUM DOT605
磷酸-S6 Ser235/236 BF 抗-BF:QUANTUM DOT525
磷酸-eIF4G Ser1108 TS 抗-TS:QUANTUM DOT585
磷酸-ERK1/2 Thr202/Tyr204 NCA 抗-TS:QUANTUM DOT705
表4.第一抗体—半抗原缀合物和相关抗半抗原—量子点缀合物。
以下乳腺标志物购自Ventana Medical Systems有限公司，并根据制造商的建议使用：确认抗雌激素受体(ER) (SP1) (Cat#790-4324)，确认抗孕酮受体(PR) (1E2) (Cat#790-2223)，途径抗HER-2/neu (4B5) (Cat#790-2991)，确认抗Ki-67 (30-9) (Cat#790-4286)和通知HER2 Dual ISH DNA 探针混合物测定(VMSI Cat #780-4422)。PTEN D4.3购自Cell Signaling Technologies（丹佛斯，马萨诸塞州）。
B. 细胞模型和肿瘤组织样品
乳腺癌细胞系模型SKBR3和前列腺癌细胞系模型LNCaP在补充有10％FBS的McCoy的5A培养基中培养。将SKBR3细胞用ATP-竞争性泛AKT激酶抑制剂药物GSK690693在低纳摩尔浓度（250nM）下处理24小时用于抗体验证研究。药物治疗后，用冷的1X PBS洗涤细胞，在冷的10％中性缓冲的福尔马林中固定，并包埋在石蜡中以便切片和载玻片制备。
未处理或用PI3K抑制剂LY294002（SignalSlide® Phospho-Akt (Ser473) IHCControls; Cat#8101）处理的石蜡包埋的LNCaP细胞的载玻片制剂购自Cell SignalingTechnologies（丹佛斯，马萨诸塞州）。预期通过Indivumed GmbH（汉堡，德国（表5））或OHSUKnight Diagnostic Laboratories（KDL）来采购肿瘤样品。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表5. 预期通过Indivumed采购的乳腺癌样品。
用于Indivumed样品的冷缺血时间为16分钟或更少，具有浸润性导管癌（IDC）的FFPE乳腺肿瘤样品预期从OHSU Pathology采购。在Ventana Medical Systems有限公司（图森，亚利桑那州）采购Calu-3异种移植物。使用Chafin等（2013）（通过引用并入本文）中描述的快速双温固定方法将全部Indivumed和Calu-3异种移植物样品固定并包埋在石蜡中。使用标准临床实践将乳腺肿瘤-IDC样本固定在福尔马林中、处理、并被石蜡包埋。使用1-2mm的取芯设备从石蜡块冲压感兴趣区域，并重新包埋该感兴趣区域。将所有FFPE样品切成4μm厚的连续切片用于载玻片制备，根据标准协议，通过苏木精和伊红（H＆E）对24-48μm距离内的一个连续切口染色。单独使用磷酸酶缓冲剂或加入λ磷酸酶（New England Biolabs，伊普斯威奇，马萨诸塞州）来处理Calu-3异种移植物载玻片（Fogh等，1977），以评价第一抗体的磷酸—表位特异性。
C. 免疫印迹法（Immunoblotting）
通过使细胞裂解物在具有0.5M二硫苏糖醇的等体积的Laemmli样本缓冲剂（Biorad，赫拉克勒斯，加利福尼亚州）中在100℃下达5分钟而变性来制备来自SKBR3细胞的蛋白质样本。蛋白质通过SDS-PAGE分离，被转移到聚偏二氟乙烯膜上，用第一抗体进行印迹，并用辣根过氧化物酶缀合的第二抗体进行检测。使用ECL（Thermo Scientific）检测蛋白质带。
D. 细胞和肿瘤样本的免疫标记
在FFPE样品LnCap、SKBR3和Calu-3异种移植物上实行使用基于DAB的检测的亮视场IHC，以使用BenchmarkXT自动染色仪（Ventana Medical Systems，图森，亚利桑那州）确定针对初次磷酸抗体染色的最佳测定条件。使用了The ultraView Universal DAB检测试剂盒（VMSI Cat＃760-500）。必要时，将OMNIMAP DAB抗Rb检测试剂盒（VMSI Cat＃760-149）的OMNIMAP抗Rb HRP组分或抗半抗原特异性HRP第二抗体缀合物替代ULTRAVIEW DABMultimer（例如，分别用于未缀合的第一抗体或抗半抗原缀合的第一抗体评价）。所有HRP缀合物在37℃下孵育8分钟。
在Benchmark XT自动染色仪（Ventana Medical Systems，图森，亚利桑那州）上对SKBR3细胞和肿瘤组织的FFPE样本实行荧光光谱成像的免疫染色，以评价在FFPE细胞和肿瘤样本中用半抗原-抗半抗原化学过程进行的磷蛋白质染色。在EZPREP缓冲剂（VMSI Cat＃950-102）中使所有FFPE样本（细胞模型、异种移植物或肿瘤组织）经受自动脱蜡，并在抗体孵育之前用CC1缓冲剂（VMSI Cat＃950-124）进行细胞调节达90分钟。将FFPE样本与半抗原缀合的第一抗体的单个或混合物（pS6：BF，pAKT S473：DIG，peIF4G：TS，pPRAS40：NP，pERK1/2：NCA，pAKT T308：DNP分别为5,15,20,20,30,12.5μg/ mL的DNP）在37℃下一起孵育达32分钟。在第一抗体孵育步骤之后，将样本通过适当的第二抗半抗原抗体QD缀合物的组合（抗BF：QD525，抗DIG：QD565，抗TS：QD585，抗NP：QD605l，抗NCA：QD625，抗DNP：QD655分别在40,50,50,70,40,30nM浓度下）在37℃下孵育达32分钟。在用抗体自动染色后，样本被在乙醇系列中脱水，然后通过二甲苯脱水，并使用Cytoseal 60（Thermo Scientific）安装（mount）。
E. 病理学家对肿瘤地带进行评分和识别
来自患者的肿瘤样品通过用于乳腺癌功能标志物ER、PR、Her2、Ki-67、PTEN的IHC，以及用于INDIVUMED肿瘤样品的Her2 Dual ISH，以及用于OHSU-IDC样品的ER、PR、Her2来染色。功能性标志物购自Ventana Medical Systems有限公司，并根据制造商的建议使用。根据标准实践，由专业认证的病理学家对乳腺癌标志物的IHC染色进行评分（Wolff 2007，Hammond，2010）。专业认证的病理学家以24-48mm间隔在H＆E染色的连续切片上识别肿瘤地带。
F. 肿瘤样品的突变分析
针对相关基因突变来筛选肿瘤样本。病理学家识别来自未染色的FFPE切片的肿瘤地带被分离用于DNA提取。通过PCR扩增来源于FFPE组织的20ng DNA用于突变分析，通过使用涵盖已知在癌症中发挥作用的37种基因的编码外显子的面板。使用定制的Ion AMPLISEQ（Ion Torrent）实体肿瘤面板（Beadling 2013）来产生靶扩增库。扩增库制备和测序的细节在以下“补充方法：扩增库的制备”中进行说明。对于OHSU IDC样本，如前所述（Ang 2014），使用基于多重PCR-质谱法的技术实行突变筛选，其涵盖53个基因中的643个点突变。通过测序检测到的基因突变在表6中列出。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
表6. Indivumed样品的PIK3Ca基因组和扩展乳腺IHC生物标志物谱。
G. 图象分析
成像策略利用闭环稳定的金属卤化物电弧光源（Exfo Exacte，Lumen Dynamics，安大略省，加拿大，零件号P010-00201R），该光源能够在相同平面上具有可重复的照明积分通量，绝对照明水平的变化小于1％；照明水平也可以以线性方式调整1％的增量。照明源提供了一种用于使用光功率测量系统（X-Cite光学功率计量器和传感器，Lumen Dynamics，安大略省，加拿大，零件号P010-00245R）将样本平面处的输出校准为绝对单位的机制。该校准设备用于校准光源中的微处理器，以确保通过成像光学列和用于每个数据采集的滤波器精确地将100 mw的激发照明递送到样本平面。
为了确保染色强度的变化是由于报告分子浓度的变化，我们确保成像场被均匀地照亮。Exfo Exacte光源通过液体光导耦接到显微镜，该液体光导用来在耦接到显微镜之前使光源均匀化。一旦耦接，以常规的科勒方式建立视场照明以便入射光激发。这种配置被证实为产生跨由光谱成像设备捕获的地带的均匀的场照明。
该成像系统基于Zeiss AxioImager M2（Zeiss，索恩伍德，纽约，零件号4300049902），其配备有Zeiss-Marzhauser自动化台（零件号4320249903）和自动化z轴。滤波转盘（零件号424907）、相机端口（零件号425504）和物镜转盘（零件号424505）和管式镜头转盘（零件号4253029901），其都提供有自动化接口，该自动化接口用来通过定制软件实现自动采集（VAIS 获取）。
对于组织解剖预扫描成像，通过干涉滤波器（Omega Optical，伯灵顿，佛蒙特州，零件号710DF20）对宽带透射照明进行滤波，从而以圆周倾斜暗视场照明策略提供710nm波长照明。
使用EC Plan-Neofluar 10x/0.30NA物镜（Zeiss，索恩伍德，纽约，零件号4203409901）来收集组织区域预扫描。在设置用于解剖预扫描成像的相机端口（Zeiss，索恩伍德，纽约，零件号426112）上使用了一个0.5x的c型底座（c-mount）适配器。0.5x c型底座适配器是规定以允许使用被配置为能够使用与暗区组织图像结合的荧光核复染色的成像分束器（Photometrics Dual-View 2，Photometrics，图森，亚利桑那州），使得可以以类似于2色苏木精和伊红（H＆E）图像的方式快速收集并呈现2色组织扫描。对于这项研究，仅使用折射率（暗视场）组分被认为足以识别可以用H＆E染色的连续切片证实的组织病理学地带。基于具有6.5微米像素的Sony ICX 285微透镜芯片，在闭环冷却至0摄氏度的情况下，在Photometrics CoolSNAP ES2 12位单色CCD相机（Photometrics，图森，亚利桑那州）上捕获组织区域预扫描。
产生组织解剖结构的折射率对比图像，其可以由医师数字化地呈现以便注释。为了能够选择用于多重成像的肿瘤区域，使用以大约710nm波长为中心的20nm带宽的透射暗视场照明对组织地带进行成像。这种方法允许基于组织与周围封固剂的轻微折射率差异的整体组织解剖结构的对比，但不会对于荧光体或组织自发荧光造成光损伤的风险。因此，对于大面积的快速采集而言，可以使用高水平的照明，并且曝光时间保持较短。
通过在数字观察器中观察多重染色的组织的折射图像，技术人员能够使用高分辨率的光谱成像来定位和注释待获取的感兴趣区域（AOI），以检测并定量生物标志物。这样可以将折射率图像与用苏木精和伊红染色的相同组织的连续切片进行比较，以确认解剖病理学区域。
用于光谱成像的相机是基于具有6.5微米像素的Sony ICX 285单色芯片的非冷却实施方式。用于光谱成像的传感器被评价和表征为提供数字化到4096灰度级的62 dB动态范围，与线性偏差小于1％。用于干涉测量捕获的曝光时间约为10 ms，因此与读取噪声相比，暗电流对噪声的影响是可忽略的。
用于光谱荧光成像的激发/发射滤光器如下：380nm中心波长，具有50nm激发带宽（Omega Optical，伯灵顿，佛蒙特州，零件号QMAX / EX355-405 / 25）；具有低于410nm的反射波段的dichFOVc分束器（Omega Optical，伯灵顿，佛蒙特州，零件号XF2004 / 25.7 *36）以及在420nm处具有深阻挡跃迁的长通滤波器（Omega Optical，伯灵顿，佛蒙特州，零件号3001372）。
用Plan-Apochromat 20x / 0.8NA M27物镜（Zeiss，索恩伍德，纽约，零件号4206509901）捕获所有荧光光谱成像。在用于光谱图像采集的第二相机端口上使用1x c型底座。为了减轻色差的影响，使用在3个位置具有重叠景深的z堆叠。这种惯例被确定以允许在实际条件下跨检测光谱捕获报告基因的聚焦图像。
光谱数据采集利用（Applied Spectral Imaging，Migdal Ha'Emak，以色列）以符合文献（Malik等，1996；Garini等，2006）中描述的方式耦接到c型底座输出的Sagnac干涉仪。干涉仪输出耦接到集成到光谱成像设备中的CCD相机以在一系列路径长度处数字化干涉图。
为了提供编码到未处理的光谱立方体中的基准波长参考，将488陷波滤波器（Semrock有限公司，罗切斯特，纽约）放置在物镜和干涉仪之间的无限远空间中的检测路径中。组织自体荧光具有覆盖光谱蓝色范围的宽峰，以及该陷波滤波器将窄的局部最小值编码成原始数据的组织自发荧光分量。然后在分析软件中检测该局部最小光谱特征，并将该局部最小光谱特征用来校准要在分析中解混的针对各种发光部件的参考光谱的对准。该编码校准确保了由于干涉仪光学器件的温度相关波动导致的原始数据中的波长映射的任何小的偏移得到缓和，以最小化解混中的精度损失的可能性。
自定义系统自动化和采集软件是在Python ['Ventana分析成像系统（VAIS）ACQUIRE]中开发的，用以配置并编排预扫描和光谱自动采集工作流程。采集软件利用Python接口进行用于显微镜、光源和扫描前相机控制的低级仪器控制库。软件GUI允许交互式选择相关解剖病理学，选择感兴趣的肿瘤区域上的结构化取样密度（50％），选择z平面（以1μm间隔的3个平面），使得它们可以被保存和重新加载，以允许以相同的仪器配置有效地重复采集。采集接口允许定义复杂的采集方案，例如在多个z平面上的光谱采集，在一系列地带上重复对大的肿瘤区域进行取样。
通过ASI光谱成像应用（Applied Spectral Imaging，米格达勒埃梅克，以色列）实现了干涉仪的基本控制和低级配置。通过我们的定制接口实现了高级自动化，该定制接口通过ASI应用间接控制了光谱成像设备。
对干涉仪的设置进行了优化，以便在干涉图在大约100波长处被傅里叶变换为表示二维空间的光谱图像立方体之后，在400nm和800nm波长之间的可见光范围内在大约100个取样点处产生波长图像。
对于荧光光谱采集，曝光时间被标准化为每帧8毫秒，以用于采集干涉图，该时间被选择为在实验中遇到的最亮荧光样本的CCD阱容量的3/4内提供信号。
定制分析软件[“Ventana分析成像系统”（VAIS）ANALYSIS]是在Python中开发的，能够以对多维原始数据进行专门处理，并对相关特征进行提取，以用于测量、可视化、绘图和电子表格导出。使用通常用于分解荧光信号的无约束最小二乘拟合方法（Garini等2006）实行重叠分析物信号的解混。
在放大率（32x）下收集数据，并在网格中的每个视场坐标处捕获高分辨率光谱数据。每个视场的数据通过z轴在多个z位置收集，以确保通过组织厚度捕获并减轻轴向色差（颜色在样品中的不同深度聚焦）。
AOI中的各个视场被收集并存储在目录结构中，使得可以使用VAIS ANALYSIS软件对AOI的视场进行分组以便进一步分析。数据组织和数据集创建接口允许对视场进行分组以便比较。
在获取多重标志物数据之后，通过线性最小二乘法与参考光谱解混，将分析物通道解混到玻璃、组织自发荧光和每个报告基因量子点（525、556、585、605、625、655），以提供表示在标准化条件下捕获的每种标志物的染色强度的纯分析物通道图像。确定解混算法以通过以下实验来产生准确的结果：通过成像系统混合多个透射和反射光带，并对所得到的对照数据实行解混操作。还注意到解混的性能以可靠地分割靶向到组织中不同细胞区室的多个标志物。以这种方式，可以通过检查所得解混分析物图像中的信号的空间定位来评价光谱解混的精度。
基于形态测量性质（尺寸）和光度测量性质（信号强度范围），对数据集中每个视场的解混染色通道进行进一步分割以选择感兴趣的特征。这些分割存留为数据集对象的一部分，并且可通过在VAIS查看器中打开数据集并更改分割参数来重新分割，然后按照新名称保存数据集。
技术人员使用VAIS查看器进一步检查和编辑自动分割功能，利用注释工具以标记特征以便分析。以这种方式，实验者能够指定要包括或排除在分析之外的区域。作为示例，研究者将根据任何下游分析指定被排除的坏死区域。这些注释然后存留为“数据集”的一部分，并且可以由利用专门的查看器和适当的许可打开数据集的其他技术人员编辑。
一旦将数据集加载到异质性分析界面中，每个视场的每个分析物被加载到图像“堆叠”（3D阵列）中，使得x和y轴是空间坐标，以及z轴的每个层表示不同的分析物图。每个视场图像栈在x或y边缘附加到先前的图像栈，使得这些视场被平铺成代表肿瘤区域的大的x、y、z图像。当每个分析物视场被加载时，先前已经注释为被包括的每个视场的区域保持不变，并且其他区域被设置为零值。
参数被标准化以控制加载层中的像素是否受到中值滤波器的影响以在给定的覆盖区域上使信号均匀化，或者信号是否在给定的覆盖区域上被平均。对于这项研究，图像分辨率降低75%以在8×8像素覆盖区域上平均，并且以2像素半径应用中值滤波器。这些参数确定了输入到聚类算法的每个“超像素”或单位区域的大小，并且用于减少由于噪声引起的信号中局部波动的影响。
接下来是将类似表达模式的区域分组成“聚类”。对于细胞表达和激活异质性分析，我们选择了一种将在n维空间中形成更密集的“点云”的算法，每个点代表由针对我们的分析物测量的6个强度值形成的向量。实现被称为均值漂移的基于密度的聚类算法，（Comaniciu和Meer，2002）。均值漂移算法适用于在我们的多重数据集中分割不同的表达模式。通过描述分布截止的参数（带宽）来指定多-标志物表达中的相似性截止。带宽估计器功能 (Comaniciu & Meer, 2001, http://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.cluster.estimate_bandwidth.html 和 https://github.com/scikit-learn/scikit-learn/blob/c957249/sklearn/cluster/mean_shift_.py#L31) 用于确定要使用的带宽，该带宽估计器获取待取样的像素数量和分位数参数的输入。带宽估计器从图像中取样多个地带（在这里的示例中为500），并且从样本和分位数确定带宽（我们使用0.75的分位数，0.5是取样值之间的成对距离的中值）。
均值漂移聚类算法的输入是平铺数据集图像栈，以及输出是x、y阵列，其中x和y坐标是输入平铺图像栈的空间坐标，并且每个xy位置处的值是指示给定像素所属的聚类数的标记。因此，在输出阵列中，具有值“1”的像素属于聚类号1，具有值“2”的像素属于聚类号2，对于已经被算法分割的多个聚类依此类推。
通过为聚类输出阵列中的每个数分配颜色并显示在计算机屏幕上来创建“聚类图”。以这种方式，聚类'0'以呈现为白色区域，与聚类'1'相关联的像素被着色为红色，与聚类'2'相关联的像素为黄色等等。分析物图像的聚类图和颜色叠加可以放置在用于数据收集的光学配置的专门的图像查看器的交替窗口中，以将各种聚类的空间区域与不同标志物的相对表达水平进行比较。聚类图有效地识别在解剖学背景中多重生物标志物的相似和不同表达或激活模式的区域。以这种方式，容易地使不同表达或激活的区域之间的关系可视化。
聚类分析输出阵列用来分割平铺的输入图像栈上的区域，并测量聚类区域中每个“像素”（单位区域）处的针对每个分析物的值。以这种方式，给定生物标志物的强度值（反映表达水平或激活）的分布对每个分析物以每聚类方式并且对每个像素或单位区域以行的方式使用箱形图来绘制。
H. 生物标志物强度分析
染色细胞和肿瘤组织样本中所有PI3K途径蛋白质的磷酸化水平均由混合通道的强度进行定量，所述混合通道的强度表示每种标志物的染色强度贡献。从阈值像素计算每个图像场的平均强度（排除了视场中最亮信号的1％以下的像素值，以从未染色区域去除非相关像素贡献，并且最大强度的95％以上的像素被钳制在95％的强度水平，以去除从热像素到平均值的假性的贡献）。从几个随机选择的图像场的组合平均值计算每个患者的磷酸标志物的总体平均强度。
I. 信号传导途径表型—聚类分析
均值漂移算法是一种更普遍地应用于机器视觉中的对象跟踪和彩色图像中分割对象的模式搜索算法。这里我们已使用该算法以便基于6种标志物之间表达模式相似度来分割区域。该算法的使用产生向量空间中类似表达模式的分割组，并且能够容忍具有不规则形状的分布。此外，算法运行而不必针对各聚类必须多么“不同”或强加数据上假定的聚类数来假定离散的截止点。
通过使用来自Scikit学习项目（Pedregosa等，2011）的对象的VAIS分析中实现的平均移位聚类分析，在支持代码处理多场图像栈作为输入的情况下，磷蛋白质标记物的各种聚类模式被识别。均值漂移算法的输入是向量的阵列，每个向量由针对标准化网格单位区域或“超像素”而平均的6种标志物值组成。超像素在大小上可以从单个像素调整到覆盖许多像素的区域，并且跨包括正在处理的整个数据集的视场以连续的方式平铺。使用带宽估计器来估计均值漂移算法的带宽参数，所述带宽估计器针对为500的分位数和样本大小具有为0.75的输入参数。所得到的可视化显示将每个视场的颜色编码的超像素图平铺为单个二维图像。产生指示每个聚类占用的总面积的相对比例的颜色编码的直方图，以及每个聚类的每种标志物的超像素值的分布。
J. 网络信号传导聚类的分层树形图分析
为了对所产生的磷酸标志物表达表型之间的相似性进行排序，使用采用欧几里德距离度量的非参数分层分析（Hastie, T.等，The elements of statistical learning，第2卷，Springer，2009）。通过计算每种表型之间的向量差，计算磷酸标志物表达表型的所有组合之间的距离。使用标准的聚集、自下而上的分层分析，从而以最小的欧几里得距离对网络信号传导聚类进行排序和分组，并以树形图格式绘制。
K. 结果
1. 多重组织成像平台（MTIP）功能的表征
生成六种抗磷酸抗体-QD缀合物对的面板用于多重化（表4），该面板由PI3K信号传导途径（pAKT473、pAKT308、pPRAS40、pS6、peIF4G）中的五个效应子组分和MAPK信号传导途径（pERK）中的一个输出效应子组分组成，涉及与PI3K信号传导（ref）的串扰的途径。将全部六种半抗原化抗磷酸标志物抗体的混合物与组织一起孵育，随后用六种抗半抗原第二抗体-QD缀合物的混合物孵育（图14A-C ）。
使用FFPE细胞和异种移植模型系统，使用一系列IHC实验来测试所选抗体的特异性（图14A-C 、15A-B 和16）。使用SKBR3细胞系、PI3K途径激活的完善的乳腺癌模型（Englemen PNAS ref）来测试抗磷酸标志物半抗原缀合的第一和抗半抗原单克隆第二功能。未处理或用AKT小分子抑制剂GSK690693处理SKBR3细胞。将两个细胞群体制备为FFPE块，并使用抗磷酸标志物原色进行染色，随后由抗半抗原第二抗体与HRP缀合以允许通过DAB进行对比。这允许验证半抗原抗半抗原标记方案（图14A-C ；DAB染色图案与并行实行的第一抗种类第二染色一致）。
在用LY294002处理的LnCap细胞上使用单一未缀合的第一抗体的DAB IHC展示所有标志物的广泛表达丧失（图15A-B ：LnCap）。根据LY294002治疗的PI3K标志物表达的预期丧失确定未缀合的第一抗体的特异性。然后使用磷酸酶处理的Calu-3异种移植组织建立这些第一抗体的磷酸特异性，其中所有磷酸标志物抗体的磷酸酶处理组织中的染色显著降低（图15A-B ：Calu-3）。通过上文概述的SKBR3块上的免疫荧光（IF）染色来评价量子点缀合的抗半抗原抗体的功能。首先，每次使用一个磷酸标志物实行IF染色，然后进行超光谱成像，以将磷酸标志物信号与自身荧光背景信号分离（图14A ）。该过程显示与DAB染色结果一致的染色强度图。这证实了我们量子点缀合的抗半抗原第二试剂的预期功能。
然后使用组合标志物进行多重实验，接下来进行超光谱成像和处理以分离针对每种标志物的信号贡献（图14B ）。为了附加的比较，将SKBR3细胞裂解物经受用全部六种磷酸抗体的免疫印迹（图14C ）。结果示出，在与IF和针对两个细胞群体的免疫印迹结果相比较时，每种标志物的光谱解混图像的图案和表达是一致的。两个AKT标志物都示出表达中预期的相对增加，随后是GSK690693药物治疗（Rhodes 2008）。pPRAS40、pERK和pS6示出药物治疗后的表达中的降低，但pelF4G在表达中没有示出任何显著变化。在使用MTIP检测的药物治疗时磷酸标志物表达变化与在IF和免疫印迹染色中观察到变化的相似性验证了在多重测定上下文中使用的缀合抗体的特异性和功能性。
2. MTIP蛋白质谱和再现性
利用通过靶向测序（表5和6）、患者5（图17A ）证实的PIK3Ca中的已知H1047R突变，使FFPE乳腺患者肿瘤样本染色来测试MTIP的表现。图17A 中的每个面板包含跨病理学家标记的肿瘤地带随机选择的在FOV上平均的全部六种磷酸标志物的染色模式。来自相同FOV的磷酸标志物的光谱解混图像示出肿瘤地带内的异质染色模式，其反映每种标记物的预期生物表达模式。这些数据证明MTIP能够在完整的FFPE实体肿瘤组织中的广泛动态表达范围上并以亚细胞空间分辨率检测多重磷酸标志物信号传导。
使用患者5样本（图17D）建立MTIP性能的再现性。连续3天重复测定一式三份（总共n = 9），并且每种标志物的表达水平被测量为在相邻连续切片中的同源ROI中成像的组织区域上的平均值。MTIP产生在针对每个相应的磷酸标志物的80％的窄边缘内变化的染色水平测量。所有标志物中的变化系数从8％变化到13.8％（白色条，左图，图17D），这表明与用于实验室开发的生物化学测试的美国病理学家学院（CAP）指南一致的测定平台中的再现性水平。
3. 具有PI3K途径突变的乳腺肿瘤中的MTIP蛋白质谱
在通过靶向测序确定的代表PI3K途径中常见基因组畸变的乳腺癌群中实行使用MTIP的定量的磷酸表达谱。来自这些样本的连续切片也通过IHC用乳腺标志物（包括ER、PR、Ki67、Her2和PTEN）进行染色，并由病理学家评分，以更好地了解PI3K激活的其他贡献者，其可能不明显仅仅来自基因组状态（表6）。MTIP显示，个体肿瘤具有PI3K途径磷酸表达的复杂模式（个体ROI，图18A ；平均ROI，图18B ）。第二，MTIP显示了磷酸表达中的显著的患者间异质性。MTIP显示，PI3K途径磷酸激活不一定仅由PIK3ca突变状态预测（图18C ）。例如，患者1在PIK3Ca中具有E545K突变，但没有显示高水平的PI3K途径激活。该样品也是支持低PI3K激活的PTEN +。可替代地，患者5样品保持PIK3ca中的H1047R突变以及高Her2表达和PTEN阴性（图18C ），这表明添加剂输入因子进入PI3K途径激活。这些数据指示使用MTIP的多重磷酸表达谱可以补充传统的IHC生物标志物评价和基因型信息，以便产生更全面的肿瘤发生分析。
4. 乳腺肿瘤中的MTIP图蛋白质异质性
计算模式识别被用来将具有相似表达模式的区域分割为表型群体或“表达聚类”。平均移位聚类分析被用来识别磷酸化的独特模式（图11）。表型被定义为跨六种标志物具有相对磷酸蛋白质表达的类似模式的肿瘤地带；属于每个聚类的二维肿瘤区域被颜色编码以表示存在于所捕获的肿瘤区域（n = 8）中的识别表型（图19A ）。每个表型聚类跨肿瘤的空间范围进行了颜色编码（图19B ），并绘制了三个最大表型聚类（以面积计）内针对每个磷酸标志物所测量的的表达水平分布（图19C ）。表型的分层聚类显示在热图中，并以树枝形结构关系图形式排列（图19D ）。检查四个示例的肿瘤的颜色编码表型图得到几个观察结果。首先，多个独特的PI3K途径磷酸化表型存在于跨个体肿瘤的异质空间分布中。每个患者在相同肿瘤组织内具有多种不同的信号传导途径磷酸化表型。患者3在感兴趣的所有地带中具有识别的相同表型，而患者4具有针对捕获地带的子集特有的某些表型。在肿瘤内和肿瘤之间的pERK和pAKT308比例中突出的变异性是明显的，并且pAKT 473、pRAS40、pS6的模式在各患者之间似乎显著变化。分层分析显示，如通过每种标志物磷酸表达谱（图18B 和C 和19C ）所述，预期的PI3K途径磷酸化表型与所识别的基因型（野生型、AKT1或PIK3CA突变）没有良好地相关。在所有肿瘤中，通过全部六种PI3K网络组分（灰色着色的聚类，图19A 、B 、C）的较低磷酸激活水平从上皮组织分割基质组织。有趣的是，注意到只出现在小细胞组中的表型的存在（图19B 、5-CA3、3-CA1和2-CA1）；这样的数据指示需要进一步表征这些特定的异常上皮亚型。因此，MTIP聚类分析提供了关于不同的磷酸激活表型的定量数据；在使组织材料均匀化或在较大区域上平均的正交方法中丢失这种信息。
为了进一步了解具有相同PI3K途径突变的样品的异质性，在具有作为PIK3Ca WT或PIK3Ca E545K（其已示出激活PI3K途径信号传导）的浸润性导管癌（IDC）的明确定义地带的乳腺损伤样品（图20）中评价磷酸信号传导网络异质性[Zardavas等2014]）。将来自聚类分析的结果与以前的患者群的基因组状态进行比较（图20C-E ）。在包含不同表型的较大地带内存在罕见表型的小群集（图20A 和B ，19A 和B ）。虽然不同表型的分布根据患者而不同，但大多数表型由pERK + pAKT T308签名（其量值成比例地增加）组成，其中pAKT 308信号水平高于所有聚类中的pERK水平（图20D ）。虽然层次分析显示基质组织地带的表型分组，但与图19A-D 中的分析相似，这些肿瘤在磷酸表型与相应的基因型（野生型或E545K突变）之间没有显示出明确的关系。
在这些示例中，仅基因型信息似乎不足以预测磷酸蛋白质激活水平。这些结果突出了MTIP提供补充现有基因组和IHC生物标志物信息的磷酸—蛋白质组学信息的潜力。
图21是本发明的成像方法的实施例的说明。在x-y平面上提供多光谱图像100。多光谱图像100通过解混操作而解混，以便提供图像栈102。
在这里考虑的示例中，多光谱图像100的通道数n为n = 5，使得混合操作提供数量n = 5层，L1、L2、L3、L4、L5，其中每层可以被渲染为相应的单通道图像。因此，在这里考虑的示例中，图像栈102包括数量n = 5个单通道图像104、106、108、110和112。由解混操作产生的图像栈102创建n + 2维空间，其中每个点P i 由其在x-y平面中的空间坐标（即xi ，yi ）以及位置xi，yi 处的n个单通道图像上的各个强度值给出。例如，点Pi 的L1平面上的强度值以及因此点Pi 的n + 2维空间中的第三坐标的值为Ii（L1），即在位置xi、yi处的层L1上的强度值。同样，点Pi的其他坐标值由Ii（L2）、Ii (L3)、Ii (L4)和Ii (L5)给出。换句话讲，
点 Pi = (xi, yi, Ii (L2), Ii (L3), Ii (L4), Ii (L5))。
然后通过应用无监督的非参数基于密度的聚类算法（例如均值漂移聚类算法）来实行聚类操作，以便对由图像栈102给出的n + 2维空间中的点进行聚类。在这里考虑的示例中，这提供了许多聚类，其中的两个在图21中示出，用于说明的目的，即聚类C1和C2。已经通过聚类算法识别的每个聚类包含在应用适当的距离度量（例如，欧几里德距离度量）的n+ 2维空间中相对接近的图像栈102的点数，以测量n + 2维空间中的两点Pi 和Pj 之间的距离。
例如，从其获得多光谱图像100的细胞样本的异质性可以由通过聚类算法识别的不同聚类的数量来表示。聚类的结果可以被可视化，例如通过输入用户对单通道图像104-112中的一个的选择，例如在显示设备117上呈现的单通道通道图像108。通过将聚类C1和C2投射到x-y空间上，将x-y平面中的聚类C1和C2的定界114、116作为覆盖显示在单通道图像108上。在x-y空间中的结果得到的定界通过示例的方式显示为用于聚类C1的定界114和显示设备117上的用于聚类C2的定界116。
根据进一步的实施例，用户可以选择单通道图像104-112中的多个，使得这些多个单声道图像同时显示在显示设备上。可以在部分或全部显示的单通道图像上显示定界114和116。
本发明的实施例由于在n + 2维空间中的聚类和随后在x-y平面中的聚类成像特别有利于作为对人眼不明显的聚类，因为它们延伸到从用户的想象中隐藏的n + 2维空间变得明显。换句话说，本发明的实施例能够检测跨图像栈层形成的图像栈102中的聚类的存在，其提供关于细胞样本中的异质性的关键信息。这种聚类的检测（例如聚类和/或聚类位置的数量）基于可以得出关于疾病状态的哪些结论（特别是是否给予药物）来呈现重要的信息。例如，如果聚类的数量低于阈值，则指示低度的异质性，则这可能表明没必要给予化学疗法。此外，聚类位置的检测和成像可能为操作规划提供重要信息。
根据本发明的实施例，包含在图像栈102中的点通过对各点进行像素合并来低通滤波。例如，这可以使用p×p方形来实现，例如在x-y平面内移动的2×2方形。在p×p方形的每个位置，每维度计算该方形内的各点的强度值的平均值，并且针对该方形的位置输出针对每个维度的单一平均强度值，然后移动到下一个平铺块上。以这种方式处理整个图像栈102导致点数减少p×p的因子。减少的点数导致聚类算法所需的执行时间减少，并且由于消除噪声的低通滤波导致更稳定的聚类结果。然后，如图21所描绘的，聚类的结果（即定界114和116）然后覆盖在全分辨率图像（例如单通道图像108）上。
5. 讨论
MTIP技术可以捕获和测量癌细胞模型和临床乳腺癌组织中多重的磷蛋白质表达。我们提出了使用鲁棒的机器学习模式识别算法来用于识别乳腺癌样品中表型和定量信号传导途径异质性的实践方法。我们展示了MTIP技术在表征肿瘤样本时提供关于细胞表型的相关信息的能力；该信息是通过正交方法使用当前的生物标志物无法访问的，以及因此与现有的生物标志物和基因组信息是互补的。
PI3K途径可以通过几种机制来激活，包括PIK3Ca中的基因突变（在所有乳腺癌8-10的约30％中发现）、PTEN表达的丧失（例如通过PTEN缺失或后成沉默）和受体酪氨酸激酶（RTK）扩增（例如Her2过度表达）。不规则PI3K途径磷酸化状态是PI3K途径激活的结果，不管PI3K途径改变的根源如何。我们的实验突出了如下事实：PI3K途径激活可以源自多个输入，并且指示单独使用基因分型不容易实行患病组织中磷酸激活表型的预测；因此，使用MTIP评价PI3K途径标志物磷酸化状态可以补充现有的诊断工具。
通过异质性分析和表型聚类，上文证明了使用常规生物化学分析解决将会丢失的小但潜在重要的表型的群体的能力。结果突出了MTIP在表型异质性背景下网络信号传导途径激活的蛋白质组学定量中的性能和相关性。从MTIP分析得到的磷酸表达谱可能与基因组和其他生物标志物信息相关或相当。在PI3K信号传导的背景下，靶向PI3K途径的几种单一药剂正在开发中，并处于临床研究的各个阶段 (Hassan等，2013；Fruman和Rommel Nat.Rev Drug Disco，2014)。上述结果指示，MTIP可以识别可能影响用于抑制PI3K途径激活的个性化治疗决定的患者特异性磷酸表达特征。然而，成功的靶向治疗剂的未来可能依赖于以各种组合使用途径特异性抑制剂 (AL-Lazikani Nature Biotech，2012；Bozik等，2013)。在多途径磷酸表达谱（如本工作中所述的PI3K和MAPK）的背景下，MTIP可以提供磷酸—蛋白质组学数据，其可以在每个患者的基础上将组合疗法的使用情境化。
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Claims (46)

1.一种表征细胞样本中的异质性的方法，所述细胞样本包括用可检测的标志物标记的一种或多种分析物，所述方法包括在计算机装置上分析所述细胞样本的图像（100），所述计算机装置包括被编程为将聚类分析应用于从所述细胞样本的图像获得的数据集以创建包括表达模式的多个聚类的聚类图的计算机处理器，其中：
(a)所述数据集包括用于所述细胞样本的图像的至少一部分的图像栈（102），其中，所述图像栈包括x轴、y轴和z轴，其中，所述x轴和所述y轴表示所述图像的部分内的空间坐标，并且所述z轴包括数目为n的层（L1，L2，L3 ...，Ln），其中，所述z轴的每个层包括在多个x、y坐标处的单一可检测标志物的强度数据；以及
(b)所述聚类分析包括将无监督的、非参数的基于密度的聚类算法应用于图像栈，其中所述聚类算法对由所述数据集在至少n + 2维空间中定义的点（P i 、P j ）进行聚类，其中每个点由x、y坐标和所述图像栈中的相应的x、y坐标处的n层的n个强度数据值给出，从而生成所述多个聚类，
(c)输出代表所述聚类分析的结果的输出数据（114，116），所述数据表示所述细胞样本中的异质性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述图像是多通道图像，并且其中通过解混所述多通道图像来获得所述n层。
3.根据权利要求2所述的方法，其中通过显示所述多通道图像（100）和/或一个或多个单通道图像（104，106，108，110，112）来实行所述数据的输出，其中通过可视化所述多通道图像和/或所述至少一个单通道图像中的所述聚类的定界（114，116）显示所述n层之一来给出单通道图像。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，还包括生成指示所述数据集中的每个聚类的比例区域的聚类直方图，所述聚类直方图是在步骤c中输出的数据。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，还包括对所述n+2维空间的点进行像素合并以用于对所述图像栈进行低通滤波，并降低xy分辨率以提供经像素合并的图像栈，其中在经像素合并的图像栈上实行步骤b中的聚类分析。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，所述图像的部分是所述细胞样本的至少一个感兴趣区域（AOI）内的至少一个视场（FOV）。
7.根据权利要求1、2或3所述的方法，所述输出数据包括指示所述聚类分析的结果中的聚类数量的数据。
8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述基于密度的聚类算法是均值漂移聚类算法，其中所述均值漂移聚类算法的输入是所述图像栈，并且所述均值漂移算法的输出是x、y阵列，其中x和y坐标是所述输入图像栈的空间坐标，并且每个x、y坐标处的值是指示给定x、y坐标所属的聚类号的标记。
9.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述细胞样本的图像是能够被数字地渲染以供医生注释的组织解剖的折射率对比度图像，并且其中基于组织解剖选择所述AOI。
10.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述数据集通过以下方法获得，所述方法包括：
（a1）计算所述图像内的多个AOI中的每一个的FOV取样网格；
（a2）在每个FOV中的单个或多个z平面处自动收集多光谱数据和/或超光谱数据；
（a3）从所述多光谱数据和/或超光谱数据计算地分割可检测标志物信号；
（a4）将在所述聚类分析中要作为一组进行比较的FOV选择到数据集结构中；以及
（a5）对所述数据集中的每个FOV的每个可检测标志物信号应用自动形态特征分割。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述FOV取样网格包括跨所述AOI以规则间隔间距的多个FOV。
12.根据权利要求10所述的方法，其中来自每个FOV z平面的所述多光谱数据和/或所述超光谱数据被自动保存在对患者、测定、活检、切片、AOI位置和/或FOV位置具有元数据属性的嵌套数据结构或数据库中。
13.根据权利要求10所述的方法，其中：
（a4a）被选择要作为一组进行比较的FOV对应于相同组织切片中的不同肿瘤病灶，或者
（a4b）基于从相同患者取得的活体组织切片对FOV进行分组，以便与从相同患者取得的不同活体组织切片进行比较；或者
（a4c）基于肿瘤位置对FOV进行分组；或者
（a4d）基于患者对FOV进行分组以便与另一患者进行比较；或者
（a4e）基于肿瘤基因型对FOV进行分组。
14.根据权利要求10所述的方法，其中特征分割基于大小约束、强度约束或大小约束和强度约束的组合。
15.根据权利要求10所述的方法，其中用于获得所述数据集的方法还包括：
（a6）手动指定一个或多个FOV中的地带以包括该聚类分析或从该聚类分析排除。
16.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中当被共同定位和可定量时，所述可检测标志物基于光谱或其他物理特性产生可与其它标志物和组织分离的信号。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述可检测标志物附接到抗体。
18.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述可检测标记物附接至与至少一种磷酸化蛋白质特异性结合的至少一种抗体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种磷酸化蛋白质是PI-3激酶信号转导途径或MAP激酶信号转导途径的成员。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种磷酸化蛋白质选自由AKT、PRAS40、S6、EIF4G和ERK1 / 2组成的组。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞样本是通过使用双温固定来固定的组织样本。
22.一种根据肿瘤中的信号转导途径的生理状态表征肿瘤的方法，所述方法包括根据权利要求1至21中任一项所述的方法分析肿瘤样本的图像，其中：
用所述可检测标志物标记两种或更多种分析物；
用可检测标志物标记的分析物中的至少一种是磷酸化的信号转导蛋白质；以及
在针对所述图像的每个FOV中的单个或多个z平面上收集超光谱或多光谱数据。
23.一种用于自动识别细胞样本中的异质性的系统，所述系统包括：
（a）分析性成像分析系统，其包括：
处理器；和
存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令在由所述处理器执行时使所述处理器实行包括根据权利要求1至22中任一项所述的方法的操作。
24.根据权利要求23所述的系统，还包括：
（b）分析性成像硬件系统，其适于从所述细胞样本捕获所述细胞样本的数字化图像和多光谱数据和/或超光谱数据，并将所述数字化图像传送到所述分析性成像分析系统。
25.根据权利要求24所述的系统，还包括含有细胞样本的载玻片，其中一个或多个感兴趣的分析物用可检测标记物标记。
26.根据权利要求25所述的系统，其中所述细胞样本是已经使用双温固定保藏的福尔马林固定的石蜡包埋的组织样本，并且其中所述可检测标记物附接至与至少一种磷酸化蛋白质特异性结合的至少一种抗体。
27.根据权利要求26所述的系统，其中所述至少一种磷酸化蛋白质是PI-3激酶信号转导途径或MAP激酶信号转导途径的成员。
28.根据权利要求26所述的系统，其中所述至少一种磷酸化蛋白质选自由AKT、AKT、PRAS40、S6、EIF4G和ERK1 / 2组成的组。
29.根据权利要求23-28中任一项所述的系统，其中所述系统还包括：
(c) 关系数据库。
30.一种用于存储由处理器执行以实行操作的计算机可执行指令的非暂时计算机可读存储介质，所述操作包括根据权利要求1至22中任一项所述的方法。
31.一种根据磷酸化谱来表征肿瘤的方法，所述方法包括：
（a）以揭示形态细节从而使肿瘤地带与其他非肿瘤地带区分开的方式捕获所述肿瘤的细胞样本的数字图像，其中：
（a1）所述肿瘤的细胞样本用多种可检测标记的特异性结合剂标记；
（a2）所述多种特异性结合剂中的至少一种对信号转导蛋白质的磷酸化的形式是特异的；以及
（a3）所述特异性结合剂的可检测标记物：
（a3a）在彼此共同定位时基于光谱特性彼此可分离；
（a3b）可与所述细胞样本分离；以及
（a3c）可定量；
（b）在处理器上执行注释所述细胞样本的数字图像的功能以选择所述细胞样本的肿瘤地带内的一个或多个感兴趣区域（AOI）；
（c）在处理器上执行计算所述图像内的每个AOI的视场（FOV）取样网格的功能，并且在每个FOV中的单个或多个z平面上收集多光谱数据和/或超光谱数据；
（d）在处理器上执行从所述多光谱数据和/或超光谱数据计算地分割可检测标志物信号的功能；
（e）在处理器上执行将彼此比较的FOV放入到数据集结构中的功能；以及
（f）可选地，在处理器上执行对所述数据集中的每个FOV的每个可检测标志物信号应用基于大小约束、强度约束或大小约束和强度约束的组合的自动形态特征分割以识别将从聚类分析漏掉的FOV的地带的功能；
（g）可选地，在处理器上执行允许手动指定一个或多个FOV中的地带以包括所述聚类分析或从所述聚类分析排除的功能；
（h）在处理器上执行将所述数据集结构加载到具有x轴、y轴和z轴的图像栈中的功能，其中所述x轴和所述y轴表示所述FOV内的空间坐标，并且所述z轴包括一个或多个层，其中所述z轴的每个层包括在多个x、y坐标处的单一可检测标志物的强度数据；以及
（i）在处理器上执行将无监督的非参数的基于密度的聚类算法应用于所述图像栈以将x、y坐标与跨所述z轴的各层具有相似比例的可检测标志物强度的其他x、y坐标分组从而产生具有相似表达模式的多个聚类的功能，其中每个聚类表示磷酸化谱。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述无监督的非参数的基于密度的聚类算法是均值漂移聚类算法，其中均值漂移聚类算法的输入是所述图像栈，并且均值漂移算法的输出是x、y阵列，其中x和y坐标是所述输入图像栈的空间坐标，并且每个x、y坐标处的值是指示给定x、y坐标所属的聚类号的标记。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞样本是组织样本，并且所述组织样本的图像是能够被数字地渲染以便由医师注释的组织解剖的折射率对比度图像，并且其中基于组织解剖选择所述AOI。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述FOV取样网格包括跨所述AOI以规则间隔间距的多个FOV。
35.根据权利要求31所述的方法，其中来自每个FOV z平面的所述多光谱数据和/或所述超光谱数据被自动保存在对患者、测定、活检、切片、AOI位置和/或FOV位置具有元数据属性的嵌套数据结构或数据库中。
36.根据权利要求31所述的方法，其中：
（a4a）被选择要作为一组进行比较的FOV对应于相同组织切片中的不同肿瘤病灶，或者
（a4b）基于从相同患者取得的活体组织切片对FOV进行分组，以便与从相同患者取得的不同活体组织切片进行比较；或者
（a4c）基于肿瘤位置对FOV进行分组；或者
（a4d）基于患者对FOV进行分组以便与另一患者进行比较；或者
（a4e）基于肿瘤基因型对FOV进行分组。
37.根据权利要求31所述的方法，其中信号转导蛋白质的磷酸化的形式中的至少一种是PI-3激酶信号转导途径或MAP激酶信号转导途径的成员。
38.根据权利要求31所述的方法，其中信号转导蛋白质的磷酸化的形式中的至少一种选自由AKT、PRAS40、S6、EIF4G和ERK1 / 2组成的组。
39.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞样本是通过使用双温固定来固定的组织样本。
40.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法在包括分析性成像硬件系统的系统上执行，所述分析性成像硬件系统适于根据（a）捕获所述数字图像并将所述数字图像传送到分析性成像分析（AIA）系统，所述AIA系统包括处理器和耦接到所述处理器的存储器，所述存储器存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令在由所述处理器执行时使所述处理器实行操作（b）-（i）。
41.一种由包括显示设备（117）的多光谱成像系统实现的对细胞样本成像的方法，所述方法包括：
- 从所述细胞样本获取图像数据（100），所述图像数据包括多光谱像素，
- 提供数目为n的单通道图像（104，106，108，110，112）的多光谱像素的光谱解混，
- 实行聚类分析，包括在由所述n个单通道图像给出的n+2维空间中应用无监督的非参数的基于密度的聚类算法，从而生成多个聚类（C1，C2），
- 在所述显示设备（117）上显示通过所述聚类获得的聚类结果的表示（114，116）。
42.根据权利要求41所述的方法，还包括显示所述单通道图像（108）中的至少一个并且将所述聚类结果的表示（114，116）显示为所述至少一个单通道图像上的覆盖。
43.根据权利要求41或42所述的方法，所述单通道图像的数量n大于3。
44.根据权利要求43所述的方法，所述单通道图像的数量n大于4。
45.根据权利要求41或42所述的方法，其中在实行所述聚类算法之前，所述解混图像数据被低通滤波。
46.根据权利要求41或42所述的方法，其中在实行所述聚类算法之前，对所述解混图像数据进行像素合并，其中所显示的图像（108）具有未经像素合并的图像数据的分辨率。
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