CN108136216B

CN108136216B - 对包含肿瘤组织的样品评分的方法

Info

Publication number: CN108136216B
Application number: CN201680062062.2A
Authority: CN
Inventors: 詹尼弗·波尔德奥克斯; 纳温·达卡帕加里; 泰·特兰; 布莱恩·利特尔; 金周荣
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2036-10-21
Also published as: AU2016341307A1; US11726092B2; AU2022224735A1; EP3365063C0; ES2979219T3; WO2017070585A1; JP2020201271A; JP2018534563A; JP6750009B2; EP3365063B1; US20190056404A1; EP3365063A4; US10705088B2; US20200292550A1; CN108136216A; AU2016341307B2; EP3365063A1; JP7119036B2; CN113671186A

Abstract

本发明部分涉及对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品进行评分的方法。该分值表示至少一对细胞之间的空间接近度，所述至少一对细胞的第一成员表达第一生物标志物，并且所述至少一对细胞的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物。从这些方法获得的分值可以指示患者可能会对免疫治疗积极应答的似然度。

Description

对包含肿瘤组织的样品评分的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2015年10月23日递交的美国临时专利申请No.62/245,858和于2015年11月24日递交的美国临时专利申请No.62/259,319的权益，所述两个申请的全部公开通过引用被结合于此。

背景技术

本发明总体涉及癌症治疗领域。

发明内容

本文在一个方面中公开了对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品进行评分的方法，包括：(i)使用包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品，确定表示至少一对细胞之间的空间接近度的分值，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；以及(ii)记录当与阈值比较时表示癌症患者会对免疫治疗积极应答的似然度的分值。在一些实施例中，至少一对细胞的第一成员包含肿瘤细胞，并且至少一对细胞的第二成员包含非肿瘤细胞。在一些实施例中，非肿瘤细胞包含免疫细胞。在一些实施例中，至少一对细胞的第一成员和第二成员包含免疫细胞。在一些实施例中，至少一对细胞的第一成员包含肿瘤细胞、骨髓细胞、或基质细胞，并且至少一对细胞的第二成员包含免疫细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞、骨髓细胞、或基质细胞表达PD-L1，且免疫细胞表达PD-1。在一些实施例中，空间接近度是在像素尺度上进行评估的。在一些实施例中，至少一对细胞之间的空间接近度在约1个像素至约100个像素的范围内。在一些实施例中，至少一对细胞之间的空间接近度在约0.5μm至约50μm的范围内。在一些实施例中，确定步骤包括：(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)针对每个选定的视野，将可归属于第一生物标志物的荧光信号扩大足以涵盖位于附近的表达第二生物标志物的细胞的裕度；以及(iii)将每个选定视野中表达第二生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成(arrive at)空间接近度分值。在一些实施例中，荧光标记中的每一者都是针对特定生物标志物的。在一些实施例中，多个荧光标记包括针对第一生物标志物的第一荧光标记和第二生物标志物的第二荧光标记。在一些实施例中，裕度在约1个像素至约100个像素的范围内。在一些实施例中，位于附近的表达第二生物标志物的细胞在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5至约50μm内。在一些实施例中，以像素为单位来测量第一总面积。在一些实施例中，标准化因数是每个选定视野中的所有非肿瘤细胞的第二总面积。在一些实施例中，标准化因数是每个选定视野中的具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的第二总面积。在一些实施例中，标准化因数是每个选定视野中的所有细胞的第二总面积。在一些实施例中，以像素为单位来测量第二总面积。在一些实施例中，预定因数是10⁴。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、以及它们的组合组成的组中的第一生物标志物，并且所述至少一对细胞的第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28以及它们的组合组成的组中的第二生物标志物。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达PD-L1并且所述至少一对细胞的第二成员表达PD-1。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达PD-L1，并且所述至少一对细胞的第二成员表达CD80。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达CTLA-4，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达CD80。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达PD-L2，并且所述至少一对细胞的第二成员表达PD-1。在一些实施例中，至少一对细胞的第一成员表达CTLA-4，至少一对细胞的第二成员表达CD86。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达LAG-3，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达HLA-DR。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达TIM-3，并且所述至少一对细胞的第二成员表达半乳凝素9。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达41BB，并且至少一对细胞的第二成员表达4.1BBL。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达OX40并且所述至少一对细胞的第二成员表达OX40L。在一些实施例中，至少一对细胞的第一成员表达CD40，至少一对细胞的第二成员表达CD40L。在一些实施例中，至少一对细胞的第一成员表达ICOS，至少一对细胞的第二成员表达ICOSL。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达GITR，并且所述至少一对细胞的第二成员表达GITRL。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达HLA-DR，并且所述至少一对细胞的第二成员表达TCR。在一些实施例中，阈值范围为约500至约5000。在一些实施例中，阈值为约900+/-100。在一些实施例中，免疫治疗包括免疫检查点疗法。在一些实施例中，与对第一生物标志物的表达进行定量估计或对第二生物标志物的表达进行定量估计相比，该方法提供了出色的预测能力。在一些实施例中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施例中，阳性预测值为65％或更高。在一些实施例中，阳性预测值为70％或更高。在一些实施例中，阳性预测值为75％或更高。在一些实施例中，阴性预测值为65％或更高。在一些实施例中，阴性预测值为80％或更高。

本文在另一方面公开了确定表示选自在能够从取自癌症患者的包含肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野中呈现的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的分值的方法，该方法包括：(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一特定生物标志物的细胞的视野；(ii)针对每个选定的视野，将可归属于第一特定生物标志物的荧光信号扩大足以涵盖位于附近的表达第二特定生物标志物的细胞的裕度；以及(iii)将每个选定视野中表达第二特定生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。在一些实施例中，荧光标记中的每一者都是针对特定生物标志物的。在一些实施例中，多个荧光标记包含针对第一生物标志物的第一荧光标记和针对第二生物标志物的第二荧光标记。在一些实施例中，一个或多个荧光标记包括与对特定生物标志物具有结合亲和性的抗体或另一抗体轭合的荧光团。在一些实施例中，每个荧光标记包含独立地选自由DAPI、

2、

3、

3,5、

5、FITC、TRITC、488染料、555染料、594染料、和德克萨斯红(Texas Red)组成的组中的一者或多者的荧光团。在一些实施例中，裕度在约1个像素至约100个像素的范围内。在一些实施例中，位于附近的表达第二特定生物标志物的细胞在表达第一特定生物标志物的细胞的质膜的约0.5至约50μm内。在一些实施例中，以像素为单位来测量第一总面积。在一些实施例中，标准化因数是每个选定视野中的所有非肿瘤细胞的第二总面积。在一些实施例中，标准化因数是每个选定视野中的具有表达第二特定生物标志物的能力的所有细胞的第二总面积。在一些实施例中，标准化因数是每个选定视野中的所有细胞的第二总面积。在一些实施例中，以像素为单位来测量第二总面积。在一些实施例中，预定因数是10⁴。在一些实施例中，空间接近度分值(SPS)由以下等式确定：

其中，A_I是总计相互作用面积(表达第二特定生物标志物且被可归属于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大荧光信号涵盖的细胞的总面积)，A_c是具有表达第二特定生物标志物的能力的细胞的总面积。在一些实施例中，与对第一生物标志物的表达进行定量估计或对第二生物标志物的表达进行定量估计相比，该方法提供了出色的预测能力。在一些实施例中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。在一些实施例中，阳性预测值为65％或更高。在一些实施例中，阳性预测值为70％或更高。在一些实施例中，阳性预测值为75％或更高。在一些实施例中，阴性预测值为65％或更高。在一些实施例中，阴性预测值为80％或更高。

在一些实施例中，第一特定生物标志物包括肿瘤和非肿瘤标志物，第二特定生物标志物包含非肿瘤标志物。

附图说明

图1示出了在制备用于成像和分析的组织样品中使用的抗体和检测试剂的概况的非限制性示例。

图2a示出了图像内的用DAPI检测到的所有细胞核的非限制性示例。

图2b示出了图2a的图像内的所有细胞的扩大(dilated)二元掩模的非限制性示例。

图3a示出了用488染料检测到的S100的图像的非限制性示例。

图3b示出了图3a内的所有肿瘤区域的二元掩模的非限制性示例。

图3c示出了图3a内的所有肿瘤细胞的掩模的非限制性示例。

图3d示出了图3a内的所有非肿瘤细胞的掩模的非限制性示例。

图4a示出了用

5检测到的PD-L1的图像的非限制性示例。

图4b示出了图4a内的所有PD-L1阳性细胞的二元掩模的非限制性示例。

图5a示出了用

3.5检测到的PD-1的图像的非限制性示例。

图5b示出了图5a内的所有PD-1阳性非肿瘤细胞的二元掩模的非限制性示例。

图6a示出了所有PD-L1-阳性细胞和最邻近的细胞的相互作用掩模的非限制性示例。

图6b示出了非常接近PD-L1阳性细胞的PD-1阳性细胞的相互作用区室(interaction compartment)的非限制性示例。

图7a示出了26名黑素瘤患者的相互作用分值的非限制性示例。

图7b示出了图7a的26位患者的最大相互作用分值的非限制性示例。

图8示出了基于整体切片成像来代替富集算法的分析结果。

图9示出了26名患者的相互作用分值与无进展生存期(progression freesurvival)的比较。注意：*指示未校正的对数秩检验(log-rank test)。

图10示出了PD-L1表达与患者的无进展生存期的比较。

图11示出了与PD-L1阳性细胞(红色)、PD-1阳性细胞(黄色)、所有肿瘤细胞(绿色)、和针对免疫治疗为阳性应答者的所有细胞(蓝色)相对应的荧光信号的掩模的非限制性示例。

图12示出了与PD-L1阳性细胞(红色)、PD-1阳性细胞(黄色)、所有肿瘤细胞(绿色)和针对免疫治疗为阴性应答者的所有细胞(蓝色)相对应的荧光信号的掩模的非限制性示例。

图13示出了38名非小细胞肺癌患者的代表性PD-1/PD-L1相互作用分值。

图14是根据示例性实施例的用于对包括肿瘤组织的样本进行评分的过程的流程图。

图15是根据第二示例性实施例的用于对包含肿瘤组织的样本进行评分的过程的流程图。

图16是根据示例性实施例的被配置为对包含从癌症患者采集的肿瘤组织的样本进行评分的控制器的框图。

图17是根据示例性实施例的用于对包含肿瘤组织的样本进行评分的图像处理步骤的流程图。

图18示出了使用22C3FDA批准的IHC测定法确定的PD-L1表达与患者的无进展生存期的比较。注：*指示p值是使用未校正的对数秩检验确定的。

图19a示出了来自另外34名黑素瘤患者的相互作用分值的非限制性示例。

图19b示出了图19a的患者的相互作用分值与无进展生存期的比较。

图19c示出了来自图7的患者和图19a的患者的相互作用分值。

图19d示出了图19c的患者的相互作用分值与无进展生存期的比较。注：*指示p值是通过使用未校正的对数秩检验确定的。

图19e示出了图19c的患者的相互作用分值与总生存期(OS)的比较。注：*指示p值是通过使用未校正的对数秩检验确定的。

图20示出了来自29名转移性黑素瘤患者的CTLA-4/CD80相互作用分值的非限制性示例。

图21示出了来自29名患有睾丸癌的患者的PD-1/PD-L1相互作用分值的非限制性示例。

具体实施例

下文描述各种实施例。应该注意的是，这些具体实施例并非旨在作为详尽的描述或作为对本文讨论的更广泛方面的限制。结合特定实施例描述的一个方面不一定限于该实施例并且可以用任何其他(一个或多个)实施例来实践。

如本文所使用的，“大约”将被本领域普通技术人员所理解并且将根据使用该术语的上下文而在一定程度上变化。如果存在对于本领域普通技术人员而言并不清楚的术语的使用，考虑到使用该术语的上下文，“大约”将意指高达特定术语的正负10％。

在描述元素的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)中，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则术语“一”、“一个”和“该”以及类似表达的使用将被解释为涵盖单数和复数。除非本文另有说明，否则本文中的值的范围的详述仅旨在用作单独参考落在范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值被并入到本说明书中，如同在本文中单独列举一样。除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明实施例，并且不对权利要求的范围构成限制。说明书中的语言不应被解释为将任何未要求保护的元素表示为对于本发明的实践是必需的。

术语“治疗”或“诊治”是指以达到统计学上明显的程度或达到本领域技术人员可检测的程度的量、方式或模式给予治疗来有效改善与疾病相关的状况、症状、或参数或预防疾病恶化。有效的量、方式或模式可以根据患者的不同而有所不同，并且可以根据患者进行量身定制。

本文在一个方面中公开了对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品进行评分的方法。

在一些实施例中，可以使用对特定生物标志物具有亲和性的多个荧光标记对样品染色。经染色的样品的数字图像可被获取，并且可基于荧光标记的位置来进一步对图像进行分析。可基于表达所关注的第一生物标志物的细胞的数目来区分视野的优先次序，而非进行全图像分析。然后可以针对荧光信号来对预定数目的视野进一步分析。在一些实施例中，使用四种不同类型的荧光标记来生成对应于所关注的第一生物标志物的荧光信号的图像和对应于所关注的第二生物标志物的荧光信号的图像以及对应于由所有细胞表达的生物标志物的荧光信号的图像和对应于由肿瘤细胞表达的生物标志物的荧光信号的图像。在另外的实施例中，操控荧光信号的图像以生成与图像内的细胞对应的荧光信号的一个或多个掩模。在一些实施例中，荧光信号的一个或多个掩模包括选自由以下各项组成的组的一项或多项：图像内所有细胞的掩模、图像内的所有肿瘤细胞的掩模、图像内的所有非肿瘤细胞的掩膜、图像内的表达所关注的第一生物标志物的所有细胞的掩膜、图像内的表达所关注的第二生物标志物的所有细胞的掩膜、以及表示表达图像内所关注的第一生物标志物的所有细胞以及位于附近的表达所关注的第二生物标志物的细胞的相互作用掩模。在又一实施例中，使用相互作用掩模来生成所有选定视野中位于表达所关注的第一生物标志物的细胞附近的表达所关注的第二生物标志物的细胞的相互作用区室。相互作用区室的总面积可以用于生成表示至少一对细胞之间的空间接近度的分值，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物。在一些实施例中，分值指示癌症患者会对免疫治疗积极应答的似然度的分值。在一些实施例中，与对所关注的第一生物标志物的表达进行定量估计或对所关注的第二生物标志物的表达进行定量估计相比，该方法提供了出色的预测能力。

因此，在一些实施例中，本文提供了对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品进行评分的方法，包括：(i)使用包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品，确定表示至少一对细胞之间的空间接近度的分值，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；以及(ii)记录当与阈值比较时表示癌症患者会对免疫治疗积极应答的似然度的分值。在一些实施例中，与对第一生物标志物的表达进行定量估计或对第二生物标志物的表达进行定量估计相比，该方法提供了出色的预测能力。

在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员包含肿瘤细胞，并且所述至少一对细胞的第二成员包含非肿瘤细胞。在一些实施例中，非肿瘤细胞是免疫细胞。在一些实施例中，非肿瘤细胞是基质细胞。

在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员和第二成员包含免疫细胞。

在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员包含肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞，并且所述至少一对细胞的第二成员包含免疫细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞表达PD-L1并且免疫细胞表达PD-1。

在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员包含肿瘤细胞，并且所述至少一对细胞的第二成员包含免疫细胞。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员包含骨髓细胞，并且所述至少一对细胞的第二成员包含免疫细胞。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员包含基质细胞，并且所述至少一对细胞的第二成员包含免疫细胞。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达PD-L1并且免疫细胞表达PD-1。

在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、及它们的组合组成的组中的第一生物标志物。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28、及它们的组合组成的组中的第二生物标志物。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、及它们的组合组成的组中的第一生物标志物，并且所述至少一对细胞的第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28、及它们的组合组成的组中的第二生物标志物。

在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达PD-L1，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达PD-1。在一些实施例中，至少一对细胞中的第一成员表达PD-L1，并且至少一对细胞中的第二成员表达CD80。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达CTLA-4，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达CD80。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达PD-L2，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达PD-1。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达CTLA-4，所述至少一对细胞中的第二成员表达CD86。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达LAG-3，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达HLA-DR。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达TIM-3，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达半乳凝素9。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达41BB，并且至少一对细胞中的第二成员表达4.1BBL。在一些实施例中，所述至少一对细胞的第一成员表达OX40，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达OX40L。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达CD40并且所述至少一对细胞中的第二成员表达CD40L。在一些实施例中，至少一对细胞的第一成员表达ICOS，并且所述至少一对细胞中的第二个成员表达ICOSL。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达GITR，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达GITRL。在一些实施例中，所述至少一对细胞中的第一成员表达HLA-DR，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达TCR。

在一些实施例中，被至少一对细胞的第一成员表达的第一生物标志物和被至少一对细胞的第二成员表达的第二生物标志物彼此相互作用。在一些实施例中，被至少一对细胞的第一成员表达的第一生物标志物和被至少一对细胞的第二成员表达的第二生物标志物彼此并没有相互作用。

在一些实施例中，至少一对细胞之间的空间接近度在约0.5μm至约50μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在2.5μm至约50μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在2.5μm至约45μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在2.5μm至约40μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在2.5μm至约35μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在2.5μm至约30μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在2.5μm至约25μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在2.5μm至约20μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在2.5μm至约15μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在5μm至约50μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在5μm至约45μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在5μm至约40μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在5μm至约35μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在5μm至约30μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在5μm至约25μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在5μm至约20μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度在5μm至约15μm的范围内。在一些实施例中，空间接近度约为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50μm。

在一些实施例中，至少一对细胞之间的空间接近度在约1个像素至约100个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约5个像素至约100个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度范围在约5个像素至约90个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约5个像素至约80个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约5个像素至约70个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约5个像素至约60个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约5个像素至约50个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约5个像素至约40个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约5个像素至约30个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约10个像素至约100个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约10个像素至约90个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约10个像素至约80个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约10个像素至约70个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约10个像素至约60个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约10个像素至约50个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约10个像素至约40个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度在约10个像素至约30个像素的范围内。在一些实施例中，空间接近度约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个像素。在一些实施例中，像素宽度为0.5μm。

在一些实施例中，确定步骤包括：(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)针对每个选定的视野，将可归属于第一生物标志物的荧光信号扩大足以涵盖位于附近的表达第二生物标志物的细胞的裕度；以及(iii)将每个选定视野中表达第二生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。

在一些实施例中，确定步骤包括：(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)针对每个选定的视野，将可归属于第一生物标志物的荧光信号扩大以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞；以及(iii)将每个选定视野中表达第二生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。

在一些实施例中，确定步骤包括：(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)针对每个选定的视野，将可归属于第一生物标志物的荧光信号扩大约1个像素至约100个像素范围的裕度以涵盖位于附近的表达第二生物标志物的细胞；以及(iii)将以像素为单位测得的每个选定视野中表达第二生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。

在一些实施例中，确定步骤包括：(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)针对每个选定的视野，将可归属于第一生物标志物的荧光信号扩大约1个像素至约100个像素范围的裕度以涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞；以及(iii)将以像素为单位测得的每个选定视野中表达第二生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。

在一些实施例中，在确定步骤中使用四种荧光标记，其中，每种荧光标记特定于不同生物标志物。在另外的实施例中，第一荧光标记与第一生物标志物相关联，第二荧光标记与第二生物标志物相关联，第三荧光标记与第三生物标志物相关联，并且第四荧光标记与第四生物标志物相关联。在一些实施例中，第一生物标志物包含肿瘤和非肿瘤标志物。在一些实施例中，第二生物标志物包含非肿瘤标志物。在一些实施例中，第一生物标志物包含肿瘤和非肿瘤标志物，并且第二生物标志物包含非肿瘤标志物。在一些实施例中，第三生物标志物被所有细胞表达。在一些实施例中，第四生物标志物仅在肿瘤细胞中被表达。在一些实施例中，第三生物标志物被所有细胞表达，并且第四生物标志物仅在肿瘤细胞中被表达。在一些实施例中，一个或多个荧光标记包括与对特定生物标志物具有结合亲和性的抗体或另一抗体轭合(conjugate)的荧光团。在一些实施例中，一个或多个荧光标记是对特定生物标志物具有亲和性的荧光团。

荧光团的示例包括但不限于荧光素(fluorescein)、6-FAM、罗丹明(rhodamine)、德克萨斯红(Texas Red)、加利福尼亚红(California Red)、iFluor594、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)、羧基罗丹明(carboxyrhodamine)、羧基罗丹明6F(carboxyrhodamine 6F)、羧基罗多明(carboxyrhodol)、羧基罗丹明110(carboxyrhodamine 110)、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素(coumarin)、

Cy-Chrome、

350、

405、

488、

549、

594、

633、

649、

680、

750、

800、藻红蛋白(phycoerythrin)、PerCP(多甲藻黄素-叶绿素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4'、5'-二氯-2'、7'-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6-)-羧基-X-罗丹明)、HEX、LuciferYellow、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa

350、Alex

430、Alexa

488、Alexa

532、Alexa

546、Alexa

568、Alexa

594、Alexa

633、Alexa

647、Alexa

660、Alexa

680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、

FL、

FL-Br2、

530/550、

558/568、

630/650、

650/665、

R6G、

TMR、

TR、OPAL^TM520、OPAL^TM540、OPAL^TM570、OPAL^TM620、OPAL^TM650、OPAL^TM690以及它们的组合。在一些实施例中，荧光团选自由DAPI、

2、

3、

3,5、

5、

7、FITC、TRITC、488染料、555染料、594染料、德克萨斯红和香豆素组成的组。488染料的示例包括但不限于Alexa

488、DyLight

和CF^TM488A。555染料的示例包括但不限于Alexa

555。594染料的示例包括但不限于Alexa

594。

本文所使用的“视野”是指组织样本的整个切片数字图像的一部分。在一些实施例中，整个切片图像具有2-200个预定视野。在一些实施例中，整个切片图像具有10-200个预定视野。在一些实施例中，整个切片图像具有30-200个预定视野。在一些实施例中，整个切片图像具有10-150个预定视野。在一些实施例中，整个切片图像具有10-100个预定视野。在一些实施例中，整个切片图像具有10-50个预定视野。在一些实施例中，整个切片图像具有10-40个预定视野。在一些实施例中，整个切片图像具有10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100(包括其中的增加数)个预定视野。

在一些实施例中，可归属于第一生物标志物的荧光信号被扩大约1个像素至约100个像素范围的裕度。在一些实施例中，裕度约5个像素至约100个像素。在一些实施例中，裕度约5个像素至约90个像素。在一些实施例中，裕度约5个像素至约80个像素。在一些实施例中，裕度约5个像素至约70像素。在一些实施例中，裕度约5个像素至约60个像素。在一些实施例中，裕度约5个像素至约50个像素。在一些实施例中，裕度约5个像素至约40个像素。在一些实施例中，裕度约5个像素至约30个像素。在一些实施例中，裕度约10个像素至约100像素。在一些实施例中，裕度约10个像素至约90个像素。在一些实施例中，裕度约10个像素至约80个像素。在一些实施例中，裕度约10个像素至约70个像素。在一些实施例中，裕度约10个像素至约60个像素。在一些实施例中，裕度约10个像素至约50个像素。在一些实施例中，裕度约10个像素至约40个像素。在一些实施例中，裕度约10个像素至约30个像素。在一些实施例中，裕度约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个像素。在一些实施例中，像素宽度为0.5μm。

在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约2.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约2.5μm至约45μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约2.5μm至约40μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约2.5μm至约35μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约2.5μm至约30μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约2.5μm至约25μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约2.5μm至约20μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约2.5μm至约15μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约5μm至约45μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约5μm至约40μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约5μm至约35μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约5μm至约30μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约5μm至约25μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约5μm至约20μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约5μm至约15μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，扩大可归属于第一生物标志物的荧光信号以涵盖位于附近的在表达第一生物标志物的细胞的质膜约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50μm内的表达第二生物标志物的细胞。在一些实施例中，位于附近的细胞上的第二生物标志物是与第一生物标志物直接接触的。

在一些实施例中，每个选定视野中表达第二生物标志物的所有细胞的第一总面积是以像素为单位测量的。

在一些实施例中，标准化因数是每个选定视野中所有非肿瘤细胞的第二总面积。在一些实施例中，第二总面积是以像素为单位测量的。在一些实施例中，第一总面积和第二总面积都是以像素为单位测量的。

在一些实施例中，标准化因数是每个选定视野中具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的第二总面积。在一些实施例中，第二总面积是以像素为单位测量的。在一些实施例中，第一总面积和第二总面积都是以像素为单位测量的。

在一些实施例中，标准化因数是每个所选视野中所有细胞的第二总面积。在一些实施例中，第二总面积是以像素为单位测量的。在一些实施例中，第一总面积和第二总面积都是以像素为单位测量的。

在一些实施例中，阈值分值约500至约5000。在一些实施例中，阈值分值约500至约4500。在一些实施例中，阈值分值约500至约4000。在一些实施例中，阈值分值约500至约3500。在一些实施例中，阈值分值约500至约3000。在一些实施例中，阈值分值约500至约2500。在一些实施例中，阈值分值约500至约2000。在一些实施例中，阈值分值约500至约1500。在一些实施例中，阈值分值约500至约1000。在一些实施例中，阈值分值约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、或5000，包括其中的增加数。在一些实施例中，阈值分值约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、或5000，包括其中的加或减100的增加数。

在一些实施例中，预定因数约10至约10⁵。在一些实施例中，预定因数约10²至约10⁵。在一些实施例中，预定因数约10³至约10⁵。在一些实施例中，预定因数约10⁴至约10⁵。在一些实施例中，预定因数约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或10⁵，包括其中的增加数。

在一些实施例中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或它们的组合。通过将对治疗有应答的具有高于阈值分值的分值的患者数量除以对治疗有应答的患者总数来计算阳性预测值。通过将对治疗无应答的具有低于阈值分值的分值的患者数量除以对治疗无应答的患者总数来计算阴性预测值。

在一些实施例中，阳性预测值大于60％。在一些实施例中，阳性预测值是65％或更大。在一些实施例中，阳性预测值是70％或更大。在一些实施例中，阳性预测值是75％或更大。在一些实施例中，阳性预测值是80％或更大。在一些实施例中，阳性预测值约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，包括其中的增加数。

在一些实施例中，阴性预测值是60％或更大。在一些实施例中，阴性预测值是65％或更大。在一些实施例中，阴性预测值是70％或更大。在一些实施例中，阴性预测值是75％或更大。在一些实施例中，阴性预测值是80％或更大。在一些实施例中，阴性预测值是约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，包括其中的增加数。

在本文公开的方法中，癌症患者是哺乳动物。在一些实施例中，哺乳动物是人类。在一些实施例中，哺乳动物并不是人类。在另外的实施例中，哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、或马。

在本文公开的方法中，肿瘤组织取自癌症患者。癌症的种类包括但不限于：循环系统的癌症，例如，心脏的癌症(肉瘤[血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤]、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)、纵隔膜和胸膜的癌症、以及其他胸内器官、血管肿瘤和肿瘤相关的血管组织的癌症；呼吸道(例如，鼻腔和中耳、副鼻窦、喉、气管、支气管和肺)的癌症，例如小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、支气管癌(鳞状细胞、未分化小细胞、未分化的大细胞、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、间皮瘤；消化系统的癌症，例如，食道的癌症(例如，鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、腹部的癌症(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胃的癌症、胰腺的癌症(导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤)、小肠的癌症(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、Kaposi's肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠的癌症(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道的癌症，例如，肾脏的癌症(腺癌、Wilm’s瘤[肾胚细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和/或尿道的癌症(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺的癌症(腺癌、肉瘤)、睾丸的癌症(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎瘤、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝脏的癌症，例如，肝细胞癌(肝细胞性肝癌)、胆管细胞型肝癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤、胰腺内分泌肿瘤(例如，嗜铬细胞瘤、胰岛瘤、血管活性肠肽肿瘤、胰岛细胞瘤和胰高血糖素瘤)；骨骼的癌症(例如，骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏(Ewing’s)肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)；神经系统的癌症，例如，中枢神经系统(CNS)的肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、头骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿瘤、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜的癌症(脑膜瘤、脑膜肉瘤、脑胶质瘤)、脑癌(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性成胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、成视网膜细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤；生殖系统的癌症，例如，妇科方面的癌症、子宫方面的癌症(子宫内膜癌)、宫颈方面的癌症(宫颈癌、宫颈癌前病变)、卵巢方面的癌症(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类的癌]、颗粒细胞肿瘤、睾丸间质细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴方面的癌症(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道方面的癌症(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤))、输卵管(癌)以及与女性生殖器官有关的其他部位的癌症；胎盘、阴茎、前列腺、睾丸、和其他与男性生殖器官相关的部位的癌症；血液系统的癌症，例如，血液方面的癌症(骨髓性白血病[急性和慢性]、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；口腔方面的癌症，例如唇、舌头、牙龈、口底、腭等口腔部位、腮腺以及唾液腺的其他部位、扁桃体、口咽、鼻咽、梨状窝、咽喉、以及唇、口腔和咽部的其他部位的癌症；皮肤的癌症，例如，恶性黑素瘤、皮肤黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、Karposi's肉瘤、痣异常增生痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、和瘢痕瘤；肾上腺的癌症：成神经细胞瘤；以及包括结缔组织和软组织的其他组织的癌症，腹膜后腔和腹膜的癌症，眼睛、眼内黑素瘤及附件的癌症，乳房、头和/或颈、肛门区的癌症，甲状腺、甲状旁腺、肾上腺和其他内分泌腺及相关结构的癌症，继发性和非特异性恶性淋巴结肿瘤、呼吸系统和消化系统的继发性恶性肿瘤以及其他部位的继发性恶性肿瘤，或它们的一种或多种组合。

免疫治疗的示例包括但不限于单克隆抗体(例如，阿仑单抗或曲妥单抗)、缀合单克隆抗体(例如，替伊莫单抗、本妥昔单抗(brentuximab vendotin)、或曲妥珠单抗抗体-药物偶联物)、双特异性单克隆抗体(博纳吐单抗)、免疫检查点抑制剂(例如，易普利姆玛(ipilimumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、尼鲁单抗(nivolumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、或杜瓦单抗(durvalumab))、沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、和咪喹莫特、以及它们的组合。在一些实施例中，免疫治疗包括免疫检查点疗法。

本文在另一方面公开了确定表示选自在能够从取自癌症患者的包含肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野中呈现的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的分值的方法，该方法包括：(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一特定生物标志物的细胞的视野；(ii)针对每个选定视野，将可归属于第一特定生物标志物的荧光信号扩大以涵盖位于附近的表达第二特定生物标志物的细胞；以及(iii)将每个选定视野中表达第二特定生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。在一些实施例中，与对第一特定生物标志物的表达进行定量估计或对第二特定生物标志物的表达进行定量估计相比，该方法提供了出色的预测能力。

本文在另一方面公开了确定表示选自在能够从取自癌症患者的包含肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野中呈现的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的分值的方法，该方法包括：(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)针对每个选定的视野，将可归属于第一生物标志物的荧光信号扩大以涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞；以及(iii)将每个选定视野中表达第二生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。在一些实施例中，与对第一特定生物标志物的表达进行定量估计或对第二特定生物标志物的表达进行定量估计相比，该方法提供了出色的预测能力。

本文在另一方面公开了确定表示选自在能够从取自癌症患者的包含肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野中呈现的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的分值的方法，该方法包括：(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)针对每个选定的视野，将可归属于第一生物标志物的荧光信号扩大约1个像素至约100个像素范围的裕度以涵盖位于附近的表达第二生物标志物的细胞；以及(iii)将以像素为单位测得的每个选定视野中表达第二生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。在一些实施例中，与对第一特定生物标志物的表达进行定量估计或对第二特定生物标志物的表达进行定量估计相比，该方法提供了出色的预测能力。

本文在另一方面公开了确定表示选自在能够从取自癌症患者的包含肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野中呈现的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的分值的方法，该方法包括：(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；(ii)针对每个选定的视野，将可归属于第一生物标志物的荧光信号扩大约1个像素至约100个像素范围的裕度以涵盖在表达第一生物标志物的细胞的质膜约0.5μm至约50μm内的表达第二生物标志物的细胞；以及(iii)将以像素为单位测得的每个选定视野中表达第二生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。在一些实施例中，与对第一特定生物标志物的表达进行定量估计或度第二特定生物标志物的表达进行定量估计相比，该方法提供了出色的预测能力。

在一些实施例中，空间接近度分值(SPS)由以下等式确定：

其中，A_I是总计相互作用面积(表达第二特定生物标志物且被归属于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大荧光信号涵盖的细胞的总面积)，且A_NT是非肿瘤细胞的总面积。

在一些实施例中，空间接近度分值(SPS)由以下等式确定：

其中，A_I是总计相互作用面积(表达第二特定生物标志物且被归属于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大荧光信号涵盖的细胞的总面积)，A_c是具有表达第二特定生物标志物的能力的细胞的总面积。

另一方面，对包括来自癌症患者的肿瘤组织的样品进行评分的方法被用于治疗患者的癌症的方法中。在一些实施例中，对包括来自癌症患者的肿瘤组织的样品进行评分的方法是在施加免疫治疗之前执行的。

在另一方面中，本文公开了治疗有需要的患者的癌症的方法，该方法包括：(a)对包含取自患者的肿瘤组织的样品进行评分，其包括(i)使用包含取自患者的肿瘤组织的样品，确定表示至少一对细胞之间的空间接近度的分值，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；以及(ii)记录该分值；(b)将该分值与阈值进行比较；以及(c)如果该分值在与阈值比较时表示癌症患者会对免疫治疗积极应答的似然度，则向患者施加免疫治疗。在一些实施例中，确定步骤如本文所述。

图14是描绘用于对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品进行评分的方法的一个实施例的步骤的流程图。在步骤1401中，获得图像数据，并且在步骤1402中，图像数据被解混，使得特定于各种类型的荧光信号的数据被分离到不同的信道。在步骤1403中，来自第一信道的数据被用来生成针对第一生物标志物为阳性的所有细胞的掩膜(第一生物标志物掩膜)。然后，扩大所有细胞的掩模(步骤1404)以生成表示在其中可以找到相互作用细胞(针对第二生物标志物为阳性)的预定接近度的扩大掩模。在一些实施例中，第一生物标志物掩模扩大1到100个像素之间的像素值。在步骤1405中，来自第二通道的数据被用来生成针对第二生物标志物为阳性的所有细胞的掩模(第二生物标志物掩模)。在步骤1406中，将第一生物标志物掩模和第二生物标志物掩模结合以生成标识在针对第一生物标志物为阳性的细胞的预定接近度内的针对第二生物标志物为阳性的细胞的相互作用掩模。在步骤1407中，基于相互作用掩模的面积来计算空间接近度分值。

图15是描绘用于对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品进行评分的方法的第二实施例的步骤的第二流程图。在步骤1501中，获取图像数据，并且在步骤1502中，将图像数据解混，使得特定于各种类型的荧光信号的数据被分离到不同的信道。在步骤1503中，来自第一信道的数据被用于生成视野中的所有细胞的掩模，并且在步骤1504中，来自第二通道的数据被用于生成视野中的亚组区域(例如，肿瘤区域)的掩模。在步骤1505中，将所有细胞的掩模与亚组区域掩模组合以生成亚组细胞的掩模和非亚组细胞的掩模。在一些实施例中，亚组细胞是肿瘤细胞，非亚组细胞是非肿瘤细胞。在步骤1506中，来自第三信道的数据被用来生成针对第一生物标志物为阳性的所有细胞的掩膜(第一生物标志物掩膜)。然后，扩大所有阳性细胞的掩膜(步骤1507)以生成表示在其中可以找到相互作用细胞(针对第二生物标志物为阳性)的预定接近度的扩大掩模。在一些实施例中，第一生物标志物掩模扩大1到100个像素之间的像素值。在步骤1508中，来自第四信道的数据被用来生成针对第二生物标志物为阳性的所有细胞的掩膜(第二生物标志物掩膜)。在步骤1509中，将扩大掩模和第二生物标记掩模结合以生成标识在针对第一生物标志物为阳性的细胞的预定接近度内的针对第二生物标志物为阳性的细胞的相互作用掩模。在步骤1510中，通过将相互作用掩模的面积除以能够针对第二生物标志物为阳性的所有细胞(亚组细胞)的面积或除以所有细胞的面积(如通过图15的流程图中的虚线所指示的对这二者中任一输入的使用)来计算空间接近度分值。在一些实施例中，能够针对第二生物标志物为阳性的细胞是肿瘤细胞或非肿瘤细胞。

在一些实施例中，亚组细胞和非亚组细胞分别对应于肿瘤细胞和非肿瘤细胞，反之亦然。在一些实施例中，亚组细胞和非亚组细胞分别对应于活细胞和非活细胞，反之亦然。在一些实施例中，亚组细胞是活细胞的亚组，并且非亚组细胞由未被包含在活细胞的亚组中的活细胞组成。在一些实施例中，亚组细胞和非亚组细胞分别对应于T细胞和非T细胞，反之亦然。在一些实施例中，亚组细胞和非亚组细胞分别对应于骨髓细胞和非骨髓细胞，反之亦然。

在一些实施例中，空间接近度分值表示一对细胞的靠近程度。在一些实施例中，通过使用基于围绕一对细胞中所选择的第一细胞的周长的边界逻辑、确定这对细胞的边界的交集、和/或通过确定这对细胞的重叠面积来籍由这对细胞的边界之间的接近度、这对细胞的质心之间的接近度来确定这对细胞的靠近程度。

在一些实施例中，空间接近度分值是与与样本的图像相关联的元数据相关联的、被包括在生成的报告中、被提供给操作员以确定免疫指令策略、被记录在数据库中、与患者的医疗记录相关联、和/或被显示在显示设备上。

在本文公开的方法中，根据示例性实施例，对数字图像的操纵可以通过包括诸如图16的框图中所示的控制器之类的控制器的计算系统来执行。控制器200被示出为包括通信接口202和处理电路204。通信接口202可以包括用于与各种系统、设备或网络进行数据通信的有线或无线接口(例如，插孔、天线、发射器、接收器、收发器、接线端子等)。例如，通信接口202可以包括用于经由基于以太网的通信网络来发送和接收数据的以太网卡和端口和/或用于经由无线通信网络进行通信的WiFi收发器。通信接口202可以被配置为经由局域网或广域网(例如，互联网、建筑物WAN等)进行通信并且可以使用各种通信协议(例如，BACnet、IP、LON等)。

通信接口202可以是被配置为促进控制器200与各种外部系统或设备(例如，成像设备102)之间的电子数据通信的网络接口。例如，控制器200可以从成像设备102接收用于选定视野的成像数据，以便进行数据的分析和空间接近度分值(SPS)的计算。

仍然参考图16，处理电路204被示出为包括处理器206和存储器208。处理器206可以是通用或专用处理器、专用集成电路(ASIC)、一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)、一组处理组件、或其他合适的处理组件。处理器506可以被配置为执行存储在存储器508中或从其他计算机可读介质(例如，CDROM、网络存储装置、远程服务器等)接收的计算机代码或指令。

存储器208可以包括用于存储用于完成和/或促进本公开中描述的各种过程的数据和/或计算机代码的一个或多个设备(例如，存储器单元、存储器设备、存储设备等)。存储器208可以包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、硬盘驱动器存储装置、临时存储装置、非易失性存储器、闪存、光存储器、或用于存储软件对象和/或计算机指令的任何其他合适的存储器。存储器208可以包括数据库组件、目标代码组件、脚本组件、或用于支持本公开中描述的各种活动和信息结构的任何其他类型的信息结构。存储器508可经由处理电路204可通信地连接到处理器206，并且可以包括用于运行(例如，通过处理器206来运行)本文描述的一个或多个过程的计算机代码。

仍然参考图16，控制器200被示出为接收来自成像设备102的输入。成像设备获取所有成像数据并将对其及描述其的所有元数据进行记录。成像设备然后将数据串行化成可由控制器200读取的流。数据流可容纳任何二进制数据流类型，例如，文件系统、RDBM、或直接TCP/IP通信。为了数据流的使用，控制器200被示出为包括光谱解混器210。光谱解混合器210可以从成像设备102接收图像数据，对该图像数据执行光谱解混以将呈现各种波长的图像解混到针对每个波段的单独的离散信道。例如，图像数据可被“解混”到针对被用来标识组织样本中所关注的细胞或蛋白质的各种荧光团中的每一者的单独的信道中。仅通过举例的方式，荧光团可以是由DAPI、

2、

3、

3,5、

5、FITC、TRITC、488染料、555染料、594染料、和德克萨斯红组成的组中的一者或多者。在一个示例中，信道之一可以包括落在围绕461nm的波长(针对DAPI的最大发射波长)的预定频带内的图像数据，以识别图像中的细胞核。其他信道可以包括不同波长的图像数据，以使用不同的荧光团来标识组织样本的不同部分。

控制器200还被示出为包括各种掩模器，例如细胞掩模器212、亚组区域掩模器216、第一生物标志物掩模器222、以及第二生物标志物掩模器224。在其他实施例中，这些掩模器或可以被包括在控制器200中的其他掩模器被用于从光谱解混器210接收经解混的信号并且根据用于标识组织样本中的某些所关注特征的荧光团来创建针对所关注的特定细胞或区域的掩模。为了创建掩模，掩模器(例如，细胞掩模器212、亚组区域掩模器216、第一生物标志物掩模器222、以及第二生物标志物掩模器224)接收与视野中的每个像素的强度有关的图像数据。像素强度与样品发射的荧光量成比例，荧光量又与样品中蛋白质生物标志物的量成比例(当使用荧光团来标识特定生物标志物时)。可以基于存在于图像像素中的值来设置绝对阈值。所有大于或等于阈值的像素将被映射为1.0或“有(on)”，并且所有其他像素将被映射为0.0或“无(off)”。通过这种方式，创建二元掩模来标识视野中所关注的细胞或组织部分。在其他实施例中，使用下限来创建掩模，其中，具有处于或高于下限的强度的所有像素被接受并用作掩模的像素值。如果强度低于下限，则将像素值设置为0.0或“无”。

在图17中所示的用于掩模的示例流程图中，示出了DAPI和488染料信道(分别用于标识细胞核和肿瘤区域)使用下限方案(步骤1710、步骤1712、步骤1720、步骤1722)来提供掩模输出，而Cy5和Cy3.5信道(用于标识生物标志物)使用的是阈值方案(步骤1730、1740)。与下限方案相关联的是还需要直方图步骤来确定下限。特别地，直方图阈值(步骤1712、步骤1722)产生输入图像的阈值，并使用浮动比例(sliding scale)来确定阈值出现的点。输入是当前图像和用户定义的阈值百分比。后者用于确定阈值级别应被设置在总强度的哪个百分比上。首先，每个像素的强度被相加至总强度。阈值百分比乘以该总强度以获得截断总和(cut-off sum)。最后，所有像素按照强度(直方图)分组，并将它们的强度从最低到最高(逐柱式地)相加，直到达到截断总和。该过程中访问的最后一个最高像素强度是当前图像的阈值。所有强度大于该值的像素其强度都被设置为最大，而其他所有像素都被设置为最小。

在图17中被标识为步骤1714、步骤1716、步骤1724、步骤1726、步骤1728、步骤1732、步骤1734、步骤1736、步骤1742、步骤1744的步骤表示在最初的掩模器(例如，细胞掩模器212、亚组区域掩模器216、第一生物标志物掩模器222、和第二生物标志物掩模器224)中出现的中间步骤。这些步骤定义如下：

扩大增加了图像中最亮的区域的面积。针对扩大需要两个输入。第一个是隐式的当前图像，第二个是要扩大的迭代的数目。假定只有二元图像用于第一输入。若该程序对连续图像进行操作，则输出不会是有效的扩大。扩大过程首先要找到图像中的最大像素强度。随后，图像中的每个像素都被检查一次。如果进行检查的像素的强度等于最大强度，则该像素将在输出图像中被绘制为具有迭代半径并以原始像素为中心的圆。该圆中的所有像素的强度都等于最大强度。所有的其他像素都将无需修改直接被复制到输出图像中。

填孔过程可用最大强度的像素填充图像的“空白”区域。这些空白区域是那些具有最小强度并且其像素面积(大小)是由用户指定的区域。当前图像和大小是所需的两个输入。如同扩大，该过程应仅被应用于二元图像。

腐蚀以与扩大相同的方式来处理图像。第一步中确定图像中的最小强度，只有与最低强度匹配的像素被更改，并且用最低强度值来填充用于放大所找到的最小强度像素的圆，除此之外，其余功能均与扩大相同。如同扩大，该过程应仅被应用于二元图像。

移除对象。预计有两个输入：当前图像和对象大小。移除对象与填孔过程相反。只包含最大强度的填充面积小于输入对象大小的像素的任何区域将会被设置为最小强度并因此被“移除”。该过程应仅被应用于二元图像；应用于连续图像可能会得不期望的结果。

在最后步骤1718、步骤1729、步骤1738、和步骤1746处的输出分别是所得到的细胞掩模、亚组区域掩模(或者，在该特定示例中是肿瘤区域掩模)、生物标志物1细胞掩模、和生物标志物2细胞掩模。图17进一步描绘了这些所得到的掩模的结合以计算空间接近度分值。下面参考图16中描绘的控制器200的结合掩模器来描述这些结合。

控制器200被示出为包括结合掩模器，例如，亚组细胞掩模器218、非亚组细胞掩模器220和相互作用掩模器230。亚组细胞掩模器执行与(And)操作(如图17中的步骤1752所示)以将细胞掩模器212的输出(表示图像中的所有细胞)与亚组区域掩模器216的输出结合。因此，亚组细胞掩模器生成图像中所有亚组细胞的掩模。在一些实施例中，亚组细胞是肿瘤细胞。使用了由非亚组细胞掩模器220执行的输出(out)操作(如图17中的步骤1754所示)的相同结合生成样本图像中所有非亚组细胞的掩模。在一些实施例中，非亚组细胞为非肿瘤细胞。

在与另一掩模结合之前，第一生物标志物掩模(来自第一生物标志物掩模器222)被扩大器226扩大。扩大掩模表示围绕那些表达第一生物标志物的细胞的区域，以便标识会在与表达第一生物标志物的细胞相互作用的恰当接近度内的表达第二生物标志物的细胞的空间。这由图17的步骤1756和1758表示。图17的流程图示出了扩大发生在1756和1758两个步骤中。当每个步骤中有最大迭代的限制时，在两个步骤中实现扩大可能是有必要的。例如，可能最多允许10次迭代(对应于10个像素的增加)，所以当需要增加20个像素时，扩大必须分成两个后续步骤。

在第二生物标志物掩模器224内，可以使用与(And)操作将生物标志物掩膜与上述非亚组掩膜结合(如图17的步骤1760所示)，以便生成针对第一生物标志物为阳性的所有非亚组细胞的掩模。然后，将该掩模在相互作用掩模器230处与来自扩大器226的扩大掩模结合(步骤1762)以生成相互作用掩模。相互作用掩模标识了针对第二生物标记物为阳性的并且同时也在相互作用区域内或与扩大掩模重叠的非亚组细胞。然后，这些被标识的细胞表示可以与针对第一生物标志物为阳性的细胞相互作用的细胞，从而实现更强的治疗应答。

为了计算空间接近度分值(SPS)，在面积评估器232处以像素为单位来确定相互作用掩模的面积。在一些实施例中，在面积评估器234处以像素为单位来确定能够表达第二生物标志物的所有细胞的面积。能够表达第二生物标志物的细胞可以是肿瘤细胞或非肿瘤细胞。在一些实施例中，在面积评估器234中以像素为单位来确定所有细胞的面积。在相互作用计算器236处通过将来自面积评估器232的面积除以来自面积评估器234的面积再乘以预定因数来确定相互作用或空间接近度分值。如上所述，在一个实施例中，相互作用计算器236运行的等式是：

其中，A_I是总计相互作用面积(表达第二特定生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的细胞的总面积)，A_C是具有表达第二特定生物标志物的能力的细胞的总面积或视野中所有细胞的总面积。

在二元与(AND)运算之后对And过程建模，但在重要方面有所不同。And接受当前图像和用户所选择的结果。输出是通过执行来自两个输入图像的匹配像素的标准化强度之间的乘法而创建的图像。在某些情况下，图像强度数据已被标准化。因此，And过程只是两个图像之间的逐像素式的乘法。Out所需的两个输入是当前图像和用户所选择的结果。根据公式A*(1-B/B_max)从第一图像中将第二图像去除，其中，A是当前图像，B是用户所选择要以去除的图像，B_max是B的最大强度。注意，B除以B_max将B标准化。

示例

示例1。对来自人类患者的黑素瘤组织样品进行的样品制备、成像、以及成像分析

样品制备。对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品脱蜡。然后，切片在蒸馏水中温育之前通过一系列二甲苯再水合，再用酒精清洗。然后在升高的压力和温度条件下进行热诱导的抗原修复，随后使其冷却并将其转移至Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲盐水中。接着进行染色，其中进行以下步骤。首先，在与蛋白封闭剂一起温育之前，阻断内源性过氧化物酶以减少非特异性抗体染色。接下来，用鼠抗PD1一抗(primary antibody)来对切片染色。然后，切片在用抗鼠HRP二抗(secondary antibody)进行温育之前要先被清洗。在切片被清洗之后使用

3.5(珀金埃尔默)来检测PD-1染色。然后通过含有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼进行两次清洗来淬灭任何残留的HRP。在用兔抗PD-L1一抗进行染色之前再次清洗切片。在切片被清洗之后，利用抗兔HRP二抗与用488染料和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)直接标记的鼠抗S100的混合物进行温育。再次清洗切片之后使用

5(珀金埃尔默)来检测PD-L1染色。最后一次对切片进行清洗，随后将具有封固剂的盖玻片盖在切片上并在室温下干燥过夜。图1示出了抗体和检测试剂的示意性概述。可选地，用抗CD8一抗来代替抗PD1一抗来对切片染色。

样品成像与分析。然后，使用Vectra 2智能切片分析系统(使用Vectra软件版本2.0.8(珀金埃尔默))来获取荧光图像。首先，使用DAPI以4倍(4x)放大率对切片进行单色成像。使用(利用inForm开发的)自动算法来辨识切片中含有组织的区域。

针对与DAPI(蓝色)、FITC(绿色)、和

5(红色)相关联的信道，所辨识的含有组织的切片区域以4x放大率成像以创建RGB图像。这些4x放大率的图像使用视野选择器104中的(利用inForm开发的)自动富集算法来处理，以根据最高的

5表达来辨识和排列可能的20x放大率的视野。

在DAPI、FITC、德克萨斯红、和

5波长的20x放大率下对最大的40个视野进行成像。对原始图像的可接受性进行检查，并且在分析之前排除未聚焦、不存在任何肿瘤细胞、高度坏死、或包含与预期抗体定位(即，背景染色)高度不相关的荧光信号的图像。使用AQUAduct(珀金埃尔默)来处理所接受的图像，其中，每个荧光团通过光谱解混器210在光谱上被解混到单个信道并被保存为单独的文件。

使用AQUAnalysis^TM或通过使用了AQUAserve^TM的全自动过程来进一步分析所处理的文件。详情如下。

由细胞掩模器212处理每个DAPI图像以辨识该图像(图2a)内的所有细胞核，然后将该图像扩大3个像素以表示整个细胞的大致尺寸。所得到的掩模表示该图像内的所有细胞(图2b)。

通过肿瘤掩模器216来处理用488染料检测到的S100(黑素瘤的肿瘤细胞标志物)(图3a)以创建该图像内所有肿瘤区域的二元掩膜(图3b)。该掩模与所有细胞的掩模之间的重叠通过使用肿瘤细胞掩模器218来创建针对肿瘤细胞的新的掩模(图3c)。

类似地，肿瘤细胞标志物的缺失与所有细胞核的掩膜的结合创建了针对所有非肿瘤细胞的新的掩膜(图3d)，该过程是由非肿瘤细胞掩膜器220执行的。

每个

5图像(图4a)都是通过第一生物标志物掩模器222处理的并且与所有细胞的掩模重叠，以创建为PD-L1阳性的所有细胞的二元掩模(图4b)。用所有细胞的掩模来重叠生物标志物掩模消除了在掩模中可能被错误地标识为生物标志物阳性细胞的噪声像素。

每个

3.5图像(图5a)通过第二生物标志物掩模器224进行处理，以创建PD-1阳性细胞的二元掩模并与所有非肿瘤细胞的掩膜重叠以创建为PD-1阳性的非肿瘤细胞的二元掩膜(图5b)。用所有非肿瘤细胞的掩模来重叠生物标志物掩模消除了在掩模中可能被错误地标识为生物标志物阳性细胞的噪声像素。

使用第二扩大器226来扩大所有PD-L1阳性细胞的二元掩模以创建涵盖最近邻的细胞(例如，具有PD-1的细胞)的相互作用掩膜(图6a)。通过使用相互作用掩模器230将该相互作用掩膜与所有PD-1阳性的非肿瘤细胞的二元掩模结合，以创建非常接近PD-L1阳性细胞以使得PD-1可能与PD-L1相互作用的PD-1阳性细胞的相互作用区室(图6b)。

在面积评估器232、234中分别计算针对相互作用区室的所有可接受的区域(高达40个视野)的总面积和非肿瘤细胞的总面积。通过使用相互作用计算器236将来自相互作用区室的所有可接受视野的总面积除以非肿瘤细胞的总面积再乘以因数10000，以创建表示每个样本的相互作用分值的完整的数。PD-L1和PD-1测量结果具有高重现性(分别为R²＝0.98和0.97)。在归档临床样本(n＝53)中可观察到较广的PD-L1和PD-1表达和相互作用分值的范围。在用nivolumab(n＝5)或pembrolizumab(n＝21)治疗的26名晚期黑素瘤患者群体中，发现PD-1/PD-L1相互作用分值能够将应答者与无应答者区分开(p＝0.01)，但是单独PD-L1(p＝0.07)或单独CD8(p＝0.23)却不行。此外，表现出较高PD-1/PD-L1相互作用分值的患者的应答率更高(82％比20％，p＝0.01)。与具有较低PD-1/PD-L1相互作用分值的患者相比，具有较高PD-1/PD-L1相互作用分值的患者经历的无进展生存期更长(p＝0.059)，死亡率更低(22％比58％)。这些结果表明，与单独PD-L1表达相比，这种对组织样本进行评分以获得PD-1/PD-L1相互作用分值的方法提供了出色的预测能力(82％阳性预测值，80％阴性预测值)。

在图7A中示出了26名患者的代表性分值。基于这些数据，选择阈值为800-900来指示对治疗应答的似然度。

可选地，针对每个个体视野计算相互作用分值，并且在图7b中示出每个患者的最大分值。基于最大分值，选择阈值1900来表示对治疗应答的似然度。

为了评估富集算法对相互作用分值的影响，使用整体切片成像来代替富集算法执行上述过程(见图8)。当执行整体切片成像时，对抗PD1治疗应答的患者与未应答的患者之间不再有统计学上明显的差异。因此，通过这种分析无法确定阈值。

将相互作用分值与患者的无进展生存期(PFS)进行比较(图9)。至少为803的相互作用分值呈现出与生存期良好的相关性。值得注意的是，PD-L1表达与改进的PFS无关(图10)。

图11和图12示出了指示PD-L1阳性细胞(红色)、PD-L-阳性细胞(黄色)、肿瘤细胞(S100，绿色)、和所有细胞(DAPI，蓝色)的重叠掩模的代表性示例。对于免疫治疗的阳性应答者，图11中的掩模很容易地指示出PD-L1阳性细胞(红色)、PD-1阳性细胞(黄色)、和所有肿瘤细胞(绿色)的存在。相反，对于免疫治疗的阴性应答者，图12中的掩模指示肿瘤细胞(S100，绿色)和所有细胞(DAPI，蓝色)的存在，但几乎不指示PD-L1阳性细胞(红色)或PD-1阳性细胞(黄色)的存在。图11表示值为2176的相互作用分值(对免疫疗法的完全应答)。图12表示值为8的相互作用分值(对免疫疗法无应答)。

还使用FDA批准的方法来评估组织样品，以用抗PD-L1抗体克隆22C3来测出非小细胞肺癌中的PD-L1，但目前尚未用于黑素瘤组织样品。将PD-L1表达与患者PFS进行比较并被示于图18中。与本文所述的使用相互作用分值的方法相比，该方法并没有表现出统计学上相关的诊断值。

对34名另外的转移性黑素瘤患者的检验群体进行检查并获取PD-1/PD-L1相互作用分值(见图19a)。这些相互作用分值也与患者的无进展存活期(PFS)进行比较(图19b)。尽管没有统计学上的意义(p＝0.19)，但该比较表明PD-1/PD-L1相互作用分值较高的患者具有较长的PFS的趋势。由于这些疗法在临床上的使用相对近期，统计学上的显著性可能会受到限制，因此限制了这些患者的随访时间。

在图19c-图19e中示出了针对26名早期患者群体与34名检验患者群体的组合的PD-1/PD-L1相互作用分值以及这些分值与患者PFS或患者总生存期(OS)的比较。组合的分析清楚地指示出具有较高PD-1/PD-L1的患者表现出对抗PD-1治疗的更佳的应答。

示例2对来自人类患者的非小细胞肺癌组织样品进行的样品制备、成像、以及成像分析

执行与示例1类似的过程，其中，用488染料直接标记的鼠抗泛细胞角蛋白(mouseanti-pan cytokeratin)来取代用488染料直接标记的鼠抗S100以用于上皮肿瘤样品。38个样品的相互作用分值在图13中示出。

示例3。对具有表达PD-L1的细胞和表达CD80的细胞的组织样品进行的样品制备、成像、以及成像分析

样品制备。对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品脱蜡、再水合并在升高的温度条件下进行抗原修复。然后进行染色，随后执行以下步骤。首先，使用

(高级细胞诊断)，利用20对跨越约1kb的CTLA-4mRNA的杂交探针对组织进行CTLA-4表达检测。用TSA-

3观察原位杂交。清洗切片，然后通过含有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼进行两次清洗来淬灭任何残留的HRP。在用鼠抗CD80一抗进行染色之前再次清洗切片。在切片被清洗之后用抗鼠HRP二抗进行温育。清洗切片，然后使用TSA-

5(珀金埃尔默)来检测CD80染色。然后通过含有50mM过氧化氢的新鲜的100mM苯甲酰肼对切片进行两次清洗来淬灭任何残留的HRP。再次清洗切片之后使用兔抗CD3一抗来染色。清洗切片，然后用抗兔HRP二抗与4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物进行温育。清洗切片，然后使用TSA-

(Life Technologies)来检测CD3染色。最后一次对切片进行清洗，随后将具有封固剂的盖玻片盖在切片上并在室温下干燥过夜。

执行与示例1类似的成像和分析过程，成像是针对DAPI、FITC、

3和

5波长进行的。使用CTLA-4和CD80的表达来开发用于获取20x图像的富集算法。执行分析以通过测量CD80阳性细胞的接近度内的CTLA-4和CD3阳性细胞的总面积(以像素为单位)除以CD3阳性细胞的总面积(以像素为单位)再乘以因数10000来确定CTLA-4/CD80相互作用分值。结果在图20中示出。

示例4。对具有表达CTLA-4的细胞和表达CD80的细胞的组织样品进行的样品制备、成像、以及成像分析。

执行与示例1类似的过程，用CTLA-4和CD80的染色和分析来取代PD-L1和PD-1的染色和分析。

示例5。对具有表达PD-L2的细胞和表达PD-1的细胞的组织样品进行的样品制备、成像和成像分析。

执行与示例1类似的过程，用PD-L2的染色和分析来取代PD-L1的染色和分析。

示例6。对具有表达CTLA-4的细胞和表达CD86的细胞的组织样品进行的样品制备、成像和成像分析。

执行与示例1类似的过程，用CTLA-4和CD86的染色和分析来取代PD-L1和PD-1的染色和分析。

示例7。对具有表达LAG-3的细胞和表达HLA-DR的细胞的组织样品进行的样品制备、成像和成像分析。

执行与示例1类似的过程，用LAG-3和HLA-DR的染色和分析来取代PD-L1和PD-1的染色和分析。

示例8。对具有表达TIM-3的细胞和表达半乳凝素9的细胞的组织样品进行的样品制备、成像和成像分析。

执行与示例1类似的过程，用TIM-3和半乳凝素9的染色和分析来取代PD-L1和PD-1的染色和分析。

示例9。对具有表达41BB的细胞和表达4.1BBL的细胞的组织样品进行的样品制备、成像和成像分析。

执行与示例1类似的过程，用41BB和4.1BBL的染色和分析来取代PD-L1和PD-1的染色和分析。

示例10。对具有表达OX40的细胞和表达OX40L的细胞的组织样品进行的样品制备、成像和成像分析。

执行与示例1类似的过程，用OX40和OX40L的染色和分析来取代PD-L1和PD-1的染色和分析。

示例11。对具有表达CD40的细胞和表达CD40L的细胞的组织样品进行的样品制备、成像和成像分析。

执行与示例1类似的过程，用CD40和CD40L的染色和分析来取缔取代PD-L1和PD-1的染色和分析。

示例12。对具有表达ICOS的细胞和表达ICOSL的细胞的组织样品进行的样品制备、成像和成像分析。

执行与示例1类似的过程，用ICOS和ICOSL的染色和分析来取代PD-L1和PD-1的染色和分析。

示例13。对具有表达GITR的细胞和表达GITRL的细胞的组织样品进行的样品制备、成像和成像分析。

执行与示例1类似的过程，用GITR和GITRL的染色和分析来取代PD-L1和PD-1的染色和分析。

示例14。对具有表达HLA-DR的细胞和表达TCR的细胞的组织样品进行的样品制备、成像和成像分析。

执行与示例1类似的过程，用HLA-DR和TCR的染色和分析来取代PD-L1和PD-1的染色和分析。

示例15。对具有表达PD-1、PD-L1、和CD3的细胞的组织样品进行的样品制备、成像、以及成像分析

执行与示例1类似的过程，其中，该过程是在没有鼠抗S100抗体的情况下进行的。替代地，在PD-L1检测之后，通过微波来去除一抗和二抗。然后用兔抗CD3一抗对切片进行染色。清洗切片，然后利用抗兔HRP二抗和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物进行温育。清洗切片，然后使用TSA-AlexaFluor488(Life Technologies)来检测CD3染色。成像和分析的执行类似于示例1，其中，通过将PD-L1阳性区域中的PD-1阳性细胞的面积(以像素为单位)除以所有有核细胞的面积(以像素为单位)再乘以因数10000来计算空间接近度(例如，相互作用分值)。29个样品的相互作用分值在图21中示出。

段落A。一种对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品进行评分的方法，包括：

(i)使用包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品，确定表示至少一对细胞之间的空间接近度的分值，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于第一生物标志物的第二生物标志物；以及

(ii)记录当与阈值比较时表示癌症患者会对免疫治疗积极应答的似然度的分值。

段落B。根据段落A所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员包含肿瘤细胞，并且所述至少一对细胞的第二成员包含非肿瘤细胞。

段落C。根据段落A或段落B所述的方法，其中，非肿瘤细胞包含免疫细胞。

段落D。根据段落A所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员和第二成员包含免疫细胞。

段落E。根据段落A所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员包含肿瘤细胞、骨髓细胞、或基质细胞，并且所述至少一对细胞的第二成员包含免疫细胞。

段落F。根据段落E所述的方法，其中，肿瘤细胞、骨髓细胞、或基质细胞表达PD-L1，且免疫细胞表达PD-1。

段落G。根据段落A-段落F中任一段所述的方法，其中，空间接近度是在像素尺度上进行评估的。

段落H。根据段落A-段落G中任一段所述的方法，其中，至少一对细胞之间的空间接近度在约1个像素至约100个像素的范围内。

段落I。根据段落A-段落F中任一段所述的方法，其中，至少一对细胞之间的空间接近度在约0.5μm至约50μm的范围内。

段落J。根据段落A所述的方法，确定步骤还包括：

(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一生物标志物的细胞的视野；

(ii)针对每个选定视野，将可归属于第一生物标志物的荧光信号扩大足以涵盖位于附近的表达第二生物标志物的细胞的裕度；以及

(iii)将每个选定视野中表达第二生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。

段落K。根据段落J所述的方法，其中，荧光标记中的每一者都是针对特定生物标志物的。

段落L。根据段落J或段落K所述的方法，其中，多个荧光标记包括针对第一生物标志物的第一荧光标记和针对第二生物标志物的第二荧光标记。

段落M。根据段落J-段落L中任一段所述的方法，其中，裕度在约1个像素至约100个像素的范围内。

段落N。根据段落J-段落M中任一段所述的方法，其中，位于附近的表达第二生物标志物的细胞在表达第一生物标志物的细胞的质膜的约0.5至约50μm内。

段落O。根据段落J-段落N中任一段所述的方法，其中，以像素为单位来测量第一总面积。

段落P。根据段落J-段落O中任一段所述的方法，其中，标准化因数是每个选定视野中的所有非肿瘤细胞的第二总面积。

段落Q。根据段落J-段落O中任一段所述的方法，其中，标准化因数是每个选定视野的具有表达第二生物标志物的能力的所有细胞的第二总面积。

段落R。根据段落P或段落Q所述的方法，其中，以像素为单位来测量第二总面积。

段落S。根据段落J-段落R中任一段所述的方法，其中，预定因数是10⁴。

段落T。根据段落A所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、以及它们的组合组成的组中的第一生物标志物，并且所述至少一对细胞的第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28以及它们的组合组成的组中的第二生物标志物。

段落U。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达PD-L1并且所述至少一对细胞的第二成员表达PD-1。

段落V。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达PD-L1，并且所述至少一对细胞的第二成员表达CD80。

段落W。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达CTLA-4，并且所述至少一对细胞的第二成员表达CD80。

段落X。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达PD-L2，并且所述至少一对细胞的第二成员表达PD-1。

段落Y。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达CTLA-4，并且所述至少一对细胞的第二成员表达CD86。

段落Z。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达LAG-3，并且所述至少一对细胞的第二成员表达HLA-DR。

段落AA。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达TIM-3，并且所述至少一对细胞的第二成员表达半乳凝素9。

段落AB。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达41BB，并且至少一对细胞的第二成员表达4.1BBL。

段落AC。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达OX40并且所述至少一对细胞的第二成员表达OX40L。

段落AD。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达CD40，并且所述至少一对细胞的第二成员表达CD40L。

段落AE。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达ICOS，并且所述至少一对细胞的第二成员表达ICOSL。

段落AF。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达GITR，并且所述至少一对细胞的第二成员表达GITRL。

段落AG。根据段落T所述的方法，其中，所述至少一对细胞的第一成员表达HLA-DR，并且所述至少一对细胞的第二成员表达TCR。

段落AH。根据段落A-段落AG中任一段所述的方法，其中，阈值范围为约500至约5000。

段落AI。根据段落AH所述的方法，其中，阈值为约900加或减100。

段落AJ。根据段落A-段落AI中任一段所述的方法，其中，免疫治疗包括免疫检查点疗法。

段落AK。一种确定表示选自在能够从取自癌症患者的包含肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野中呈现的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的分值的方法，该方法包括：

(i)选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一特定生物标志物的细胞的视野；

(ii)针对每个选定视野，将可归属于第一特定生物标志物的荧光信号扩大足以涵盖位于附近的表达第二特定生物标志物的细胞的裕度；以及

(iii)将每个选定视野中表达第二特定生物标志物且被涵盖在可归属于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值。

段落AL。根据段落AK所述的方法，其中，荧光标记中的每一者都是针对特定生物标志物的。

段落AM。根据段落AK或段落AL所述的方法，其中，多个荧光标记包含针对所述第一生物标志物的第一荧光标记和针对所述第二生物标志物的第二荧光标记。

段落AN。根据段落AK-段落AM中任一段所述的方法，其中，一个或多个荧光标记包括与对特定生物标志物具有结合亲和性的抗体或另一抗体轭合的荧光团。

段落AO。根据段落AK-段落AM中任一段所述的方法，其中，每个荧光标记包含独立地选自由DAPI、

2、

3、

3,5、

5、FITC、TRITC、488染料、555染料、594染料、和Texas Red组成的组中的一者或多者的荧光团。

段落AP。根据段落AK-段落AO中任一段所述的方法，其中，裕度在约1个像素至约100个像素的范围内。

段落AQ。根据段落AK-段落AP中任一段所述的方法，其中，位于附近的表达第二特定生物标志物的细胞在表达第一特定生物标志物的细胞的质膜的约0.5至约50μm内。

段落AR。根据段落AK-段落AQ中任一段所述的方法，其中，以像素为单位来测量第一总面积。

段落AS。根据段落AK-段落AP中任一段所述的方法，其中，标准化因数是每个选定视野中的所有非肿瘤细胞的第二总面积。

段落AT。根据段落AK-段落AP中任一段所述的方法，其中，标准化因数是每个选定视野的具有表达第二特定生物标志物的能力的所有细胞的第二总面积。

段落AU。根据段落AS或段落AT所述的方法，其中，以像素为单位来测量第二总面积。

段落AV。根据段落AK-段落AU中任一段所述的方法，其中，预定因数是10⁴。

段落AW。根据段落AK所述的方法，其中，空间接近度分值(SPS)由以下等式确定：

其中，A_I是总计相互作用面积(表达第二特定生物标志物且被可归属于表达第一特定生物标志物的细胞的扩大荧光信号涵盖的细胞的总面积)，A_c是具有表达第二特定生物标志物的能力的细胞的总面积。

段落AX。根据段落AK所述的方法，其中，第一特定生物标志物包含肿瘤和非肿瘤标志物，并且第二特定生物标志物包含非肿瘤标志物。

段落AY。根据段落A所述的方法，其中，与对第一生物标志物的表达进行定量估计或对第二生物标志物的表达进行定量估计相比，该方法提供了出色的预测能力。

段落AZ。根据段落AK所述的方法，其中，与对第一特定生物标志物的表达进行定量估计或对第二特定生物标志物的表达进行定量估计相比，该方法提供了出色的预测能力。

段落BA。根据段落AY或段落AZ所述的方法，其中，预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。

段落BB。根据段落BA所述的方法，其中，阳性预测值为65％或更高。

段落BC。根据段落BB所述的方法，其中，阳性预测值为70％或更高。

段落BD。根据段落BC所述的方法，其中，阳性预测值为75％或更高。

段落BE。根据段落BA所述的方法，其中，阴性预测值为65％或更高。

段落BF。根据段落BE所述的方法，其中，阴性预测值为80％或更高。

虽然已经示出并描述了特定实施例，应当明白的是可以根据本领域普通技术在其中进行修改和变更，而不脱离如在所附权利要求中定义的其较宽方面中的技术。

本文的示例性描述的实施例可以适宜地在不存在本文未详细公开的任意一个或多个要素，一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当可扩展并且非限制性地理解。另外，本文采用的术语和表达作为说明并且非限制性的术语使用，并且在这种术语和表达的使用中不意图排除所显示和描述的特征或其一部分的任意等价物，但应知道在所要求保护的技术的范围内多种修改是可能的。另外，短语“基本上由……组成”将被解释为包括具体叙述的那些要素以及不实质影响本发明要求保护的技术的基本和新特性的另外的要素。短语“由……组成”排除未具体叙述的任意要素。

本公开不限制于本申请中描述的特定实施例的方面。对本领域技术人员显而易见的是，可以进行多种修改和变化而不脱离其精神和范围。除本文列举的那些之外，本公开的范围内的功能上等价的方法和组合物根据以上说明将对于本领域技术人员是显而易见的。这种修改和变化意图落入所附权利要求的范围内。本公开仅由所附权利要求的方面，连同这些权利要求给出的全部等价范围来限定。应该明白的是该公开不限定于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物学系统，其当然可以变化。还应该明白的是本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不旨在是限定性的。

此外，在公开的特征或方面是以马库什(Markush)组的方式描述的情况下，本领域技术人员明白该公开从而也以马库什组的任何单独的成员或成员的子组的方式描述。

本领域技术人员明白的是，用于任何和所有目的，尤其是在提供书写描述的方面，本文公开的所有范围也包括任何和所有可能的子范围和其子范围的组合。任意列出的范围可以容易地被认为是足以描述并实现被分成至少两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等的相同范围。作为非限制性示例，本文公开的每个范围可以容易地被分成下面的三分之一、中间的三分之一和上面的三分之一。如本领域技术人员也将明白的是，所有语言如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所叙述的数目并且是指可以如上所述随后被分成子范围的范围。最终，如本领域技术人员将明白的是，范围包括每个单独的成员。

本说明书中所引用的所有出版物、专利申请和授权专利和其他文件通过引用并入本文，如同明确单独地指示每个单独出版物、专利申请、授权专利或其他文件通过引用整体并入本文。在本公开内容的定义与通过引用并入的文本所包含的定义矛盾的情况下，以本公开内容为准。

其他实施例在所附权利要求中给出。

Claims

1.一种计算机可读介质，其上存储有程序指令，当所述程序指令被处理器执行时，实现一种对包含取自癌症患者的肿瘤组织的样品进行评分的方法，包括：

（i）使用包含取自所述癌症患者的肿瘤组织的所述样品，确定表示至少一对细胞之间的空间接近度的分值，所述至少一对细胞中的第一成员表达第一生物标志物，并且所述至少一对细胞中的第二成员表达不同于所述第一生物标志物的第二生物标志物；以及

（ii）记录当与阈值比较时表示所述癌症患者会对免疫治疗积极应答的似然度的所述分值；

其中，所述确定步骤包括：

（a）选择能够从取自所述癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的所述样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达所述第一生物标志物的细胞的视野；

（b）针对每个所选择的视野，将归属于所述第一生物标志物的荧光信号扩大足以涵盖位于附近的表达所述第二生物标志物的细胞的裕度；以及

（c）将每个所选择的视野中表达所述第二生物标志物且被涵盖在能够归属于表达所述第一生物标志物的所述细胞的所述扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值,

其中，所述步骤（b）包括：

（i）生成针对所述第一生物标志物为阳性的所有细胞的掩膜；和

（ii）扩大针对所述第一生物标志物为阳性的所有细胞的所述掩膜以生成表示在其中可以找到针对所述第二生物标志物为阳性相互作用细胞的预定接近度的扩大掩模。

2.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞中的所述第一成员包含肿瘤细胞，并且所述至少一对细胞中的所述第二成员包含非肿瘤细胞。

3.根据权利要求2所述的计算机可读介质，其中，所述非肿瘤细胞包含免疫细胞。

4.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员和所述第二成员包含免疫细胞。

5.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员包含肿瘤细胞、骨髓细胞或基质细胞，并且所述至少一对细胞的所述第二成员包含免疫细胞。

6.根据权利要求5所述的计算机可读介质，其中，所述肿瘤细胞、所述骨髓细胞或所述基质细胞表达PD-L1，并且所述免疫细胞表达PD-1。

7.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述空间接近度是在像素尺度上进行评估的。

8.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞之间的所述空间接近度在1个像素至100个像素的范围内。

9.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞之间的所述空间接近度在0.5μm至50μm的范围内。

10.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述荧光标记中的每一者都是针对特定生物标志物的。

11.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述多个荧光标记包括针对所述第一生物标志物的第一荧光标记和针对所述第二生物标志物的第二荧光标记。

12.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述裕度在1个像素至100个像素的范围内。

13.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，位于附近的表达所述第二生物标志物的所述细胞在表达所述第一生物标志物的所述细胞的质膜的0.5至50μm内。

14.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述第一总面积是以像素为单位测量的。

15.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述标准化因数是每个所选择的视野中的所有非肿瘤细胞的第二总面积。

16.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述标准化因数是每个所选择的视野中具有表达所述第二生物标志物的能力的所有细胞的第二总面积。

17.根据权利要求15所述的计算机可读介质，其中，所述第二总面积是以像素为单位测量的。

18.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述预定因数是10⁴。

19.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达选自由PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HLA-DR、半乳凝素9、CD80、CD86、4.1BBL、ICOSL、CD40、OX40L、IDO-1、GITRL、以及它们的组合组成的组中的第一生物标志物，并且所述至少一对细胞中的所述第二成员表达选自由PD-1、TIM3、LAG3、41BB、OX40、CTLA-4、CD40L、CD28、GITR、ICOS、CD28以及它们的组合组成的组中的第二生物标志物。

20.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达PD-L1并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达PD-1。

21.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达PD-L1，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达CD80。

22.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达CTLA-4，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达CD80。

23.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达PD-L2，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达PD-1。

24.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达CTLA-4，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达CD86。

25.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达LAG-3，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达HLA-DR。

26.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达TIM-3，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达半乳凝素9。

27.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达41BB，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达4.1BBL。

28.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达OX40，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达OX40L。

29.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达CD40，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达CD40L。

30.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达ICOS，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达ICOSL。

31.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达GITR，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达GITRL。

32.根据权利要求19所述的计算机可读介质，其中，所述至少一对细胞的所述第一成员表达HLA-DR，并且所述至少一对细胞的所述第二成员表达TCR。

33.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述阈值范围为500至5000。

34.根据权利要求33所述的计算机可读介质，其中，所述阈值为900加或减100。

35.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述免疫治疗包括免疫检查点疗法。

36.根据权利要求1所述的计算机可读介质，其中，所述方法与对所述第一生物标志物的表达进行定量估计或对所述第二生物标志物的表达进行定量估计相比提供了出色的预测能力。

37.根据权利要求36所述的计算机可读介质，其中，所述预测能力被量化为阳性预测值、阴性预测值或其组合。

38.根据权利要求37所述的计算机可读介质，其中，所述阳性预测值为65％或更高。

39.根据权利要求38所述的计算机可读介质，其中，所述阳性预测值为70％或更高。

40.根据权利要求39所述的计算机可读介质，其中，所述阳性预测值为75％或更高。

41.根据权利要求37所述的计算机可读介质，其中，所述阴性预测值是65％或更高。

42.根据权利要求41所述的计算机可读介质，其中，所述阴性预测值是80％或更高。

43.一种计算机可读介质，其上存储有程序指令，当所述程序指令被处理器执行时，实现一种确定表示选自在能够从取自癌症患者的包含肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野中呈现的多个细胞中的至少一对细胞之间的空间接近度的分值的方法，所述方法包括：

（i）选择能够从取自癌症患者的包含用多个荧光标记染色的肿瘤组织的样品中获得的预定数量的视野，该选择偏向于选择相比其他视野包含更多数量的表达第一特定生物标志物的细胞的视野；

（ii）针对每个所选择的视野，将归属于所述第一特定生物标志物的荧光信号扩大足以涵盖位于附近的表达第二特定生物标志物的细胞的裕度；以及

（iii）将每个所选择的视野中表达所述第二特定生物标志物且被涵盖在归属于表达所述第一特定生物标志物的所述细胞的扩大荧光信号内的所有细胞的第一总面积除以标准化因数，再将所得到的商乘以预定因数来达成空间接近度分值；

其中，步骤（ii）包括：

（a）生成针对所述第一特定生物标志物为阳性的所有细胞的掩膜；和

（b）扩大针对所述第一特定生物标志物为阳性的所有细胞的所述掩膜以生成表示在其中可以找到针对第二特定生物标志物为阳性相互作用细胞的预定接近度的扩大掩模。

44.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，所述荧光标记中的每一者都是针对特定生物标志物的。

45.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，所述多个荧光标记包含针对所述第一特定生物标志物的第一荧光标记和针对所述第二特定生物标志物的第二荧光标记。

46.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，一个或多个荧光标记包括与对特定生物标志物具有结合亲和性的抗体或另一抗体轭合的荧光团。

47.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，每个荧光标记包含独立地选自由DAPI、Cy®2、Cy®3、Cy®3,5、Cy®5、FITC、TRITC、488染料、555染料、594染料、和Texas Red组成的组中的一者或多者的荧光团。

48.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，所述裕度在1个像素至100个像素的范围内。

49.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，位于附近的表达所述第二特定生物标志物的所述细胞在表达所述第一特定生物标志物的所述细胞的质膜的0.5至50μm内。

50.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，所述第一总面积是以像素为单位测量的。

51.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，所述标准化因数是每个所选择的视野中的所有非肿瘤细胞的第二总面积。

52.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，所述标准化因数是每个所选择的视野中具有表达所述第二特定生物标志物的能力的所有细胞的第二总面积。

53.根据权利要求51所述的计算机可读介质，其中，所述第二总面积是以像素为单位测量的。

54.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，所述预定因数是10⁴。

55.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，所述空间邻近分值SPS由以下等式确定：

其中，A_I是总计相互作用面积，其为表达所述第二特定生物标志物且被归属于表达所述第一特定生物标志物的细胞的扩大荧光信号涵盖的细胞的总面积，A_c是具有表达所述第二特定生物标志物的能力的细胞的总面积。

56.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，所述第一特定生物标志物包含肿瘤和非肿瘤标志物，并且所述第二特定生物标志物包含非肿瘤标志物。

57.根据权利要求43所述的计算机可读介质，其中，所述方法与对所述第一特定生物标志物的表达进行定量估计或对所述第二特定生物标志物的表达进行定量估计相比提供了出色的预测能力。