CN107607384A - 一种细胞纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞纯化方法，包括对目标细胞表面用磁性颗粒进行修饰、磁性分离，细胞平铺在样品板上，对样品板上的细胞进行光学扫描后进行磁性分离，所述磁性分离涉及用磁针或磁铁块分离。采用对细胞进行至少一次全扫描找出疑似目标细胞或目标细胞，还可对疑似目标细胞进行跟踪扫描，确定目标细胞，最终抽取目标细胞，能有效地提高效率；另一方面，本发明的细胞纯化方法，是通过形成单细胞区域，然后对目标细胞进行抽取，使得抽取的细胞包含或只有单个目标细胞的概率大大增大，这有利于后续的工作进行，如基因分析，这能使得基因分析的准确率大大提高。

Description

一种细胞纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞纯化方法。

背景技术

癌症的诊断事关人的生命健康。然而，在临床上确诊癌症常常已经是晚期。癌症的死亡率很高，且化疗、放疗给病人的身体和精神上带来了极大的痛苦和折磨，而药物治疗随着癌症的发展、转移，病情千变万化，癌细胞的耐药性也随之产生，对于更换何种药物，没有选择可靠依据。因此，科学家们开始分离癌细胞、研究癌细胞。

目前，根据癌细胞尺寸较大的特点，采用薄膜压紧法，分离癌细胞。但是白细胞的尺寸与癌细胞的尺寸有重合，这样的方法分离出来的癌细胞很有可能还含有白细胞，从而会导致后续分析不准确等缺陷。

为了准确地从多种细胞中找出目标细胞，如癌细胞，一般都需要对细胞进行扫描。但是，目前的扫描方法均是对所有细胞依次进行全扫描，耗时多，效率低。

发明内容

为了克服以上现有技术中存在的问题，本发明提供一种细胞纯化方法，包括对目标细胞表面用磁性颗粒进行修饰、磁性分离，细胞平铺在样品板上，对样品板上的细胞进行光学扫描后进行磁性分离，所述磁性分离涉及用磁针或磁铁块分离。

优选的是，磁性分离时，用磁针或磁铁块在样品板上水平扫描运动，吸取目标细胞。

上述任一方案，优选的是，所述样品板设有均匀、规律分布的凸起结构，所述凸起结构之间的间距不大于目标细胞的尺寸。

上述任一方案，优选的是，所述凸起结构由柔性材料制成。

上述任一方案，优选的是，所述样品板底部设有多孔底板，所述多孔底板的孔径小于目标细胞尺寸。

上述任一方案，优选的是，所述样品板设有通孔，所述样品板的上下表面表现为疏水，所述通孔的内表面表现为亲水。

上述任一方案，优选的是，所述样品板设有盲孔，盲孔内表面表现为亲水，样品板其他表面表现为疏水。

上述任一方案，优选的是，所述样品板装有油，所述油中分散有水基液滴，所述细胞封闭于所述水基液滴内。

上述任一方案，优选的是，所述油中含有表面活性剂，使得所述水基液滴之间不会互溶。

上述任一方案，优选的是，所述样品板上规律地相间地设有亲水区及疏水区，所述亲水区的尺寸不小于目标细胞的尺寸。

上述任一方案，优选的是，所述光学扫描包括对样品板上的所有细胞进行至少一次全扫描，根据细胞的光学特征、形状和/或大小，找到疑似目标细胞或目标细胞，对所述疑似目标细胞进行定位。。

上述任一方案，优选的是，找到疑似目标细胞后，再对所述疑似目标细胞进行跟踪扫描或定点成像，以确认目标细胞。

上述任一方案，优选的是，所述跟踪定点成像，是在全扫描过程中，找出每个疑似目标细胞后，停止所述全扫描，立即在该处进行跟踪定点成像或对所述疑似目标细胞进行定位，待全扫描结束后，再对所有定位的疑似目标细胞进行跟踪扫描成像。

上述任一方案，优选的是，所述对所述疑似目标细胞进行定位包括识别、记录和/或输出每个疑似目标细胞的坐标X、Y和Z。

上述任一方案，优选的是，抽取细胞前，向细胞附近添加胰蛋白酶。

上述任一方案，优选的是，平铺样品时，细胞呈多层分布，找出疑似目标细胞后，将疑似目标细胞及其附近的细胞抽取出来再次进行平铺域添加稀释液，使疑似目标细胞呈单层分布，然后再进行所述全扫描及跟踪扫描/定点成像。

上述任一方案，优选的是，平铺样品时，细胞呈两层至五层层分布，找出疑似目标细胞后，将所有疑似目标细胞抽取出来并在同一个容器中混合，然后形成数目多余疑似目标细胞个数的液滴，然后再进行所述全扫描及跟踪扫描成像。

本发明的细胞纯化方法，采用对细胞进行至少一次全扫描找出疑似目标细胞或目标细胞，还可对疑似目标细胞进行跟踪扫描，确定目标细胞，最终抽取目标细胞，这能有效地提高效率；另一方面，本发明的细胞纯化方法，是通过形成单细胞区域，然后对目标细胞进行抽取，使得抽取的细胞包含或只有单个目标细胞的概率大大增大，这有利于后续的工作进行，如基因分析，这能使得基因分析的准确率大大提高。

具体实施方式

为了进一步解释、清楚理解本发明的发明内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明和阐述。

以下实施例中的样品取自癌症患者的血液，并且，为了提高效率，在以下所有实施例中，均先通过现有技术中的分离方法将血液中的红细胞和血小板都分离出去，这时，血液中的细胞为：循环肿瘤细胞，即进入人体外周血的肿瘤细胞，其大小约为12-25μm，和大小约为7-15μm的白细胞（white blood cell，WBC）。

实施例1.1

一种细胞分析中的细胞纯化方法，包括如下步骤：第一步：取样；具体操作为抽取血液、分离红细胞、血小板和白细胞；第二步：将第一步中除去红细胞、血小板和白细胞的样品平铺透明平板样品板1上，单层分布，细胞之间间隔较小；第四步：对第三步中的细胞进行扫描，找出目标细胞；第五步：抽取含有目标细胞的液体；第六步：稀释含有目标细胞的液体；第七步：将第六步中的液体平铺于第二样品板上；第八步：对第二样品板上的细胞进行扫描，找出目标细胞；第九步：抽取目标细胞；具体地，采用移液枪吸取，抽取单细胞时，每个目标细胞与周围的细胞之间的距离大于抽取装置的作用范围。

其中，第二步至第八步循环进行至少一次，直至每个目标细胞与周围的细胞之间的距离大于抽取装置的作用范围，进行抽取目标细胞。所述第二样品板为透明平板样品板；所述对细胞进行扫描，先对所有细胞进行一次全扫描，根据目标细胞和非目标细胞的尺寸，找出疑似目标细胞，记录所述疑似目标细胞的坐标位置XYZ，然后再对所述记录的所述疑似目标细胞的坐标位置XYZ处进行跟踪扫描，根据细胞的形态确认目标细胞。

首先对所有细胞进行全扫描，同时观察细胞的尺寸大小，将所有尺寸为12-25μm的细胞的坐标X、Y和Z记录下来；然后对所述记录的所有X、Y和Z处的细胞进行跟踪扫描，一般情况下，白细胞呈圆形，且表面光滑，而循环肿瘤细胞是表面凹凸不平或形状不规则，从而识别出循环肿瘤细胞。

将抽取出来的循环肿瘤细胞存放于细胞存放器中备用。

实施例2.1

与实施例1.1不同的是，对所有细胞进行一次全扫描，根据目标细胞的抗体标志物荧光特征确认疑似目标细胞，记录疑似目标细胞的坐标X、Y和Z，对所述记录的所述疑似目标细胞的坐标位置处进行跟踪扫描，根据非疑似目标细胞的抗体标志物的荧光特征及核酸染色物的荧光特征、抗体标志物荧光特征、非疑似目标细胞的抗体标志物荧光特征及核酸染色物的荧光特征确认目标细胞。

实施例3.1

与实施例1.1不同的是，对所有细胞进行一次全扫描，根据目标细胞的抗体标志物荧光特征找出疑似目标细胞，对所述记录的所述疑似目标细胞的坐标位置处进行跟踪扫描后，根据细胞形状、非疑似目标细胞的抗体标志物荧光特征、细胞大小及核酸染色物荧光特征确认目标细胞。

实施例4.1

与实施例1.1不同的是，进行两次全扫描，且顺序式进行，第一次和第二次全扫描分别对细胞的形状和大小进行扫描，对所有细胞的大小进行一次全扫描结束后，再对所有细胞的形状进行全扫描。

实施例5.1

与实施例2.1不同的是，所述两次全扫描交叉交替式进行，对每一个细胞，都是先在白光下进行扫描，观察细胞的大小和/或形貌，然后，在同一个细胞处，将光源从白光切换至荧光，然后进行目标细胞的荧光特征扫描，即调节滤光镜使红色光透过。可以将表面凹凸不平的、和/或形状不规则的、和/或尺寸12-25μm的细胞和/或显红色的细胞判断为疑似目标细胞。

实施例5.2

与实施例5.1不同的是，对每一个细胞，都是先在荧光下进行扫描，调节滤光镜使蓝光透过，观察细胞核大小和形状，然后，在同一个细胞处，将光源从荧光切换至白光，观察细胞的大小和/或表面形貌。可以将细胞核大和/或畸形的细胞，和/或表面凹凸不平的、和/或形状不规则的、和/或尺寸12-25μm的细胞判断为疑似目标细胞。

实施例5.3

与实施例5.2不同的是，在荧光下观察细胞核的大小和形状后，调节滤光镜，使绿光透过；然后再次调节滤光镜，使红光透过；然后再将光源从荧光切换至白光，观察细胞的大小和/或表面形貌。可以将细胞核大和/或畸形、不显绿光但显红光的细胞，和/或表面凹凸不平的、和/或形状不规则的、和/或尺寸12-25μm的细胞判断为目标细胞。可以不需要所述跟踪扫描，即，通过交叉交替进行的多次全扫描，即可确认出来目标细胞CTC。

当然，按照本发明的构思及以上列举的实施例，本领域技术人员可以以此类推，可以将核酸染色物的荧光特征、目标细胞表面蛋白/抗体标志物的荧光特征、非目标细胞表面蛋白/抗体标志物的荧光特征及细胞的大小和形状在全扫描和/或跟踪扫描/定点成像的过程中进行排列组合，从而得到在上述实施例中没有列举的方案，但这些经过排列组合得到的方案，也属于本发明的实施例，在此不一一列举。

实施例6

与实施例1.1不同的是，所述全扫描在低倍放大倍数下进行，对细胞进行粗筛。所述全扫描在4×10的放大倍数下进行。全扫描是采用低倍放大倍数，可以有效地缩短全扫描时间，而后，再用高倍放大倍数（25×10）进行跟踪扫描，在缩短时间的同时，也保证了目标细胞的准确查找。

实施例7

与实施例1.1不同的是，在全扫描过程中，一旦发现疑似目标细胞，则所述全扫描过程暂停，对该疑似目标细胞立即进行跟踪定点成像，对细胞的大小、形状、目标细胞的抗体标志物的荧光特征、非目标细胞的抗体标志物的荧光特征和/或核酸染色物的荧光特征进行扫描，以确定该疑似目标细胞是否为目标细胞，然后继续所述全扫描，下一次发现疑似目标细胞时，再次重复上述过程。

实施例8.1

与上述实施例不同的是，平铺时，细胞呈两层分布，在进行一次全扫描找到疑似目标细胞后，由于这时的疑似目标细胞并不是单个细胞，而是上、下两层的细胞，所以，在这时找出的疑似目标细胞称为疑似目标细胞区域，采用移液枪将疑似目标细胞区域的细胞吸取出来，在另一干净区域或样品板上再次平铺，使其中的细胞呈单层分布，然后重复全扫描和跟踪扫描，找出目标细胞，并采用移液枪抽取目标细胞。找出疑似目标细胞区域后，直接向其周围至少一次添加水或PBS，使其中的细胞呈单层分布或减少分布层数，然后重复全扫描和跟踪扫描，直到疑似目标细胞区域的细胞呈单层分布，然后抽取单个目标细胞。

实施例8.2

与实施例8.1不同的是，将所有疑似目标细胞及其附近的细胞抽取出来在一个容器内混合，再通过液滴形成器形成比细胞数量大很多的液滴，使每个液滴里至多含有一个目标细胞，其中可以有非目标细胞也可以没有，然后再对液滴内的细胞进行扫描、抽取目标细胞。

液滴设置在油里，在形成液滴的时候，可以选择性地加入表面活性剂。

实施例9.1

与上述实施例不同的是，在样品制备时，通过液滴形成器形成比细胞数量少很多的液滴，使每个液滴里含有多个细胞，形成单细胞区域，然后对液滴内的细胞进行扫描，找出疑似目标细胞区域。然后，将疑似目标细胞区域抽取出来分别转移至不同的容器中。

值得注意的是，以上实施例仅仅是本发明的发明内容的优选实施方式，用来解释、说明发明内容，不能用来限制被发明的内容，且，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的总构思的前提下，还可以做出若干不需创造性劳动的改变，而这个改变也应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种细胞纯化方法，包括对目标细胞表面用磁性颗粒进行修饰、磁性分离，其特征在于：细胞平铺在样品板上，对样品板上的细胞进行光学扫描后进行磁性分离，所述磁性分离涉及用磁针或磁铁块分离。

2.如权利要求1所述的一种细胞纯化方法，其特征在于：磁性分离时，用磁针或磁铁块在样品板上水平扫描运动，吸取目标细胞。

3.如权利要求1所述的一种细胞纯化方法，其特征在于：所述样品板设有均匀、规律分布的凸起结构，所述凸起结构之间的间距不大于目标细胞的尺寸。

4.如权利要求1所述的一种细胞纯化方法，其特征在于：所述样品板底部设有多孔底板，所述多孔底板的孔径小于目标细胞尺寸。

5.如权利要求1所述的一种细胞纯化方法，其特征在于：所述样品板设有通孔，所述样品板的上下表面表现为疏水，所述通孔的内表面表现为亲水。

6.如权利要求1所述的一种细胞纯化方法，其特征在于：所述样品板上规律地相间地设有亲水区及疏水区，所述亲水区的尺寸不小于目标细胞的尺寸。

7.如权利要求1所述的一种细胞纯化方法，其特征在于：所述光学扫描包括对样品板上的所有细胞进行至少一次全扫描，根据细胞的光学特征、形状和/或大小，找到疑似目标细胞或目标细胞，对所述疑似目标细胞进行定位。

8.如权利要求7所述的一种细胞纯化方法，其特征在于：对所述疑似目标细胞进行定位包括识别、记录和/或输出每个疑似目标细胞的坐标X、Y和Z。

9.如权利要求1所述的一种细胞纯化方法，其特征在于：平铺样品时，细胞呈多层分布，找出疑似目标细胞后，将疑似目标细胞及其附近的细胞抽取出来再次进行平铺域添加稀释液，使疑似目标细胞呈单层分布，然后再进行所述全扫描及跟踪扫描/定点成像。

10.如权利要求1所述的一种细胞纯化方法，其特征在于：平铺样品时，细胞呈多层分布，找出疑似目标细胞后，将所有疑似目标细胞抽取出来并在同一个容器中混合，然后形成数目多余疑似目标细胞个数的液滴，然后再进行所述全扫描及跟踪扫描成像。