ES2902879T3 - Método de cuantificación de células inmunitarias en tejidos tumorales y sus aplicaciones - Google Patents

Abstract

Un método para evaluar un número o densidad de células inmunitarias en tejidos tumorales que comprende las etapas que consisten en: a. proporcionar uno o más cortes inmunoteñidos de sección de tejido obtenido por un sistema automatizado de tinción de portaobjetos usando anticuerpos que se unen específicamente a marcadores expresados por células inmunitarias, b. proceder a la digitalización de los portaobjetos de la etapa a. mediante captura de barrido de alta resolución, mediante lo cual se obtiene una imagen digital de alta definición del portaobjetos a analizar, c. detectar el corte de la sección de tejido en la imagen digital d. analizar el corte de la sección de tejido para definir (i) un tumor (CT) y (ii) un margen invasivo del tumor (IM), e. proporcionar una cuadrícula de referencia de tamaño con unidades distribuidas uniformemente que tienen una misma superficie, estando dicha cuadrícula adaptada al tamaño del tumor a analizar, e1. comprobar la calidad de la inmunotinción mediante: - cálculo de la distribución de la intensidad de tinción de las células positivas detectadas para cada unidad de la cuadrícula y para la región tumoral total, que representa dicha distribución, - para cada portaobjetos, cálculo de los valores medio, mediano, mínimo y máximo de la intensidad de tinción de todas las células teñidas positivas detectadas, - comparación de los valores y la distribución de la intensidad de la tinción con una referencia de intensidad de intervalo normal determinada para cada marcador, y f. detectar y cuantificar las células teñidas de cada unidad mediante lo cual se evalúa el número o la densidad de células inmunitarias teñidas de cada unidad.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de cuantificación de células inmunitarias en tejidos tumorales y sus aplicaciones

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para cuantificar células inmunitarias en tejidos tumorales y sus aplicaciones.

Antecedentes de la invención

Los documentos EP-A-EP1943520 y WO2007045996 describen un método in vitro para el pronóstico de los pacientes de la progresión de un cáncer y/o de la supervivencia, y/o la predicción de la respuesta al tratamiento (quimioterapia, radioterapia, bioterapia, inmunoterapia) cuyo método comprende las siguientes etapas:

a) cuantificar, en una muestra de tejido tumoral de dicho paciente, al menos un marcador biológico indicativo del estado de la reacción inmunitaria adaptativa local de dicho paciente; y

b) comparar el valor obtenido en la etapa a) para dicho al menos un marcador biológico con un valor de referencia predeterminado para el mismo marcador biológico; cuyo valor de referencia predeterminado se correlaciona con un pronóstico específico de la progresión de dicho cáncer o supervivencia de dicho paciente o la predicción de respuesta al tratamiento (tal como quimioterapia, radioterapia, bioterapia, inmunoterapia) para anticipar el "paciente que responde bien" frente al "paciente que responde mal".

La muestra de tejido tumoral puede seleccionarse del grupo que consiste en (i) un tumor primario global (como un todo), (ii) una muestra de tejido del tumor, (iii) una muestra de tejido del tejido que rodea directamente al tumor, cuyo tejido puede denominarse más específicamente "margen invasivo" del tumor, (iv) islotes linfoides en las proximidades del tumor, (v) los ganglios linfáticos ubicados en la proximidad más cercana al tumor, (vi) una biopsia del tumor realizada antes de la cirugía y (vii) una metástasis distante.

El marcador biológico se cuantifica preferiblemente, en la etapa a), en muestras tumorales recogidas de dos regiones del tumor, respectivamente (i) el tumor (CT) y (ii) el margen invasivo del tumor (IM).

El método anterior se implementó en micromatrices de tejidos (TMA). Sin embargo, la mayoría de las etapas del procedimiento se implementan manualmente y se pueden observar problemas con la reproducibilidad de las mediciones. Por ejemplo, pueden producirse diferencias entre patólogos para la selección de áreas tumorales a perforar, basadas en el examen de contratinción con hematoxilina-eosina. Además, se observa una dificultad para perforar exactamente el área seleccionada por el patólogo. Estos errores típicos pueden ocurrir en cada etapa. Si bien el método descrito en estos documentos permite obtener un alto rendimiento para predecir la supervivencia de los pacientes con cáncer, aún se están investigando métodos con cualidades aún mejores, en particular en lo que respecta a la reproducibilidad de la automatización y la comparabilidad de los resultados.

Como destacan Halama et al. en "Quantification of prognostic immune cell markers in colorectal cancer using whole slide imagining tumour maps, analytical and quantitative cytology and histology", vol. 32, 6, diciembre de 2010, págs.

333-340, el muestreo de sondas histológicas utilizando micromatrices de tejido (TMA) es especialmente problemático en el caso de una heterogeneidad espacial de la molécula diana, como se observa con frecuencia en el tejido canceroso. Halama et al. proponen microscopía de portaobjetos de tejido completo para la adquisición de datos. Sin embargo, el estudio no demuestra un algoritmo de diagnóstico específico que produzca un parámetro capaz de interpretar la heterogeneidad espacial del tumor. Concluye que hasta que no se cree este algoritmo de diagnóstico y se realice un estudio de seguimiento no puede saber si el mapa tumoral tendrá valor de pronóstico en un paciente individual.

Los métodos de la técnica anterior antes mencionada, así como los descritos en Pagés et al. (Journal of Clinical Oncology 2009, 27 (35): 5944-5951), Halama et al. (Plos One 2009, 4 (11) E7487: 1-6), Halama et al. (Cancer Research 2011,71 (17): 5670-5677), Halama et al. (Oncoimmunology, 2012, 1 (1): 62-66), y Packeisen y col. (J Clin Pathol 2002, 55: 613-615), todos se centran únicamente en la cuantificación de la tinción.

Sumario de la invención

Ahora, los autores de la invención han descubierto un método para evaluar un número o densidad de células inmunitarias en tejidos tumorales, para obtener una puntuación inmunitaria (o Immunoscore) de pacientes que padecen un cáncer.

Se ha observado de manera sorprendente e inesperada que el uso del nuevo método para evaluar un número o densidad de células inmunitarias en tejidos tumorales asegura la automatización, repetibilidad y reproducibilidad del método descrito en el documento WO2007045996 y por lo tanto proporciona un método de ensayo estándar para ensayos entre laboratorios para predecir la supervivencia y la respuesta al tratamiento de pacientes con cáncer.

El nuevo método tiene particularmente menos problemas de repetibilidad y reproducibilidad en comparación con el método de los documentos EP-A-EP1943520 y WO2007045996

Descripción de las realizaciones preferidas

Por tanto, un objeto de la presente solicitud es un método para evaluar un número o densidad de células inmunitarias en tejidos tumorales que comprende las etapas que consisten en:

a. proporcionar uno o más cortes inmunoteñidos de sección de tejido obtenidos mediante un sistema automatizado de tinción de portaobjetos usando anticuerpos que se unen específicamente a antígenos expresados por células inmunitarias.

b. proceder a la digitalización de los portaobjetos de la etapa a. mediante captura de barrido de alta resolución, mediante lo cual se obtiene una imagen digital de alta definición (4.6 pm/píxel o mejor) del portaobjetos que se va a analizar,

c. detectar el corte de la sección de tejido en la imagen digital

d. analizar el corte de la sección de tejido para definir (i) el tumor (CT) y (ii) el margen invasivo del tumor (IM),

e. proporcionar una cuadrícula de referencia de tamaño con unidades distribuidas uniformemente que tienen una misma superficie, estando dicha cuadrícula adaptada al tamaño del tumor a analizar,

e l . comprobar la calidad de la inmunotinción como se describe a continuación,

f. detectar y cuantificar las células teñidas de cada unidad mediante lo cual se evalúa el número o la densidad de células inmunitarias teñidas de cada unidad.

Normalmente, los anticuerpos son específicos para una proteína expresada por una célula inmunitaria y más particularmente son específicos para un marcador de superficie de la célula inmunitaria. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser específicos para un marcador como se describe en el documento WO2007045996, las células inmunitarias consideradas pueden ser células B y preferiblemente células T. Por ejemplo, las células T de la invención son células T de los subgrupos células CD3+ (células T), células CD8+ o células GZMB+ (células T citotóxicas), células CD4+ (células T auxiliares), células CD45RO+ (células T de memoria). En una realización particular, los anticuerpos son específicos para marcadores CD3, CD4, CD8, CD20, CD45RO y GZMB.

Cuando se utilizan dos o más marcadores, las etapas anteriores se implementan preferiblemente por separado para cada marcador. Por ejemplo, se utilizan anticuerpos anti-CD3 para un corte de tejido y anticuerpos anti-CD8 para otro corte de tejido, preferiblemente un corte de tejido adyacente. Alternativamente, se puede realizar una detección múltiple, por ejemplo doble, cuando los anticuerpos usados para detectar diferentes marcadores se tiñen de manera diferente. Por tanto, hay disponible una señal detectable para cada marcador.

La inmunohistoquímica o IHC se refiere al procedimiento convencional de detección de antígenos (generalmente proteínas) en células de una sección de tejido utilizando el principio de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos en tejidos biológicos. La tinción inmunohistoquímica permite visualizar una interacción anticuerpo-antígeno. Se puede implementar de varias formas. En el caso más común, un anticuerpo se conjuga con una enzima, tal como la peroxidasa, que puede catalizar una reacción que produce color. Alternativamente, el anticuerpo también se puede marcar con un fluoróforo, tal como fluoresceína o rodamina.

Los anticuerpos usados en la invención están típicamente disponibles comercialmente. En particular, cuando se selecciona el marcador CD3 para implementar el método de la invención, puede ser adecuado el anticuerpo 2GV6 disponible comercialmente en Roche Ventana (Tucson, AZ, EE. UU.) (Chetty R et al., J Pathol. 173 (4): 303-307, 1994). En particular, cuando se selecciona el marcador CD8 para implementar el método de la invención, puede ser adecuado el anticuerpo C8/144B disponible comercialmente en Dako (Dinamarca) (Mason DY, Cordell JL, Gaulard P, Tse AGD, Brown MH. "lmmunohistological detection of human cytotoxic/suppressor T cells using antibodies to a CD8 peptide sequence". J Clin Pathol 1992: 45: 1084-8).

Se pueden detectar dos o más marcadores cuando se implementa el procedimiento. En una realización particular se pueden utilizar las siguientes combinaciones: CD3+CD8, CD3+CD45RO, CD3+CD20, CD3+GZMB, CD8+CD20, CD8+GZMB, CD8+CD45RO, CD20+GZMB, CD20+CD45RO, GZMB+CD45RO, CD4+CD8, CD4+CD45RO, CD4+GZMB, CD4+CD20, y todas las combinaciones de 3 marcadores entre los marcadores CD3, CD8, CD20, CD45RO, CD4 y GZMB. En las condiciones preferidas para implementar la invención, las combinaciones CD3+CD45RO, CD8+CD45RO y CD3+CD8 son las más preferidas, más particularmente la última, debido a la baja tinción de fondo obtenida con estos anticuerpos.

Pueden usarse secciones de tejido de diferentes tipos de tumores en el presente procedimiento. Una muestra de tejido tumoral abarca (i) un tumor primario global (como un todo), (ii) una muestra de tejido (una biopsia) del tumor, (iii) una muestra de tumor resecado y (iv) una muestra de metástasis distante.

En el presente método se pueden utilizar uno o más portaobjetos provistos de un corte teñido de una sección de tejido.

Por lo general, un solo portaobjetos es suficiente para un marcador, a menos que se obtenga una mala tinción.

Por ejemplo, se puede utilizar un sistema de IHC automático tal como BenchMark® XT que permite la preparación automática de portaobjetos teñidos para implementar la etapa de tinción inmunohistoquímica a).

La digitalización de los portaobjetos de la etapa a. se hace por captura de barrido, por ejemplo, con un escáner Hamamatsu NanoZoomer® 2.0-HT de alta resolución que permite escanear portaobjetos de tamaño estándar (26 mm

x 76 mm). Este escáner proporciona imágenes digitales de alta definición (se prefiere x20: 0.46 pm/píxel) y (x40: 0.23 pm/píxel).

La detección, es decir, la definición de los límites del corte de la sección de tejido en la imagen digital la puede realizar un técnico experto, normalmente un médico, o puede implementarse mediante el software apropiado.

El análisis del corte de la sección de tejido para definir los límites de (i) el tumor (CT) y (ii) el margen invasivo del tumor

(IM) también lo puede realizar un médico o puede implementarse mediante el software apropiado. Normalmente se obtienen tres áreas correspondientes a tejido sano, tumor y margen invasivo entre estos.

Preferiblemente, antes de esta etapa, el corte de la sección de tejido se divide en áreas de propiedades similares, de acuerdo con criterios tales como uno o más de colores, intensidad, compacidad, vacío, densidad del tejido, densidad nuclear usando contratinción, granulosidad, forma, tamaño de elementos detectados y área.

En la etapa e. se proporciona una cuadrícula de referencia adaptada al tamaño del tumor a analizar. Se utiliza una cuadrícula de malla preferiblemente hexagonal, cuadrada o rectangular. Se prefiere especialmente una cuadrícula de malla cuadrada.

La superficie de una malla individual, en lo sucesivo "unidad", será, por ejemplo, de 2.5 10-9 m2 a 25 10-6 m2, preferiblemente de 1010-9 m2 a 100010-9 m2, particularmente de 10010-9 m2 hasta 100010-9 m2, más particularmente de 300 10-9 m2 hasta 800 10-9 m2, y muy particularmente de aproximadamente 650 10-9 m2.

Se prefieren las unidades hexagonales, cuadradas o rectangulares que tienen una superficie de 10 10-9 m2 a 1000

10-9 m2, particularmente de 100 10-9 m2 a 1000 10-9 m2, más particularmente de 300 10-9 m2 a 80 particularmente de aproximadamente 650 10-9 m2.

Una cuadrícula de referencia de malla cuadrada que tiene lados de 500 a 1000 pm de longitud, preferiblemente aproximadamente 800 pm, es la más preferida debido a la media representativa apropiada de células inmunitarias en tal área, en el intervalo de 1 a 5000 células.

Una cuadrícula de referencia preferida está provista, por ejemplo, de 2 a 5000, preferiblemente de 10 a 2000, particularmente de 100 a 1000, más particularmente de 400 a 700 unidades.

Lo más preferido es una cuadrícula con 400 a 700 unidades de forma cuadrada que tienen lados de aproximadamente

800 pm de longitud.

Las unidades cubren toda la superficie de la muestra.

La densidad de las células de interés puede expresarse como el número de dichas células de interés que se cuentan por unidad de área superficial de la muestra de tejido, por ejemplo, por mm2. La densidad de células de interés también puede consistir en el porcentaje de un subconjunto de células específico (p. ej., células T CD3+) por células totales o subpoblación de células total (establecido en 100%). La obtención, en la etapa g) del método, de más de un valor de cuantificación para cada marcador biológico que se utiliza permite un pronóstico de cáncer final o la predicción de una respuesta al tratamiento más exactos que cuando solo se determina un valor de cuantificación por marcador biológico.

La calidad de la tinción es un parámetro importante para la precisión de los resultados obtenidos, por lo que es importante comprobar la calidad de la tinción del corte de tejido.

Por tanto, el método comprende además una etapa e1. de comprobar la calidad de la tinción del corte de tejido.

La comprobación de la calidad de la tinción se implementa calculando, preferiblemente con el software adecuado, la distribución de la intensidad de la tinción de las células positivas detectadas para cada unidad y para la región tumoral total, que representa dicha distribución.

La media, mediana, mínima y máxima de la intensidad de tinción relevante (por ejemplo, marrón) de todas las células teñidas positivas detectadas en las regiones tumorales se pueden calcular y proporcionar para cada portaobjetos analizado.

Los valores y la distribución de la intensidad de la tinción se comparan con una referencia (intensidad de intervalo normal) determinada para cada marcador.

En la etapa de detección f., se cuenta el número de células positivas de cada unidad. Dado que se conoce la superficie de cada unidad, también se conoce la densidad de células positivas por unidad de superficie. La etapa f. la puede hacer un técnico experto, generalmente un médico, o puede implementarse mediante el software apropiado. El método permite cuantificar, en una muestra de tejido tumoral de un paciente, al menos un marcador biológico indicativo del estado de la reacción inmunitaria de dicho paciente frente al cáncer.

Según la descripción, el método anterior puede usarse para segregar pacientes en grupos de acuerdo con su supervivencia esperada o su respuesta a un tratamiento contra el cáncer. El valor anterior se puede comparar, para cada marcador biológico usado, con un valor de referencia predeterminado para el mismo marcador biológico; cuyo valor de referencia predeterminado se correlaciona con un pronóstico específico de progresión de dicho cáncer y/o supervivencia del paciente y/o respuesta a un tratamiento de cáncer ("paciente que responde bien" vs. "paciente que responde mal").

Los siguientes parámetros pueden usarse para cuantificar las células teñidas de cada unidad, para un marcador dado:

- número total de células teñidas

- densidad de células teñidas por unidad de superficie

- número total de células teñidas aisladas (sin contacto con otras células teñidas)

- número total de células teñidas dentro de un grupo de células teñidas (donde al menos 1 célula teñida está en contacto con un mínimo de 3 células teñidas).

En las condiciones preferidas para implementar la invención,

- se analiza cada región (CT e IM) de un tumor.

- se determina la densidad de células teñidas de cada unidad.

- se asigna un color a cada unidad de acuerdo con la densidad de células teñidas detectadas y de acuerdo con una gradación, por ejemplo, de verde a rojo (de la densidad mínima a la densidad máxima). Estas etapas se implementan preferiblemente mediante software apropiado.

Preferiblemente, la densidad de células teñidas en cada región tumoral (CT e IM) se determina mediante la densidad media de 1 a 1000 unidades, preferiblemente de 2 a 100 unidades, más preferiblemente de 3 a 10 unidades, lo más preferiblemente 3 unidades, que tienen densidad máxima. La selección de unidades que tienen la densidad máxima se implementa preferiblemente mediante software apropiado. Se obtiene un valor para cada una de las áreas CT e IM. Si los valores están por encima de un valor umbral, la muestra se considera positiva. Por lo tanto, para un solo marcador, son posibles cuatro posibilidades: CT+ e IM+, CT- e IM-, CT+ e IM-, CT- e IM+. Cuando se utilizan dos o más marcadores CD3, CD8, CD20, CD45RO y GZMB, son posibles las mismas posibilidades para el segundo marcador.

Los autores de la invención han descubierto que el método es fiable si el 30% o más, preferiblemente 40% o más de la superficie de una unidad considerada está llena de células.

Son posibles criterios distintos de la densidad media de varias unidades, basados preferiblemente en combinaciones de subcriterios de los grupos A, B y C

Grupo A

1. número máximo de células positivas (las células positivas se refieren a las células teñidas detectadas por el software)

2. densidad máxima de células positivas

3. suma del número de células positivas

4. suma de la superficie de células positivas

5. suma de las densidades de células positivas

6. número medio de células positivas

7. densidad media de células positivas

8. número máximo de células positivas

9. número mediano de células positivas

10. densidad mediana de células positivas

En el grupo A, se prefieren los criterios 2, 5, 7 y 10 porque tienen en cuenta la superficie del tejido analizado.

Grupo B

1. células positivas individuales

2. células positivas en grupos que contienen al menos 3 células positivas

3. células positivas individuales o grupos que contienen al menos 3 células positivas

4. todas las células positivas

5. las unidades más positivas, preferiblemente tres (3) unidades positivas

6. unidades aleatorias, preferiblemente tres (3) unidades aleatorias.

En el grupo B, se prefieren los criterios 4 y 5 porque el criterio tiene en cuenta todas las células positivas detectadas y reduce la heterogeneidad seleccionando las 3 unidades más teñidas. Por otro lado, utilizar de tres a cincuenta unidades aleatorias permite obtener resultados muy rápidos ya que este procedimiento puede evitar cuantificar todo el tumor. El resultado del análisis de un portaobjetos teñido es de 10 - 100 veces más rápido.

Grupo C

1. región tumoral CT

2. región tumoral IM

3. regiones tumorales CT e IM

En el grupo C, se prefiere el criterio 3: "regiones tumorales CT e IM" porque este método es el más poderoso para discriminar a los pacientes, y donde la relación de riesgo entre los grupos es la más alta.

Los ejemplos de combinaciones de dichos criterios incluyen, por ejemplo, para marcadores de células tales como CD3:

Otros ejemplos de combinaciones de dichos criterios en donde el subcriterio del grupo A es la mediana del número de células positivas incluyen, por ejemplo

1- número mediano de células positivas (células individuales o grupos que contienen al menos 3 células) en las unidades con una superficie de tejido mayor o igual a 40% de la superficie total de la unidad en las regiones tumorales CT e IM

2- número de células positivas (células individuales) en las unidades con una superficie de tejido mayor o igual a 40% de la superficie total de la unidad en las regiones tumorales CT e IM,

3- número mediano de células positivas (en grupos que contienen al menos 3 células) en las unidades con una superficie de tejido mayor o igual a 40% de la superficie total de la unidad en las regiones tumorales CT e IM, 4- mediana de la densidad de células positivas (células individuales o grupos que contienen al menos 3 células) en las unidades con una superficie de tejido mayor o igual a 40% de la superficie total de la unidad en las regiones tumorales CT e IM,

5- mediana de la suma del número de células positivas (células individuales o en grupos que contienen al menos 3 células) en las unidades con una superficie de tejido mayor o igual a 40% de la superficie total de la unidad en las regiones tumorales CT e IM,

6- mediana de la suma del número de células positivas (células individuales) en las unidades con una superficie de tejido mayor o igual a 40% de la superficie total de la unidad en las regiones tumorales CT e IM

7- mediana de la suma del número de células positivas (en grupos que contienen al menos 3 células) en las unidades con una superficie de tejido mayor o igual a 40% de la superficie total de la unidad en las regiones tumorales CT e IM

8- mediana de la suma de la densidad de células positivas (células individuales o en grupos que contienen al menos 3 células) en las unidades con una superficie de tejido mayor o igual a 40% de la superficie total de la unidad en las regiones tumorales CT e IM

9- mediana del número medio de células positivas (células individuales o en grupos que contienen al menos 3 células) en las unidades con una superficie de tejido mayor o igual a 40% de la superficie total de la unidad en las regiones tumorales CT e IM

10- mediana del número medio de células positivas (células individuales) en las unidades con una superficie de tejido mayor o igual a 40% de la superficie total de la unidad en las regiones tumorales CT e IM

Para cada una de las combinaciones de criterios anteriores y para cada marcador (p. ej., marcador CD3, CD4, CD8, CD20, CD45RO o GZMB), se determina un valor umbral que permite determinar si la muestra se considera positiva o negativa en este criterio.

Se determina un valor umbral, para cada marcador en cada región, para cada método. El valor umbral se determina usando una cohorte de pacientes con dicho cáncer, y considerando un umbral arbitrario, el umbral para el valor medio o mediano de la cohorte, o preferiblemente usando el valor p óptimo que discrimina a los pacientes, o la relación de riesgo óptima que discrimina a los pacientes, o el valor óptimo de iAUC que discrimina a los pacientes,

Para CD3, por ejemplo, los valores adecuados son aproximadamente:

Estos valores están sujetos a cambios en función de los ajustes de calibración del software utilizados tales como umbral de intensidad de señal o detección celular, y ajustes basados en el tipo de paciente analizado (tumor primario, metástasis, los estadios del cáncer I, II, III, IV, el tipo de tumor estudiado (colon, mama, pulmón, melanoma, etc.).

Cada valor umbral de referencia para cada marcador se puede predeterminar llevando a cabo un método que comprende las etapas de:

m) proporcionar al menos una colección de muestras de tejido tumoral seleccionadas del grupo que consiste en: i) una colección de muestras de tejido tumoral de pacientes con cáncer clasificados convencionalmente como Tis, o T1, o T2, o T3 o T4 y N0, o N1, o N2, o N3 y M0 o M1, que se hayan sometido a un tratamiento contra el cáncer y, posteriormente, no hayan tenido una recaída del cáncer o ninguna recurrencia del cáncer después del tratamiento contra el cáncer; ii) una colección de muestras de tejido tumoral de pacientes con cáncer clasificados convencionalmente como Tis, o T1, o T2, o T3 o T4 y N0, o N1, o N2, o N3 y M0 o M1, que se hayan sometido a un tratamiento contra el cáncer, y posteriormente hayan tenido recaídas o recurrencias del cáncer después del tratamiento contra el cáncer.

n) , cuantificar para cada muestra de tejido tumoral comprendida en una colección de muestras de tejido tumoral proporcionada en la etapa m), dicho marcador biológico, mediante lo cual se obtiene una colección de valores de cuantificación para dicho marcador biológico y para dicha colección de muestras de tejido tumoral;

o) calcular, a partir de dicha colección de valores de cuantificación obtenidos al final de la etapa n), el valor medio de cuantificación para dicho marcador biológico, con lo cual se obtiene un valor de referencia predeterminado para dicho marcador biológico que se correlaciona con un pronóstico de cáncer específico o una respuesta al tratamiento. El "tratamiento contra el cáncer" al que se hace referencia en la definición de la etapa m) anterior se refiere a cualquier tipo de terapia contra el cáncer a la que se hayan sometido los pacientes con cáncer previamente a la recogida de muestras de tejido tumoral, incluida radioterapia, quimioterapia, bioterapia, inmunoterapia y cirugía. p. ej. resección quirúrgica del tumor.

En vista de un valor de significación estadística mínimo, el valor de referencia umbral puede ser un intervalo de valores. Por ejemplo, en una escala hipotética de 1 a 10, si el umbral ideal es 5, un intervalo adecuado (de ejemplo) puede ser 4-6. Por tanto, se puede evaluar a un paciente comparando valores, donde los valores superiores a 5 indican, por ejemplo, un buen pronóstico y los valores inferiores a 5 indican, por ejemplo, un mal pronóstico; o se puede evaluar a un paciente comparando valores y comparando los valores con una escala, donde los valores por encima del intervalo de 4-6 indican, por ejemplo, un buen pronóstico y los valores por debajo del intervalo de 4-6 indican, por ejemplo, un mal pronóstico, indicando los valores dentro del intervalo de 4-6 un pronóstico intermedio.

En ciertas realizaciones preferidas de la etapa o) del método para determinar los valores umbral anteriores, dicha información relacionada con el resultado clínico real de los pacientes se selecciona del grupo que consiste en (i) la duración de la supervivencia sin enfermedad (SSE) y (ii) la supervivencia global (SG).

Para segregar a los pacientes en grupos de acuerdo con su supervivencia esperada, se prefiere la disponibilidad de un valor de referencia predeterminado para más de un marcador biológico. Por lo tanto, generalmente, se determinan uno o más valores de referencia predeterminados para una pluralidad de marcadores biológicos indicativos del estado de la respuesta inmunitaria contra el cáncer que se engloban en el presente documento, simplemente repitiendo uno cualquiera de los métodos para obtener valores de referencia predeterminados que se han descrito anteriormente, para la pluralidad de marcadores biológicos.

Un valor de referencia predeterminado preferido consiste en un valor de cuantificación mediano para el marcador biológico de interés que discrimina entre un mal pronóstico del cáncer y un buen pronóstico del cáncer.

La precisión de un valor de referencia predeterminado específico aumenta con el número de muestras de tejido que se utilizan para obtener valores de cuantificación para un marcador biológico específico y, por lo tanto, para calcular un valor medio (el valor de referencia predeterminado) que está asociado con un resultado del cáncer específico. Preferiblemente, con el fin de obtener valores de referencia predeterminados altamente relevantes para cada marcador biológico de interés, dichos valores de referencia predeterminados consisten en el valor medio de una pluralidad de valores de cuantificación de dicho marcador medidos en muestras de tejido procedentes de la misma pluralidad de pacientes con cáncer que experimentaron un resultado clínico específico.

Más preferiblemente, para evaluar valores de referencia predeterminados precisos, los valores de referencia están predeterminados a partir de al menos 50 valores de cuantificación, para un marcador biológico específico, utilizando por lo tanto muestras de tejido procedentes de al menos 50 pacientes con cáncer que han experimentado un resultado clínico malo o bueno específico, p. ej. SSE o SG de más de 5 años después del diagnóstico. En realizaciones preferidas, se obtiene un valor de referencia predeterminado de al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 o más valores de cuantificación para un marcador biológico específico.

Otras realizaciones para predeterminar un valor de referencia se describen en los documentos EP-A-EP1943520 y WO2007045996.

Un método más preferido de la invención es un método totalmente computarizado.

El método anterior se puede implementar de la siguiente manera:

Se prepara una muestra de tejido tumoral. La muestra de tejido tumoral se fija preferiblemente en formalina y se integra en un fijador rígido, tal como parafina (cera) o epoxi, que se pone en un molde y luego se endurece para producir un bloque que se corta fácilmente. Se preparan secciones finas de material utilizando un microtomo, se ponen en un portaobjetos de vidrio y se someten a inmunohistoquímica, por ejemplo, utilizando un equipo automatizado de IHC tal como BenchMark® XT, para obtener portaobjetos teñidos. Si se van a considerar varios marcadores, se preparan diferentes portaobjetos teñidos.

Cuando se ha evaluado el número o la densidad de células inmunitarias intratumorales de cada unidad de acuerdo con el método anterior, se selecciona una de las combinaciones de criterios anteriores y se obtiene un valor para el marcador o cada marcador. El valor obtenido se compara con el valor umbral/de referencia del marcador y de la combinación de criterios.

Si el valor obtenido está por encima del valor umbral/de referencia, al tumor se le asigna una marca tal como "+" o "alto", y si el valor obtenido está por debajo del valor umbral/de referencia, al tumor se le asigna una marca tal como "-" o "bajo".

Cuando se implementa el método anterior con un solo marcador y se consideran por separado el CT y el IM, el tumor y por lo tanto el paciente pueden ser alto/alto, alto/bajo, bajo/alto, bajo/bajo. Pueden obtenerse tres categorías de pacientes: "2 alto", "1 alto", "0 alto". En tal caso, puede obtenerse una puntuación inmunitaria (o Immunoscore) de 0 a 2.

Cuando se implementa el método anterior con dos marcadores y se considera (y preferiblemente) el CT o el IM, el tumor y, por lo tanto, el paciente también pueden ser alto/alto, alto/bajo, bajo/alto, bajo/bajo. Pueden obtenerse tres categorías de pacientes: "2 alto", "1 alto", "0 alto". También en tal caso, puede obtenerse una puntuación inmunitaria (o Immunoscore) de 0 a 2.

Cuando se implementa el método anterior con dos marcadores y se consideran por separado el CT y el IM, el tumor y por lo tanto el paciente pueden ser alto/alto/alto/alto, bajo/bajo/bajo/bajo, alto/alto/alto/bajo, alto/alto/bajo/bajo y alto/bajo/bajo/bajo. Para los tres últimos, la evaluación puede ser independiente del marcador y del área positiva CT o IM.

Se puede utilizar cualquier convenio. Por ejemplo, "+", "positivo", "alto", "alta" son equivalentes para evaluar el mismo resultado (muchas células teñidas).

En tal caso, una puntuación inmunitaria (o Immunoscore) en un intervalo de 0 a 4 se puede resumir de la siguiente manera:

Puntuación 4: Cuatro (4) evaluaciones "altas"

Puntuación 3: tres (3) evaluaciones "altas"

Puntuación 2: dos (2) evaluaciones "altas"

Puntuación 1: una (1) evaluación "alta"

Puntuación 0: Cero (0) evaluación "alta".

El método según la invención tiene propiedades ventajosas debido a su reproducibilidad, repetibilidad y la posibilidad de llevar a cabo el método en una práctica rutinaria.

El presente procedimiento permite obtener valores numéricos para todo el tumor si se desea, y no solo información limitada a micromatrices de tejido (TMA).

El alcance de la invención puede entenderse mejor con referencia a los ejemplos que se dan a continuación, cuyo objetivo es explicar las ventajas de la invención.

Un objeto de la presente invención también es un kit para implementar el método anterior que comprende un soporte que comprende valores umbral de referencia.

Otro objeto de la presente descripción es un ordenador provisto de un software para implementar el método anterior. Las condiciones preferidas para implementar los métodos descritos anteriormente también se aplican a los otros objetos de la invención contemplados anteriormente.

Descripción de los dibujos

La figura 1 representa una imagen de un corte de sección de tejido detectada en una imagen digital.

La Figura 2 muestra la imagen de un corte de sección de tejido de la Figura 1 dividida en áreas de propiedades similares, según uno o varios criterios.

La figura 3 es una imagen similar a la imagen 2 en donde se han definido el tumor y el margen invasivo del tumor. La figura 4 es una imagen que muestra tres áreas de la sección de tejido: tumor en la parte superior, tejido sano en la parte inferior y margen invasivo entre estas áreas.

La figura 5 muestra una cuadrícula de referencia de tamaño con unidades de forma cuadrada, adaptada al tamaño del tumor (tumor y margen invasivo) analizado. El tumor es gris y tiene forma de V.

La figura 6 es una imagen de una unidad típica. Los puntos negros corresponden a células teñidas, es decir, células que contienen el marcador.

La Figura 7 muestra una curva representativa que muestra la calidad de la tinción obtenida para una unidad de cuadrícula en función de la intensidad de la tinción marrón para todas las células positivas detectadas por el software.

La evaluación de la calidad de la tinción se implementa preferiblemente en todas las unidades de una sección de tejido.

La figura 8 es una imagen del tumor. Según el número de células teñidas en una unidad determinada, el software ha asignado un color más o menos oscuro.

La Figura 9 es una ampliación de una parte de la Figura 6, en donde las células teñidas (en negro) se muestran mejor.

La figura 10 es un diagrama de bloques de un sistema para llevar a cabo la invención.

Las figuras 11 y 12 son diagramas de flujo de programación que ilustran un ejemplo de un procedimiento para implementar etapas del método según la invención.

La Figura 13 ilustra el método de cuantificación del ejemplo 2 y particularmente una detección de células CD3+ en una sección de tumor (análisis de portaobjetos completo de un cáncer colorrectal). Dibujo superior: límites de la muestra de tejido, tumor y margen invasivo, a continuación, el dibujo de la sección de tejido se divide en tres áreas: Tumor en la parte superior derecha, tejido sano en la parte izquierda e inferior derecha y el área más clara el margen invasivo.

La Figura 14 ilustra el método de cuantificación del ejemplo 2 y particularmente una detección de células CD8+ en una sección de tumor (análisis de portaobjetos completo de un cáncer colorrectal). Dibujo superior: límites de la muestra de tejido, tumor y margen invasivo, a continuación, el dibujo de la sección de tejido se divide en tres áreas: Tumor en la parte superior derecha, tejido sano en la parte izquierda e inferior derecha y el área más clara el margen invasivo.

La Figura 15 ilustra un cálculo de un valor umbral óptimo de acuerdo con los valores p asociados para la supervivencia sin enfermedad (pruebas de rango logarítmico) y muestra los valores p frente a una densidad de 20 a 2000 células CD3+/mm2.

La Figura 16 ilustra histogramas para el porcentaje de distribución de la intensidad de tinción para CD3 y CD8 para diez unidades diferentes de un corte de tumor teñido.

Las Figuras 17-19 ilustran histogramas que representan el porcentaje de células positivas detectadas en las regiones tumorales de CT e IM con respecto a la intensidad de tinción de las células, después de la inmunotinción de CD3.

En la Figura 10 se muestra un procedimiento según la invención para obtener una imagen que muestra tres áreas de una sección de tejido de un tumor.

El procedimiento comienza en la etapa 10 "delimitación de los bordes del tejido" cuando se analiza una imagen digital de un portaobjetos para obtener los límites de la sección de tejido.

Luego, en la etapa 12 "segmentación de la muestra de tejido en áreas homogéneas", se analizan parámetros tales como el color del área, la intensidad de la contratinción, densidad del área para los núcleos, compacidad, vacío, densidad del tejido, granulosidad, forma, tamaño de los elementos detectados y área, o varios de estos parámetros, y la sección de tejido se divide en áreas homogéneas de propiedades similares según dichos parámetros. Por lo general, para una muestra de tejido que tiene una superficie de aproximadamente 1 -10 cm2, se obtienen de 100 a 10000 áreas, típicamente de 2000 a 4000 áreas homogéneas.

Luego, en la etapa 14 "delimitación del tumor", la computadora (o un experto, generalmente un médico), delimita digitalmente el tumor y el margen invasivo en vista del resultado de la etapa 12 teniendo en cuenta parámetros tales como el tamaño y morfología del núcleo celular, color del núcleo celular, etc. Cuando una persona experta implementa esta etapa, por ejemplo, puede usar el ratón del ordenador o un lápiz para el mismo.

Luego, en la etapa 16 "delimitación del centro del tumor y el margen invasivo", la sección de tejido se divide en tres áreas: tumor, tejido sano y margen invasivo. El software define un área intermedia denominada "margen invasivo" entre el tejido sano y el tumor, por ejemplo, 500 pm de ancho a cada lado del límite del tumor, por lo que tiene un ancho de 1 mm. De hecho, extensos estudios realizados por los autores de la invención han demostrado que una anchura de 1 mm era la más representativa del margen invasivo.

En la etapa 18 "provisión de una cuadrícula adaptada al tamaño del tumor", se crea una cuadrícula rectangular adaptada al tamaño del tumor y el margen invasivo. La cuadrícula rectangular está compuesta por unidades de forma cuadrada que tienen típicamente lados de 500 a 1000 pm de longitud, preferiblemente aproximadamente 800 pm.

En la etapa 20 "recuento de unidades de células teñidas unidad por unidad", las células teñidas se cuentan teniendo en cuenta parámetros tales como el color de las células, el tamaño esperado de una sola célula, la forma de las células o la intensidad de la tinción.

En la etapa 22 "división del número de células teñidas entre la superficie de la unidad", el número de células teñidas (positivas) se divide entre el área de la superficie de una unidad (por ejemplo, 0.6410-6 m2 para un cuadrado que tiene lados de 800 pm de longitud. Se obtiene así una densidad de células teñidas (positivas) por unidad de superficie.

En la etapa 24, "Asignación de color a cada unidad según la densidad de las células teñidas", el software asigna un color a cada unidad en función de la densidad, por ejemplo, de amarillo claro a rojo oscuro.

Como se mencionó anteriormente, este procedimiento se puede implementar por separado para cada marcador si se usa más de un marcador en el método. Por ejemplo, el procedimiento se implementa para las células CD3 y luego para las células CD8.

En la Figura 12 se muestra un procedimiento según la invención para segregar pacientes en grupos. En este ejemplo, se ha seleccionado la siguiente combinación de parámetros: A densidad media de células positivas, B Las tres unidades más teñidas y C Regiones tumorales CT e IM.

El procedimiento comienza en la etapa 30 "Detección de las 3 unidades más teñidas en el centro del tumor". "Centro del tumor" se utiliza en contraste con "margen del tumor". El software detecta las 3 unidades más teñidas (por ejemplo, las unidades de color rojo más oscuro) de acuerdo con los datos de la etapa 24 anterior.

En la etapa 32 "Cálculo de la densidad media de células positivas en el centro del tumor", se calcula la densidad media de células teñidas (positivas).

En la etapa 34 "Valor de referencia para la densidad media de células positivas en el centro del tumor", el valor umbral/de referencia es proporcionado por una base de datos que contiene el valor umbral/de referencia para dicha combinación de parámetros y dicho marcador. La base de datos comprende preferiblemente el valor umbral/de referencia para cada combinación de parámetros y cada marcador.

En la etapa 36 "Comparación de la densidad media de células positivas en el centro del tumor con el valor de referencia", el valor de la etapa 32 se compara con el valor umbral/de referencia de la etapa 34 y proporciona la información requerida. Si el valor de la etapa 32 está por encima del valor umbral/de referencia de la etapa 34, la muestra se considera "ALTA", por ejemplo, "BAJA" en el caso opuesto.

El procedimiento se implementa, por ejemplo, para dos marcadores y para las regiones tumorales CT e IM.

Se puede obtener una puntuación a partir de dicha información y se puede evaluar la supervivencia esperada de un paciente de forma fiable porque la intervención y valoración humana se limita al mínimo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Fabricación de portaobjetos teñidos de tejido tumoral

Se hicieron dos secciones de parafina de tejido de 4 micrómetros del bloque tumoral seleccionado y se depositaron en agua desionizada en portaobjetos de microscopio (portaobjetos Superfrost-plus) para inmunohistoquímica. Las secciones de tejido de parafina se secaron a temperatura ambiente y se incubaron en un horno a 56°C-58°C durante la noche.

Las inmunotinciones se realizaron con anticuerpos certificados IVD para CD3 y CD8 (CONFIRM CD3 (2GV6, Ventana) y CD8 (C8/144B; Dako)). El protocolo asociado contenía las etapas clave de bloqueo, recuperación de epítopos y detección. Se aplicó una hematoxilina de Mayer modificada destinada a teñir núcleos celulares en portaobjetos (Hematoxilina II, Ventana) para detectar de manera óptima las células teñidas con el software especializado. El protocolo utilizado con el equipo automatizado Benchmark XT (Roche-Ventana) fue:

CC1 es un tampón basado en tris con un pH ligeramente básico. El diluyente de anticuerpos primarios para CD8 fue K004 (Clinisciences).

Escaneo de portaobjetos teñidos de tejido tumoral para obtener imágenes digitales

Se realizó una digitalización de los portaobjetos en imagen digital con un escáner (NanoZoomer 2.0-HT, Hamamatsu) en un modo 20X. El formato de la imagen digital era compatible con el sistema de análisis de imágenes Definiens Developer XD. Para evitar colores no homogéneos en las imágenes escaneadas, se realizó una calibración para el balance de blancos, oscuro y brillante y para el sombreado.

Ejemplo 2: Análisis de portaobjetos teñidos mediante tratamiento de software

- Un patólogo ha cargado la imagen digital de cada inmunohistoquímica para CD3 y CD8 y comienza el análisis con un software de análisis de imágenes especializado (Definiens Developer XD)

- el procedimiento semiautomático contiene una etapa para:

- la detección automática del tejido,

- la segmentación automática del tejido en unidades,

- la eliminación manual de los artefactos (pliegues, desgarros, burbujas, ...),

- la selección manual del área tumoral por el patólogo, utilizando un pincel como herramienta digital,

- la detección automática del margen invasivo,

- la detección automática de las células teñidas en cada unidad del tumor,

- el análisis del gráfico para la distribución, la media y la mediana de las intensidades de tinción de las células positivas detectadas por el software, con el fin de validar la inmunotinción y la cuantificación de las células teñidas; este análisis se implementa en cada unidad, en todas las unidades de la sección de tejido,

- los valores y la distribución de las intensidades de tinción se comparan con un valor de referencia respectivamente para CD3 y CD8; si las intensidades de tinción tienen valores similares (el mismo valor más o menos aproximadamente 20%), la muestra de tejido se considera teñida con precisión; se da un ejemplo a continuación, - la identificación y validación de las tres unidades más infiltradas en cada región tumoral (CT e IM),

- el cálculo de la densidad media de las tres unidades más infiltradas en cada región tumoral.

Análisis IHC de CD3

Análisis IHC de CD8

Para determinar si el paciente es Alto o Bajo para cada marcador en cada región tumoral, se comparan las densidades medias de las 3 unidades más infiltradas con la densidad media del umbral óptimo, previamente definido en el estudio de la cohorte de referencia.

En la cohorte de referencia de cánceres colorrectales clínicamente localizados (estadio I-II de TNM de UICC), el umbral óptimo para discriminar a los pacientes para la supervivencia sin enfermedad es

Para el caso analizado, el tumor es

Alto/Alto para CD3

Alto/Alto para CD8

En consecuencia, el Immunoscore es I-4

Ejemplo 3: Ejemplo de cálculo de un valor umbral óptimo según los valores p asociados para la supervivencia sin enfermedad (pruebas de rango logarítmico)

Cálculo del valor p para la supervivencia sin enfermedad (pruebas de rango logarítmico)

Para cada valor de 20 a 2000 células CD3+/mm2, se determinó el número de pacientes (proporcionando así grupos de pacientes) que tenían una densidad de células CD3+ en el tumor (región CT) (puntos circulares en la curva inferior) menor que dicho valor.

Se calculó el valor de p para las pruebas de rango logarítmico que comparan grupos de pacientes para cada valor umbral de 20 a 2000 células CD3+/mm2 en el tumor (puntos circulares y curva correspondiente).

Los resultados se dan en la figura 15.

El eje X representa las densidades de células expresadas en células/mm2, el eje Y representa los valores P de rango logarítmico (puntos circulares y curva correspondiente en la parte inferior de la figura). También se representan la razón de riesgo (puntos cuadrados y curva correspondiente) y el índice de concordancia iAUC (curva fina).

Los pacientes se clasifican como "Bajo" (por debajo de un punto de corte determinado) y como "Alto" (por encima de este punto de corte). Se analizan valores entre 20 y 2000 células/mm2 en este ejemplo. Por ejemplo, para el valor de 100 células/mm2, los pacientes con menos de 100 células CD3+/mm2 están en el grupo "Bajo" y los pacientes con 100 o más células CD3+/mm2 están en el grupo "Alto". Se trazan las curvas de Kaplan Meier que comparan los pacientes Altos y Bajos, y se calcula el valor P del rango logarítmico (P = 0.01, en este ejemplo).

Los resultados muestran (véase la Fig. 15) que los valores entre 70 y 700 células/mm2 son significativos para CD3+ en el tumor (gráficos de círculos) (P <0.05). El umbral de valor P óptimo lo proporciona el valor correspondiente al valor P mínimo, que se encuentra en este ejemplo a 200 células/mm2. En consecuencia, el valor umbral óptimo se establece en 200 células/mm2.

Puede determinarse un valor umbral óptimo utilizando un enfoque similar para cada marcador en cada región tumoral, para valores distintos de la densidad de células positivas.

Ejemplo 4: Repetibilidad y reproducibilidad de la inmunohistoquímica

La repetibilidad y la reproducibilidad de la inmunohistoquímica de CD3 y CD8 se han estudiado de acuerdo con diferentes métodos. (criterio de las 3 unidades más teñidas).

Método de repetibilidad 1:

Se inmunotiñe un portaobjetos de un tumor (para CD3 o CD8) y se digitaliza con el escáner. La imagen digital es analizada 10 veces con el software de análisis de imágenes por un mismo operador (en otras palabras, 10 análisis de la misma inmunotinción son realizados por un mismo operador). Se determina el coeficiente de variación (CV). Resultados:

CD3;

El CV para la región CT es de 3.20%.

El CV para la región IM es de 7.11%.

El CV para el análisis del tumor (CT e IM) es de 5.16%.

CD8;

El CV para la región CT es de 1.88%.

El CV para la región IM es de 3.07%.

El CV para el análisis del tumor (CT e IM) es de 2.48%

Método de repetibilidad 2:

Se analizan cuatro muestras de tumores. Para cada muestra de tumor, se realizan cuatro portaobjetos adyacentes. Los portaobjetos se inmunotiñen (para CD3 o CD8) en el mismo experimento y se digitalizan con el escáner en un mismo análisis. Las imágenes digitales se analizan con el software de análisis de imágenes en un mismo análisis por un mismo operador. Se determina el coeficiente de variación (CV) para cada IHC (CD3 o CD8) entre portaobjetos adyacentes.

Resultados:

CD3; Tumor n° 1-4

El CV para la región CT es de 5.41%.

El CV para la región IM es de 10.59%.

El CV para el análisis del tumor (CT e IM) es de 8.00%.

CD8; Tumor n° 1-4

El CV para la región CT es de 8.73%.

El CV para la región IM es de 9.09%.

El CV para el análisis del tumor (CT e IM) es de 8.91%.

Método de reproducibilidad 1:

- Se analiza un portaobjetos de una muestra de tumor de una micromatriz de tejido (TMA). - El portaobjetos se inmunotiñe (para CD3 o CD8) y se digitaliza con un escáner. - Las imágenes digitales se analizan con el software de análisis de imágenes en 12 análisis para CD3 y 24 análisis por un mismo operador (en otras palabras, 12 análisis de la misma inmunotinción los realiza un mismo operador).

- Se determina el coeficiente de variación (CV).

Resultados:

CD3; El CV para la mancha de TMA es <1%.

CD8; El CV para la mancha de TMA es <1%.

Método de reproducibilidad 2:

- Se inmunotiñe un portaobjetos de una muestra de tumor (para CD3 o CD8) y se digitaliza con el escáner. La imagen digital es analizada 10 veces con el software de análisis de imágenes por dos operadores. Se determina el coeficiente de variación (CV) entre ambos operadores.

Resultados:

CD3;

El CV para la región CT es de 3.42%.

El CV para la región IM es de 7.03%.

El CV para el análisis del tumor (CT e IM) es de 5.23%.

CD8;

El CV para la región CT es de 2.72%.

El CV para la región de IM no es aplicable (no hay IM detectable).

El CV para el análisis del tumor (CT) es de 2.72%

Método de reproducibilidad 3:

- Se analizan dos muestras de tumor. Para cada muestra de tumor, se realizan 5 portaobjetos adyacentes (C1-C5). Los portaobjetos se inmunotiñen (CD3 y CD8) en diferentes análisis y se digitalizan en diferentes análisis. Las imágenes digitales son analizadas con el software de análisis de imágenes por dos operadores (operador n° 1 para los portaobjetos C1, C3 y C5; operador n° 2 para los portaobjetos C2 y C4). Se determina el coeficiente de variación (CV) para cada IHC (CD3 y CD8) entre ambos investigadores para portaobjetos adyacentes.

Resultados:

CD3;

El CV para la región CT es de 17.89%.

El CV para la región IM es de 5.37%.

El CV para el análisis del tumor (CT e IM) es de 11.68%.

CD8;

El CV para la región CT es de 14.90%.

El CV para la región IM es de 8.71%.

El CV para el análisis del tumor (CT e IM) es de 2.72%

Ejemplo 5: Ejemplos detallados de implementación del control de calidad de la inmunotinción para CD3 y CD8 Se seleccionaron aleatoriamente 10 unidades inmunoteñidas para CD3 y CD8 de acuerdo con el ejemplo 1. Se determinaron las intensidades medias de las unidades /- 1 DE.

Los valores medios obtenidos son: CD3: 239 /- 43 (intervalo: 282-196), CD8: 217 /- 44 (intervalo: 261-173). Dichos valores se consideran valores de referencia para validar la calidad de la inmunotinción de cada muestra de un paciente determinado. Los intervalos anteriores corresponden a una diferencia de más o menos 20% del valor medio de referencia. El experto en la técnica entiende que, por diversas razones, el umbral de tolerancia puede ampliarse (por ejemplo, más o menos 22% o 25%), o preferiblemente estrecharse (por ejemplo, más o menos 5%, 8%, 10%, 15%). Equipo 1

Se seleccionaron aleatoriamente 10 unidades inmunoteñidas para CD3 de acuerdo con el ejemplo 1. Se determinaron las intensidades medias de las unidades /- 1 DE. El resultado obtenido es: media = 234 /- 64. El histograma para la distribución de la intensidad de tinción para CD3 muestra que la intensidad de tinción de CD3 obtenida es cercana a la intensidad de tinción de referencia de CD3, dentro del intervalo: 282-196.

Por tanto, se considera que la muestra está correctamente inmunoteñida.

La densidad de células inmunitarias teñidas medida por el equipo 1: CT: 1795 células/mm2, IM: 2319 células/mm2 está validado.

Equipo 2

El mismo protocolo fue implementado por un segundo equipo que trabajó en el portaobjetos adyacente al portaobjetos examinado por el equipo 1.

El resultado obtenido es: media = 251 /- 56, dentro del intervalo: 282-196. En vista del valor de referencia anterior, la muestra se considera por lo tanto como correctamente inmunoteñida.

La densidad de células inmunitarias teñidas medida por el equipo 1: CT: 1665 células/mm2, IM: 2198 células/mm2 está validado.

Los valores de densidades de CD3 en las regiones tumorales [centro del tumor (CT) y el margen invasivo (IM)] obtenidos por el equipo 1 y el equipo 2 para los portaobjetos adyacentes son de hecho similares.

Equipo 3

El mismo protocolo fue implementado por un tercer equipo trabajando en el otro portaobjetos adyacente al portaobjetos examinado por el equipo 1. El resultado obtenido es: media = 148 /- 27. El histograma para la distribución de la intensidad de la tinción para CD3 muestra que la intensidad de la tinción de CD3 obtenida está alejada de la intensidad de la tinción de referencia de CD3 (fuera del intervalo: 282-196).

Por lo tanto, se considera que la muestra está inmunoteñida incorrectamente.

La densidad de células inmunitarias teñidas medida por el equipo 3: CT: 914 células/mm2, IM: 1707 células/mm2 no está validado.

Los resultados anteriores muestran que en ausencia de una referencia y de un control de calidad de la inmunotinción, se pueden obtener resultados muy diferentes e inexactos.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para evaluar un número o densidad de células inmunitarias en tejidos tumorales que comprende las etapas que consisten en:

a. proporcionar uno o más cortes inmunoteñidos de sección de tejido obtenido por un sistema automatizado de tinción de portaobjetos usando anticuerpos que se unen específicamente a marcadores expresados por células inmunitarias, b. proceder a la digitalización de los portaobjetos de la etapa a. mediante captura de barrido de alta resolución, mediante lo cual se obtiene una imagen digital de alta definición del portaobjetos a analizar,

c. detectar el corte de la sección de tejido en la imagen digital

d. analizar el corte de la sección de tejido para definir (i) un tumor (CT) y (ii) un margen invasivo del tumor (IM), e. proporcionar una cuadrícula de referencia de tamaño con unidades distribuidas uniformemente que tienen una misma superficie, estando dicha cuadrícula adaptada al tamaño del tumor a analizar,

e1. comprobar la calidad de la inmunotinción mediante:

- cálculo de la distribución de la intensidad de tinción de las células positivas detectadas para cada unidad de la cuadrícula y para la región tumoral total, que representa dicha distribución,

- para cada portaobjetos, cálculo de los valores medio, mediano, mínimo y máximo de la intensidad de tinción de todas las células teñidas positivas detectadas,

- comparación de los valores y la distribución de la intensidad de la tinción con una referencia de intensidad de intervalo normal determinada para cada marcador, y

f. detectar y cuantificar las células teñidas de cada unidad mediante lo cual se evalúa el número o la densidad de células inmunitarias teñidas de cada unidad.

2. El método según la reivindicación 1, en donde la detección y cuantificación de las células teñidas de cada unidad se implementa por separado en el tumor (CT) y el margen invasivo del tumor (IM).

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde los anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos específicos para marcadores CD3, CD4, CD8, CD20, CD45RO o GZMB.

4. El método según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se usan dos o tres anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en las siguientes combinaciones: CD3+CD8, CD3+CD45RO, CD3+CD20, CD3+GZMB, CD8+CD20, CD8+GZMB, CD8+CD45RO, CD20+GZMB, CD20+CD45RO, GZMB+CD45RO, CD4+CD8, CD4+CD45RO, CD4+GZMB, CD4+CD20, y todas las combinaciones de 3 marcadores entre los marcadores CD3, CD8, CD20, CD45RO, CD4 y GZMB.

5. El método según una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde se usa un equipo automatizado de IHC para implementar la etapa a).

6. El método según una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el análisis del corte de la sección de tejido para definir los límites de (i) el tumor (CT) y (ii) el margen invasivo del tumor (IM) se implementa mediante el software apropiado.

7. El método según una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde se usan unidades hexagonales, cuadradas o rectangulares que tienen una superficie de 1010-9 m2 a 1000 10-9 m2.

8. El método según una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el número o la densidad evaluados de células inmunitarias teñidas de cada unidad se selecciona de los valores del grupo A:

- número máximo de células teñidas

- densidad máxima de células teñidas

- suma del número de células teñidas

- suma de la superficie de células teñidas

- suma de las densidades de células teñidas

- número medio de células teñidas

- densidad media de células teñidas

- número máximo de células teñidas

- mediana del número de células teñidas.

9. El método según una de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además detectar células o unidades según un criterio del Grupo B que consiste en:

- células teñidas individuales

- células teñidas en grupos que contienen al menos 3 células teñidas

- células teñidas individuales o grupos que contienen al menos 3 células teñidas

- todas las células teñidas

- la mayoría de las unidades teñidas

- unidades aleatorias.