CN110243921B - 一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，包括如下内容：先采集组织表面的脂质分子并保持其原位信息；再借助于激光解吸/电离质谱平台，在无基质参与的情况下获取组织表面的脂质分子特征指纹谱图；再基于组织表面的脂质特征指纹谱图，结合统计分析方法建立多种肿瘤的判别模型，对肿瘤组织与正常组织、各种肿瘤组织的亚型进行判定；最后结合质谱成像技术实现无切片情况下的组织分子数字成像，用于判别肿瘤边界；本发明实现快速、高效、高准确率的临床组织鉴定、肿瘤亚型判别和肿瘤边界成像，提高检测通量，增加组织表面的脂质分子信息的稳定性和在肿瘤组织鉴别中的差异性维度。

Description

一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法
技术领域
本发明涉及临床组织精准分子活检的技术领域，具体涉及一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)是当今社会危害中国乃至全世界人民生命健康的重要杀手之一。每年在全世界范围内的恶性肿瘤发生病例超过1400万，因恶性肿瘤相关原因引发的死亡病例超过800万，在中国平均每天约有1万人被确诊为癌症，致死率超过心脏病和脑血管病这两大疾病。对于大多数罹患恶性实体瘤的病人，尤其是早中期病人来说，手术切除是主要治疗方法之一。但手术后的总体恶性肿瘤高复发率在医学上依旧是一个具有挑战性的难题，尤其是肝癌、肠癌、肾癌等。因此，对癌症的组织学鉴别诊断非常重要，有助于推动术中的肿瘤诊断以实时优化指导术中治疗和术后治疗。
通常，肿瘤组织的鉴定和手术切除的评估主要取决于临床医生的经验。计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)是指导手术的传统方法。虽然上述影像诊断技术可以反映肿瘤的内部结构，但大多数不能在手术术中应用。术中超声(IOUS)虽然经常用于引导手术的切除，但其敏感性和信号特异性十分有限。组织学检查是肿瘤诊断的金标准。术中通常只进行冰冻切片和苏木精&伊红染色，准确的病理鉴定对病理科医生的经验水平要求较高，且至少耗时半小时。很多情况下，肿瘤组织的鉴定需要在术后进行免疫组化(IHC)染色，但耗时较长，且需要多张片子对多种生物标志物的表达分别进行检测。
近年来，以肿瘤的精准诊断和治疗为核心的精准医学研究正在全世界范围内蓬勃发展。它主要是从基因组的分子诊断出发，以大数据为导向进行智能化的判别，寻求更为精准的个性化治疗手段。在现代系统生物学中，除了基因组能表征疾病发生的可能性，蛋白组与代谢组能更加直接地反映疾病的表型，从而也催生了人类的表型组研究。其中，由多种结构的脂质分子组成的脂质组作为代谢组中的重要成员之一，在细胞膜系统的物质组成、能量供应以及信号传导中发挥重要的作用，也最为直接和实时地反映细胞微环境的生理和病理情况。脂质在细胞中的异常合成与代谢，也已被生物学家证明与肿瘤的快速增殖、物质交换和肿瘤转移等过程密切相关。因此，脂质组成上的变化，包括脂质种类、脂肪酸链长度以及不饱和度等均有望作为肿瘤的潜在生物标志物，用于精准诊断和鉴定，并反向体现整个系统生物学在疾病发生发展中的代谢通路作用机理。
以质谱技术为平台的脂质组学研究能够在免标记的情况下提供更多维的信息。其中，相较于前处理复杂、检测耗时的色谱-质谱联用技术，高通量的直接离子化质谱技术，基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)抗盐性强，预处理要求简单，是最有潜力作为新型组织活检的技术之一，能在分子水平反映组织微环境是否存在与疾病相关的脂质分子异常，并最大限度地保留组织表面的原位分子信息。但现有的基于MALDI-MS的组织表面脂质分析大多需要有机或无机纳米基质喷涂，极大地消耗制样时间，因为结晶产生的表面不均匀性，离子抑制效应明显，脂质谱的稳定性和可重复性差。另一方面，因组织样本的切片等操作依旧必不可少，这大大降低了其“高通量”的性能，使其对大量组织样本的快速有效鉴别的可行性大大降低。
市场需要一种新型的组织活检和用于组织表面生物标志物发现验证的技术手段，本发明的发明人在对基于MALDI-MS获取组织表面脂质谱图的研究和实践过程中，发现半导体垂直硅纳米线阵列芯片可以通过接触式取样的方式从组织表面原位萃取脂质分子，并直接用于芯片上的质谱检测，以获取组织表面的脂质分子指纹谱图。该脂质分子群不仅能保留空间分布，且具有明显的组织特异性，能够特征性地代表组织表面的脂质微环境，并在多种肿瘤组织表面显示出与正常组织的显著性差异，且不同的肿瘤亚型也具有内在脂质谱差异。多种样本的脂质谱大数据结合有效特征提取和统计分析方法，可以实现多种肿瘤的精准鉴定和判别，建立起脂质谱与组织种类、肿瘤起源、肿瘤良恶性以及临床病理和预后等的相关性，且在省略组织切片、真空干燥、基质喷涂等所有组织前处理过程的前提下在5～10min内完成从采样到检测的全过程，能够解决现有技术的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，通过组织表面的脂质分子群的快速原位采集方法，再结合高通量激光解吸/电离质谱技术和数据统计分析手段，实现快速、高效、高准确率的临床组织鉴定、肿瘤亚型判别和肿瘤边界成像。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，包括如下步骤：
步骤一，用取样芯片从组织表面进行脂质取样；
步骤二，借助于激光解吸/电离质谱平台，在无基质参与情况下获取组织表面的脂质分子特征指纹谱图；
步骤三，基于组织表面的脂质特征指纹谱图，结合统计分析方法建立多种肿瘤的判别模型，对肿瘤组织与正常组织、各种肿瘤组织的亚型进行判定；
步骤四，结合质谱成像技术实现无切片情况下的组织分子数字成像，用于判别肿瘤边界。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，包括如下步骤：
步骤一，用取样芯片从组织表面进行脂质取样；
步骤二，将样本送入MALDI-MS仪器，选择激光能量、检测模式和分子量检测范围，在对检测范围内进行标准品分子量校正后，依次采集多个样本在多个硅纳米线芯片上的脂质指纹谱图或结合成像模式对同片芯片上的各个位点进行二维扫描；检测模式包括：负离子模式和正离子模式；
对于需要进行结构鉴定的分子在同台仪器中选定分子量，设定合适的质谱能量分别获取母离子和子离子信号，并叠加，结合脂质数据库比对二级谱图结果对脂质分子进行鉴定；
步骤三，基于组织表面的脂质特征指纹谱图，结合统计分析方法建立多种肿瘤的判别模型，对肿瘤组织与正常组织、各种肿瘤组织的亚型进行判定；
具体过程为：将获取的原始脂质指纹谱图的ASCII数据导出，通过数学软件设定分子信息提取程序，获取原始谱图在设定分子量范围内的所有峰的质荷比和归一化后的相对强度信息；
步骤四，将步骤三得到的相对强度信息经单变量统计分析和多变量统计分析方法筛选特征峰或特征比值，并用于分析同种癌症的癌组织与非癌组织、各种亚型癌组织、各种来源的癌组织之间的显著性差异水平；将每个病人的原始数据、归一化后的数据以及特征分子集统一归类储存，联合其组织的病理检查结果、患者的临床特征及愈后跟踪信息建立大样本数据库；
步骤五，以步骤四得到的大样本数据库为基础构建判别与预测模型，判别与预测模型先以已有数据进行训练与交叉验证，再以部分样本为测试集测试其判别和预测能力；
判别和预测能力通过计算敏感性、特异性、准确率以及AUC值进行评估；
步骤六，以构建的数据模型为基础创建能够实现数据输入、处理和结果导出的人机界面，将步骤三至五的信息集合在该界面中，实现已有样本数据库的数据调动和未知样本的归属和判别。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，将获取的原始脂质指纹谱图的ASCII数据导出，通过数学软件设定分子信息提取程序，获取原始谱图在设定分子量范围内的所有峰的质荷比和归一化后的相对强度信息；
分子信息包括：所有检测到的峰信息，经过单变量分析之后满足显著性差异要求的特征信息；单变量分析包括：t检验，方差分析，Mann-Whitney U检验；
归一化方法包括：全谱范围内的峰强度归一化，按照脂质分子类别进行分段归一化，提取双峰构成的分子对的比值数据。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，
将得到的相对强度信息经单变量统计分析和多变量统计分析方法筛选特征峰或特征比值，并用于分析同种癌症的癌组织与非癌组织、各种亚型癌组织、各种来源的癌组织之间是否存在显著差异；将每个病人的原始数据、归一化后的数据以及特征分子集统一归类储存，联合其组织的病理检查结果、患者的临床特征及愈后跟踪信息建立大样本数据库；
单变量统计分析包括：t检验，方差分析，Mann-Whitney U检验；
多变量统计分析包括：PCA主成分分析，HCL分层聚类分析，SOM自组织映射，LDA线性判别分析，PLS-DA偏最小二乘法-判别分析，OPLS-DA正交偏最小二乘法判别分析，PC-DA主成分判别分析。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，
以得到的大样本数据库为基础构建判别与预测模型，判别与预测模型先以已有数据进行训练与交叉验证，再以部分样本为测试集测试其判别和预测能力；
判别和预测能力通过计算敏感性、特异性、准确率以及AUC值进行评估，若敏感性、特异性、准确率值大于90％以及AUC值大于0.9，则表明模型有良好的判别和预测能力；
判别与预测模型包括：自主构建的人工神经网络，遗传算法，支持向量机。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，基于负离子模式下的脂质指纹谱图的肾细胞癌组织判别过程如下：
步骤a，将待测肾细胞癌组织样本与癌旁组织样本均从临床外科手术中获取，剪裁，清洗，记录信息后置于-80℃超低温冰箱储存，得到待测样品；
步骤b，用硅纳米线芯片从临床组织表面进行脂质取样；
脂质取样过程为：
将待测样品从-80℃超低温冰箱中取出，置于室温下解冻，切开，使内表面暴露，将硅纳米线芯片切割，使芯片碰到组织表面并使组织具有变形，接触取样时间为5s-180s，采样结束后用纯水彻底冲洗芯片表面，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的靶板基底，放置于真空干燥环境中保存直至质谱检测；
步骤c，在负离子检测模式下获取所有临床肾组织样本在700-1200Da分子量范围内的脂质指纹谱图，在临床肾组织表面的脂质主要以硫苷脂和羟基硫苷脂分子为主；
步骤d，将临床肾细胞癌组织与癌旁组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有峰强度进行全谱归一化，归一化方法为以全谱范围内的信号最强峰为1，其余峰相对于信号最强峰的强度比值为各峰归一化后的数值；
步骤e，将临床肾细胞癌组织与癌旁组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有归一化后的峰强度进行OPLS-DA分析和双样本的t检验进行特征峰的筛选，同时满足OPLS-DA中的VIP投影变量重要度值大于设定值和t检验中的p显著性差异值小于设定值的峰为能够区分肾细胞癌组织与癌旁组织的特征分子，满足VIP>1，p<0.05的峰被认为是临床肾细胞癌组织表面的潜在生物标志物；
步骤f，OPLS-DA会自动给出该判别方法的解释率R2Y以及表征模型的预测能力的参数Q2，两者越接近1越表明肾细胞癌组织与癌旁组织的差异性越大，满足R2Y>0.5，Q2>0.5表明肾细胞癌组织与癌旁组织能够被区分开；根据肾组织样本的数据点在OPLS-DA二维图中的位置是落在肿瘤组织区还是非肿瘤组织区判断该样本的归属。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，临床肾细胞癌组织表面的特征峰包括：m/z＝778.6，794.6，876.6，878.6，888.6，892.6，894.6，904.64，906.6，908.7，922.6，924.6，1024.7，1052.7。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，肝细胞型肝癌组织与非癌组织的判别过程如下：
步骤a，将待测的肝细胞型肝癌组织样本与癌旁、正常肝组织样本均从临床外科手术中获取，剪裁，清洗，记录信息后置于-80℃超低温冰箱储存，得到待测样品；
步骤b，用硅纳米线芯片从临床组织表面进行脂质取样；
脂质取样过程为：
将待测样品从-80℃超低温冰箱中取出，置于室温下解冻，切开，使内表面暴露，将硅纳米线芯片切割，使芯片碰到组织表面并使组织具有变形，接触取样时间为5s-180s，采样结束后用纯水彻底冲洗芯片表面，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的靶板基底，放置于真空干燥环境中保存直至质谱检测；
步骤c，在负离子和正离子检测模式下同时获取所有临床肝组织样本的脂质指纹谱图，在临床肝组织表面的脂质包括脂肪酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸和甘油三酯；
步骤d，将临床肝组织样本的脂质指纹谱图中的相邻双峰的离子强度相除，得到相邻双峰的比值，相邻双峰的分子量差为2Da，以分子量较小的峰为M，则比值＝M+2峰的离子强度/M峰的离子强度；
将临床肝细胞型肝癌组织与癌旁、正常肝组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有比值信息分别进行LDA线性判别分析，再用数学分析软件得到基于n维比值矩阵X的n个线性判别式，tn＝a1X1+a2X2+a3X3+…+anXn，其中a1至an构成系数矩阵，并自动计算每组样本的重心坐标点(x，y)；
根据所有组织的数据点按照贡献率最高的第一线性判别式和第二线性判别式得到LDA二维图，若与癌组织重心点之间的距离小于与癌旁和正常肝组织的样本之间的距离，则被判别为癌组织；若与癌组织重心点之间的距离大于与癌旁和正常肝组织的样本之间的距离，则判别不是癌组织。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，基于人工神经网络的肿瘤组织预测过程如下：
步骤a，
将待测肾细胞癌组织样本与癌旁组织样本均从临床外科手术中获取，剪裁，清洗，记录信息后置于-80℃超低温冰箱储存，得到待测样品；
将待测的肝细胞型肝癌组织样本与癌旁、正常肝组织样本均从临床外科手术中获取，剪裁，清洗，记录信息后置于-80℃超低温冰箱储存，得到待测样品；
步骤b，用硅纳米线芯片从临床组织表面进行脂质取样；
脂质取样过程为：
将待测样品从-80℃超低温冰箱中取出，置于室温下解冻，切开，使内表面暴露，将硅纳米线芯片切割，使芯片碰到组织表面并使组织具有变形，接触取样时间为5s-180s，采样结束后用纯水彻底冲洗芯片表面，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的靶板基底，放置于真空干燥环境中保存直至质谱检测；
步骤c，在负离子检测模式下获取所有临床肾组织样本的脂质指纹谱图，在临床肾组织表面的脂质主要以硫苷脂和羟基硫苷脂分子为主；
在负离子和正离子检测模式下同时获取所有临床肝组织样本的脂质指纹谱图，在临床肝组织表面的脂质包括脂肪酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸和甘油三酯；
步骤d，将临床肾细胞癌组织与癌旁组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有峰强度经全谱归一化，归一化方法为以全谱范围内的信号最强峰为1，其余峰相对于信号最强峰的强度比值为各峰归一化后的数值；将临床肝组织样本的脂质指纹谱图中的相邻双峰的离子强度相除，得到所有相邻双峰的比值，相邻双峰的分子量差为2Da，以分子量较小的峰为M，则比值＝M+2峰的离子强度/M峰的离子强度；
步骤e，将临床肾组织和临床肝组织的脂质指纹谱图中的所有分子归一化后的分子强度信息或在癌组织和非癌组织中有显著性差异的特征分子强度信息导入前反馈人工神经网络系统，为输入值，设定输出值为由0和1构成的矩阵代表组别；设定人工神经网络的训练集为所有数据的70％，验证集为15％，测试集为15％，模型自动对预测敏感性、特异性和准确率进行计算，并得到ROC曲线和AUC值；
步骤f，完成人工神经网络模型建立后，用敏感性、特异性、准确率、AUC值评估该模型对肾癌组织和肝癌组织的预测能力，若敏感性、特异性、准确率值大于90％以及AUC值大于0.9，则表明模型有良好的判别和预测能力。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，
步骤f，完成人工神经网络模型建立后，敏感性、特异性、准确率、AUC值评估该模型对肾癌组织和肝癌组织的预测能力，若敏感性、特异性、准确率值大于90％以及AUC值大于0.9表明模型有良好的判别和预测能力；
若以肾癌组织表面在负离子模式下700-1100Da分子量范围内所有检测到的峰为依据，敏感性、特异性和准确率均为100％；
或以肾癌组织表面在负离子模式下m/z＝778.5，794.6，876.6，878.6，892.6，904.6，906.6，922.6，924.6，888.6这9个特征峰为依据，敏感性、特异性和准确率均为100％；
若以肝癌组表面负离子模式下200-1000Da和正离子模式下700-1000Da分子量范围内所有的相邻双峰比值信息为依据，敏感性、特异性和准确率分别为95.0％，99.2％和97.8％；
若以肝癌组表面负离子模式下的I(m/z＝255.2)/I(m/z＝253.2)，I(m/z＝281.2)/I(m/z＝279.2)，I(m/z＝305.3)/I(m/z＝303.3)，I(m/z＝331.3)/I(m/z＝329.3)，I(m/z＝740.5)/I(m/z＝738.5)，I(m/z＝764.5)/I(m/z＝762.5)，I(m/z＝835.5)/I(m/z＝833.5)，I(m/z＝859.5)/I(m/z＝857.5)，I(m/z＝861.6)/I(m/z＝859.5)，I(m/z＝863.6)/I(m/z＝861.6)，I(m/z＝885.6)/I(m/z＝883.5)，I(m/z＝887.6)/I(m/z＝885.6)，I(m/z＝891.6)/I(m/z＝889.6)和正离子模式下的I(m/z＝739.5)/I(m/z＝737.5)，I(m/z＝804.6)/I(m/z＝802.5)，I(m/z＝855.7)/I(m/z＝853.7)，I(m/z＝877.7)/I(m/z＝875.7)，I(m/z＝881.8)/I(m/z＝879.7)，I(m/z＝903.7)/I(m/z＝901.7)，I(m/z＝905.8)/I(m/z＝903.7)，I(m/z＝907.8)/I(m/z＝905.7)，I(m/z＝909.8)/I(m/z＝907.7)共22个比值为依据，敏感性、特异性和准确率分别为96.7％，99.2％和98.3％。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，基于脂质分子的数字成像及肿瘤边界判别过程如下：
步骤a，从临床外科手术中获取癌组织与癌旁组织相连的组织样本，裁剪；
步骤b，将硅纳米线芯片切割后，使芯片能碰到组织表面并使组织具有的变形，接触取样时间为5s-180s，完成顶端接触取样；
步骤c，采样结束后，用纯水彻底冲洗芯片表面，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的靶板基底，并对其表面进行图像扫描；
步骤d，将靶板送入质谱仪，使其自动二维扫描，并将获得的谱图中能够代表癌组织表面的脂质分子信息、特征相邻双峰信息以及多维脂质分子信息经过PCA、LDA线性降维变换、经OPLS-DA非线性降维变换后的数据导入MATLAB进行数字成像，同时将同块组织在-10℃--20℃环境下切片，得到厚度为10-20μm的组织片完成苏木精&伊红染色，将质谱数字成像结果与苏木精&伊红组织切片染色图相对照，评价本方法用于肿瘤边界判别的可行性；
苏木精&伊红显示的肿瘤区域和非肿瘤区域的颜色深浅对比及其边界轮廓与质谱的数字成像图显示的肿瘤边界进行对照，若两者的边界轮廓能够相吻合，则表明组织分子数字成像能够用于判别肿瘤边界；若两者的边界轮廓不能够相吻合，则表明组织分子数字成像的空间辨别能力不足以判别肿瘤边界；
将数字成像结果与步骤四所建立的临床组织样本数据库，可获得相比于苏木精&伊红染色更为丰富的疾病信息，包括：肿瘤异质性信息，肿瘤亚型信息。
前述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，取样芯片进行脂质取样的取样对象包括：临床手术中的组织表面，术前穿刺样本，胃肠镜检查中获取的样本。
本发明的有益之处在于：
本发明通过顶端接触取样法将组织表面脂质分子原位快速转移至硅纳米线芯片表面，借助于激光解吸/电离-质谱(LDI-MS)平台，在无基质喷涂情况下获取组织表面的脂质分子特征指纹谱图，并结合统计分析方法建立多种肿瘤的判别模型，对肿瘤组织与正常组织、各种肿瘤组织的亚型进行判定，并发展比率质谱成像技术，提高脂质分子信息的稳定性，并以此实现组织成像，用于判别肿瘤边界；
本发明的高通量指纹谱图获取方法不仅可以一次性获取多个组织、多个位点、多个芯片表面的质谱结果，提供多维度的数据集，且可以保留在萃取转印过程中组织表面的分子空间分布信息，可用于术中切缘的阴性判别和肿瘤边界成像；
本发明利用脂质分子谱图建立肿瘤特征数据库和实现肿瘤组织精准鉴定和判别，可辅助或替代组织病理学检查，应用于术前组织活检、术中组织鉴定和术后分子诊断等重要临床精准医学领域，临床价值广；
本发明积累的大量临床样本的脂质指纹谱图可指导脂质代谢通路研究，挖掘与肿瘤相关的代谢异常靶点，推动系统生物学研究和临床新药开发；
本发明的组织样本表面脂质分子群的采集方法提供了一种无须组织切片的组织表面原位的快速分子采样模式，对组织样本要求低，耗时短，便于操控和自动化；
本发明的方法取自同个组织的癌变区域与非癌变区域的脂质分子指纹谱图同样具有肿瘤特异性，可结合统计分析方法实现肿瘤组织的精准判别；
本发明提取脂质分子指纹谱图中的相邻双峰分子对的比值数据，一方面可以提高数据稳定性，另一方面可以代表组织表面的脂质特征，用于特定组织的肿瘤组织识别，并提高肿瘤组织与非肿瘤组织的差异对比度，结合成像实现肿瘤边界判别。
附图说明
图1是本发明的基于组织表面脂质指纹谱图的肿瘤组织判别方法流程示意图；
图2是本发明的硅纳米线(SiNWs)芯片与硅纳米线@还原氧化石墨烯(SiNWs@rGO)复合芯片的表面上的脑组织脂质指纹谱图的比较图(横坐标为质荷比(m/z)；纵坐标为质谱仪器中的离子强度)；
图3是本发明的硅纳米线(SiNWs)芯片与硅纳米线@还原氧化石墨烯(SiNWs@rGO)复合芯片的表面测得的脂质分子总离子强度(柱状图)和峰数量(折线图)的比较图(横坐标为检测模式，左侧纵坐标为总离子强度，右侧纵坐标为峰数量，单位为个)；
图4是本发明验证实验1-1的取自小鼠的不同组织样本的代表性脂质指纹谱图，(a-1)、(a-2)为脑组织，(b-1)、(b-2)为肾组织，(c-1)、(c-2)为肝组织，(d-1)、(d-2)为肺组织，同一列中上图为负离子模式下的脂质指纹谱图，下图为正离子模式下的脂质指纹谱图(横坐标为质荷比(m/z)；纵坐标为归一化后的离子强度，范围0-1)；
图5是本发明应用一临床肾癌组织及癌旁组织的代表性脂质指纹谱图(横坐标为质荷比(m/z)；纵坐标为质谱仪器中的离子强度)；
图6是是本发明应用一临床肾癌组织及癌旁组织的判别分析结果示意图(横坐标为第一判别式t1的计算结果，纵坐标为第二判别式t2的计算结果，R2X和R2Y值分别表示该判别模型对两个判别式矩阵的解释率)；
图7是本发明应用二中临床肝癌组织在两种检测模式下的代表性脂质指纹谱图(横坐标为质荷比(m/z)；纵坐标为归一化后的离子强度，范围0-1)；
图8是本发明应用二中不同归一化方法下肝细胞型肝癌组织和正常肝组织表面的脂质分子信息的稳定性比较结果图，(a-1)、(a-2)为全谱归一化后的RSD分布结果，(b-1)、(b-2)为按照脂质分子类别进行归一化后的RSD分布结果，(c-1)、(c-2)为计算相邻双峰(分子量差为2Da)的比值后的RSD分布结果；(横坐标为相对标准偏差(RSD)值的范围，纵坐标为对应于横坐标一定RSD范围内，脂质峰或者比值数量占所有峰或所有比值数量的分布百分比。)
图9是本发明应用二中临床肝癌组织和非癌组织的线性判别分析结果示意图(横坐标为第一判别式的计算结果，纵坐标为第二判别式的计算结果，括号中分别表示两个判别式的贡献率)；
图10是本发明应用四中肝癌组织苏木精&伊红染色图，黑色框内为癌组织区域，灰色长条形框内为本发明中用于脂质质谱检测的区域；
图11是本发明应用四中肝癌组织与肝癌旁组织在脂肪酸分子范围内的指纹谱图(横坐标为质荷比(m/z)；纵坐标为归一化后的离子强度，范围0-1)；
图12是本发明应用四中基于肝癌组织脂质谱图中的双峰比值在镜像变换前后的数字成像图，镜像变换后的成像图中的黑色虚线对应于本发明图10中苏木精&伊红染色图显示的肿瘤边界；
图13是本发明应用四中基于肝癌组织脂质谱图中的单峰数字成像图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，如附图1所示，包括如下步骤：
步骤一，用取样芯片从组织表面进行脂质取样；需要说明的是：取样芯片进行脂质取样的取样对象包括：临床手术中的组织表面，术前穿刺样本，胃肠镜检查中获取的样本等，样本的来源不受限制。
取样芯片采用硅纳米线芯片，制造过程如下：(对于硅纳米线芯片的描述，请查询本公司的另一篇专利：一种硅纳米线芯片及基于硅纳米线芯片的质谱检测方法)
硅纳米线芯片以单晶硅为原料，可通过金属辅助刻蚀法(MACE)快速制备，也可通过反应离子刻蚀法(RIE)、气液固三相生长法(VLS)等方法制备得到。其中金属辅助刻蚀法制备具体步骤为：将表面清洁的单晶硅片浸入含硝酸银和氢氟酸的混合溶液中于室温下刻蚀5-30min，氢氟酸的浓度为4.8mol/L,硝酸银浓度为0.04-0.4mol/L。刻蚀完成后，用去离子水充分洗涤硅片表面，并浸入稀硝酸中浸泡0.5-12h除去硅片表面的银，最终得到硅纳米线芯片。该硅纳米线芯片具有萃取硫苷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇等偏酸性的脂质分子的能力，适宜于负离子模式下的脂质分子谱图的获取。
硅纳米线芯片可通过表面修饰还原氧化石墨烯薄膜的方式提高其对组织表面的脂质分子吸附萃取能力。具体的还原氧化石墨烯薄膜的修饰具体步骤为：硅纳米线芯片首先与体积浓度为1％-5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的甲苯溶液在干燥无水环境下反应10-120min，反应结束后用甲苯、乙醇依次洗涤，并于110℃环境下固化1h，完成表面APTES的修饰。再者，将质量分数浓度为0.1-1％的氧化石墨烯溶液(溶剂为水/乙醇＝1:1)滴加8μL于1mm×1mm的硅纳米线芯片表面，待其干燥，于70-90℃的水合肼气体氛围中反应0.5-3h。反应结束冷却至常温，即可得到表面修饰有不同还原程度的还原氧化石墨烯的硅纳米线芯片。APTES上的氨基与还原氧化石墨烯表面的羧基之间的静电吸附力可确保硅纳米线@还原氧化石墨烯复合芯片在接触取样过程、溶剂洗涤过程中不受破坏。硅纳米线@还原氧化石墨烯复合芯片能利用π堆积、静电吸附等作用力促进疏水性较强的中性甘油酯分子和分子结构中带有氨基等碱性基团的脂质分子的吸附萃取，从而扩大脂质分子信息覆盖率。
脂质取样过程为：
将取自动物或临床的组织样本从-80℃超低温冰箱中取出，置于室温下解冻，切开，使内表面暴露，将硅纳米线芯片切割，使芯片碰到组织表面并有约0.5mm变形，接触取样时间为5-180s，采样结束后用纯水彻底冲洗芯片表面10s，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的靶板基底，放置于真空干燥环境中保存直至质谱检测。
需要说明的是：该过程主要基于硅纳米线芯片表面的纳米结构与组织表面的组织液微环境之间的吸附萃取作用，包括静电吸附、π-π堆积等，存在明显的动力学过程和芯片表面依懒性，通过调整接触取样时间可获得针对不同组织的最佳接触取样条件，硅纳米线芯片的表面性质可改变该芯片的萃取能力和萃取倾向性。萃取转印至芯片表面的分子包含非水溶性的脂质分子，也包含水溶性的盐分、基质蛋白等，故完成接触取样过程后需进行适宜的快速洗涤过程，以洗去盐分等干扰而保留脂质分子信息。
步骤二，将样本送入MALDI-MS仪器，选择激光能量、检测模式和分子量检测范围，在对检测范围内进行标准品分子量校正后，依次采集多个样本在多个硅纳米线芯片上的脂质指纹谱图或结合成像模式对同片芯片上的各个位点进行二维扫描；
检测模式包括：负离子模式和正离子模式；适宜于在负离子模式下出峰的脂质分子包含但不限于：脂肪酸(FA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、硫苷脂(ST)、羟基硫苷脂(ST(OH))等。倾向于在正离子模式下离子化的脂质分子包含但不限于：磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM)、甘油二酯(DG)、甘油三酯(TG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、半乳糖神经酰胺(Gal-Cer)等。在本方法中，负离子模式下检测到的脂质分子主要以[M-H]-离子形式存在，在正离子模式下，PC以[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+三种加和形式存在，以[M+Na]+为主，SM以[M+Na]+、[M+K]+形式存在，以[M+K]+为主，PS主要以[M+Na]+形式存在，Gal-Cer主要以[M+K]+形式存在，DG和TG同时以[M+Na]+、[M+K]+两种形式存在。分子量检测范围设定在200-1500Da之间，用不同链长的脂肪酸标准品、脂质标准品以及多肽标准品的混合溶液完成该分子量范围内的分子量校正。
对于需要进行结构鉴定的分子在同台仪器中选定分子量，设定合适的质谱能量分别获取母离子和子离子信号，并叠加，结合脂质数据库比对二级谱图结果对脂质分子进行鉴定；
步骤三，将获取的原始脂质指纹谱图的ASCII数据导出，通过MATLAB等数学软件设定分子信息提取程序，获取原始谱图在设定分子量范围内的所有峰的质荷比和归一化后的相对强度信息；
分子信息包括：所有检测到的峰信息，经过单变量分析之后满足显著性差异要求的特征信息；单变量分析包括：t检验，方差分析，Mann-Whitney U检验；
归一化方法包括：全谱范围内的峰强度归一化，按照脂质分子类别进行分段归一化，提取双峰构成的分子对的比值数据。
步骤四，将得到的相对强度信息经单变量统计分析和多变量统计分析方法筛选特征峰或特征比值，并用于分析同种癌症的癌组织与非癌组织、各种亚型癌组织、各种来源的癌组织之间的显著差异水平；将每个病人的原始数据、归一化后的数据以及特征分子集统一归类储存，联合其组织的病理检查结果、患者的临床特征及愈后跟踪信息建立大样本数据库；
单变量统计分析包括：t检验，方差分析，Mann-Whitney U检验；
多变量统计分析包括：PCA主成分分析，HCL分层聚类分析，SOM自组织映射，LDA线性判别分析，PLS-DA偏最小二乘法-判别分析，OPLS-DA正交偏最小二乘法判别分析，PC-DA主成分判别分析。
该样本库中的组织包含肝癌、肠癌、肾癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等来自人体的多种癌症组织，既包括原发性肿瘤组织，也包括转移性肿瘤组织。每种癌症的不同亚型组织也在该大数据样本库内。同时，组织的病理检查结果、患者的临床特征及预后跟踪信息也与每个样本的脂质谱图信息相链接。
相比筛选特征峰，作为一种优选，将相邻双峰构成的分子对的相对离子强度相除并进行筛选，得到特征性的比值数据；部分临床组织样本表面采集到的脂质分子指纹谱图中包含多组不同类别的脂质分子群，不同脂质分子群在质谱检测时具有不同的离子化效率。而属于同类别的脂质分子具有相同的核心结构，离子化效率相近，但脂肪酸链长度和不饱和度有所差异，而不同的脂肪酸链长度和不饱和度差异能反映与脂肪酸合成代谢密切相关的组织的肿瘤发生和发展情况。故提取脂质分子指纹谱图中的相邻双峰分子对的比值数据，一方面可以提高数据稳定性，另一方面可以代表组织表面的脂质特征，用于特定组织的肿瘤组织识别，并提高肿瘤组织与非肿瘤组织的差异对比度，结合成像实现肿瘤边界判别。
步骤五，以得到的大样本数据库为基础构建判别与预测模型，判别与预测模型先以已有数据进行训练与交叉验证，再以部分样本为测试集测试其判别和预测能力；
判别和预测能力通过计算敏感性、特异性、准确率以及AUC值进行评估；
判别与预测模型包括：自主构建的人工神经网络，遗传算法，支持向量机。
步骤六，以构建的数据模型为基础创建能够实现数据输入、处理和结果导出的人机界面，将步骤三至五的信息集合在该界面中，实现已有样本数据库的数据调动和未知样本的归属和判别。
验证实验1-1：验证不同的组织的脂质指纹谱图具有特异性；
组织表面的脂质分子群的快速原位采集和检测方法过程如下：
1)将取自动物或临床的组织样本从-80℃超低温冰箱中取出，置于室温下解冻，并适当切开，使内表面暴露出来。将硅纳米线芯片或硅纳米线@还原氧化石墨烯复合芯片切割成2mm×2mm大小，背部粘贴上导电胶并固定于可程序操控的机械臂下方，设定机械臂的移动距离参数使芯片恰好能碰到组织表面并有约0.5mm的变形，设定芯片与组织表面的接触取样时间为5-180s。开启自动程序后，完成顶端接触取样过程。
2)采样结束后将硅纳米线芯片从机械臂端脱离，用纯水彻底冲洗芯片表面10s，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的自制金属或不锈钢靶板基底，放置于真空干燥环境中保存直至质谱检测。
3)将放置有硅纳米芯片或硅纳米线@还原氧化石墨烯复合芯片的靶板基底，送入质谱仪器，在正离子或负离子模式下检测分子量范围700-1000Da的来自不同组织的脂质指纹谱图。用于组织表面萃取的芯片的选择会对谱图的信息量产生影响，如附图2-3所示，硅纳米线@还原氧化石墨烯复合芯片因还原氧化石墨烯优良的吸附性能和检测性能会提高负离子检测模式下的峰强度和增加正离子检测模式下的分子信息量。
4)在最佳条件下获取不同组织的脂质指纹谱图。结果如附图4所示，脑、肾、肝、肺四种组织的脂质指纹谱图显示出组织特异性，其中，在负离子模式下，在脑和肾组织表面中含有大量的的硫苷脂(STs)和羟基化硫苷脂(ST(OH)s)，而肝脏组织的主要脂质成分是磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)。磷脂酰甘油(PG)或磷脂酸(PA)的峰仅出现在肺组织的质谱图中。而在正离子模式下，与其他组织相比，脑组织的谱图中含有更多的的磷脂酰胆碱(PC)和半乳糖神经酰胺(Gal-Cer)成分，但几乎没有任何甘油三酯(TG)信号。
将硅纳米芯片与本判别方法结合可以有如下的应用：
应用一，基于负离子模式下的脂质指纹谱图的肾细胞癌组织判别过程如下：
1)肾细胞癌组织样本与癌旁(距离癌细胞距离0.5cm)组织均从临床外科手术中获取，大小在0.5cm×0.5cm～1cm×1cm之间。所有的肾组织样本先用去离子水冲洗以除去组织表面的残留血液，记录信息后置于-80℃超低温冰箱储存。
2)按照实验1-1中的1)、2)步骤完成临床肾细胞癌组织与癌旁组织表面的脂质分子萃取转印，芯片选用硅纳米线芯片，萃取转印时间为30s。
3)在负离子检测模式下获取所有临床肾组织样本在700-1200Da分子量范围内的脂质指纹谱图。附图5所示为一例肾细胞癌组织与癌旁组织在该范围内的脂质谱图。在临床肾组织表面的脂质主要以硫苷脂和羟基硫苷脂分子为主。但癌组织区域和癌旁组织在脂质组成上显示出明显的种类差异。
4)将临床肾细胞癌组织与癌旁组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有峰强度经全谱归一化，归一化方法为以全谱范围内的信号最强峰为1，其余峰相对于信号最强的峰的强度比值为各峰归一化后的数值。
5)将临床肾细胞癌组织与癌旁组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有归一化后的峰强度进行OPLS-DA分析和双样本的t检验进行特征峰的筛选，同时满足OPLS-DA中的VIP投影变量重要度值大于设定值和双样本t检验中的p显著性差异值小于设定值的峰为能够区分肾细胞癌组织与癌旁组织的特征分子，满足VIP>1，p<0.05的分子可被认为是临床肾细胞癌组织表面的潜在生物标志物。需要说明的是，双样本的t检验在MATLAB软件中可通过“ttest2”函数一次性获得多组数据的两两检验，其原理为：设定原假设H0为两组符合方差齐性的数据均值无差别，在设定双侧检验下的检验水准α＝0.05的前提下判断H0为真的概率p值，p<α，则表示拒绝原假设；t检验也可以在SPSS等其他软件中实现；该实施例VIP值的计算在成熟的SIMCA软件中进行。
临床肾细胞癌组织表面的特征峰包括：m/z＝778.6，794.6，876.6，878.6，888.6，892.6，894.6，904.64，906.6，908.7，922.6，924.6，1024.7，1052.7。
6)步骤f，OPLS-DA会自动给出该判别方法的解释率R2Y以及表征模型的预测能力的参数Q2，两者越接近1表明肾细胞癌组织与癌旁组织的差异性越大，满足R2Y>0.5，Q2>0.5表明肾细胞癌组织与癌旁组织能够被区分开。根据肾组织样本的数据点在OPLS-DA二维图中的位置是落在肿瘤组织区还是非肿瘤组织区判断该样本的归属。
需要说明的是：附图6显示在OPLS-DA图中，癌组织与癌旁组织能够明显区分，且满足VIP值大于1的峰在癌组织与非癌组织之间的t检验结果均表现为p<10-7，表明在癌组织和非癌组织之间有极大的显著性差异。
应用二，肝细胞型肝癌组织与非癌组织的判别过程如下：
1)肝细胞型肝癌组织样本(T)与癌旁(距离癌细胞距离2cm，PT)、正常肝组织(距离癌细胞距离>2cm的切缘处，N)均从临床外科手术中获取，大小在0.5cm×0.5cm～1cm×1cm之间。所有的肝组织样本先用去离子水冲洗以除去组织表面的残留血液，记录信息后置于-80℃超低温冰箱储存。
2)按照实验1-1中的1)、2)步骤完成临床肝细胞型肝癌组织与癌旁、正常肝组织表面的脂质分子萃取转印，芯片选用硅纳米线@还原氧化石墨烯复合芯片，萃取转印时间为60s。
3)在负离子和正离子检测模式下同时获取所有临床肝组织样本的脂质指纹谱图，负离子模式检测范围为200-1000Da，正离子模式检测范围为700-1000Da。附图7所示为一例肝细胞型肝癌组织的脂质谱图。在临床肝组织表面的脂质包括脂肪酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸和甘油三酯。
4)将临床肝组织样本的脂质指纹谱图中的峰强度按照检测模式(负离子或正离子)进行全谱归一化或按照脂质分子类别进行归一化或计算所有相邻双峰(分子量差为2Da)的比值(例如C18:0分子量为283.2，C18:1分子量为281.2，则比值为I(C18:0)/I(C18:1))。评估三种数据预处理模式下数据的稳定性，统计三种数据预处理模式下，取自同块组织的9片芯片(三次批间实验，每批次内共三片芯片)上获得的数据的相对标准偏差(RSD)分布结果，计算所有数据的RSD的中位数值。满足肿瘤组织上中位数RSD小于30％，非肿瘤组织上的中位数RSD小于20％的被认为是适合于临床组织检测分析的评估要求。
附图8所示为取自同块肝细胞型肝癌组织样本及正常肝组织的9片芯片表面的脂质谱图按照三种数据预处理后数据的稳定性比较结果。相较于全谱归一化和按照脂质分子类别归一化，相邻双峰比值在肝组织表面的稳定性较好，适合于代表肝组织表面的脂质分子信息和用于特征提取。
5)将临床肝细胞型肝癌组织与癌旁、正常肝组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有比值信息分别进行LDA线性判别分析，于MALTAB、SPSS等软件中得到基于n维比值矩阵X的n个线性判别式，tn＝a1X1+a2X2+a3X3+…+anXn，其中a1至an构成系数矩阵，软件自动计算每组样本的重心坐标点(x，y)。根据所有组织的数据点按照贡献率最高的第一线性判别式和第二线性判别式得到LDA二维图，若与癌组织重心点之间的距离小于与癌旁和正常肝组织的样本之间的距离，则被判别为癌组织；若与癌组织重心点之间的距离大于与癌旁和正常肝组织的样本之间的距离，则判别不是癌组织。。
结果分析：附图9显示在判别分析图中，比值信息可以清楚地区分癌组织与癌旁和正常肝组织，且癌旁组织和正常组织相互重叠，体现其二者均为非癌组织的临床特性。基于三组样本的两两双样本t检验，可筛选出在癌组织和癌旁之间存在显着性差异(p<0.01)的特征比值信息，这些特征在癌旁和正常肝组织之间没有显著性差异。
应用三，基于人工神经网络的肿瘤组织预测过程如下：
1)将实验一和实验二中的临床肾组织和临床肝组织的脂质指纹谱图中的所有分子归一化后的分子强度信息(肝：比值信息)或在癌组织和非癌组织中有显著性差异的特征分子强度信息(肝：特征比值信息)导入前反馈人工神经网络系统为输入值，设定输出值为由0和1构成的矩阵代表组别(例如癌组织和癌旁组织分别为1和0)；设定人工神经网络的训练集为所有数据的70％，验证集为15％，测试集为15％。模型自动对预测敏感性、特异性和准确率进行计算，并得到ROC曲线和AUC值。
2)完成人工神经网络模型建立后，根据1)中的敏感性、特异性、准确率、AUC值评估该模型对肾癌组织和肝癌组织的预测能力，若敏感性、特异性、准确率值大于90％以及AUC值大于0.9，则表明模型有良好的判别和预测能力；
若以肾癌组织表面在负离子模式下700-1100Da分子量范围内所有检测到的峰为依据，敏感性、特异性和准确率均为100％；
若以肾癌组织表面在负离子模式下m/z＝778.5，794.6，876.6，878.6，892.6，904.6，906.6，922.6，924.6，888.6这9个特征峰为依据，敏感性、特异性和准确率均为100％；
若以肝癌组表面负离子模式下200-1000Da和正离子模式下700-1000Da分子量范围内所有的相邻双峰比值信息为依据，敏感性、特异性和准确率分别为95.0％，99.2％和97.8％；
若以肝癌组表面负离子模式下的I(m/z＝255.2)/I(m/z＝253.2)，I(m/z＝281.2)/I(m/z＝279.2)，I(m/z＝305.3)/I(m/z＝303.3)，I(m/z＝331.3)/I(m/z＝329.3)，I(m/z＝740.5)/I(m/z＝738.5)，I(m/z＝764.5)/I(m/z＝762.5)，I(m/z＝835.5)/I(m/z＝833.5)，I(m/z＝859.5)/I(m/z＝857.5)，I(m/z＝861.6)/I(m/z＝859.5)，I(m/z＝863.6)/I(m/z＝861.6)，I(m/z＝885.6)/I(m/z＝883.5)，I(m/z＝887.6)/I(m/z＝885.6)，I(m/z＝891.6)/I(m/z＝889.6)和正离子模式下的I(m/z＝739.5)/I(m/z＝737.5)，I(m/z＝804.6)/I(m/z＝802.5)，I(m/z＝855.7)/I(m/z＝853.7)，I(m/z＝877.7)/I(m/z＝875.7)，I(m/z＝881.8)/I(m/z＝879.7)，I(m/z＝903.7)/I(m/z＝901.7)，I(m/z＝905.8)/I(m/z＝903.7)，I(m/z＝907.8)/I(m/z＝905.7)，I(m/z＝909.8)/I(m/z＝907.7)共22个比值为依据，敏感性、特异性和准确率分别为96.7％，99.2％和98.3％。
Figure BDA0002112420660000171
表1
结果分析：如表1所示：临床肾癌组织及肝癌组织的人工神经网络预测模型结果，此两种癌组织的敏感性、特异性和准确率接近100％，AUC值均超过0.9883，表明基于本发明采集到的组织表面脂质分子信息结合人工神经网络能够实现肿瘤组织的判别和预测。
应用四，癌组织数字成像及肿瘤边界判别过程如下：
1)从临床外科手术中获取癌组织与癌旁组织相连的肝细胞型肝癌样本，大小为0.5cm×2cm左右。
2)将硅纳米线@还原氧化石墨烯复合芯片切割成2.5mm×10mm大小，背部粘贴上导电胶并固定于可程序操控的机械臂下方，设定机械臂的移动距离参数使芯片恰好能碰到组织表面并有约0.5mm的变形，设定芯片与组织表面的接触取样时间为60s。开启自动程序后，完成顶端接触取样过程。芯片相对于组织块的相对位置于取样前、取样时、取样后均及时拍照记录。
1)采样结束后将硅纳米线芯片从机械臂端脱离，用纯水彻底冲洗芯片表面10s，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的自制金属或不锈钢靶板基底，并对其表面进行图像扫描，扫描分辨率为600-1200dpi。后将该靶板送入质谱仪。
设定质谱成像检测的空间分辨率为50-200μm，使其自动二维扫描，并将获得的谱图中符合应用二中所筛选的特征峰和特征相邻双峰信息导入MATLAB进行数字成像。同时将同块组织在-15℃环境下切片，得到厚度为12μm的组织片完成苏木精&伊红染色。将质谱成像结果与苏木精&伊红组织切片染色图相对照，评价本方法用于肿瘤边界判别的可行性；
苏木精&伊红显示的肿瘤区域和非肿瘤区域的颜色深浅对比及其边界轮廓与质谱的数字成像图显示的肿瘤边界进行对照，若两者的边界轮廓能够相吻合，则表明组织分子数字成像能够用于判别肿瘤边界；若两者的边界轮廓不能够相吻合，则表明组织分子数字成像的空间辨别能力不足以判别肿瘤边界；
将数字成像结果与步骤四所建立的临床组织样本数据库，可获得相比于苏木精&伊红染色更为丰富的疾病信息，包括但不限制于肿瘤异质性、肿瘤亚型等信息。
结果分析：判别结果如附图10-13显示脂肪酸双峰，C18:2与C18:1、C20:4与C20:3的强度比值数字成像结果经镜像转换后，与苏木精&伊红染色图像中的淡色虚线框中的肿瘤边界位置(黑色虚线为边界)保持一致，且相较于单峰成像显著增强了癌组织与癌旁组织之间的差异对比度。
本发明通过顶端接触取样法将组织表面脂质分子原位快速转移至硅纳米线芯片表面，借助于LDI-MS平台，在无基质喷涂情况下获取组织表面的脂质分子特征指纹谱图，并结合统计分析方法建立多种肿瘤的判别模型，对肿瘤组织与正常组织、各种肿瘤组织的亚型进行判定，并发展比率质谱成像技术，提高脂质分子信息的稳定性，并以此实现组织成像，用于判别肿瘤边界；本发明技术方案能够在无需组织切片与yan组织样本预处理情况下，借助硅纳米线芯片的吸附和萃取作用原位采集组织表面的脂质分子信息，且在无需基质喷涂的前提下实现质谱检测，结合高通量激光解吸/电离质谱技术和数据统计分析手段，实现快速、高效、高准确率的临床组织鉴定、肿瘤亚型判别和肿瘤边界成像。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种基于纳米芯片的组织表面脂质指纹谱图的获取及分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，用取样芯片从组织表面进行脂质取样；所述取样芯片采用硅纳米线芯片，所述硅纳米线芯片表面修饰有不同还原程度的还原氧化石墨烯,具体步骤为：硅纳米线芯片与体积浓度为1％-5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES的甲苯溶液在干燥无水环境下反应10-120min；反应结束后用甲苯、乙醇依次洗涤，并于110℃环境下固化1h，完成表面APTES的修饰；将溶剂为水：乙醇＝1:1，质量分数浓度为0.1-1％的氧化石墨烯溶液滴加8μL于1mm×1mm的硅纳米线芯片表面，待其干燥，于70-90℃的水合肼气体氛围中反应0.5-3h；
步骤二，将样本送入MALDI-MS仪器，选择激光能量、检测模式和分子量检测范围，在对检测范围内进行标准品分子量校正后，依次采集多个样本在多个硅纳米线芯片上的脂质指纹谱图或结合成像模式对同片芯片上的各个位点进行二维扫描；所述检测模式包括：负离子模式和正离子模式；对于需要进行结构鉴定的分子在同台仪器中选定分子量，设定合适的质谱能量分别获取母离子和子离子信号，并叠加，结合脂质数据库比对二级谱图结果对脂质分子进行鉴定；借助于激光解吸/电离质谱平台，在无基质参与情况下获取组织表面的脂质分子特征指纹谱图；
步骤三，基于组织表面的脂质特征指纹谱图，结合统计分析方法建立多种肿瘤的判别模型，对肿瘤组织与正常组织、各种肿瘤组织的亚型进行判定；具体过程为：将获取的原始脂质指纹谱图的ASCII数据导出，通过数学软件设定分子信息提取程序，获取原始谱图在设定分子量范围内的所有峰的质荷比和归一化后的相对强度信息；
步骤四，将得到的相对强度信息经单变量统计分析和多变量统计分析方法筛选特征峰或特征比值；并用于分析同种癌症的癌组织与非癌组织、各种亚型癌组织、各种来源的癌组织之间的显著性差异水平；将每个病人的原始数据、归一化后的数据以及特征分子集统一归类储存，联合其组织的病理检查结果、患者的临床特征及愈后跟踪信息建立大样本数据库；
步骤五，以得到的大样本数据库为基础构建判别与预测模型，判别与预测模型先以已有数据进行训练与交叉验证，再以部分样本为测试集测试其判别和预测能力；判别和预测能力通过计算敏感性、特异性、准确率以及AUC值进行评估；
步骤六，以构建的数据模型为基础创建能够实现数据输入、处理和结果导出的人机界面，将步骤三至五的信息集合在该界面中，实现已有样本数据库的数据调动和未知样本的归属和判别；结合质谱成像技术实现在无切片的情况下进行组织分子数字成像，用于判别肿瘤边界。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米芯片的组织表面脂质指纹谱图的获取及分析方法，其特征在于，
所述分子信息包括：所有检测到的峰信息，经过单变量分析之后满足显著性差异要求的特征信息；所述单变量分析包括：t检验，方差分析，Mann-Whitney U检验；
所述归一化方法包括：全谱范围内的峰强度归一化，按照脂质分子类别进行分段归一化，提取双峰构成的分子对的比值数据。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米芯片的组织表面脂质指纹谱图的获取及分析方法，其特征在于，
所述单变量统计分析包括：t检验，方差分析，Mann-Whitney U检验；
所述多变量统计分析包括：PCA主成分分析，HCL分层聚类分析，SOM自组织映射，LDA线性判别分析，PLS-DA偏最小二乘法-判别分析，OPLS-DA正交偏最小二乘法判别分析，PC-DA主成分判别分析。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米芯片的组织表面脂质指纹谱图的获取及分析方法，其特征在于，
若敏感性、特异性、准确率值大于90%以及AUC值大于0.9，则表明模型有良好的判别和预测能力；
所述判别与预测模型包括：自主构建的人工神经网络，遗传算法，支持向量机。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米芯片的组织表面脂质指纹谱图的获取及分析方法，其特征在于，取样芯片进行脂质取样的取样对象包括：临床手术中的组织表面，术前穿刺样本，胃肠镜检查中获取的样本。
6.根据权利要求1所述的一种基于纳米芯片的组织表面脂质指纹谱图的获取及分析方法，其特征在于，脂质取样过程为：将取自动物或临床的组织样本从-80℃冰箱中取出，置于室温下解冻，切开，使内表面暴露，将硅纳米线芯片切割，使芯片碰到组织表面并有0.5mm变形，接触取样时间为5-180s，采样结束后用纯水彻底冲洗芯片表面10s，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的靶板基底，放置于真空干燥环境中保存直至质谱检测。
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