CN112911105B - 一种数字pcr结果读取装置及读取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸分析领域,本发明设计的数字PCR芯片,尤其是通过微透镜阵列与光电转换器件直接贴合,避免使用复杂的光路系统,体积小,便携,适合现场检测。同时将微透镜阵列与电感耦合成像技术或互补金属氧化物半导体成像器件相结合,通过面成像方式,对核酸扩增过程结束后的油包水微滴进行快速成像,可以大幅降低检测时间。本发明亦可用于微流控芯片、微阵列芯片的成像、分析。
Description
技术领域
本发明涉及核酸分析领域,利用微透镜阵列与成像器件相结合实现数字PCR结果快速读取,本发明亦可用于微流控芯片、微阵列芯片的成像、分析领域。
背景技术
随着疫情在全球的蔓延,如何快速、便捷的进行核酸检测,如何准确、高效的识别检测结果一直是各国科学家所极其关注的领域。现有技术中,CN 103674934 B公开了题为“用于化学发光检测的微流控芯片成像仪器和系统”的现有技术,其可以对微流控芯片上的化学发光信号进行有效收集和分析。又例如CN102928969A公开了一种微透镜增强型滑块式共聚焦光学扫描仪,该扫描仪同时驱动微透镜阵列和排列了多个透光针孔的不透光滑块以设定的恒定速度往复滑动来扫描样品。再例如CN105319197A公开了一种基于微透镜阵列的液滴微流控芯片,该发明通过优化设计检测区域的液滴流动管路来提高并行检测通道数量。在成像方式上,上述几项专利主要针对观测面积较大的芯片或微孔板,观察面积约为几平方厘米到几十平方厘米,因此均使用传统的以透镜组为主的光路系统。而传统的透镜组光路方式的物距一般较长,占据空间较大,待测芯片或微孔板上的光信号只有很少一部分能够进入透镜组,因此限制了成像灵敏度,光的捕获效率较低。
现有数字PCR产品中,在信号读取过程中,大多采用油包水微滴结构,直径约为150微米,读取装置一般采用光电倍增管进行信号读取。检测时,一般将微滴推入毛细管或微流控通道中,流动过程中,通过PMT进行逐点检测,PMT的灵敏度较高,但是检测时间较长,以微孔板载体为例,一般在2个小时以上。
因此,需要一种成像灵敏度高且体积较小、易于携带且能快速读取数据的装置。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供的一种数字PCR结果读取装置。
本发明包括数字PCR芯片、光源、微透镜阵列、CCD或CMOS相机,进一步包括成像软件。其中,所微透镜阵列用于读取时将激发的荧光聚焦在CCD或者CMOS相机的靶面上。
本发明中的数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术,相对于传统的实时定量PCR,数字PCR能够直接数出DNA分子的拷贝数,可以实现对起始样品的绝对定量。本发明将数字PCR芯片设计为平面结构,数字PCR芯片上检测区域面积与电感耦合器件CCD或互补金属氧化物半导体成像器件CMOS相机的靶面面积相同或相近。数字PCR芯片分为上下两层。芯片上层起到盖片的作用,材质、厚度和颜色无要求,形状为平板。芯片下层材质为透明的塑料、橡胶、玻璃或者石英,包含但不限于环烯烃类共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃或石英等。芯片下层厚度约为0.1-3.5mm,包括有样本池。芯片下层可以采用具有滤光功能的材质或镀膜,这样可以不需使用滤光片,进一步缩短光程,提高检测灵敏度。样本池的高度大于数字PCR油包水微滴结构的直径,小于数字PCR油包水微滴结构的2倍直径。样本池底面可以根据需要,或者CCD或CMOS相机的靶面的形状进行设计。
因此,本发明提供一种数字PCR结果读取装置,包括数字PCR芯片和整体成像系统,其特征在于:所述整体成像系统包括微透镜阵列,CCD或CMOS相机,包括或者不包括光源,其中:所述数字PCR芯片包括芯片上层,芯片下层和样本池,所述样本池设置在所述芯片上层与所述芯片下层之间,通过所述样本池以及芯片上层、芯片下层配合实现待测样本的承载;所述芯片上层由透明或非透明的平板材料制成,所述芯片下层由透明材料制成;所述样本池的高度大于数字PCR油包水微滴结构直径,同时小于所述数字PCR油包水微滴结构直径的2倍;所微透镜阵列用于读取时激发的荧光聚焦在CCD或者CMOS相机的靶面上。
在优选地具体实施方式中,所述微透镜阵列的一面与所述数字PCR芯片紧密贴合,另一面与所述电感耦合器件CCD或互补金属氧化物半导体成像器件CMOS相机紧密贴合。
本发明提供了利用所述的数字PCR结果读取装置对数字PCR结果进行读取的方法,包括如下步骤:
第一步,将数字PCR扩增结束后的油包水微滴溶液滴入数字PCR芯片的样本池内,盖上芯片上层,将油包水微滴铺展在样本池;
第二步,将所述数字PCR芯片放置在微透镜阵列上,全使得所述微透镜阵列的一面与所述数字PCR芯片紧密贴合,另一面与所述电感耦合器件CCD或互补金属氧化物半导体成像器件CMOS相机紧密贴合。在明场或打开光源,激发油包水微滴发射出荧光,微透镜阵列将荧光聚焦在CCD或者CMOS相机的靶面上,可以形成有规律的光斑或者经过校正后成像。;
第三步,CCD或CMOS相机靶面接受光信号转化为电信号,进而转化为灰度值进行分处理,优选地将转化的灰度值传递给计算机,进行分析处理并呈现结果。
本发明避免使用传统的光学透镜组,最大程度上缩短了成像物距,一方面进一步减小体积,另一方面增加了对芯片上光学信号的捕获率,降低了对CCD或CMOS的要求。一般来说,为了提高灵敏度,数字PCR需要使用制冷CCD或CMOS,而本发明中,可以采用非制冷CCD或者CMOS进行成像,从而降低了成本。可以实现快速、高灵敏度的成像,同时便于携带和使用。该设计也可以用于微流控芯片的成像分析。
附图说明
图1为本发明一种数字PCR结果读取装置中的芯片设计示意图;
图2为本发明一种数字PCR结果读取装置中的成像系统示意图;
图3为本发明一种数字PCR结果读取装置中的成像系统局部图;
图4为本发明方法与伯乐QX200实验结果对比图。
其中,各附图标记的含义如下:1、芯片上层,2、芯片下层,3、样本池,4、数字PCR芯片,5、微透镜阵列,6、CCD相机的靶面,7、CCD相机,8、激发光源。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明包括数字PCR芯片4、光源8、微透镜阵列5、CCD或CMOS相机7及成像软件。具体的结构如下:
如图1所示,数字PCR芯片4由芯片上层1,芯片下层2和样本池3组成。芯片上层1起到盖片的作用,材质为玻璃、厚度为0.5 mm,形状为平板。芯片下层2材质为经过磁控溅射镀膜的玻璃,具有滤光功能,厚度为0.5 mm,形状为平板,芯片下层2上设有样本池3。样本池3高度为150μm,长度为8mm,宽度为6mm。
如图2所示,整体成像系统由数字PCR芯片4,微透镜阵列5,CCD相机7,激发光源8组成。微透镜阵列5微透镜单元直径为30μm,可将数字PCR芯片4内样本池3中的光聚焦在CCD或CMOS相机(7)的靶面6上。CCD相机7使用SONY ICX825芯片,像素尺寸为6.45μm。
微透镜阵列5是由通光孔径及浮雕深度为微米级的透镜组成的阵列,可以实现聚焦、成像,具有尺寸小、集成度高的特点,能够完成传统光学元件无法完成的功能,并能构成许多新型的光学系统。本发明使用微透镜阵列5时,微透镜阵列5的一面与数字PCR芯片4紧密贴合,另一面与CCD或CMOS相机7(具体是其靶面6)紧密贴合,这样就可以将数字PCR芯片4上样本池3中油包水微滴的光信号直接聚焦在CCD或CMOS相机7的靶面6上,进行成像或者形成有规律的光斑,实现数字PCR结果的快速读取。
在荧光检测中,数字PCR芯片4的芯片下层2如无滤光功能或镀膜,则应在数字PCR芯片4与微透镜阵列5中间加入滤光片。这种情况下,数字PCR芯片4、滤光片、微透镜阵列5与CCD或CMOS相机7(具体是其靶面6)依次紧密贴合。如果对聚焦要求不高,也可以使用光纤面板代替微透镜阵列5。数字PCR芯片4的芯片下层2可以采用具有滤光功能的材质或镀膜,光源8可以采用激光或者发光二极管。在明场检测中,可以不使用光源和滤光片。
CCD或CMOS为光电转换器件,将光信号转化为电信号,进而编码后转化为数字信号。成像软件对数字信号进行分析,结果呈现在计算机上。
结合一个具体的实验样例,解释说明该装置的使用方法,具体包括如下步骤:
第一步,进行数字PCR实验,使用人乳腺癌细胞HCC1954细胞样品,提取DNA后使用伯乐液滴生成装置合成微滴悬浊液后,放入PCR仪中进行扩增,扩增目的基因片段NM001289936.17/31,利用公知的引物序列如下:正向引物为:5’-CCAGTAGAATGGCCAGGACAA-3’,反向引物为:5’-TGGCTGCCAGGGTCTGA-3’。扩增结束后,将PCR过程后的油包水微滴溶液滴入数字PCR芯片4的样本池3内,盖上芯片上层1,将油包水微滴铺展在样本池3,由于样本池3的高度大于数字PCR油包水微滴结构的直径,小于数字PCR油包水微滴结构的2倍直径,所以,竖直方向上有且仅有一层油包水微滴。
(2)将数字PCR芯片4放置在微透镜阵列5上,打开发光二极管作为光源8,激发油包水微滴发射出荧光。由于芯片下层2材质为经过磁控溅射镀膜的玻璃,起到滤光片的作用,微透镜阵列5将荧光聚焦,照射在CCD相机7的靶面6上,形成有规律的光斑。
(3)CCD相机7的靶面6接受光信号转化为电信号,进而转化为灰度值,传递给计算机,计算机利用灰度值作图进行分析处理,并呈现结果,请参考图3。
对图片中的灰度点进行即时分析计数,经过处理后得到样本拷贝数。对照试验使用伯乐数字PCR读取仪进行分析,具体操作:配制PCR反应体系,将样品与油相液体混合,生成微滴,密封后进行PCR反应,反应结束后轻轻地平稳放入微滴读取仪,打开软件读取分析信号。因为该仪器使用光电倍增管对微滴溶液进行点扫描,所以读取时间较长,每一样本读取时间约为90秒, 96孔板中的样本读取总时间约为144分钟。而采用本专利方法,每一样本读取时间约为100毫秒, 96例样本读取总时间仅为9.6秒,大大优于传统方法。两组结果相近,两者结果对比如图4所示,线相关系数R>0.95,通过比对,证实该发明读取结果可靠。
本发明将数字PCR芯片通过微透镜阵列与光电转换器件直接贴合,能够避免使用复杂的光路系统,体积小,便携,适合现场检测。同时将微透镜阵列与电感耦合成像技术(CCD)或互补金属氧化物半导体成像器件(CMOS)相结合,通过面成像方式,对核酸扩增过程结束后的油包水微滴进行快速成像,可以大幅降低检测时间。
Claims (10)
1.一种数字PCR结果读取装置,包括数字PCR芯片(4)和整体成像系统,其特征在于:所述整体成像系统包括微透镜阵列(5),CCD或互补金属氧化物半导体成像器件CMOS相机(7),包括或者不包括光源(8),其中:所述数字PCR芯片(4)包括芯片上层(1),芯片下层(2)和样本池(3),所述样本池(3)设置在所述芯片上层(1)与所述芯片下层(2)之间,通过所述样本池(3)以及芯片上层(1)、芯片下层(2)配合实现待测样本的承载;所述芯片上层(1)由透明或非透明的平板材料制成,所述芯片下层(2)由透明材料制成;所述样本池(3)的高度大于数字PCR油包水微滴结构直径,同时小于所述数字PCR油包水微滴结构直径;所述微透镜阵列(5)的一面与数字PCR芯片(4)紧密贴合,另一面与CCD或互补金属氧化物半导体成像器件CMOS相机(7)紧密贴合,且所述微透镜阵列(5)用于读取时将激发的荧光聚焦在CCD或者互补金属氧化物半导体成像器件CMOS相机(7)的靶面(6)上。
2.根据权利要求1所述的数字PCR结果读取装置,其特征在于:所述芯片下层(2)材质为滤光或者镀膜透明材料;或者磁控溅射镀膜的玻璃。
3.根据权利要求1所述的数字PCR结果读取装置,其特征在于:在所述数字PCR芯片(4)与所述微透镜阵列(5)之间还加入滤光片。
4.根据权利要求1所述的数字PCR结果读取装置,其特征在于:所述光源(8)为激光或者发光二级管。
5.根据权利要求1所述的数字PCR结果读取装置,其特征在于:所述芯片上层(1)的厚度为0.1-5.0mm,所述芯片下层的厚度为0.1-3.5mm,所述样本池的高度为0.1-0.5mm。
6.根据权利要求1所述的数字PCR结果读取装置,其特征在于:所述芯片下层(2)与所述样本池(3)一体成型。
7.根据权利要求1所述的数字PCR结果读取装置,其特征在于:所述数字PCR芯片(4)为平面结构,所述数字PCR芯片(4)上检测区域面积与电感耦合器件CCD或互补金属氧化物半导体成像器件CMOS相机(7)的靶面(6)面积相匹配。
8.根据权利要求7所述的数字PCR结果读取装置,其特征在于:还包括成像软件,所述电感耦合器件CCD或互补金属氧化物半导体成像器件CMOS相机为光电转化器件,转化后的数字信号通过所述成像软件显示在计算机上。
9.利用如权利要求1至8任一项所述的数字PCR结果读取装置对数字PCR结果进行读取的方法,其特征在于,包括如下步骤:
第一步,将数字PCR扩增结束后的油包水微滴溶液滴入数字PCR芯片(4)的样本池(3)内,盖上芯片上层(1),将油包水微滴铺展在样本池(3);
第二步,将所述数字PCR芯片(4)放置在微透镜阵列(5)上,在明场或打开光源,激发油包水微滴发射出荧光,微透镜阵列(5)将荧光,聚焦在CCD或者互补金属氧化物半导体成像器件CMOS相机(7)的靶面(6)上,以形成有规律的光斑或者经过校正后成像;
第三步,CCD或者互补金属氧化物半导体成像器件CMOS相机(7)的靶面(6)接受光信号转化为电信号,进而转化为灰度值,进行分析处理并呈现结果。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述第三步中,是将转化的灰度值传递给计算机,进行分析处理并呈现结果。
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GR01 | Patent grant | ||
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