CN104541167B - 用于定量肿瘤组织中的免疫细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
用于评估肿瘤组织中免疫细胞的数量或密度的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：a.提供通过使用特异性结合由免疫细胞表达的抗原(标志物)的抗体的自动化载片染色系统获得的一片或多片免疫染色的组织切片，b.通过高分辨率扫描捕获进行到步骤a.的载片的数字化，由此获得待分析载片的高清晰度(4.6μm/像素或更好)数字图像，c.检测数字图像上该片组织切片d.分析该片组织切片，用于定义(i)肿瘤(CT)和(ii)肿瘤的侵入性边缘(IM)，e.提供尺寸参考网格，其中均匀分布单元具有相同表面，所述网格适于待分析肿瘤的尺寸，e1.检查免疫染色的质量，f.检测和定量每个单元的染色细胞，由此评估每个单元染色的免疫细胞的数量或密度。
Description
发明领域
本发明涉及用于定量肿瘤组织中的免疫细胞的方法及其应用。
背景技术
EP-A-EP1943520和WO2007045996描述了用于预后患者的癌症的进展和/或存活，和/或预测对治疗(化疗、放疗、生物治疗、免疫治疗)的响应的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)在来自所述患者的肿瘤组织样品中定量至少一种指示所述患者的局部适应性免疫反应的状态的生物标志物；和
b)比较步骤a)获得的所述至少一种生物标志物的值与相同生物标志物的预定参考值；所述预定参考值与所述患者的所述癌症的进展或存活的特定预后或治疗响应(诸如化疗、放疗、生物治疗、免疫治疗)的预测相关联以预期“良好响应者”vs“差响应者”。
肿瘤组织样品可以选自(i)总体原发肿瘤(作为整体)，(ii)来自肿瘤的组织样品，(iii)来自直接包围肿瘤的组织的组织样品，所述组织选可以更具体地称为肿瘤的“侵入性边缘”，(iv)与肿瘤密切接近的淋巴岛，(v)位于肿瘤最接近处的淋巴结，(vi)手术之前进行的肿瘤活检，和(vii)远处转移。
优选在步骤a)中在从肿瘤的两个区域(分别为(i)肿瘤(CT)和(ii)肿瘤的侵入性边缘(IM))收集的肿瘤样品中定量生物标志物。
在组织微阵列(TMA)上实施上述方法。然而，所述方法的大多数步骤手动执行，且可能观察到测量的可重复性的问题。例如，基于苏木精-伊红复染检查，可以发生病理学家之间选择肿瘤区域以打孔的差异。另外，观察到准确地打孔病理学家观察到的区域的困难。此类典型错误可以发生在每一个步骤。尽管这些文献中描述的方法使得可能获得用于预测癌症患者的存活的高性能，但研究仍继续至具有甚至更好品质的方法，特别是关于自动化再现性和结果的可比性。
如Halama等人在Quantification of prognostic immune cell markers incolorectal cancer using whole slide imagining tumour maps,analytical andquantitative cytology and histology,Vol.32,6,Dec 2010,pp.333-340中所强调，使用组织微阵列(TMA)采样组织学探针在目标分子的空间异质性(如癌组织中经常观察到)的情况下是特别成问题的。Halama等人提出全组织切片显微镜用于数据采集。然而，该研究没有证明产生能够解释肿瘤的空间异质性的参数的特定诊断方法。他的结论是，直到生成该诊断方法并进行后续研究，他不知道肿瘤图谱是否将在单个患者中具有预后价值。
发明简述
现在，本申请人已经发现用于评估肿瘤组织中免疫细胞的数量或密度、用于获得患有癌症的患者的免疫评分(或免疫评分)的方法。
已经以令人惊讶和意料之外的方式注意到，用于评估肿瘤组织中免疫细胞的数量或密度的新方法的使用确保了WO2007045996中描述方法的自动化、可重复性和再现性，并且因此提供了用于预测癌症患者的存活率和治疗响应的实验室间测试的标准测试方法。
当与EP-A-EP1943520和WO2007045996的方法相比时，新方法具有特别较少的可重复性和再现性的问题。
优选实施方案的描述
因此，本申请的主题是用于评估肿瘤组织中免疫细胞的数量或密度的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：
a.提供通过使用特异性结合由免疫细胞表达的抗原的抗体的自动化载片染色系统获得的一片或多片免疫染色的组织切片。
b.通过高分辨率扫描捕获进行到步骤a.的载片的数字化，由此获得待分析载片的高清晰度(4.6μm/像素或更好)数字图像，
c.检测数字图像上该片组织切片
d.分析组织切片，用于定义(i)肿瘤(CT)和(ii)肿瘤的侵入性边缘(IM)，
e.提供尺寸参考网格，其中均匀分布单元具有相同表面，所述网格适于待分析肿瘤的尺寸，
f.检测和定量每个单元的染色细胞，由此评估每个单元染色的免疫细胞的数量或密度。
通常，抗体对于由免疫细胞表达的蛋白是特异性的，更具体地对于免疫细胞表面标志物是特异性的。例如，抗体可对于如WO2007045996中描述的标志物是特异性的，考虑的免疫细胞可以是B细胞和优选是T细胞。例如，本发明的T细胞是亚群CD3+细胞(T细胞)、CD8+细胞或GZMB+细胞(细胞毒性T细胞)、CD4+细胞(T辅助细胞)、CD45RO+细胞(记忆性T细胞)的T细胞。在一个具体实施方案中，抗体对于CD3、CD4、CD8、CD20、CD45RO、和GZMB标志物是特异性的。
当使用两种或更多种标志物时，优选对于每种标志物单独实施上述步骤。例如，抗CD3抗体用于一个组织切片，且抗CD8抗体用于另一个组织切片，优选邻近的组织切片。当不同地染色用于检测不同标志物的抗体时，可替代地进行多重(例如双重)检测。因此，每种标记物可用一种可检测信号。
免疫组织化学或IHC是指通过使用抗体特异性结合生物组织中的抗原的原理检测组织切片的细胞中的抗原(通常是蛋白)的常规方法。免疫组织化学染色允许可视化抗体-抗原相互作用。它可以以多种方式来实现。在最常见的实例中，将抗体缀合至酶，诸如过氧化物酶，其可催化产生颜色的反应。或者，抗体也可以标记至荧光团，诸如荧光素或若丹明。
本发明中使用的抗体通常是可商购的。具体而言，当选择CD3标志物用于实施本发明的方法时，商购自Roche Ventana(Tucson,AZ,USA)的2GV6抗体可以是合适的(Chetty R,等人,J Pathol.173(4):303-307,1994)。具体而言，当选择CD8标志物用于实施本发明的方法时，商购自Dako(Denmark)的C8/144B抗体可以是合适的(Mason DY,Cordell JL,GaulardP,Tse AGD,Brown MH.Immunohistological detection of human cytotoxic/suppressorT cells using antibodies to a CD8peptide sequence.J Clin Pathol 1992:45:1084-8)。
当实施该方法时可以检测两种或更多种标志物。在具体实施方案中，可以使用以下组合：CD3+CD8、CD3+CD45RO、CD3+CD20、CD3+GZMB、CD8+CD20、CD8+GZMB、CD8+CD45RO、CD20+GZMB、CD20+CD45RO、GZMB+CD45RO、CD4+CD8、CD4+CD45RO、CD4+GZMB、CD4+CD20和CD3、CD8、CD20、CD45RO、CD4和GZMB标志物中的3种标志物的所有组合。在用于实施本发明的优选条件下，组合CD3+CD45RO、CD8+CD45RO和CD3+CD8是最优选的，更特别是后者，因为用这些抗体获得的背景染色低。
可以在本方法中使用不同类型肿瘤的组织切片。肿瘤组织样品涵盖(i)总体原发性肿瘤(作为整体)，(ii)来自肿瘤的组织样品(活检样品)，(iii)切除的肿瘤样品，和(iv)远处转移样品。
用一片染色的组织切片提供的一个或多个载片可用于本方法中。通常，一个单一载片对于一种标记物是足够的，除非获得较差染色。
例如，IHC自动化诸如允许自动染色载片制备的可用于实施免疫组织化学染色步骤a)。
步骤a的载片的数字化通过扫描捕获进行，例如使用允许扫描标准尺寸(26mm x76mm)载片的高分辨率Hamamatsu2.0-HT扫描仪。这种扫描仪提供高清晰度数码图像(x20:0.46μm/像素是优选的)和(x40:0.23μm/像素)。
检测，即数字图像上组织切片的边界的定义可以由技术人员、通常由医生人工进行，或者可以通过适当的软件来实施。
分析组织切片用于定义(i)肿瘤(CT)和(ii)肿瘤的侵入性边缘(IM)的边界也可以由医生人工进行，或者可以通过适当的软件来实施。通常获得对应于正常组织、肿瘤和其之间的侵入性边缘的三个区域。
优选地，在该步骤之前，根据标准诸如检测要素和区域的颜色、强度、致密性、空性、组织密度、使用复染的核密度、粒度、形状、尺寸中的一种或多种，将该片组织切片分成类似特性的区域。
在步骤e，提供适于待分析肿瘤的尺寸的参考网格。优选使用六边形、正方形或矩形网状网格。正方形网状网格是特别优选的。
单个网格的表面，下文称为“单元”，应为例如2.510-9m2至2510-6m2，优选1010-9m2至100010-9m2，特别是10010-9m2至100010-9m2，更特别是30010-9m2至80010-9m2，且非常特别是约65010-9m2。
具有以下表面的六边形、正方形或矩形单元是优选的：1010-9m2至100010-9m2，特别是10010-9m2至100010-9m2，更特别是30010-9m2至80010-9m2，且非常特别是约65010-9m2。
边长长度为500至1000μm、优选约800μm的正方形网状参考网格是最优选的，因为在此类区域中免疫细胞的适当代表性平均值为1至5000个细胞。
提供优选的参考网格，例如具有2至5000，优选10至2000，特别是100to 1000，更特别是400至700个单元。
边长长度为约800μm且具有400至700个正方形单元的网格是最优选的。
单元覆盖样品的整个表面。
目标细胞密度可以表示为每单位组织样品的表面积(例如每mm2)计数的所述目标细胞的数量。目标细胞的密度也可以由每总细胞或总细胞亚群(设定为100％)的特定细胞亚群(例如，CD3+T细胞)的百分比组成。在该方法的步骤g)，对于每种使用的生物标志物获得多于一个定量值允许相比于每种生物标志物仅测定一个定量值时更精确的治疗响应的最终癌症预后或预测。
当用于评价肿瘤组织中免疫细胞的数量或密度的方法随后为其中染色质量可能是所获得结果的准确性的重要参数的进一步步骤时，检查组织切片的染色质量是重要的。
因此，在实施本发明的优选条件下，所述方法进一步包括检查组织切片的染色质量的步骤e1。
检查染色质量可以通过，优选用适当软件，计算对于每个单元与总肿瘤区域检测到的阳性细胞的染色强度的分布(代表所述分布)来实施。
可以针对每个分析的载片计算和提供肿瘤区域中检测到的所有阳性染色细胞的相关(例如棕色)染色强度的平均值、中值、最小值和最大值。
染色强度的值和分布可以与针对每种标记物测定的参考值(正常范围强度)进行比较。
在检测步骤f.中，计数每个单元的阳性细胞的数量。由于每个单元的表面是已知的，所以每个表面单元的阳性细胞的密度也是已知的。步骤f.可以由技术人员、通常由医生人工进行，或者可以通过适当的软件来实施。该方法允许定量来自患者的肿瘤组织样品中至少一种指示所述患者针对癌症的免疫响应的状态的生物标志物。
上述方法可用于根据患者的预期存活率或他们对于癌症治疗的响应将患者分组。对于使用的每种生物标志物，可以将上述值与对于相同生物标志物的预定参考值进行比较；所述预定参考值与所述患者的所述癌症进展和/或存活率的特定预后和/或对癌症治疗的响应(“良好响应者”vs“差响应者”)相关。
对于给定标志物，以下参数可用于定量每个单元的染色细胞：
-染色细胞的总数量
-每个表面单元的染色细胞的密度
-分离的染色细胞(不与其它染色细胞接触)的总数量
-染色细胞簇内染色细胞的总数量(其中，至少1个染色细胞与最少3个染色细胞接触)。
在用于实施本发明的优选条件下，
-分析肿瘤的每个区域(CT和IM)。
-测定每个单元的染色细胞的密度。
-根据检测的染色细胞的密度并根据等级，例如绿色至红色(从最小密度至最大密度)，将颜色分配给每个单元。这些步骤优选通过适当的软件来实施。
优选地，每个肿瘤区域(CT和IM)中染色细胞的密度通过1至1000个单元，优选2至100个单元，更优选3至10个单元，最优选3个单元(具有最大密度)的平均密度来测定。具有最大密度的单元的选择优选通过适当的软件来实施。对于CT和IM区域中的每一个，获得一个值。如果所述值高于阈值，则样品被认为是阳性的。因此，对于单一标志物，四种可能性是可能的：CT+和IM+，CT-和IM-，CT+和IM-，CT-和IM+。当使用CD3、CD8、CD20、CD45RO和GZMB标志物中的两个或更多个时，对于第二标志物，相同可能性是可能的。
本发明人已经发现，如果30％或更多，优选40％或更多的考虑的单元表面填充有细胞时，则该方法是可靠的。
除了几个单元的平均密度以外的其他标准也是可能的，这优选基于A、B和C组的子标准的组合。
A组
1.阳性细胞的最大数量(阳性细胞是指由软件检测的染色细胞)
2.阳性细胞的最大密度
3.阳性细胞数量的总和
4.阳性细胞表面的总和
5.阳性细胞密度的总和
6.阳性细胞的平均数
7.阳性细胞的平均密度
8.阳性细胞的最大数
9.阳性细胞的中值数
10.阳性细胞的中值密度
在A组中，标准2、5、7和10是优选的，因为它们考虑分析的组织的表面。
B组
1.单阳性细胞
2.包含至少3个阳性细胞的簇中的阳性细胞
3.单阳性细胞或包含至少3个阳性细胞的簇
4.所有阳性细胞
5.最阳性单元，优选三(3)个阳性单元
6.随机单元，优选三(3)个随机单元
在B组中，标准4和5是优选的，因为该标准考虑检测的所有阳性细胞，并通过选择3个最染色单元降低异质性。另一方面，使用3到50个随机单元允许获得非常快的结果，因为该程序可以避免定量整个肿瘤。染色载片的分析结果快10-100倍。
C组
1.肿瘤区域CT
2.肿瘤区域IM
3.肿瘤区域CT和IM
在C组中，标准3：“肿瘤区域CT和IM”是优选的，因为该方法在区分患者中是最强大的，并且组之间的风险比是最高的。
此类标准的组合的实例包括例如用于细胞标志物，诸如CD3：
| 标准的组合 | A组 | B组 | C组 |
| C1 | 7 | 4 | 3 |
| C2 | 7 | 5 | 3 |
| C3 | 10 | 4 | 3 |
| C4 | 10 | 5 | 3 |
| C5 | 6 | 4 | 3 |
| C6 | 6 | 5 | 3 |
| C7 | 9 | 4 | 3 |
| C8 | 9 | 5 | 3 |
| C9 | 4 | 4 | 3 |
| C10 | 4 | 5 | 3 |
| C11 | 3 | 4 | 3 |
| C12 | 3 | 5 | 3 |
| C13 | 5 | 4 | 3 |
| C14 | 5 | 5 | 3 |
| C15 | 7 | 4 | 2 |
此类标准的组合的其它实例(其中A组的子标准是阳性细胞的中值数)包括，例如
1-组织表面大于或等于肿瘤区域CT和IM中单元总表面的40％的单元中阳性细胞(单细胞或包含至少3个细胞的簇)的中值数，
2-组织表面大于或等于肿瘤区域CT和IM中单元总表面的40％的单元中阳性细胞(单细胞)的数量，
3-组织表面大于或等于肿瘤区域CT和IM中单元总表面的40％的单元中阳性细胞(在包含至少3个细胞的簇中)的中值数，
4-组织表面大于或等于肿瘤区域CT和IM中单元总表面的40％的单元中阳性细胞(单细胞或包含至少3个细胞的簇)的密度的中值，
5-组织表面大于或等于肿瘤区域CT和IM中单元总表面的40％的单元中阳性细胞(单细胞或在包含至少3个细胞的簇中)的数量总和的中值，
6-组织表面大于或等于肿瘤区域CT和IM中单元总表面的40％的单元中阳性细胞(单细胞)的数量总和的中值
7-组织表面大于或等于肿瘤区域CT和IM中单元总表面的40％的单元中阳性细胞(在包含至少3个细胞的簇中)的数量总和的中值，
8-组织表面大于或等于肿瘤区域CT和IM中单元总表面的40％的单元中阳性细胞(单细胞或在包含至少3个细胞的簇中)的密度总和的中值，
9-组织表面大于或等于肿瘤区域CT和IM中单元总表面的40％的单元中阳性细胞(单细胞或在包含至少3个细胞的簇中)的平均数的中值，
10-组织表面大于或等于肿瘤区域CT和IM中单元总表面的40％的单元中阳性细胞(单细胞)的平均数的中值。
对于上述标准组合中的每一种，且对于每种标志物(例如CD3、CD4、CD8、CD20、CD45RO或GZMB标志物)，测定阈值，这允许发现在该标准上样品是否被认为是阳性或阴性的。
对于每种方法，测定每个区域中每种标志物的阈值。阈值如下测定：使用具有所述癌症的患者的组群，并且采取任意阈值，该组群的平均值或中值的阈值，或者优选使用区分患者的最佳p值，或区分患者的最佳风险比，或区分患者的最佳iAUC值，
对于CD3，例如，合适的值为约：
根据使用软件的校准调整诸如信号强度阈值或细胞检测和基于分析患者的类型(原发性肿瘤，转移，癌症I、II、III、IV期，研究的肿瘤类型(结肠癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤等…)的调整，这些值经受变化。
每种标志物的每个参考阈值可以通过实施包括以下步骤的方法来预先测定：
m)提供选自下组的肿瘤组织样品的至少一个集合：i)来自癌症患者的肿瘤组织样品的集合，所述癌症患者通常被归类为Tis、或T1、或T2、或T3或T4和N0、或N1、或N2、或N3和M0或M1，已经经历抗癌治疗，随后在抗癌治疗后无癌症复发或无癌症重现；ii)来自癌症患者的肿瘤组织样品的集合，所述癌症患者通常被归类为Tis、或T1、或T2、或T3或T4和N0、或N1、或N2、或N3和M0或M1，已经经历抗癌治疗，随后在抗癌治疗后具有癌症复发或重现；
n)，定量步骤m)提供的肿瘤组织样品集合中包含的每个肿瘤组织样品的所述生物标志物，从而获得所述生物标志物和所述肿瘤组织样品集合的定量值的集合；
o)从在步骤n)结束时获得的定量值的所述集合计算所述生物标志物的平均定量值，从而获得与特定癌症预后或对治疗的响应相关的所述生物标志物的预定参考值。在上文步骤m)的定义中提及的“抗癌治疗”涉及之前用于收集肿瘤组织样品的癌症患者经历的任何类型的癌症治疗，包括放疗、化疗、生物治疗、免疫治疗和手术，例如，肿瘤的手术切除。
鉴于最小统计显著性值，阈值参考值可以是值的范围。例如，在1至10的假设量表上，如果理想阈值是5，则合适(示例性)的范围可以是4-6。因此，患者可以通过比较值来评价，其中大于5的值表明例如良好的预后，且小于5的值表明例如较差预后；或者患者可以通过比较值和比较量表上的值来评价，其中高于4-6的范围的值表明例如良好的预后，且低于4-6的范围的值表明例如较差预后，其中落入4-6的范围内的值表明中间预后。
在用于测定上述阈值的方法的步骤o)的某些优选实施方案中，涉及患者的实际临床结果的所述信息选自(i)无疾病生存的持续时间(DFS)和(ii)总体存活率(OS)。
为了根据他们的预期存活率将患者分组，多于一种生物标志物的预定参考值的可用性是优选的。因此，通常，通过简单重复用于获得多种生物标志物的上述预定参考值的任一种方法来测定多种生物标志物的一个或多个预定参考值，所述生物标志物指示针对本文中涵盖的癌症的免疫应答的状态。
优选的预定参考值由区分较差癌症预后和良好癌症预后的目标生物标志物的中值定量值组成。
特定预定参考值的精确度随着组织样品数量而增加，所述组织样品用于获得特定生物标志物的定量值，并且因此，用于计算与特定癌症结果相关的平均值(预定参考值)。优选地，鉴于获得每种目标生物标志物的高度相关的预定参考值，所述预定参考值由组织样品上测量的所述标志物的多个定量值的平均值组成，所述组织样品源自经历特定临床结果的相同多个携带癌症的患者。
更优选地，为了评价准确的预定参考值，对于特定的生物标志物，参考值从至少50个定量值预先确定，从而使用源自已经经历特定差或良好临床结果(例如，诊断后大于5年的DFS或OS)的至少50个携带癌症的患者。在优选的实施方案中，对于特定生物标志物，预定参考值获得自至少60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或更多个定量值。
用于预先确定参考值的其它实施方案公开于EP-A-EP1943520和WO2007045996。
本发明的最优选方法是完全电脑化的方法。
上述方法可以如下实施：
制备肿瘤组织样品。优选将肿瘤组织样品固定在福尔马林中并包埋在刚性固定剂，诸如石蜡(蜡)或环氧树脂中，其被放置在模具中，并且随后固化，以产生容易切割的块。材料的薄片使用显微切片机制备，放置在载玻片上，并进行免疫组织化学，例如使用IHC自动化诸如用于获得染色载片。如果考虑几种标志物，则制备不同的染色载片。
当每个单元的肿瘤内免疫细胞的数量或密度已经根据上述方法进行评价，则选择上述标准组合之一，并获得所述标志物或每种标志物的值。将获得的值与标志物和标准组合的阈值/参考值进行比较。
如果获得的值高于阈值/参考值，则肿瘤被分配标识(quotation)诸如“+”或“高”，并且如果获得的值低于阈值/参考值，则肿瘤被分配标识诸如“-”或“低”。
当用单个标志物实施上述方法并分别考虑CT和IM时，肿瘤且因此患者可以为高/高、高/低、低/高、低/低。可以获得三类患者：“2高”、“高1”、“0高”。在此类情况下，可以获得从0到2的免疫评分(或免疫评分)。
当用两种标志物实施上述方法并考虑(且优选)CT或IM时，肿瘤且因此患者也可以为高/高、高/低、低/高、低/低。可以获得三类患者：“2高”、“高1”、“0高”。也在此类情况下，可以获得从0到2的免疫评分(或免疫评分)。
当用两种标志物实施上述方法并分别考虑CT和IM时，肿瘤且因此患者可以为高/高/高/高、低/低/低/低、高/高/高/低、高/高/低/低、和高/低/低/低。对于后三种，评价可以不考虑标志物和阳性区域CT或IM。
可以使用任何惯例。例如，“+”、“阳性”、“高”、“Hi”对于评价相同结果(许多染色的细胞)而言是等效的。
在此类情况下，从0到4范围的免疫评分(或免疫评分)可以总结如下：
评分4：四(4)次“高”评价
评分3：三(3)次“高”评价
评分2：两(2)次“高”评价
评分1：一(1)次“高”评价
评分0：零(0)次“高”评价。
根据本发明的方法因为它们的再现性、可重复性和以常规实践进行该方法的可能性而具有有利特性。
本方法允许获得整个肿瘤的数值(如果需要)，而不仅限于组织微阵列(TMA)的信息。
本发明的范围可以通过参考下文给出的实施例来更好地理解，所述实施例的目的是解释本发明的优点。
本发明的一个主题也是用于实施上述方法的试剂盒，其包含含有参考阈值的支持物。
本发明的进一步主题是提供有用于实施上述方法的软件的计算机。
用于实施上述方法的优选条件也适用于上文考虑的本发明的其它主题，特别是用于实施所述上述方法的试剂盒。
附图说明
图1表示数字图像上检测到的一片组织切片的图像。
图2显示根据一个或多个标准分成类似特性的区域的图1的一片组织切片的图像。
图3是类似于图像2的图像，其中已经定义了肿瘤和肿瘤的侵入性边缘。
图4是显示组织切片的三个区域的图像：顶部的肿瘤，底部的健康组织和这些区域之间的侵入性边缘。
图5显示适于分析的肿瘤(肿瘤和侵入性边缘)的尺寸的具有正方形单元的尺寸参考网格。肿瘤是灰色的且为V形。
图6是典型单元的图像。黑点对应于染色的细胞，即包含标志物的细胞。
图7展示代表性曲线，其显示作为通过软件检测到的所有阳性细胞染为棕色的强度的函数的一个网格单元获得的染色质量。染色质量的评估优选在组织切片的所有单元上实施。
图8是肿瘤的图像。根据给定单元中染色细胞的数量，已经通过软件分配或多或少深色。
图9是图6的部分放大图，其中染色的细胞(黑色)得到更好证明。
图10是用于实施本发明的系统的方框图。
图11和12是编程流程图，说明用于实施根据本发明方法的步骤的程序的一个实例。
图13显示实施例2的定量方法和特别是肿瘤切片中CD3+细胞的检测(结肠直肠癌的整体载片分析)。顶部图：组织样品的边界，下一图的肿瘤和侵入性边缘，将组织切片分为三个区域：顶部右边的肿瘤、左边和底部右边上的健康组织和侵入性边缘最亮区域。
图14显示实施例2的定量方法和特别是肿瘤切片中CD8+细胞的检测(结肠直肠癌的整体载片分析)。顶部图：组织样品的边界，下一图的肿瘤和侵入性边缘，将组织切片分为三个区域：顶部右边的肿瘤、左边和底部右边上的健康组织和侵入性边缘最亮区域。
图15说明根据相关的无疾病生存率的p值(对数秩检验)计算最佳阈值并显示相比于20至2000个CD3+细胞/mm2的密度的p值。
图16说明对于肿瘤的染色切片的十个不同单元，CD3和CD8的染色强度的分布百分比的柱状图。
图17-19说明CD3免疫染色后，关于细胞的染色强度，表示CT和IM肿瘤区域中检测到的阳性细胞的百分比的柱状图。
根据本发明用于获得显示肿瘤的组织切片的三个区域的图像的一个程序显示于图10。
当分析载片的数字图像用于获得组织切片的边界时，该程序在步骤10“限定组织的边界”开始。
然后，在步骤12“将组织样品分割为均匀区域”中，分析参数，诸如区域颜色、复染强度、核区域密度、检测要素和区域的紧凑性、空性、组织密度、粒度、形状、尺寸，或这些参数中的几个，并根据所述参数将组织切片分为相似特性的均匀区域。通常对于具有约1-10cm2的表面的组织样品，获得100至10000个区域，通常2000至4000个均匀区域。
然后，在步骤14“限定肿瘤”中，鉴于步骤12的结果且考虑参数诸如细胞核的尺寸和形态、细胞核的颜色等，计算机(或技术人员，通常是医生)数字限定肿瘤和侵入性边缘。当技术人员实施该步骤时，例如，他可以使用计算机的鼠标或用于其的手写笔。
然后，在步骤16“限定肿瘤中心和侵入性边缘”中，将组织部分分为三个区域：肿瘤、健康组织和侵入性边缘。软件定义了健康组织和肿瘤之间的名为“侵入性边缘”的中间区域，例如肿瘤边界的每一侧500μm宽，因此具有1mm的宽度。事实上，本发明人进行的长期研究已经证明，1mm的宽度是最有代表性的侵入性边缘。
在步骤18“提供适于肿瘤尺寸的网格”中，生成适于肿瘤和侵入性边缘的尺寸的矩形网格。矩形网格由通常具有边长为500至1000μm、优选约800μm的正方形单元构成。
在步骤20“每个单元染色细胞单元的计数”中，计数染色的细胞并考虑参数诸如细胞颜色、单个细胞的预期尺寸、细胞形状或染色强度。
在步骤22“染色细胞数除以单元表面”中，将染色(阳性)细胞的数量除以单元的表面积(例如，对于边长为800μm的正方形为0.6410-6m2)。因此获得染色(阳性)细胞除以表面单元的密度。
在步骤24“根据染色细胞的密度将颜色分配至每个单元”中，软件根据密度将颜色分配给每个单元，例如，从浅黄色到暗红色。
如前面提到，如果在方法中使用多于一种标志物，则对于每种标志物分别实施该程序。例如，对于CD3细胞，然后对于CD8细胞实施程序。
根据本发明用于将患者分组的一种程序显示于图12。在本实例中，已经选择以下参数组合：A阳性细胞的平均密度，B三个最染色单元和C肿瘤区域CT和IM。
该程序在步骤30“检测肿瘤中心中3个最染色的单元”开始。“肿瘤中心”用于与“肿瘤边缘”比较。该软件根据上述步骤24的数据检测3个最染色的单元(例如暗红色单元)。
在步骤32“计算肿瘤中心中阳性细胞的平均密度”中，计算染色(阳性)细胞的平均密度。
在步骤34“肿瘤中心中阳性细胞的平均密度的参考值”中，由包含对于所述参数组合和所述标志物的阈值/参考值的数据库提供阈值/参考值。数据库优选包含对于每种参数组合和每种标志物的阈值/参考值。
在步骤36“将肿瘤中心中阳性细胞的平均密度与参考值进行比较”中，将步骤32的值与步骤34的阈值/参考值进行比较，并提供所需信息。如果步骤32的值高于步骤34的阈值/参考值，则样品被认为是例如“高”，在相反的情况下则为“低”。
例如对于两种标志物和对于肿瘤区域CT和IM实施该程序。
得分可以从所述信息获得，且患者的预期存活率可以以可靠的方式来评估，因为将人干预和评估限制到最低。
具体实施方式
实施例1：肿瘤组织的染色载片的制备
制备选择的4微米肿瘤块的两个组织石蜡切片，并储存在显微镜载片(Superfrost-plus载片)上的去离子水中，用于免疫组织化学。组织石蜡切片在室温下干燥，并在56℃-58℃烘箱中孵育过夜。
免疫染色用IVD认证的针对CD3和CD8(CONFIRM CD3(2GV6,Ventana)和CD8(C8/144B；Dako))的抗体来进行。相关方案包含阻断、表位恢复和检测的关键步骤。应用意欲用于染色载片上的细胞核的改进的Mayer苏木精(Hematoxillin II,Ventana)，以便用专用软件最佳检测染色的细胞。用Benchmark XT自动化(Roche-Ventana)使用的方案为：
CC1为具有微碱性pH的基于tris的缓冲剂。针对CD8的一级抗体稀释剂为K004(Clinisciences)。
扫瞄肿瘤组织的染色切片用于获取数字图像
将载片数字化为数字图像用20X模式的扫描仪(NanoZoomer 2.0-HT,Hamamatsu)进行。数字图像的格式与Definiens Developer XD图像分析系统兼容。为了避免扫描图像上的不均匀颜色，对于白平衡、黑与亮和对于阴影进行校正。
实施例2：通过软件处理分析染色载片
.病理学家已经上传了CD3和CD8的每次免疫组织化学的数字图像，并开始用专用的图像分析软件(Definiens Developer XD)进行分析。
.半自动程序包含用于以下的步骤：
-组织的自动检测，
-将组织自动分割为单元，
-手工去除人工部分(褶皱、撕裂、气泡，...)，
-由病理学家使用刷子作为数字工具手动选择肿瘤区域，
-自动检测侵入性边缘，
-自动检测肿瘤的每个单元中的染色细胞，
-分析图形中通过软件检测的阳性细胞的染色强度的分布、平均值和中值，以验证染色细胞的免疫染色和定量；该分析在组织切片的每个单元、在所有单元上实施，
-将染色强度的值和分布与CD3和CD8分别的参考值进行比较；如果染色强度具有类似的值(或多或少约20％的相同值)，则样品组织被认为是准确染色的；下文给出实例，
-每个肿瘤区域(CT和IM)中三个最浸润单元的鉴定和验证，
-每个肿瘤区域中三个最浸润单元的平均密度的计算。
CD3IHC分析
CD8IHC分析
为了确定患者对于每个肿瘤区域中的每种标志物是高或低，将最浸润的3个单元的平均密度与指示组群的研究中先前定义的最佳阈值的平均密度进行比较。
在临床局部的结肠直肠癌(UICC TNM I-II期)的指示组群中，区分患者的无疾病生存率的最佳阈值是
对于分析的病例，肿瘤为
对于CD3，Hi/Hi
对于CD8，Hi/Hi
因此，免疫评分为I-4。
实施例3：根据相关的无疾病生存率的P值(对数秩检验)计算最佳阈值的实例
计算无疾病生存率的p值(对数秩检验)
对于20至2000个CD3+细胞/mm2的每个值，确定具有小于所述值的肿瘤(CT区域)(底部曲线上的圆点)中CD3+细胞的密度的患者数量(由此提供患者组)。
计算比较患者组的肿瘤(圆点和相应曲线)中20至2000个CD3+细胞/mm2的每个阈值的对数秩检验的p值。
结果在图15中提供。
X轴表示以细胞/mm2表示的细胞密度，Y轴表示对数秩p值(图底部的圆点和相应曲线)。还表示了风险比(方点和相应曲线)和iAUC一致性指数(细曲线)。
将患者归类为“Lo”(低于给定切点)和“Hi”(高于该切点)。在本实施例中测试20至2000个细胞/mm2之间的值。例如，对于值100个细胞/mm2，具有小于100个CD3+细胞/mm2的患者在“Lo”组中，且具有100或更多个CD3+细胞/mm2的患者在“Hi”组中。绘制Kaplan Meier曲线，比较Hi和Lo患者，且计算对数秩p值(在本实施例中P＝0.01)。
结果显示(参见图15)，70和700个细胞/mm2之间的值对于肿瘤中的CD3+(圆图)是显著的(P<0.05)。最佳P值阈值由对应于最小P值的值提供，这在本实施例中发现为200个细胞/mm2。因此，最佳阈值设定为200个细胞/mm2。
对于除了阳性细胞密度以外的值，对于每个肿瘤区域中的每种标志物，最佳阈值可以使用类似方法来测定。
实施例4：免疫组织化学的重复性和再现性
已经根据不同的方法研究CD3和CD8免疫组织化学的重复性和再现性。(3个最染色单元的标准)。
重复性方法1：
将一个肿瘤载片免疫染色(针对CD3或CD8)并用扫描器计数。数字图像由相同操作者用图像分析软件分析10次(在其它方面，相同免疫染色的10次分析由相同操作者进行)。测定变异系数(CV)。
结果：
CD3；
CT区域的CV为3.20％。
IM区域的CV为7.11％。
肿瘤(CT和IM)的分析的CV为5.16％。
CD8；
CT区域的CV为1.88％。
IM区域的CV为3.07％。
肿瘤(CT和IM)的分析的CV为2.48％。
重复性方法2：
分析四个肿瘤样品。对于每个肿瘤样品，进行四个相邻载片。将载片在相同实验中免疫染色(针对CD3或CD8)并在相同运行中用扫描器计数。数字图像由相同操作者在相同运行中用图像分析软件进行分析。测定相邻载片之间的每个IHC(CD3和CD8)的变异系数(CV)。
结果：
CD3；肿瘤#1-4
CT区域的CV为5.41％。
IM区域的CV为10.59％。
肿瘤(CT和IM)的分析的CV为8.00％。
CD8；肿瘤#1-4
CT区域的CV为8.73％。
IM区域的CV为9.09％。
肿瘤(CT和IM)的分析的CV为8.91％。
再现性方法1：
-分析一个来自TissueMicro阵列(TMA)的肿瘤样品的载片。-将载片免疫染色(针对CD3或CD8)并用扫描器计数。-数字图像由相同操作者用图像分析软件在12次运行(CD3)和24次运行中分析(在其它方面，相同免疫染色的12次分析由相同操作者进行)。
-测定变异系数(CV)。
结果：
CD3；TMA斑点的CV为＜1％。
CD8；TMA斑点的CV为＜1％。
再现性方法2：
将一个肿瘤样品的载片免疫染色(针对CD3或CD8)并用扫描器计数。数字图像由两个操作者用图像分析软件分析10次。测定两个操作者之间的变异系数(CV)。
结果：
CD3；
CT区域的CV为3.42％。
IM区域的CV为7.03％。
肿瘤(CT和IM)的分析的CV为5.23％。
CD8；
CT区域的CV为2.72％。
IM区域的CV不适用(没有可检测到的IM)。
肿瘤(CT)的分析的CV为2.72％。
再现性方法3：
-分析两个肿瘤样品。对于每个肿瘤样品，进行5个相邻载片(C1-C5)。将载片在不同运行中免疫染色(针对CD3和CD8)并在不同运行中计数。数字图像由两个操作者用图像分析软件进行分析(操作者#1用于载玻片C1、C3和C5；操作者#2用于载玻片C2和C4)。测定两个研究者之间对于相邻载片的每个IHC(CD3和CD8)的变异系数(CV)。
结果：
CD3；
CT区域的CV为17.89％。
IM区域的CV为5.37％。
肿瘤(CT和IM)的分析的CV为11.68％。
CD8；
CT区域的CV为14.90％。
IM区域的CV为8.71％。
肿瘤(CT和IM)的分析的CV为2.72％。
实施例5：实施CD3和CD8的免疫染色的质量控制的详细实例
随机选择根据实施例1的对于CD3和CD8免疫染色的10个单元。测定单元+/-1SD的平均强度。
获得的平均值是：CD3:239+/-43(范围:282-196),CD8:217+/-44(范围:261-173)。所述值被视为用于验证给定患者的各样品的免疫染色质量的参考值。上述范围对应于距参考平均值上下20％的差异。本领域技术人员理解，出于各种原因，容差阈值可以加宽(例如上下22％或25％)，或优选地变窄(例如上下5％、8％、10％、15％)。
第1组
随机选择根据实施例1的对于CD8免疫染色的10个单元。测定单元+/-1SD的平均强度。获得的结果为：平均值＝234+/-64。CD3的染色强度分布的柱状图显示，获得的CD3的染色强度接近于范围282-196内的CD3的参考染色强度。
因此样品被认为是正确免疫染色的。
验证通过第1组:CT:1795个细胞/mm2,IM:2319个细胞/mm2测量的染色的免疫细胞的密度。
第2组
由在邻近于第1组检查的载片的载片上工作的第二组实施相同方案。
获得的结果为：平均值＝251+/-56，在范围282-196内.鉴于上述参考值，因此样品被认为是正确免疫染色的。
验证通过第1组：CT:1665个细胞/mm2,IM:2198个细胞/mm2测量的染色的免疫细胞的密度。
由第1组和第2组对于邻近载片获得的肿瘤区域[肿瘤的核心(CT)和侵入性边缘(IM)]中CD3的密度值确实是相似的。
第3组
由在邻近于第1组检查的载片的其它载片上工作的第三组实施相同方案。获得的结果为：平均值＝148+/-27。CD3的染色强度分布的柱状图显示，获得的CD3的染色强度远离CD3的参考染色强度(范围282-196之外)。
因此样品被认为是不正确免疫染色的。
没有验证通过第3组：CT:914个细胞/mm2,IM:1707个细胞/mm2测量的染色的免疫细胞的密度。
上述结果显示，在不存在免疫染色的参考和质量控制的情况下，可以获得非常不同且不准确的结果。
Claims (16)
1.用于评估肿瘤组织中免疫细胞的数量或密度的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：
a.提供通过使用特异性结合由免疫细胞表达的标志物的抗体的自动化载片染色系统获得的一种或多种免疫染色的组织切片的载片，
b.通过高分辨率扫描捕获将步骤a.的载片进行数字化，由此获得待分析载片的高清晰度数字图像，
c.检测数字图像上的组织切片的载片
d.分析组织切片的载片，用于定义(i)肿瘤(CT)和(ii)肿瘤的侵入性边缘(IM)，
e.提供尺寸参考网格，其中均匀分布单元具有相同表面，所述网格适于待分析肿瘤的尺寸，
e1.通过与参考值比较检查免疫染色的质量，
f.检测和定量每个单元的染色细胞，由此评估每个单元染色的免疫细胞的数量或密度，
其中对于给定标志物，检查免疫染色的质量的步骤e1.包括：
-测量代表网格的每个单元的染色细胞的染色强度的分布值，
-将分布值与参考值比较，参考值代表具有给定标志物的已知分布的参考组织切片的染色细胞的染色强度，如果分布值在参考值范围内，则单元是正确染色的，和如果分布值不在参考值范围内，则单元是不正确染色的，
和其中如果所述单元根据步骤e1.是正确染色的，则检测和定量染色细胞的步骤f.期间评估的每个单元的染色免疫细胞的数量或密度是有效的，和如果所述单元根据步骤e1.是不正确染色的，则检测和定量染色细胞的步骤f.期间评估的每个单元的染色免疫细胞的数量或密度是无效的。
2.根据权利要求1的方法，其中每个单元的染色细胞的检测和定量分别在肿瘤(CT)和肿瘤的侵入性边缘(IM)中实施。
3.根据权利要求1的方法，其中所述抗体选自对于CD3、CD4、CD8、CD20、CD45RO、或GZMB标志物特异性的抗体。
4.根据权利要求1的方法，其中使用选自以下组合的两种或三种抗体：CD3+CD8、CD3+CD45RO、CD3+CD20、CD3+GZMB、CD8+CD20、CD8+GZMB、CD8+CD45RO、CD20+GZMB、CD20+CD45RO、GZMB+CD45RO、CD4+CD8、CD4+CD45RO、CD4+GZMB、CD4+CD20和CD3、CD8、CD20、CD45RO、CD4和GZMB标志物中的3种标志物的所有组合。
5.权利要求1的方法，其中IHC自动化用于实施步骤a)。
6.权利要求1的方法，其中步骤d.包括分析组织切片的载片用于通过软件定义(i)肿瘤(CT)和(ii)肿瘤的侵入性边缘(IM)。
7.根据权利要求1的方法，其中使用具有10x 10-9m2至1000x 10-9m2的表面的六边形或矩形单元。
8.根据权利要求7的方法，其中正方形单元作为矩形单元使用。
9.根据权利要求1的方法，其中评估的每个单元的染色的免疫细胞的数量或密度选自：
-染色细胞的最大数量
-染色细胞的最大密度
-染色细胞的数量总和
-染色细胞的表面总和
-染色细胞的密度总和
-染色细胞的平均数
-染色细胞的平均密度
-染色细胞的最大数量
-染色细胞数量的中值。
10.根据权利要求1的方法，其进一步包括根据选自以下的B组标准检测细胞或单元：
-单染色细胞
-包含至少3个染色细胞的簇中的染色细胞
-单染色细胞或包含至少3个染色细胞的簇
-所有染色细胞
-最染色的单元
-随机单元。
11.根据权利要求1的方法，还包括提供与组织切片的免疫评分相关的输出，其中提供与组织切片的免疫评分相关的输出包括以下步骤：
-对于选自肿瘤(CT)和肿瘤的侵入性边缘(IM)的至少一个肿瘤区域，对于给定标志物，将免疫细胞的数量或密度的值与用于所述给定标志物的预定阈值进行比较，
-如果免疫细胞的数量或密度的值高于预定阈值，则向肿瘤区域分配阳性标识，
-如果免疫细胞的数量或密度的值低于预定阈值，则向肿瘤区域分配阴性标识，
-基于若干个阳性标识和若干个阴性标识测定组织切片的免疫评分。
12.根据权利要求11的方法，其中对每个肿瘤区域进行所述提供与免疫评分相关的输出的步骤。
13.根据权利要求11的方法，其中对多种标志物进行所述提供与免疫评分相关的输出的步骤。
14.根据权利要求11的方法，其进一步包括根据患者的免疫评分将患者分组的步骤，将每个患者分配至具有相同免疫评分的一组患者。
15.根据权利要求1的方法，其中参考值是参考组织切片的染色细胞的染色强度的至少一个平均值、中值、最小值和最大值。
16.根据权利要求1的方法，其中参考值范围是参考值的或多或少20％。
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