JP2020522251A - 細胞コロニー採集システム - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、35 U.S.C. § 119(e)の下、あらゆる目的のために参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、2017年6月2日に出願された米国仮特許出願第62/514,747号の利益を主張する。
以下の米国特許は、あらゆる目的のために、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる:米国特許第7,776,584号。
細胞コロニーを選別および選択するための自動デバイスが、数年にわたって市販されている。しかしながら、現在のシステムは、いくつかの欠点を有する。特に、これらのシステムは、単クローン性コロニー(すなわち、単一細胞に由来するコロニー)の識別および採集に不向きである。それにもかかわらず、単クローン性コロニー内の細胞が遺伝子学的に同じであるため、そのようなコロニーは、研究および産業の両方において重要である。現在、単クローン性コロニーは、複数のステップおよび計器を使用して産生されている。例えば、単一細胞が、最初に、蛍光活性化細胞分類(FACS)等の技法を使用して単離される。次に、これらの単一細胞は、好ましくは、1つのウェルに1つの細胞で、高密度マルチウェルプレートの中に定着される。最終的に、細胞は、コロニーに成長される。これは、大量の試薬および多数のマルチウェルプレートの使用を伴う。また、このように産生される細胞コロニーの生存能力は、低い。
図1−4は、単クローン性細胞コロニーを生成するための例示的方法を示す、フローチャートである。方法と関連付けられるステップの殆どまたは全ては、細胞が定着される、「第0日(Day ZeroまたはDay 0)」と称される、最初の日と、単クローン性細胞コロニーが採集および移送される、「採集日」と称される、最終日とに実施される。概略すると、これらのステップは、第0日に細胞を撮像するステップと、採集日に細胞コロニーを撮像するステップとを含む。これらの画像の比較は、ユーザが、採集日に選択されたコロニーが第0日に撮像された単一細胞に対応するかどうか(すなわち、コロニー内の細胞の全てが、単一起源細胞から生じるため、単クローン性であるかどうか)を確認することを可能にする。方法の詳細が、下記に説明される。
第0日活動は、細胞を定着させるステップと、所望に応じて、操作を実施し、細胞の一様な空間分布および後続の成長を助長するステップと、細胞の第0日場所を捕捉するステップとを含む(図1参照)。ウェルは、第0日ステップの合間にインキュベータの中に貯蔵されてもよい。
ウェルは、細胞成長に有利な条件下で第0日から採集日まで培養される。これらの条件は、適切な大気組成、湿度、および温度を含んでもよい。条件はまた、適切な栄養素、緩衝剤、補因子、および同等物の提供を含んでもよい。生存細胞は、本時間中に分裂し、コロニーを形成するであろう。例えば、哺乳類細胞の典型的倍増時間は、24時間であり、したがって、第N日に、各起源細胞からの細胞は、およそ2N個の細胞を含むコロニーを形成するであろう。したがって、理想的条件下で、細胞コロニーは、それぞれ、第10、12、および14日に、約1,000個、約4,000個、および約16,000個の細胞を含有し得る。
採集日活動は、細胞のコロニーを撮像するステップと、撮像されたコロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップと、その可能性に基づいて、好適なコロニーの「採集リスト」を作成するステップと、各コロニーの少なくとも一部を物理的に回収し、それを標的環境の中に設置することによって、コロニーを採集し、リスト上に設置するステップとを含む(図2−4参照)。
図5−7は、単クローン性細胞コロニーを識別および採集するための例示的装置100を示す。本装置は、対物レンズ108と、ウェルの内容物の画像を捕捉するための検出器(例えば、CCDカメラ、CMOSカメラ等)110とを備える、デジタル撮像デバイス(すなわち、カメラ)106にわたる、サンプルウェル105を伴うマルチウェルプレート104を支持するための主要台またはテーブル102を含んでもよい。主要台102およびその上に搭載された細胞採集デバイス112は、上側エンクロージャ114によって被覆されてもよい。採集デバイスは、細胞コロニーの部分に係合し、それを取り上げるためのピン(細胞採集デバイス112からの垂直突起として示される)を含んでもよい。ある場合には、ピンは、中空であり、それらがコロニーの一部を「吸い上げ」、次いで、目的地ウェルまたは他の場所にそれを「噴出」することを可能にし得る。装置の基部は、下側エンクロージャ116の中にカメラを収納してもよい。上側エンクロージャおよび下側エンクロージャは、集合的に筐体を形成してもよい。対物レンズまたはカメラ全体は、3次元位置付けのために、X−Y軸ステージ118および/またはZ軸ステージ120上に搭載されてもよい。いくつかの実施形態では、カメラは、複数の共平面画像を撮影してもよく、これらの画像は、単一の画像を形成するようにともにスティッチまたはタイル化されてもよい。同一および/または他の実施形態では、カメラは、種々のZ高さにおいてさらなる画像を捕捉してもよい。1つまたは複数のコントローラ122が、本装置と通信してもよく、カメラ活動、および細胞採集および機械視覚活動を協調および制御するために使用されてもよい。種々の照明デバイスが、撮像のためにウェルプレート領域を照らすように利用されてもよい。例えば、白色光徹照124および/または蛍光落射照明源126が、使用されてもよい。本装置はさらに、適切な培地および試薬を供給するためのアクセス可能な流体工学ステーションを含んでもよい。好適な装置のさらなる側面が、米国特許第7,776,584号に説明されている。
例示的計器/ソフトウェアワークフロー
本実施例は、例示的計器/ソフトウェアワークフローを説明する。一般に、本明細書で説明されるもの等のソフトウェア/計器ワークフローは、生物学的ワークフローと交互に生じるべきである(例えば、下記の実施例4および5を参照)。
例示的スループットおよび記憶計算
本実施例は、開示される方法のためのスループットおよび記憶要件を例証するための仮説的シナリオを説明する。
単クローン性コロニーを作成するための例示的方法
本実施例は、単クローン性コロニーを作成するための例示的方法を説明する。本方法は、プロセス全体を通して1つの計器の中で、細胞コロニーの撮像、分析、および採集を含んでもよい。本方法は、6ウェルプレート内の高い細胞生存能力および/またはより少ない(例えば、10〜25枚の)プレートの使用をもたらし得る。有意に、他の場所で記述されるように、本方法は、最初に、生存単クローン性コロニーを成長させ、次いで、それらの生存能力を確立した後に、コロニーを単クローン性として識別または確認するステップを伴ってもよい。選択されたコロニーが、次いで、採集され、標的環境の中に設置されてもよい。
半固形培地の中に定着された細胞の挙動は、ハードウェアおよびソフトウェア要件の両方の重要な決定要因である。本実施例は、半固形培地の中に定着された細胞のXYZ(3次元)運動の観察を要約する。これらの観察は、そのようなXYZ運動を低減させ得る、潜在的ワークフロー改良を提案および査定するために使用され、これは、ひいては、候補細胞コロニーおよびそれらの単一起源細胞の位置の相関を促進することによって、単クローン性を査定する能力を改善し得る。
細胞株。CHO−S(チャイニーズハムスター卵巣)。
以下の結果が、CHO系細胞株を使用して取得された。細胞型、インキュベータ経過時間/機能、およびユーザの差異は、所見に影響を及ぼし得る。
定着後の最初の24時間にわたって実施された、標準条件(上記の方法を参照、2,000個の細胞/ml)下で定着された細胞(n=46個の細胞)の静的撮像時間経過分析が、細胞の約70%のみが時間0においてウェル底部の50μm以内に位置することを実証した。細胞の残りの30%は、培地体積の全体を通して分布し、これらの細胞は、最初の数時間の間にウェル底部に沈降した(8時間で細胞の100%)。ウェル底部における細胞のうち、平均90μmのXY(水平)移動が、5〜170μmの範囲を伴って最初の12時間にわたって観察された。培地中でより高く分布した細胞のうち、平均400μmのXY運動が、250〜520μmの範囲を伴って観察された。12時間後、軽微なXY偏移のみが、観察され、培地が細胞の有意な運動を防止するために十分にゲル化していたことを示唆した。
細胞のZ座標分布が低減され得るかどうかを決定するための調査が、行われた。細胞は、本明細書では、ウェルあたりの培地の体積が2mlから1mlまで低減され、細胞の濃度が4,000個の細胞/mlまで増加されたことを除いて、上記で説明されるように定着された。細胞(n=56個の細胞)の静的撮像時間経過分析が、細胞の100%が時間0においてウェル底部の50μm以内に位置することを実証した。平均40μmのXY運動が、8〜101μmの範囲を伴って最初の12時間にわたって観察された。12時間後、軽微なXY偏移のみが、観察され、培地が有意な運動を防止するために十分にゲル化していたことを示唆した。
ウェルあたりの低減された培地体積は、起源細胞およびコロニーの位置を合致させることと関連付けられる困難への解決策を提供し、したがって、単クローン性コロニーの識別の確実性を増大させる。しかしながら、低減された培地体積は、コロニー健全性および成長に影響を及ぼす。
培地脱水および細胞健全性へのその影響を軽減するためのいくつかのオプションが、利用可能である。これらは、定着後の余剰培地の添加および通気性プレートシールの使用を含む。
第1の例示的な生物学的ワークフロー
本実施例は、第1の例示的な生物学的ワークフローを説明する。
第2の例示的な代替生物学的ワークフロー
本実施例は、第2の例示的な代替生物学的ワークフローを説明する。
選択された実施形態1
本節は、限定ではないが、そのうちの一部または全てが、明確性および効率のために英数字によって指定され得る、一連の段落として提示される、細胞コロニー選択、分析、および採集方法のさらなる側面および特徴を説明する。これらの段落はそれぞれ、任意の好適な様式で、1つ以上の他の段落と、および/または本願の他の場所からの開示と組み合わせられることができる。下記の段落のうちのいくつかは、他の段落を明示的に参照し、それらをさらに限定し、限定ではないが、好適な組み合わせのうちのいくつかの実施例を提供し得る。より一般的には、全ての好適な組み合わせが、含まれる。例えば、段落A6は、段落A0を参照する一方で、とりわけ、段落A5等の他の先行する段落と、または段落A7等の後続の段落と組み合わせられることができる。同様に、1つの群の中の段落は、他の群の中の段落と組み合わせられることができる。例えば、段落A6は、B、C、およびD群の段落と組み合わせられることができる。
選択された実施形態2
本実施例は、限定ではないが、一連のインデックス付き段落として提示される、細胞コロニー選択、分析、および採集方法のその上さらなる側面および特徴を説明する。
上記に記載される開示は、独立した有用性を伴う複数の明確に異なる発明を包含し得る。これらの発明はそれぞれ、その好ましい形態で開示されているが、本明細書に開示および図示されるようなその具体的実施形態は、多数の変形例が可能性として考えられるため、限定的な意味で考慮されるものではない。本発明の主題は、本明細書に開示される種々の要素、特徴、機能、および/または性質の全ての新規かつ非自明の組み合わせおよび副次的組み合わせを含む。以下の請求項は、特に、新規かつ非自明と見なされる、ある組み合わせおよび副次的組み合わせを指摘する。特徴、機能、要素、および/または性質の他の組み合わせおよび副次的組み合わせで具現化される発明は、本出願または関連出願からの優先権を主張する出願において請求され得る。そのような請求項はまた、異なる発明または同一の発明を対象とするかどうか、出願当初の請求項に対して範囲がより広い、より狭い、等しい、または異なるかどうかにかかわらず、本開示の発明の主題内に含まれると見なされる。さらに、識別された要素に関する第1、第2、または第3等の序数指標が、要素を区別するために使用され、別様に具体的に記述されない限り、そのような要素の特定の位置または順序を示さない。
Claims (43)
- デジタル撮像デバイスを有する装置を使用して、1つ以上の単クローン性細胞コロニーを選択するための方法であって、
前記装置上にサンプルプレートを装填するステップであって、前記サンプルプレートは、半固形培地の中で保持される複数の細胞を有するウェルを含む、ステップと、
第1の時間に、前記デジタル撮像デバイスを使用して、前記ウェルの第1の複数の垂直に離間した画像を捕捉するステップであって、各画像は、体積画像スタックが前記ウェルに対して生成されるように、Z軸に沿って異なる高さを有する、ステップと、
前記第1の時間よりも実質的に遅い第2の時間に捕捉される、前記ウェルの1つ以上の画像に基づいて、細胞の候補コロニーの場所を識別するステップと、
前記体積画像スタックに基づいて、前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップと、
前記決定された可能性の測定値に応答して、前記装置の採集ヘッドを使用して前記候補コロニーを採集し、前記コロニーの少なくとも一部を単離するステップと
を含む、方法。 - 前記半固形培地の中に前記複数の細胞を定着させるステップをさらに含み、第1の複数の画像を捕捉するステップは、定着から24時間未満後に実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の複数の画像を捕捉するステップは、定着から6時間未満後に実施される、請求項2に記載の方法。
- 前記複数の細胞を定着させるステップと、前記装置上にサンプルプレートを装填するステップとの間に、定着された細胞を含有する前記ウェルを遠心分離するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記ウェルを遠心分離するステップは、少なくとも3分間、重力の少なくとも50倍の遠心力で実施される、請求項4に記載の方法。
- 前記ウェルを遠心分離するステップは、約5分間、前記重力の約100倍の遠心力で実施される、請求項5に記載の方法。
- 前記遠心分離するステップの後に、付加的半固形培地を前記ウェルに添加するステップをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記プレートを装填するステップの前に、空気透過性シールで前記ウェルを被覆するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ウェル内の前記半固形培地の深度は、約1ミリメートル以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記体積画像スタック内の連続画像の個別のZ座標は、少なくとも約20マイクロメートルだけ異なる、請求項1に記載の方法。
- 前記体積画像スタック内の連続画像の前記個別のZ座標は、約50マイクロメートル未満だけ異なる、請求項10に記載の方法。
- 前記体積画像スタック内の連続画像の前記個別のZ座標は、25マイクロメートル〜45マイクロメートルだけ異なる、請求項11に記載の方法。
- 前記体積画像スタックは、前記ウェル内の前記半固形培地の深度全体に及ぶ、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の複数の画像は、前記複数の細胞の大部分が分裂する前に収集される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の複数の画像は、前記半固形培地がゲル化した後の約6時間以内に収集される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の複数の画像の分解能は、単一細胞の識別を可能にする、請求項1に記載の方法。
- 単一細胞の画像は、前記デジタル撮像デバイスの少なくとも約4ピクセルを占有する、請求項16に記載の方法。
- 前記ウェルは、透明基部を有し、前記デジタル撮像デバイスは、前記基部の下方に配置される対物レンズを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記対物レンズの倍率は、2倍〜7倍である、請求項18に記載の方法。
- 前記対物レンズの開口数は、0.1〜0.4である、請求項18に記載の方法。
- 前記対物レンズは、乾燥対物レンズである、請求項18に記載の方法。
- 前記第1の複数の画像のうちの各画像は、全て前記Z軸に沿って同一の高さにおいて捕捉される、組み合わせられた複数のより小さい画像を備える、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のより小さい画像は、水平面に対する前記デジタル撮像デバイスの個別の既知の位置に基づいて組み合わせられる、請求項22に記載の方法。
- 前記体積画像スタックに基づいて、複数の細胞場所をマップするステップと、
前記複数の細胞場所から、少なくとも選択された第1の距離だけ全ての他の細胞から離間される単一細胞を識別するステップと、
前記細胞の候補コロニーの潜在的場所を前記識別された単一細胞に対応する場所に限定するステップと、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記体積画像スタックは、第1の体積画像スタックであり、
前記第2の時間の前に、前記デジタル撮像デバイスを使用して、第2の体積画像スタックが前記ウェルに対して生成されるように、前記ウェルの第2の複数の垂直に離間した画像を捕捉するステップと、
前記第2の体積画像スタックを前記第1の体積画像スタックと比較し、前記半固形培地内の前記細胞の移動を決定するステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記ウェルの第1の複数の垂直に離間した画像を捕捉するために使用される前記デジタル撮像デバイスは、第1のデジタル撮像デバイスであり、前記ウェルの1つ以上の画像は、第2のデジタル撮像デバイスを使用して、前記第2の時間に捕捉される、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のデジタル撮像デバイスは、前記ウェルの上方に配置される、請求項26に記載の方法。
- 前記第1の時間および前記第2の時間は、少なくとも10日だけ異なる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞の候補コロニーの場所を識別するステップはさらに、単クローン性以外の少なくとも1つの基準を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの基準は、前記コロニーの形状、密度、およびサイズから成る群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの基準は、任意の他の細胞のコロニーへの前記候補コロニーの近接性に少なくとも部分的に基づく、請求項29に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの基準は、前記候補コロニーからの蛍光強度を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、1つ以下の細胞が前記候補コロニーの場所の選択された距離内の前記体積画像スタックの中で見出されたことを観察するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記距離は、約50μm以下である、請求項33に記載の方法。
- 前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、前記候補コロニーの選択された距離によって画定される半球体積に交差する細胞場所確率円錐の数を観察するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、前記候補コロニーの場所を前記体積画像スタック内の対応する場所と比較するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記候補コロニーの場所を前記体積画像スタック内の対応する場所と比較するステップは、前記候補コロニーと前記体積画像スタック内で位置特定可能な1つ以上の個々の細胞との間の個別の距離を評価するステップを含む、請求項36に記載の方法。
- 採集するステップの後に、コロニーの少なくとも一部を分注コンテナに再配置するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルプレートの第2のウェル上で捕捉するステップ、識別するステップ、決定するステップ、および採集するステップを繰り返すステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞コロニーを採集するための装置であって、
サンプルコンテナを受容するように構成される装置台であって、前記サンプルコンテナは、複数の細胞が存在する半固形培地の体積を支持する透明基部を備える、装置台と、
デジタルカメラであって、前記デジタルカメラは、前記半固形培地中の前記細胞のデジタル画像が、前記サンプルコンテナの透明基部を通して捕捉可能であるように、前記装置台の下方に配置される対物レンズを有する、デジタルカメラと、
Z軸ポジショナであって、前記Z軸ポジショナは、前記対物レンズに結合され、選択可能な垂直高さにおいて前記対物レンズを位置付けるように構成される、Z軸ポジショナと、
前記コロニーの少なくとも一部を単離するための前記装置の採集ヘッドと、
コントローラであって、前記コントローラは、前記デジタルカメラ、前記Z軸ポジショナ、および採集ヘッドに結合され、前記コントローラは、プロセッサを備え、前記プロセッサは、記憶された命令のセットを実行することにより、(i)体積画像スタックが生成されるように、各画像が前記透明基部を通して撮影され、前記Z軸に沿って異なる高さを有する前記半固形培地の体積の複数の垂直に離間した画像を捕捉することと、(ii)前記採集ヘッドを位置付けて前記コロニーの少なくとも一部を単離することとを行うように構成されている、コントローラと
を備える、装置。 - 前記対物レンズおよび前記コントローラに結合され、選択可能な水平位置において前記対物レンズを位置付けるように構成される、X−Yポジショナをさらに備える、請求項40に記載の装置。
- 前記複数の垂直に離間した画像は、第1の時間に捕捉され、前記プロセッサはさらに、記憶された命令のセットを実行することにより、前記第1の時間よりも実質的に遅い第2の時間に、前記半固形培地の体積の1つ以上の画像を捕捉するように構成される、請求項40に記載の装置。
- 前記単一細胞の画像は、前記デジタルカメラの少なくとも約4ピクセルを占有する、請求項40に記載の装置。
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