CN109712142B - 基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法 - Google Patents

基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法 Download PDF

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Abstract

本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，首先对乳腺癌病理切片图像进行染色分离，获取基于H染色剂的图像IH和基于DAB显色剂的图像IDAB，然后经滤波消除细胞间质的影响，获得图像IH，filterd和IDAB，filterd；然后根据IH，filterd统计阴性细胞，根据IDAB，filterd及其亮度图VDAB统计强阳、中阳、弱阳细胞，最终获取阴性细胞、阳性（分强阳、中阳和弱阳）细胞的数量和所占细胞总数的概率。本发明设计基于染色分离的乳腺癌核染色细胞计数方法，能够快速有效地实现细胞计数，协助医生工作，降低医生工作量的同时保证计算准确度。

Description

基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法
技术领域
本发明涉及一种乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，更具体的说，尤其涉及一种基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法。
背景技术
根据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局于2018年统计的全国癌症数据，乳腺癌发病率已连续两年位居全国女性恶性肿瘤发病的第一名。女性全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。中国不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病率的增长速度比高发国家还高出1～2个百分点。针对原发性乳腺癌，目前国际上均是根据患者ER、PR、HER2以及Ki67的阳性状态进行免疫组化分型，将乳腺癌分为四种分子亚型，包括腔面A型、腔面B型、HER2过表达型以及三阴性型，根据不同分型确定不同的治疗方式。
在四种阳性状态表达中，ER、PR和Ki67是核染色类型，即将切片中的细胞核染色，其阳性状态是通过计算切片中阴性、阳性细胞的个数占当前切片全部细胞个数的比例来判断的。医生进行阳性状态判断时，通过显微镜放大切片的某一区域，粗略估计当前镜前各类细胞的个数，再挪动到下一个区域观察并估计，总共观察5个左右的区域，从而粗略判断整个切片的阳性状态。这种人工观察方式费时费力，在准确度也存在很大的主观性误差。因此，本发明设计基于染色分离的乳腺癌核染色细胞计数方法，能够快速有效地实现细胞计数，协助医生工作，降低医生工作量的同时保证计算准确度。
发明内容
本发明为了克服上述技术问题的缺点，提供了一种基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法。
本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，其特征在于，通过如下方法来实现：首先对获取的乳腺癌病理切片的RGB数字化图像进行染色分离，获取基于H染色剂的图像IH和基于DAB显色剂的图像IDAB；然后采用滤波方法将图像IH和IDAB中细胞间质的染色滤除，滤波后的图像分别记为IH，filterd和IDAB，filterd；根据图像IH，filterd中的B通道获取阴性细胞的位置和数量；然后，获取图像IDAB，filterd的亮度图VDAB，根据亮度图VDAB确定图像IDAB，filterd的强阳、中阳、弱阳细胞位置，再根据阳性细胞所处位置确定其所属强阳、中阳和弱阳细胞的类别和数量。
本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，通过以下步骤来实现：
a).病理图像获取，乳腺癌病理切片首先经H染色剂和DAB显色剂进行免疫组织化学处理，以使病理切片中的细胞核染色；然后采集乳腺癌病理切片的RGB数字化图像，记为图像I；b).图像的染色分离，依据H染色剂使阴性细胞核显色为蓝色、DAB显色剂使阳性细胞核显色为棕色的原理，采用染色分离方法，将图像I分离为基于H染色剂的图像和基于DAB显色剂的图像，分别记为图像IH和IDAB；c).图像的滤波处理，首先获取图像IH和IDAB的灰度图像，然后建立IH和IDAB灰度图像的直方图信息，得到不同灰度值的像素点数目，选择位于直方图右侧、灰度值对应的像素点个数明显提高的对应灰度值为滤波阈值，将灰度值高于滤波阈值的所有像素点对应的位置滤除，只保留灰度值低于滤波阈值的像素点对应的位置，最后得到IH和IDAB滤波后的图像，分别记为IH，filterd和IDAB，filterd；d).利用IH，filterd进行阴性细胞计数，以IH，filterd图像中的B通道为主、R和G通道为辅，形成包含阴性细胞所在位置的图像IH，filterd，B；然后根据形态学分割算法，在图像IH，filterd，B上标示出阴性细胞的位置，进而计算出阴性细胞个数，设为n1；e).获取IDAB，filterd的亮度图，将图像IDAB，filterd由RGB空间转换为HSV空间，然后提取出对应的亮度图VDAB；f).确定阳性细胞所在区域，首先建立亮度图VDAB的直方图，得到不同亮度值的统计个数，亮度信息的直方图为开口朝下的钟形，选择钟形左侧亮度值统计个数相对于前一亮度值统计个数增加最大的亮度值，作为区分强阳和中阳的阈值Th1；选择钟形右侧亮度值统计个数相对于前一亮度值统计个数减小最大的亮度值，作为区分中阳和弱阳的阈值Th2；亮度值低于Th1的图像区域为强阳细胞所在位置，亮度值高于Th2的区域为弱阳细胞所在位置，亮度值位于阈值Th1与Th2之间的区域为中阳细胞所在位置；并将强阳、中阳、弱阳细胞位置在图像IDAB，filterd上标示出来；g).采用与步骤d)中相同的形态学分割算法，在图像IDAB，filterd的将强阳、中阳、弱阳细胞位置上，统计出强阳、中阳和弱阳细胞的数量，设其分别为n2、n3和n4；h).细胞概率计算，根据上述步骤中所计算出的同一乳腺癌病理切片的阴性细胞个数n1、强阳细胞个数n2、中阳细胞个数n3和弱阳细胞个数n4，可计算出阴性、强阳、中阳、弱阳细胞的概率分别为n1/(n1+n2+n3+n4)、n2/(n1+n2+n3+n4)、n3/(n1+n2+n3+n4)、n4/(n1+n2+n3+n4)。
本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，步骤b)中所述的染色分离方法为：
b-1).首先，根据朗伯-比尔定律Lambert-Beer LAW，采用公式（1）将病理图像的RGB彩色值转换为光密度值；
OD= -log10(I) （1）
式中，I为病理图像的RGB三通道归一化到0至1区间内的值，OD为对应的光密度值；b-2).然后，对OD进行奇异值分解，得到两个最大的奇异值向量，并以这两个奇异值向量所指的方向建立平面坐标系；然后，将图像转换的OD值在所建的平面坐标系上做投影，得到对应于H分量和DAB分量的两个光密度场；b-3).最后，将H分量和DAB分量的两个光密度场转换回RGB空间，即可获得基于H染色剂的图像IH和基于DAB显色剂的图像IDAB。
本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，步骤c)中，选择灰度值大于200的区域作为直方图右侧，直方图右侧灰度值统计个数相对于前灰度值统计个数增加最大的灰度值为滤波阈值。
本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，步骤d)中，如果某一像素点的B≥180、 R<200 且 G≤200，则认为该像素点为阴性细胞所在位置。
本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，步骤d)中所述的形态学分割算法通过以下步骤来实现：
d-1).构造基于面积的直方图，首先将待处理的图像转化为二值图像，细胞所在区域的像素为白，然后根据二值图像中连通区的分布，构造基于白色连通区面积的直方图，确定单个细胞的区域面积阈值S，将二值图像中白色连通区面积大于2S的区域视作成团细胞，白色连通区面积小于S/2的区域舍去；d-2).若成团细胞的外轮廓的垂直长度大于水平长度，则判断该团细胞为竖直排列，则沿纵轴对该成团细胞进行分割；d-3).若成团细胞的外轮廓的水平长度大于垂直长度，则判断该团细胞为横向排列，则沿横轴对该成团细胞进行分割；d-4).图像分割完毕后，通过统计分割出的类圆形个体的数量，即可统计出细胞个数。
本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，步骤d-1)中单个细胞的区域面积阈值S的确定方法为：根据白色连通区面积的直方图，舍去直方图中面积较大和较小的连通区，只保留面积大小处于中间的连通区，对保留的连通区面积求平均值，该平均值作为单个细胞的区域面积阈值S。
本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，步骤g)中，对强阳、中阳和弱阳细胞数量的统计方法为：先统计强阳细胞个数，统计完成后，将中阳细胞所在区域中属于已统计的强阳细胞区域删除，再统计中阳细胞的个数；然后将弱阳细胞所在细胞中的中阳细胞区域删除，再统计弱阳细胞的个数。
本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，当对统计的阳性细胞的结果不满意时，可人为设定区分强阳、中阳和弱阳的阈值Th1与Th2，其设定方法为：首先人工在图像I中选取一个或一个以上的棕色区域，然后计算所选棕色区域对应的亮度信息，将所有棕色区域的亮度信息取均值后作为阈值Th1或Th2，重新对强阳、中阳和弱阳区域进行划分。
本发明的有益效果是：本发明的乳腺癌核染色细胞计数方法，首先对输入的核染色乳腺癌病理切片数字化图像进行染色分离，获得基于H染色剂的图像IH和基于DAB显色剂的图像IDAB，然后经图像滤波消除细胞间质被染色的影响，获得滤波后的图像IH，filterd和IDAB，filterd；根据图像IH，filterd统计出阴性细胞的位置和数量；根据图像IDAB得到其亮度图VDAB，根据亮度图VDAB确定图像IDAB，filterd的中强阳、中阳、弱阳细胞位置，进而确定强阳、中阳和弱阳细胞的类别和数量，本发明设计基于染色分离的乳腺癌核染色细胞计数方法，能够快速有效地实现细胞计数，协助医生工作，降低医生工作量的同时保证计算准确度。
附图说明
图1为本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法的流程示意图；
图2为本发明中所获取的乳腺癌病理切片的RGB数字化图像I；
图3为本发明中图像I经染色分离后的基于H染色剂的图像IH；
图4为本发明中图像I经染色分离后的基于DAB显色剂的图像IDAB；
图5为本发明中图像IH经滤波处理后形成的图像IH，filterd；
图6为本发明中图像IDAB经滤波处理后形成的图像IDAB，filterd；
图7为本发明中图像IH，filterd的二值图像（细胞所在区域的像素为白）；
图8为本发明中图像IH，filterd经形态学分割算法获取的阴性细胞分布图；
图9为本发明中阴性细胞在图像IH，filterd上的分布状态图；
图10为本发明中阳性细胞在图像IDAB，filterd上的分布状态图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
本发明针对的图像数据为核染色的乳腺癌数字化病理切片，包括ER、PR和Ki67三种阳性表达。其中，Ki67需要计算当前切片的阳性、阴性细胞个数及各自占总细胞个数的概率，ER/PR需要计算当前切片的强阳、中阳、弱阳以及阴性细胞个数，和各自占总细胞个数的概率。核染色的乳腺癌病理切片是通过免疫组织化学（IHC）的方式突出细胞核颜色的。免疫组织化学是利用化学反应使标记抗体的显色剂显色，采用的是H染色剂和DAB显色剂。针对乳腺癌病理切片，经过免疫组织化学后，细胞核会被染色，蓝色的细胞核为阴性细胞核，棕色的细胞核为阳性细胞核，其中棕色的细胞核有深有浅，根据其深浅程度，颜色最深的为强阳细胞核，最浅的为弱阳细胞核，两者之间的为中阳细胞核。
如图1所述，给出了本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法的流程示意图，本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，通过以下步骤来实现：
a).病理图像获取，乳腺癌病理切片首先经H染色剂和DAB显色剂进行免疫组织化学处理，以使病理切片中的细胞核染色；然后采集乳腺癌病理切片的RGB数字化图像，记为图像I；
如图2所述，给出了本发明中所获取的乳腺癌病理切片的RGB数字化图像I，由于提交的附图不能含有色彩，使得图2中的蓝色像素点区域和棕色像素点区域表现不出来，实际上图2中含有交织在一起的蓝色区域和棕色区域。
b).图像的染色分离，依据H染色剂使阴性细胞核显色为蓝色、DAB显色剂使阳性细胞核显色为棕色的原理，采用染色分离方法，将图像I分离为基于H染色剂的图像和基于DAB显色剂的图像，分别记为图像IH和IDAB；
该步骤中，所述的染色分离方法可通过以下步骤来实现：
b-1).首先，根据朗伯-比尔定律Lambert-Beer LAW，采用公式（1）将病理图像的RGB彩色值转换为光密度值；
OD= -log10(I) （1）
式中，I为病理图像的RGB三通道归一化到0至1区间内的值，OD为对应的光密度值；
b-2).然后，对OD进行奇异值分解，得到两个最大的奇异值向量，并以这两个奇异值向量所指的方向建立平面坐标系；然后，将图像转换的OD值在所建的平面坐标系上做投影，得到对应于H分量和DAB分量的两个光密度场；
b-3).最后，将H分量和DAB分量的两个光密度场转换回RGB空间，即可获得基于H染色剂的图像IH和基于DAB显色剂的图像IDAB。
如图3所示，给出了本发明中图像I经染色分离后的基于H染色剂的图像IH，图4给出了本发明中图像I经染色分离后的基于DAB显色剂的图像IDAB。
c).图像的滤波处理，首先获取图像IH和IDAB的灰度图像，然后建立IH和IDAB灰度图像的直方图信息，得到不同灰度值的像素点数目，选择位于直方图右侧、灰度值对应的像素点个数明显提高的对应灰度值为滤波阈值，将灰度值高于滤波阈值的所有像素点对应的位置滤除，只保留灰度值低于滤波阈值的像素点对应的位置，最后得到IH和IDAB滤波后的图像，分别记为IH，filterd和IDAB，filterd；
由于细胞与细胞之间存在细胞间质，染色剂会在一定程度上将细胞间质染上蓝色，显色剂会使细胞间质染上棕色，为降低细胞间质对细胞计数结果引入的误差，本发明采用滤波算法将细胞间质滤除。由于细胞间质的颜色淡，并且其所占面积通常远远高于细胞所占面积。根据此特性，首先建立IH和IDAB灰度图像的直方图，选择位于直方图右侧、灰度值对应的像素点个数明显提高的对应灰度值为滤波阈值，将被染色的细胞间质像素点滤除。
可选择灰度值大于200的区域作为直方图右侧，直方图右侧灰度值统计个数相对于前灰度值统计个数增加最大的灰度值为滤波阈值。如图5所示，给出了本发明中图像IH经滤波处理后形成的图像IH，filterd，图6给出了本发明中图像IDAB经滤波处理后形成的图像IDAB，filterd，可见经滤波处理后，被染色的细胞间质像素点被去除。
d).利用IH，filterd进行阴性细胞计数，以IH，filterd图像中的B通道为主、R和G通道为辅，形成包含阴性细胞所在位置的图像IH，filterd，B；然后根据形态学分割算法，在图像IH，filterd，B上标示出阴性细胞的位置，进而计算出阴性细胞个数，设为n1；
针对阴性细胞计数模块，只需计出蓝色细胞个数。因蓝色在RGB三通道中以B通道为主，R和G通道为辅，B的值越大，代表蓝色的程度越深。只需根据图像中每个像素点的RGB值，即可挑选出蓝色区域所在位置。可采用：如果某一像素点的B≥180、 R<200 且 G≤200，则认为该像素点为阴性细胞所在位置。
一般情况下，细胞的分布并不是相互独立的，可能会成团存在，会产生重叠现象。采用如下的形态学分割算法通过以下步骤来实现：
d-1).构造基于面积的直方图，首先将待处理的图像转化为二值图像，细胞所在区域的像素为白，然后根据二值图像中连通区的分布，构造基于白色连通区面积的直方图，确定单个细胞的区域面积阈值S，将二值图像中白色连通区面积大于2S的区域视作成团细胞，白色连通区面积小于S/2的区域舍去；
如图7所示，给出了本发明中图像IH，filterd的二值图像，细胞所在区域的像素为白色部分，白色的连通区多数为单个细胞区域，少数的为团细胞去取或者不是细胞的但染色了的细小的点。该步骤中，单个细胞的区域面积阈值S的确定方法为：根据白色连通区面积的直方图，舍去直方图中面积较大和较小的连通区，只保留面积大小处于中间的连通区，对保留的连通区面积求平均值，该平均值作为单个细胞的区域面积阈值S。
d-2).若成团细胞的外轮廓的垂直长度大于水平长度，则判断该团细胞为竖直排列，则沿纵轴对该成团细胞进行分割；
d-3).若成团细胞的外轮廓的水平长度大于垂直长度，则判断该团细胞为横向排列，则沿横轴对该成团细胞进行分割；
d-4).图像分割完毕后，通过统计分割出的类圆形个体的数量，即可统计出细胞个数。
这种方式能够较为准确的标定细胞团中每个细胞的位置，并且计算复杂度小，运行速度快。分割后的图像中均是独立的类圆形个体，通过图像连通区域，可以快速的统计出当前图像中的类圆形个体数目。但因染色过程中，可能会存在污点，或存在不是细胞的但染色了的细小的点，对统计精度产生影响。本发明通过统计各个连通区的面积，将明显低于单个细胞的区域面积阈值的连通区滤除，改善统计精度。
如图8所示，给出了本发明中图像IH，filterd经形态学分割算法获取的阴性细胞分布图，可见，分割后的图像中均是独立的类圆形个体。
e).获取IDAB，filterd的亮度图，将图像IDAB，filterd由RGB空间转换为HSV空间，然后提取出对应的亮度图VDAB；
滤波后的IH, filtered图像即可用于阴性细胞个数的统计，而阳性细胞个数的统计还需要对图像IDAB, filtered做进一步的颜色空间转换处理。针对阳性细胞，因其需统计强阳、中阳、弱阳细胞各自的个数，因此还需对强阳、中阳、弱阳的描述方式进行量化。本发明先将图像IDAB, filtered由RGB空间转换为HSV空间，并提取对应的亮度图VDAB，作为阳性细胞个数统计的依据，用于统计各个阳性级别的细胞个数。
f).确定阳性细胞所在区域，首先建立亮度图VDAB的直方图，得到不同亮度值的统计个数，亮度信息的直方图为开口朝下的钟形，选择钟形左侧亮度值统计个数相对于前一亮度值统计个数增加最大的亮度值，作为区分强阳和中阳的阈值Th1；选择钟形右侧亮度值统计个数相对于前一亮度值统计个数减小最大的亮度值，作为区分中阳和弱阳的阈值Th2；
亮度值低于Th1的图像区域为强阳细胞所在位置，亮度值高于Th2的区域为弱阳细胞所在位置，亮度值位于阈值Th1与Th2之间的区域为中阳细胞所在位置；并将强阳、中阳、弱阳细胞位置在图像IDAB，filterd上标示出来；
g).采用与步骤d)中相同的形态学分割算法，在图像IDAB，filterd的将强阳、中阳、弱阳细胞位置上，统计出强阳、中阳和弱阳细胞的数量，设其分别为n2、n3和n4；
该步骤中，确定各个级别的细胞所在位置之后，采用与阴性细胞计数模块相同的形态学分割算法和小目标区域滤除方法来统计细胞个数。因棕色细胞的中心位置的颜色一般比边缘位置的颜色要深，为防止出现空圈存在，本发明在进行每个级别的细胞统计之前，先将上一级别细胞个数统计在内的区域去除。对强阳、中阳和弱阳细胞数量的统计方法为：先统计强阳细胞个数，统计完成后，将中阳细胞所在区域中属于已统计的强阳细胞区域删除，再统计中阳细胞的个数；然后将弱阳细胞所在细胞中的中阳细胞区域删除，再统计弱阳细胞的个数。
h).细胞概率计算，根据上述步骤中所计算出的同一乳腺癌病理切片的阴性细胞个数n1、强阳细胞个数n2、中阳细胞个数n3和弱阳细胞个数n4，可计算出阴性、强阳、中阳、弱阳细胞的概率分别为n1/(n1+n2+n3+n4)、n2/(n1+n2+n3+n4)、n3/(n1+n2+n3+n4)、n4/(n1+n2+n3+n4)。
如图9所示，给出了本发明中阴性细胞在图像IH，filterd上的分布状态图，图10给出了本发明中阳性细胞在图像IDAB，filterd上的分布状态图，可见，本发明的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，可准确地统计出阴性细胞、阳性（强阳、中阳和弱阳）细胞的数量，并将其在图像IH，filterd和IDAB，filterd上标注出来，以便医生进行形象直观的观察。
当对阳性细胞的统计结果不满意时，即是阳性细胞的阈值设定不符合判别准则，需改变统计结果，可通过鼠标左键单击取色器，将鼠标指针移动到图像I中认为的棕色颜色细胞处，按下并拖动鼠标左键，完成一个区域的取色。若需对多个区域取色，可在完成一个区域取色后移动到另一个区域继续取色，最后通过点击鼠标右键完成取色。然后根据选择的多个区域的棕色对应的亮度信息，取均值作为新的阈值Th1或Th2，并依据新的阈值重新计算统计结果并展示，直至满意为止。

Claims (7)

1.一种基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，其特征在于，通过如下方法来实现：首先对获取的乳腺癌病理切片的RGB数字化图像进行染色分离，获取基于H染色剂的图像IH和基于DAB显色剂的图像IDAB；然后采用滤波方法将图像IH和IDAB中细胞间质的染色滤除，滤波后的图像分别记为IH，filterd和IDAB，filterd；根据图像IH，filterd中的B通道获取阴性细胞的位置和数量；然后，获取图像IDAB，filterd的亮度图VDAB，根据亮度图VDAB确定图像IDAB，filterd的强阳、中阳、弱阳细胞位置，再根据阳性细胞所处位置确定其所属强阳、中阳和弱阳细胞的类别和数量；
具体通过以下步骤来实现：
a).病理图像获取，乳腺癌病理切片首先经H染色剂和DAB显色剂进行免疫组织化学处理，以使病理切片中的细胞核染色；然后采集乳腺癌病理切片的RGB数字化图像，记为图像I；
b).图像的染色分离，依据H染色剂使阴性细胞核显色为蓝色、DAB显色剂使阳性细胞核显色为棕色的原理，采用染色分离方法，将图像I分离为基于H染色剂的图像和基于DAB显色剂的图像，分别记为图像IH和IDAB；
c).图像的滤波处理，首先获取图像IH和IDAB的灰度图像，然后建立IH和IDAB灰度图像的直方图信息，得到不同灰度值的像素点数目，选择位于直方图右侧、灰度值对应的像素点个数明显提高的对应灰度值为滤波阈值，将灰度值高于滤波阈值的所有像素点对应的位置滤除，只保留灰度值低于滤波阈值的像素点对应的位置，最后得到IH和IDAB滤波后的图像，分别记为IH，filterd和IDAB，filterd；
d).利用IH，filterd进行阴性细胞计数，以IH，filterd图像中的B通道为主、R和G通道为辅，形成包含阴性细胞所在位置的图像IH，filterd，B；然后根据形态学分割算法，在图像IH，filterd，B上标示出阴性细胞的位置，进而计算出阴性细胞个数，设为n1；
e).获取IDAB，filterd的亮度图，将图像IDAB，filterd由RGB空间转换为HSV空间，然后提取出对应的亮度图VDAB；
f).确定阳性细胞所在区域，首先建立亮度图VDAB的直方图，得到不同亮度值的统计个数，亮度信息的直方图为开口朝下的钟形，选择钟形左侧亮度值统计个数相对于前一亮度值统计个数增加最大的亮度值，作为区分强阳和中阳的阈值Th1；选择钟形右侧亮度值统计个数相对于前一亮度值统计个数减小最大的亮度值，作为区分中阳和弱阳的阈值Th2；
亮度值低于Th1的图像区域为强阳细胞所在位置，亮度值高于Th2的区域为弱阳细胞所在位置，亮度值位于阈值Th1与Th2之间的区域为中阳细胞所在位置；并将强阳、中阳、弱阳细胞位置在图像IDAB，filterd上标示出来；
g).采用与步骤d)中相同的形态学分割算法，在图像IDAB，filterd的将强阳、中阳、弱阳细胞位置上，统计出强阳、中阳和弱阳细胞的数量，设其分别为n2、n3和n4；
h).细胞概率计算，根据上述步骤中所计算出的同一乳腺癌病理切片的阴性细胞个数n1、强阳细胞个数n2、中阳细胞个数n3和弱阳细胞个数n4，可计算出阴性、强阳、中阳、弱阳细胞的概率分别为n1/(n1+n2+n3+n4)、n2/(n1+n2+n3+n4)、n3/(n1+n2+n3+n4)、n4/(n1+n2+n3+n4)。
2.根据权利要求1所述的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，其特征在于，步骤b)中所述的染色分离方法为：
b-1).首先，根据朗伯-比尔定律Lambert-Beer LAW，采用公式（1）将病理图像的RGB彩色值转换为光密度值；
OD= -log10(I) （1）
式中，I为病理图像的RGB三通道归一化到0至1区间内的值，OD为对应的光密度值；
b-2).然后，对OD进行奇异值分解，得到两个最大的奇异值向量，并以这两个奇异值向量所指的方向建立平面坐标系；然后，将图像转换的OD值在所建的平面坐标系上做投影，得到对应于H分量和DAB分量的两个光密度场；
b-3).最后，将H分量和DAB分量的两个光密度场转换回RGB空间，即可获得基于H染色剂的图像IH和基于DAB显色剂的图像IDAB。
3.根据权利要求1所述的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，其特征在于，步骤c)中，选择灰度值大于200的区域作为直方图右侧，直方图右侧灰度值统计个数相对于前灰度值统计个数增加最大的灰度值为滤波阈值。
4.根据权利要求1所述的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，其特征在于，步骤d)中，如果某一像素点的B≥180、 R<200 且 G≤200，则认为该像素点为阴性细胞所在位置。
5.根据权利要求1所述的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，其特征在于，步骤d)中所述的形态学分割算法通过以下步骤来实现：
d-1).构造基于面积的直方图，首先将待处理的图像转化为二值图像，细胞所在区域的像素为白，然后根据二值图像中连通区的分布，构造基于白色连通区面积的直方图，确定单个细胞的区域面积阈值S，将二值图像中白色连通区面积大于2S的区域视作成团细胞，白色连通区面积小于S/2的区域舍去；
d-2).若成团细胞的外轮廓的垂直长度大于水平长度，则判断该团细胞为竖直排列，则沿纵轴对该成团细胞进行分割；
d-3).若成团细胞的外轮廓的水平长度大于垂直长度，则判断该团细胞为横向排列，则沿横轴对该成团细胞进行分割；
d-4).图像分割完毕后，通过统计分割出的类圆形个体的数量，即可统计出细胞个数。
6.根据权利要求1所述的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，其特征在于，步骤g)中，对强阳、中阳和弱阳细胞数量的统计方法为：先统计强阳细胞个数，统计完成后，将中阳细胞所在区域中属于已统计的强阳细胞区域删除，再统计中阳细胞的个数；然后将弱阳细胞所在细胞中的中阳细胞区域删除，再统计弱阳细胞的个数。
7.根据权利要求1所述的基于染色分离的乳腺癌Ki67/ER/PR核染色细胞计数方法，其特征在于，当对统计的阳性细胞的结果不满意时，可人为设定区分强阳、中阳和弱阳的阈值Th1与Th2，其设定方法为：首先人工在图像I中选取一个或一个以上的棕色区域，然后计算所选棕色区域对应的亮度信息，将所有棕色区域的亮度信息取均值后作为阈值Th1或Th2，重新对强阳、中阳和弱阳区域进行划分。
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