JP2022190082A - 細胞コロニー採集システム - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞コロニー採集システムを提供すること【解決手段】生存単クローン性コロニーを成長させ、それらの生存能力が実証された後にそれらを単クローン性として識別し、それらを採集し、標的環境の中に設置するための方法および装置を含む、システム。本方法は、ウェルの中に低密度で細胞を定着させるステップと、定着の直後の第1の時間に、細胞の場所を示す、ウェルの一連の垂直に離間した画像を捕捉するステップと、以降の第2の時間に、候補細胞コロニーの場所を示す、同一のウェルの画像を捕捉するステップと、画像の第1のセットの中の情報に基づいて、候補コロニーが単クローン性である可能性を決定するステップと、可能性に基づいて、標的環境に移送するための採集ヘッドを使用して、候補コロニーを採集するステップとを含み得る。【選択図】なし
Description
(優先権出願の相互参照)
本願は、35 U.S.C. § 119(e)の下、あらゆる目的のために参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、2017年6月2日に出願された米国仮特許出願第62/514,747号の利益を主張する。
本願は、35 U.S.C. § 119(e)の下、あらゆる目的のために参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、2017年6月2日に出願された米国仮特許出願第62/514,747号の利益を主張する。
(他の資料の相互参照)
以下の米国特許は、あらゆる目的のために、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる:米国特許第7,776,584号。
以下の米国特許は、あらゆる目的のために、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる:米国特許第7,776,584号。
(技術分野)
細胞コロニーを選別および選択するための自動デバイスが、数年にわたって市販されている。しかしながら、現在のシステムは、いくつかの欠点を有する。特に、これらのシステムは、単クローン性コロニー(すなわち、単一細胞に由来するコロニー)の識別および採集に不向きである。それにもかかわらず、単クローン性コロニー内の細胞が遺伝子学的に同じであるため、そのようなコロニーは、研究および産業の両方において重要である。現在、単クローン性コロニーは、複数のステップおよび計器を使用して産生されている。例えば、単一細胞が、最初に、蛍光活性化細胞分類(FACS)等の技法を使用して単離される。次に、これらの単一細胞は、好ましくは、1つのウェルに1つの細胞で、高密度マルチウェルプレートの中に定着される。最終的に、細胞は、コロニーに成長される。これは、大量の試薬および多数のマルチウェルプレートの使用を伴う。また、このように産生される細胞コロニーの生存能力は、低い。
細胞コロニーを選別および選択するための自動デバイスが、数年にわたって市販されている。しかしながら、現在のシステムは、いくつかの欠点を有する。特に、これらのシステムは、単クローン性コロニー(すなわち、単一細胞に由来するコロニー)の識別および採集に不向きである。それにもかかわらず、単クローン性コロニー内の細胞が遺伝子学的に同じであるため、そのようなコロニーは、研究および産業の両方において重要である。現在、単クローン性コロニーは、複数のステップおよび計器を使用して産生されている。例えば、単一細胞が、最初に、蛍光活性化細胞分類(FACS)等の技法を使用して単離される。次に、これらの単一細胞は、好ましくは、1つのウェルに1つの細胞で、高密度マルチウェルプレートの中に定着される。最終的に、細胞は、コロニーに成長される。これは、大量の試薬および多数のマルチウェルプレートの使用を伴う。また、このように産生される細胞コロニーの生存能力は、低い。
本開示は、生存単クローン性コロニーを成長させ、それらの生存能力が実証された後にそれらを単クローン性として識別し、それらを採集し、標的環境の中に設置するための方法および装置を含む、システムを提供する。本方法は、ウェルの中に低密度で細胞を定着させるステップと、定着の直後の第1の時間に、細胞の場所を示す、ウェルの一連の垂直に離間した画像を捕捉するステップと、以降の第2の時間に、候補細胞コロニーの場所を示す、同一のウェルの画像を捕捉するステップと、画像の第1のセットの中の情報に基づいて、候補コロニーが単クローン性である可能性を決定するステップと、可能性に基づいて、標的環境に移送するための採集ヘッドを使用して、候補コロニーを採集するステップとを含み得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
デジタル撮像デバイスを有する装置を使用して、1つ以上の単クローン性細胞コロニーを選択するための方法であって、
前記装置上にサンプルプレートを装填するステップであって、前記サンプルプレートは、半固形培地の中で保持される複数の細胞を有するウェルを含む、ステップと、
第1の時間に、前記デジタル撮像デバイスを使用して、前記ウェルの第1の複数の垂直に離間した画像を捕捉するステップであって、各画像は、体積画像スタックが前記ウェルに対して生成されるように、Z軸に沿って異なる高さを有する、ステップと、
前記第1の時間よりも実質的に遅い第2の時間に捕捉される、前記ウェルの1つ以上の画像に基づいて、細胞の候補コロニーの場所を識別するステップと、
前記体積画像スタックに基づいて、前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップと、
前記決定された可能性の測定値に応答して、前記装置の採集ヘッドを使用して前記候補コロニーを採集し、前記コロニーの少なくとも一部を単離するステップと
を含む、方法。
(項目2)
前記半固形培地の中に前記複数の細胞を定着させるステップをさらに含み、第1の複数の画像を捕捉するステップは、定着から24時間未満後に実施される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記第1の複数の画像を捕捉するステップは、定着から6時間未満後に実施される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記複数の細胞を定着させるステップと、前記装置上にサンプルプレートを装填するステップとの間に、定着された細胞を含有する前記ウェルを遠心分離するステップをさらに含む、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記ウェルを遠心分離するステップは、少なくとも3分間、重力の少なくとも50倍の遠心力で実施される、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記ウェルを遠心分離するステップは、約5分間、前記重力の約100倍の遠心力で実施される、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記遠心分離するステップの後に、付加的半固形培地を前記ウェルに添加するステップをさらに含む、項目4に記載の方法。
(項目8)
前記プレートを装填するステップの前に、空気透過性シールで前記ウェルを被覆するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記ウェル内の前記半固形培地の深度は、約1ミリメートル以下である、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記体積画像スタック内の連続画像の個別のZ座標は、少なくとも約20マイクロメートルだけ異なる、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記体積画像スタック内の連続画像の前記個別のZ座標は、約50マイクロメートル未満だけ異なる、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記体積画像スタック内の連続画像の前記個別のZ座標は、25マイクロメートル~45マイクロメートルだけ異なる、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記体積画像スタックは、前記ウェル内の前記半固形培地の深度全体に及ぶ、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記第1の複数の画像は、前記複数の細胞の大部分が分裂する前に収集される、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記第1の複数の画像は、前記半固形培地がゲル化した後の約6時間以内に収集される、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記第1の複数の画像の分解能は、単一細胞の識別を可能にする、項目1に記載の方法。
(項目17)
単一細胞の画像は、前記デジタル撮像デバイスの少なくとも約4ピクセルを占有する、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記ウェルは、透明基部を有し、前記デジタル撮像デバイスは、前記基部の下方に配置される対物レンズを有する、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記対物レンズの倍率は、2倍~7倍である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記対物レンズの開口数は、0.1~0.4である、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記対物レンズは、乾燥対物レンズである、項目18に記載の方法。
(項目22)
前記第1の複数の画像のうちの各画像は、全て前記Z軸に沿って同一の高さにおいて捕捉される、組み合わせられた複数のより小さい画像を備える、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記複数のより小さい画像は、水平面に対する前記デジタル撮像デバイスの個別の既知の位置に基づいて組み合わせられる、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記体積画像スタックに基づいて、複数の細胞場所をマップするステップと、
前記複数の細胞場所から、少なくとも選択された第1の距離だけ全ての他の細胞から離間される単一細胞を識別するステップと、
前記細胞の候補コロニーの潜在的場所を前記識別された単一細胞に対応する場所に限定するステップと、
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目25)
前記体積画像スタックは、第1の体積画像スタックであり、
前記第2の時間の前に、前記デジタル撮像デバイスを使用して、第2の体積画像スタックが前記ウェルに対して生成されるように、前記ウェルの第2の複数の垂直に離間した画像を捕捉するステップと、
前記第2の体積画像スタックを前記第1の体積画像スタックと比較し、前記半固形培地内の前記細胞の移動を決定するステップと
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目26)
前記ウェルの第1の複数の垂直に離間した画像を捕捉するために使用される前記デジタル撮像デバイスは、第1のデジタル撮像デバイスであり、前記ウェルの1つ以上の画像は、第2のデジタル撮像デバイスを使用して、前記第2の時間に捕捉される、項目1に記載の方法。
(項目27)
前記第2のデジタル撮像デバイスは、前記ウェルの上方に配置される、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記第1の時間および前記第2の時間は、少なくとも10日だけ異なる、項目1に記載の方法。
(項目29)
前記細胞の候補コロニーの場所を識別するステップはさらに、単クローン性以外の少なくとも1つの基準を含む、項目1に記載の方法。
(項目30)
前記少なくとも1つの基準は、前記コロニーの形状、密度、およびサイズから成る群から選択される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記少なくとも1つの基準は、任意の他の細胞のコロニーへの前記候補コロニーの近接性に少なくとも部分的に基づく、項目29に記載の方法。
(項目32)
前記少なくとも1つの基準は、前記候補コロニーからの蛍光強度を含む、項目29に記載の方法。
(項目33)
前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、1つ以下の細胞が前記候補コロニーの場所の選択された距離内の前記体積画像スタックの中で見出されたことを観察するステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目34)
前記距離は、約50μm以下である、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、前記候補コロニーの選択された距離によって画定される半球体積に交差する細胞場所確率円錐の数を観察するステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目36)
前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、前記候補コロニーの場所を前記体積画像スタック内の対応する場所と比較するステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目37)
前記候補コロニーの場所を前記体積画像スタック内の対応する場所と比較するステップは、前記候補コロニーと前記体積画像スタック内で位置特定可能な1つ以上の個々の細胞との間の個別の距離を評価するステップを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
採集するステップの後に、コロニーの少なくとも一部を分注コンテナに再配置するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目39)
前記サンプルプレートの第2のウェル上で捕捉するステップ、識別するステップ、決定するステップ、および採集するステップを繰り返すステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目40)
細胞コロニーを採集するための装置であって、
サンプルコンテナを受容するように構成される装置台であって、前記サンプルコンテナは、複数の細胞が存在する半固形培地の体積を支持する透明基部を備える、装置台と、
デジタルカメラであって、前記デジタルカメラは、前記半固形培地中の前記細胞のデジタル画像が、前記サンプルコンテナの透明基部を通して捕捉可能であるように、前記装置台の下方に配置される対物レンズを有する、デジタルカメラと、
Z軸ポジショナであって、前記Z軸ポジショナは、前記対物レンズに結合され、選択可能な垂直高さにおいて前記対物レンズを位置付けるように構成される、Z軸ポジショナと、
前記コロニーの少なくとも一部を単離するための前記装置の採集ヘッドと、
コントローラであって、前記コントローラは、前記デジタルカメラ、前記Z軸ポジショナ、および採集ヘッドに結合され、前記コントローラは、プロセッサを備え、前記プロセッサは、記憶された命令のセットを実行することにより、(i)体積画像スタックが生成されるように、各画像が前記透明基部を通して撮影され、前記Z軸に沿って異なる高さを有する前記半固形培地の体積の複数の垂直に離間した画像を捕捉することと、(ii)前記採集ヘッドを位置付けて前記コロニーの少なくとも一部を単離することとを行うように構成されている、コントローラと
を備える、装置。
(項目41)
前記対物レンズおよび前記コントローラに結合され、選択可能な水平位置において前記対物レンズを位置付けるように構成される、X-Yポジショナをさらに備える、項目40に記載の装置。
(項目42)
前記複数の垂直に離間した画像は、第1の時間に捕捉され、前記プロセッサはさらに、記憶された命令のセットを実行することにより、前記第1の時間よりも実質的に遅い第2の時間に、前記半固形培地の体積の1つ以上の画像を捕捉するように構成される、項目40に記載の装置。
(項目43)
前記単一細胞の画像は、前記デジタルカメラの少なくとも約4ピクセルを占有する、項目40に記載の装置。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
デジタル撮像デバイスを有する装置を使用して、1つ以上の単クローン性細胞コロニーを選択するための方法であって、
前記装置上にサンプルプレートを装填するステップであって、前記サンプルプレートは、半固形培地の中で保持される複数の細胞を有するウェルを含む、ステップと、
第1の時間に、前記デジタル撮像デバイスを使用して、前記ウェルの第1の複数の垂直に離間した画像を捕捉するステップであって、各画像は、体積画像スタックが前記ウェルに対して生成されるように、Z軸に沿って異なる高さを有する、ステップと、
前記第1の時間よりも実質的に遅い第2の時間に捕捉される、前記ウェルの1つ以上の画像に基づいて、細胞の候補コロニーの場所を識別するステップと、
前記体積画像スタックに基づいて、前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップと、
前記決定された可能性の測定値に応答して、前記装置の採集ヘッドを使用して前記候補コロニーを採集し、前記コロニーの少なくとも一部を単離するステップと
を含む、方法。
(項目2)
前記半固形培地の中に前記複数の細胞を定着させるステップをさらに含み、第1の複数の画像を捕捉するステップは、定着から24時間未満後に実施される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記第1の複数の画像を捕捉するステップは、定着から6時間未満後に実施される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記複数の細胞を定着させるステップと、前記装置上にサンプルプレートを装填するステップとの間に、定着された細胞を含有する前記ウェルを遠心分離するステップをさらに含む、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記ウェルを遠心分離するステップは、少なくとも3分間、重力の少なくとも50倍の遠心力で実施される、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記ウェルを遠心分離するステップは、約5分間、前記重力の約100倍の遠心力で実施される、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記遠心分離するステップの後に、付加的半固形培地を前記ウェルに添加するステップをさらに含む、項目4に記載の方法。
(項目8)
前記プレートを装填するステップの前に、空気透過性シールで前記ウェルを被覆するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記ウェル内の前記半固形培地の深度は、約1ミリメートル以下である、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記体積画像スタック内の連続画像の個別のZ座標は、少なくとも約20マイクロメートルだけ異なる、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記体積画像スタック内の連続画像の前記個別のZ座標は、約50マイクロメートル未満だけ異なる、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記体積画像スタック内の連続画像の前記個別のZ座標は、25マイクロメートル~45マイクロメートルだけ異なる、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記体積画像スタックは、前記ウェル内の前記半固形培地の深度全体に及ぶ、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記第1の複数の画像は、前記複数の細胞の大部分が分裂する前に収集される、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記第1の複数の画像は、前記半固形培地がゲル化した後の約6時間以内に収集される、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記第1の複数の画像の分解能は、単一細胞の識別を可能にする、項目1に記載の方法。
(項目17)
単一細胞の画像は、前記デジタル撮像デバイスの少なくとも約4ピクセルを占有する、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記ウェルは、透明基部を有し、前記デジタル撮像デバイスは、前記基部の下方に配置される対物レンズを有する、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記対物レンズの倍率は、2倍~7倍である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記対物レンズの開口数は、0.1~0.4である、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記対物レンズは、乾燥対物レンズである、項目18に記載の方法。
(項目22)
前記第1の複数の画像のうちの各画像は、全て前記Z軸に沿って同一の高さにおいて捕捉される、組み合わせられた複数のより小さい画像を備える、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記複数のより小さい画像は、水平面に対する前記デジタル撮像デバイスの個別の既知の位置に基づいて組み合わせられる、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記体積画像スタックに基づいて、複数の細胞場所をマップするステップと、
前記複数の細胞場所から、少なくとも選択された第1の距離だけ全ての他の細胞から離間される単一細胞を識別するステップと、
前記細胞の候補コロニーの潜在的場所を前記識別された単一細胞に対応する場所に限定するステップと、
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目25)
前記体積画像スタックは、第1の体積画像スタックであり、
前記第2の時間の前に、前記デジタル撮像デバイスを使用して、第2の体積画像スタックが前記ウェルに対して生成されるように、前記ウェルの第2の複数の垂直に離間した画像を捕捉するステップと、
前記第2の体積画像スタックを前記第1の体積画像スタックと比較し、前記半固形培地内の前記細胞の移動を決定するステップと
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目26)
前記ウェルの第1の複数の垂直に離間した画像を捕捉するために使用される前記デジタル撮像デバイスは、第1のデジタル撮像デバイスであり、前記ウェルの1つ以上の画像は、第2のデジタル撮像デバイスを使用して、前記第2の時間に捕捉される、項目1に記載の方法。
(項目27)
前記第2のデジタル撮像デバイスは、前記ウェルの上方に配置される、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記第1の時間および前記第2の時間は、少なくとも10日だけ異なる、項目1に記載の方法。
(項目29)
前記細胞の候補コロニーの場所を識別するステップはさらに、単クローン性以外の少なくとも1つの基準を含む、項目1に記載の方法。
(項目30)
前記少なくとも1つの基準は、前記コロニーの形状、密度、およびサイズから成る群から選択される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記少なくとも1つの基準は、任意の他の細胞のコロニーへの前記候補コロニーの近接性に少なくとも部分的に基づく、項目29に記載の方法。
(項目32)
前記少なくとも1つの基準は、前記候補コロニーからの蛍光強度を含む、項目29に記載の方法。
(項目33)
前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、1つ以下の細胞が前記候補コロニーの場所の選択された距離内の前記体積画像スタックの中で見出されたことを観察するステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目34)
前記距離は、約50μm以下である、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、前記候補コロニーの選択された距離によって画定される半球体積に交差する細胞場所確率円錐の数を観察するステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目36)
前記候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、前記候補コロニーの場所を前記体積画像スタック内の対応する場所と比較するステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目37)
前記候補コロニーの場所を前記体積画像スタック内の対応する場所と比較するステップは、前記候補コロニーと前記体積画像スタック内で位置特定可能な1つ以上の個々の細胞との間の個別の距離を評価するステップを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
採集するステップの後に、コロニーの少なくとも一部を分注コンテナに再配置するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目39)
前記サンプルプレートの第2のウェル上で捕捉するステップ、識別するステップ、決定するステップ、および採集するステップを繰り返すステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目40)
細胞コロニーを採集するための装置であって、
サンプルコンテナを受容するように構成される装置台であって、前記サンプルコンテナは、複数の細胞が存在する半固形培地の体積を支持する透明基部を備える、装置台と、
デジタルカメラであって、前記デジタルカメラは、前記半固形培地中の前記細胞のデジタル画像が、前記サンプルコンテナの透明基部を通して捕捉可能であるように、前記装置台の下方に配置される対物レンズを有する、デジタルカメラと、
Z軸ポジショナであって、前記Z軸ポジショナは、前記対物レンズに結合され、選択可能な垂直高さにおいて前記対物レンズを位置付けるように構成される、Z軸ポジショナと、
前記コロニーの少なくとも一部を単離するための前記装置の採集ヘッドと、
コントローラであって、前記コントローラは、前記デジタルカメラ、前記Z軸ポジショナ、および採集ヘッドに結合され、前記コントローラは、プロセッサを備え、前記プロセッサは、記憶された命令のセットを実行することにより、(i)体積画像スタックが生成されるように、各画像が前記透明基部を通して撮影され、前記Z軸に沿って異なる高さを有する前記半固形培地の体積の複数の垂直に離間した画像を捕捉することと、(ii)前記採集ヘッドを位置付けて前記コロニーの少なくとも一部を単離することとを行うように構成されている、コントローラと
を備える、装置。
(項目41)
前記対物レンズおよび前記コントローラに結合され、選択可能な水平位置において前記対物レンズを位置付けるように構成される、X-Yポジショナをさらに備える、項目40に記載の装置。
(項目42)
前記複数の垂直に離間した画像は、第1の時間に捕捉され、前記プロセッサはさらに、記憶された命令のセットを実行することにより、前記第1の時間よりも実質的に遅い第2の時間に、前記半固形培地の体積の1つ以上の画像を捕捉するように構成される、項目40に記載の装置。
(項目43)
前記単一細胞の画像は、前記デジタルカメラの少なくとも約4ピクセルを占有する、項目40に記載の装置。
本開示は、生存単クローン性コロニーを成長させ、それらの生存能力が実証された後にコロニーを単クローン性として識別し、それらを採集し、標的環境の中に設置するための方法および装置を含む、システムを提供する。有意に、本方法は、最初に、生存単クローン性コロニーを成長させ、次いで、生存能力を証明した後に、コロニーを単クローン性として識別または確認するステップを伴ってもよい。対照的に、現在の技術は、最初に、定義により単クローン性である単一細胞を単離し、次いで、単離された細胞を生存コロニーに培養しようとするステップを伴う。これらの現在の技術は、手動集約的であり、時間がかかり、概して、96ウェルプレート中のウェルあたり単一の細胞を設置するステップを含む、いくつかのステップを伴う。また、現在の技術を用いると、細胞生存能力は、不良であり(典型的には、40%未満の生存率)、大量の試薬および多数のマルチウェルプレートが、所望の数の単クローン性コロニーを取得するために要求される(例えば、10,000個のコロニーを収穫するために400枚のプレート)。本開示のさらなる側面が、以下の節、すなわち、(I)方法の概説、(II)装置の概説、および(III)実施例に説明される。
I. 方法の概説
図1-4は、単クローン性細胞コロニーを生成するための例示的方法を示す、フローチャートである。方法と関連付けられるステップの殆どまたは全ては、細胞が定着される、「第0日(Day ZeroまたはDay 0)」と称される、最初の日と、単クローン性細胞コロニーが採集および移送される、「採集日」と称される、最終日とに実施される。概略すると、これらのステップは、第0日に細胞を撮像するステップと、採集日に細胞コロニーを撮像するステップとを含む。これらの画像の比較は、ユーザが、採集日に選択されたコロニーが第0日に撮像された単一細胞に対応するかどうか(すなわち、コロニー内の細胞の全てが、単一起源細胞から生じるため、単クローン性であるかどうか)を確認することを可能にする。方法の詳細が、下記に説明される。
図1-4は、単クローン性細胞コロニーを生成するための例示的方法を示す、フローチャートである。方法と関連付けられるステップの殆どまたは全ては、細胞が定着される、「第0日(Day ZeroまたはDay 0)」と称される、最初の日と、単クローン性細胞コロニーが採集および移送される、「採集日」と称される、最終日とに実施される。概略すると、これらのステップは、第0日に細胞を撮像するステップと、採集日に細胞コロニーを撮像するステップとを含む。これらの画像の比較は、ユーザが、採集日に選択されたコロニーが第0日に撮像された単一細胞に対応するかどうか(すなわち、コロニー内の細胞の全てが、単一起源細胞から生じるため、単クローン性であるかどうか)を確認することを可能にする。方法の詳細が、下記に説明される。
A. 第0日活動
第0日活動は、細胞を定着させるステップと、所望に応じて、操作を実施し、細胞の一様な空間分布および後続の成長を助長するステップと、細胞の第0日場所を捕捉するステップとを含む(図1参照)。ウェルは、第0日ステップの合間にインキュベータの中に貯蔵されてもよい。
第0日活動は、細胞を定着させるステップと、所望に応じて、操作を実施し、細胞の一様な空間分布および後続の成長を助長するステップと、細胞の第0日場所を捕捉するステップとを含む(図1参照)。ウェルは、第0日ステップの合間にインキュベータの中に貯蔵されてもよい。
ステップDZ-S1。着目細胞および好適な成長培地が、「定着」と称されるプロセスにおいて、組み合わせられ、サンプルウェルに添加される。ウェルは、概して、細胞および支持材料を保持するための任意の好適なコンテナを備える。典型的には、ウェルは、組織培養プレート、マイクロプレート、または他のマルチウェルプレート等のサンプルプレート内の複数のウェルのうちの1つであろう。ウェルは、ウェルの内容物が下方から視認および撮像されることを可能にする、透明基部を有してもよい。代替として、または加えて、内容物は、上方から視認および撮像されてもよい。通常、細胞および成長培地は、マルチウェルサンプルプレートのウェルの全ての中に装填される。成長培地は、ウェルに添加された後に、ゲル化する、および/または別様にその粘度を増加させるように設計または選択されてもよい。ゲル化は、細胞および細胞コロニーの移動を減速または停止し、したがって、経時的にそれらの場所を追跡することを促進し得るが、しかしながら、細胞が分裂することを防止しない。ゲル化は、理想的には、細胞分裂のために要求される特徴的な時間に対して迅速に、例えば、とりわけ、約6時間以内、約4時間以内、約2時間以内、約1時間以内、または約30分以内に起こる。そうでなければ、細胞分裂は、細胞分裂を受けた、その場所における単一細胞に由来する2つの単クローン性細胞から近接する、2つの無関係細胞を区別することを不可能にし得る。好適な成長培地は、市販の半固体マトリクス(SSM)を含む。
ステップDZ-S2。種々の追跡ステップが、良質の定着および後続の細胞生存能力を助長するように実施されてもよい。例えば、サンプルウェルは、ウェルの底部に向かった細胞移動(沈降)を加速するように遠心分離されてもよい。いくつかの実施形態では、付加的培地が、本ステップの後に追加されてもよく、殆どまたは全ての細胞コロニーがウェルの底部分に位置するであろうことを確実にする一方で、また、付加的培地も提供し、細胞成長および生存能力を助長する。同一または他の実施形態では、ウェルは、ウェル内容物を保護し、蒸発を防止するように、空気透過性シールまたは他のカバーで被覆されてもよい。これらのステップは、実施例3でさらに追究される。
ステップDZ-S3。ウェルまたはサンプルプレートは、デジタル撮像システム等の撮像システムと、ウェルを支持するためのテーブルまたはステージ等の機構とを有する、装置上に設置または別様に装填されてもよい。本ステップは、典型的には、ぶつかり合う細胞を回避するように、支持材料がゲル化した後、かつ撮像前に実施される(下記参照)。本および他の撮像ステップにおける画像は、任意の好適な形式で作成および記憶されてもよい。
ステップDZ-S4。ウェルの複数の垂直に離間した画像が、デジタル撮像デバイスを使用して捕捉されてもよい。これらの画像は、ウェルを通して、より具体的には、ウェルの成長培地含有部分を通して、異なるZ高さにおいて撮影されてもよく、体積画像スタック(代替として、Zスタックと称され得る)を生成する。体積画像スタックは、個々のカードが個々の画像を表し、カードのセットが画像スタックを表す、1組のトランプに例えられ得る。アナロジーを続けると、1組の上部と底部との間に延設される垂線は、Z(垂直)方向を表し、カードの平面は、XY(水平)方向を表す。ある場合には、ウェルサイズおよび撮像デバイスの詳細の両方に応じて、撮像デバイスは、ウェル全体を通して水平スライスを捕捉してもよい。しかしながら、より一般的に、特に大型ウェルを用いると、撮像デバイスは、ウェルを通してXY平面の一部のみを捕捉するであろう。この場合、複数の水平にオフセットされた画像が、各Z高さにおいて捕捉されてもよく、次いで、これらの画像は、ウェルのより大きい水平面積を網羅するように、ともにタイル化(当接)またはスティッチ(重複)されてもよい。画像スタックの目的は、コロニー場所との以降の比較のために、ウェル内の個々の細胞の初期場所を識別することができることである。光源および検出器を含む、撮像のさらなる側面が、本願の他の場所で議論される。
ステップDZ-S5。ウェルは、撮像の完了後に装置から除去され、コロニー成長を可能にするように貯蔵される(典型的には培養される)。
B. 第1日から採集日前日までの活動
ウェルは、細胞成長に有利な条件下で第0日から採集日まで培養される。これらの条件は、適切な大気組成、湿度、および温度を含んでもよい。条件はまた、適切な栄養素、緩衝剤、補因子、および同等物の提供を含んでもよい。生存細胞は、本時間中に分裂し、コロニーを形成するであろう。例えば、哺乳類細胞の典型的倍増時間は、24時間であり、したがって、第N日に、各起源細胞からの細胞は、およそ2N個の細胞を含むコロニーを形成するであろう。したがって、理想的条件下で、細胞コロニーは、それぞれ、第10、12、および14日に、約1,000個、約4,000個、および約16,000個の細胞を含有し得る。
ウェルは、細胞成長に有利な条件下で第0日から採集日まで培養される。これらの条件は、適切な大気組成、湿度、および温度を含んでもよい。条件はまた、適切な栄養素、緩衝剤、補因子、および同等物の提供を含んでもよい。生存細胞は、本時間中に分裂し、コロニーを形成するであろう。例えば、哺乳類細胞の典型的倍増時間は、24時間であり、したがって、第N日に、各起源細胞からの細胞は、およそ2N個の細胞を含むコロニーを形成するであろう。したがって、理想的条件下で、細胞コロニーは、それぞれ、第10、12、および14日に、約1,000個、約4,000個、および約16,000個の細胞を含有し得る。
ウェルは、随意に、第0日と採集日との間に撮像または別様に分析されてもよい。本随意の撮像は、単一水平区分の一部または全てを示す、平面画像を収集するステップ、またはZスタック全体を示す、体積画像を収集するステップを含んでもよい。これらの中間時間画像は、細胞場所のさらなる履歴証拠を提供するステップ、コロニーの健全性を査定するステップ、採集日をスケジュールするときを決定するステップ等を含む、任意の好適な目的のために使用されることができる。
C.採集日活動
採集日活動は、細胞のコロニーを撮像するステップと、撮像されたコロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップと、その可能性に基づいて、好適なコロニーの「採集リスト」を作成するステップと、各コロニーの少なくとも一部を物理的に回収し、それを標的環境の中に設置することによって、コロニーを採集し、リスト上に設置するステップとを含む(図2-4参照)。
採集日活動は、細胞のコロニーを撮像するステップと、撮像されたコロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップと、その可能性に基づいて、好適なコロニーの「採集リスト」を作成するステップと、各コロニーの少なくとも一部を物理的に回収し、それを標的環境の中に設置することによって、コロニーを採集し、リスト上に設置するステップとを含む(図2-4参照)。
ステップPD-S1。候補コロニーを含有するサンプルプレートが、撮像面積内に設置されてもよい。撮像面積は、照明および撮像中にサンプルプレートを保持および操作するためのテーブルおよび/またはステージ等のサンプル支持体を含んでもよい。
ステップPD-S2。サンプルプレートを含有する撮像面積は、好適な光を使用して照明されてもよい。本光は、光源からサンプルを通して検出器に指向される、徹照を介して、光源からサンプルに、かつ同一の経路に沿ってサンプルから光源に戻るように指向される、落射照明を介して、および/またはサンプルから検出器への軸を外れた角度から、光源からサンプルに指向される、側面照明を介して、提供されてもよい。照明光は、サンプルに応じて、白色光または着色光を含んでもよい。白色光が、典型的には、非染色コロニーに使用される一方で、着色光は、典型的には、染色コロニーに使用される。照明光はまた、蛍光検定における使用のための具体的な色を用いてフィルタ処理または生成されてもよい。
ステップPD-S3。サンプルプレートは、典型的には、適用された照明を使用して、単一平面内で撮像されてもよい。画像は、第0日画像を捕捉するために使用される撮像デバイスと同一である、または異なり得る、デジタル撮像デバイスを使用して捕捉される。
ステップPD-S4。捕捉された画像は、候補コロニーを識別するように、かつ候補コロニーが単クローン性である可能性を査定するように処理されてもよい。候補コロニーの識別は、それらの色、背景に対するそれらの吸光度または反射率、および/または他の性質に起因して、コロニーを認識するソフトウェアを使用して実施されてもよい。ある場合には、細胞コロニーは、蛍光を使用して、可視にされてもよい。例えば、細胞コロニーから分泌される、その表面上に発現される、またはその内側に含有される、着目タンパク質に結合する、蛍光標識抗体が、使用されてもよい。蛍光撮像の間に、細胞コロニーは、適切な励起波長で照明されたときに、明るく発光するスポットとして現れるであろう。細胞コロニーの直接近傍の蛍光抗体の枯渇もまた、起こり得、これは、「逆ハロー」(すなわち、画像処理を補助する、各明るいコロニーの周囲のより暗い面積)を生産する付加的利益を有する。代替として、染色の場合、細胞コロニーは、好適な染色を培地の中に混合することによって、可視にされてもよい。最終的に、多くのコロニーが、蛍光または染色を伴わずに識別されることができる。図3に関連して下記に説明されるように、単クローン性選択基準をさらに満たすコロニーの場所は、コロニー座標の採集リストにコンパイルされる。
ステップPD-S5。採集リスト上のコロニーからの細胞が、次に、ロボットデバイスを使用して、取り上げられ、または収集され、典型的には、別のサンプルプレート内の新しい環境に移送される。コロニー採集はさらに、図4に関連して下記で説明される。
ステップPD-S6。画像および他のデータが、将来の参照のために記憶される。
ステップPD-S7。採集されたコロニーを含有するサンプルプレートが、さらなる成長および/または分析のために除去される。
図3は、コロニー選択および採集リストの生成に関する、ステップPD-S4のさらなる側面を示す、フローチャートである。候補コロニーはそれぞれ、第0日画像が検査され、コロニーが単一細胞に由来する確率が推定される、二次分析を受ける。換言すると、単クローン性としてのコロニーの識別は、採集日画像内のコロニーの位置を第0日画像内の単一起源細胞の位置と相関させることによって行われる。これは、所望される場合、第1日から採集日前日までに撮影された画像を用いて明示的に確認され得る、細胞移動についてある仮定を行うことを伴う。細胞は、経時的に培地を通して漂流または別様に下向きに移動する傾向がある。本移動の大部分は、半固形培地の粘度が、概して、時間とともに増加するため、定着の直後に起こる。故に、典型的には、定着と第0日の撮像との間に遅延が、存在する。これは、第0日場所のより良好な決定、したがって、採集日(例えば、10~14日後)の細胞コロニーの起源のより良好な決定を可能にする。それでもなお、細胞は、培地がゲル化した場合でも、典型的には、下向きに移動し続けることができる。所与の開始位置に対応する、可能性として考えられる位置の分布は、開始位置にその頂点がある、逆円錐を形成する。候補コロニーが採集日に識別されると、付加的分析が、第0日に生成された体積画像スタックに基づいて、単クローン性を確認するように実施される。例えば、単一細胞のみが、候補コロニーに中心合わせされた選択された半径によって画定される半球に交差する、推定場所の円錐を有し、その場合、単クローン性の高い可能性が存在するであろうことが決定されてもよい。ユーザは、コロニーが単クローン性である可能性の測定値を使用して、採集するそのコロニーの最終選択を行う。ある場合には、本選択肢は、第0日、および多時点追跡が採用される場合、以降の日からの証明となる画像の再検査によって、知らされてもよい。
図4は、細胞コロニー採集に関する、ステップPD-S5のさらなる側面を示す、フローチャートである。ステップPD-S5は、いくつかのサブステップを有する。PD-S5.1では、コロニーが、採集のために採集リストから選択される。PD-S5.2では、ピンまたは他の回収デバイスが、採集される細胞コロニーの割り当てられたXY座標まで移動される。ピンは、ピンの端部が標的細胞コロニーにわたる培地の中に導入された状態で、コロニー採集位置に「発射」(すなわち、下降)される。コロニーが付着性である場合、ピンの端部は、標的細胞コロニーを遊離させるように攪拌されてもよい。次に、ピンは、標的コロニーの一部または全てを含む、培地の定義された体積を吸引または別様に取り上げる。最終的に、ピンが、後退され、サンプルが、留保される。PD-S5.3では、ピンの全てが使用されていない、または採集リスト内のコロニーの全てが収集されていない限り起こるであろう、別のコロニーおよび別のピンを用いた採集プロセスを繰り返すかどうかという決定が行われる。PD-S5.4では、採集されたコロニーが、標的環境、例えば、マルチウェルプレートの中に分注される。分注は、連続的に(一度に1つの標的ウェル)、および/または並行して(ピンおよび標的ウェルが同一の占有面積を有する場合に起こり得る、同時に複数の標的ウェル)起こってもよい。PD-S5.5では、ピンは、交換されるか、またはより一般的には、さらなる使用のために清掃および乾燥されるかのいずれか一方が行われる。PD-S5.6では、採集リスト内の全てのコロニーが収集および移送されていない限り起こるであろう、ステップPD-S5.1からPD-S5.5を繰り返すかどうかという決定が行われる。ステップPD-S5を実施するための好適な装置およびさらなる詳細が、米国特許第7,776,584号に説明されている。
II. 装置の概説
図5-7は、単クローン性細胞コロニーを識別および採集するための例示的装置100を示す。本装置は、対物レンズ108と、ウェルの内容物の画像を捕捉するための検出器(例えば、CCDカメラ、CMOSカメラ等)110とを備える、デジタル撮像デバイス(すなわち、カメラ)106にわたる、サンプルウェル105を伴うマルチウェルプレート104を支持するための主要台またはテーブル102を含んでもよい。主要台102およびその上に搭載された細胞採集デバイス112は、上側エンクロージャ114によって被覆されてもよい。採集デバイスは、細胞コロニーの部分に係合し、それを取り上げるためのピン(細胞採集デバイス112からの垂直突起として示される)を含んでもよい。ある場合には、ピンは、中空であり、それらがコロニーの一部を「吸い上げ」、次いで、目的地ウェルまたは他の場所にそれを「噴出」することを可能にし得る。装置の基部は、下側エンクロージャ116の中にカメラを収納してもよい。上側エンクロージャおよび下側エンクロージャは、集合的に筐体を形成してもよい。対物レンズまたはカメラ全体は、3次元位置付けのために、X-Y軸ステージ118および/またはZ軸ステージ120上に搭載されてもよい。いくつかの実施形態では、カメラは、複数の共平面画像を撮影してもよく、これらの画像は、単一の画像を形成するようにともにスティッチまたはタイル化されてもよい。同一および/または他の実施形態では、カメラは、種々のZ高さにおいてさらなる画像を捕捉してもよい。1つまたは複数のコントローラ122が、本装置と通信してもよく、カメラ活動、および細胞採集および機械視覚活動を協調および制御するために使用されてもよい。種々の照明デバイスが、撮像のためにウェルプレート領域を照らすように利用されてもよい。例えば、白色光徹照124および/または蛍光落射照明源126が、使用されてもよい。本装置はさらに、適切な培地および試薬を供給するためのアクセス可能な流体工学ステーションを含んでもよい。好適な装置のさらなる側面が、米国特許第7,776,584号に説明されている。
図5-7は、単クローン性細胞コロニーを識別および採集するための例示的装置100を示す。本装置は、対物レンズ108と、ウェルの内容物の画像を捕捉するための検出器(例えば、CCDカメラ、CMOSカメラ等)110とを備える、デジタル撮像デバイス(すなわち、カメラ)106にわたる、サンプルウェル105を伴うマルチウェルプレート104を支持するための主要台またはテーブル102を含んでもよい。主要台102およびその上に搭載された細胞採集デバイス112は、上側エンクロージャ114によって被覆されてもよい。採集デバイスは、細胞コロニーの部分に係合し、それを取り上げるためのピン(細胞採集デバイス112からの垂直突起として示される)を含んでもよい。ある場合には、ピンは、中空であり、それらがコロニーの一部を「吸い上げ」、次いで、目的地ウェルまたは他の場所にそれを「噴出」することを可能にし得る。装置の基部は、下側エンクロージャ116の中にカメラを収納してもよい。上側エンクロージャおよび下側エンクロージャは、集合的に筐体を形成してもよい。対物レンズまたはカメラ全体は、3次元位置付けのために、X-Y軸ステージ118および/またはZ軸ステージ120上に搭載されてもよい。いくつかの実施形態では、カメラは、複数の共平面画像を撮影してもよく、これらの画像は、単一の画像を形成するようにともにスティッチまたはタイル化されてもよい。同一および/または他の実施形態では、カメラは、種々のZ高さにおいてさらなる画像を捕捉してもよい。1つまたは複数のコントローラ122が、本装置と通信してもよく、カメラ活動、および細胞採集および機械視覚活動を協調および制御するために使用されてもよい。種々の照明デバイスが、撮像のためにウェルプレート領域を照らすように利用されてもよい。例えば、白色光徹照124および/または蛍光落射照明源126が、使用されてもよい。本装置はさらに、適切な培地および試薬を供給するためのアクセス可能な流体工学ステーションを含んでもよい。好適な装置のさらなる側面が、米国特許第7,776,584号に説明されている。
図6および7は、照明システムのさらなる詳細を示す。徹照器124は、サンプルウェルの上方に位置付けられ、ウェル105および関連付けられる細胞および培地を通して、検出器110まで対物レンズ108の中に進行する、光128を生産してもよい。落射照明器126は、サンプルウェルの下方に位置付けられ、ウェル105を通して上向きに進行し、ウェル内の選択されたコロニーから蛍光放射光132を励起させ、その一部は、次いで、ウェルを通して下向きに、検出器110まで対物レンズ108の中に進行する、蛍光励起光130を生産してもよい。落射照明器126はさらに、光源134と、蛍光励起フィルタ(適切である場合)136と、蛍光発光フィルタ138と、光源からウェルに、かつウェルから検出デバイスに光を指向するための光学系(例えば、鏡およびレンズ)140とを含んでもよい。光源、カメラ、フィルタ、および/または他の光学系が、好適な
有線または無線接続142A、Bおよびトリガ144A、Bを介した電子制御下にあってもよい。
有線または無線接続142A、Bおよびトリガ144A、Bを介した電子制御下にあってもよい。
図6および7はまた、X-Y-Zステージおよびコントローラのさらなる詳細も示す。X-Y(水平)およびZ(垂直)運動が、別個に支援および制御されてもよい。例えば、X-Y移動および位置が、XY軸コントローラ146、X軸エンコーダ148A、Y軸エンコーダ148B、および種々のX-Y軸制御ライン150によって制御されてもよい。同様に、Z移動が、Z軸コントローラ152、Z軸エンコーダ154、および種々のZ軸制御ライン156によって制御されてもよい。
以下の実施例は、単クローン性コロニーを産生する例示的ワークフローおよび例示的方法を含む、本開示の選択された側面および実施形態を説明する。細胞コロニーの撮像、分析、および採集は、1つの装置の中で実施されてもよい。起源細胞の位置は、コロニー成長の開始時に記録される。本位置情報は、以降で、候補コロニーが単クローン性である可能性を査定する際に使用される。実施例は、例証のみのために提示され、本開示の範囲を定義または限定することを意図していない。
(実施例1)
例示的計器/ソフトウェアワークフロー
本実施例は、例示的計器/ソフトウェアワークフローを説明する。一般に、本明細書で説明されるもの等のソフトウェア/計器ワークフローは、生物学的ワークフローと交互に生じるべきである(例えば、下記の実施例4および5を参照)。
例示的計器/ソフトウェアワークフロー
本実施例は、例示的計器/ソフトウェアワークフローを説明する。一般に、本明細書で説明されるもの等のソフトウェア/計器ワークフローは、生物学的ワークフローと交互に生じるべきである(例えば、下記の実施例4および5を参照)。
A.第0日。「第0日」は、定着の直後に起こり、X、Y、およびZ平面内の初期3次元画像捕捉を含む。第0日または以降の3次元画像捕捉は、典型的には、透過白色光(WL)を採用する。6ウェルプレート(または他の好適なプレート)が、細胞を植え付けられる。その直後に、プレートは、計器の中に設置される。初期の個々の細胞位置を確認するために、体積撮像が、6つのウェルにわたって好適な垂直間隔において画像のZスタックを捕捉するように使用される。画像の数およびそれらの間の距離を含む、捕捉性能は、培地の深度、露出時間、および任意の実験特有の基準に依存するであろう。画像捕捉のために要求される時間は、変動し得るが、一般的に、プレートあたり約45分未満であるべきである。例えば、30~35μm毎に画像を収集すると、捕捉時間は、プレートに関して約30分未満であり得る。画像は、採集のためにコロニーを単クローン性として適格とするときの使用のために、典型的には、jpeg形式において12ビットグレースケールで記憶されるであろう。
B.平面撮像。平面撮像が、透過光(WL)または蛍光(FL)照明を使用して、任意の着目時間に実施されてもよい。画像が、6つのウェルにわたって、同一の平面または複数の平面内で、プレートの底部またはその近傍で、撮影される。各ウェルは、除外ゾーンに応じて、100~140枚の画像によって網羅される。画像は、プレートの凝集像にタイル化またはスティッチされる。
C.採集日。採集日撮像が、典型的には、FL照明を使用して、上記で説明されるように、平面撮像を使用して実施される。画像は、典型的には、採集のための候補コロニーを検証するときに、分析のために、12ビットグレースケールで記憶される。単クローン性コロニーは、2段階プロセスを使用して、選択されてもよい。段階1は、採集日画像内の着目コロニーを識別するステップを含む。識別基準は、サイズ、形態、コロニーが採集ヘッドを用いて回収され得る容易性等を含んでもよい。段階2は、段階1で識別されるコロニーが単クローン性である可能性を査定するステップを含む。候補コロニー毎に、これは、候補コロニーの近傍の面積(または体積)を示す、第0日画像の領域を精査するステップと、第0日にコロニーの位置またはその近傍において単一細胞が存在した場所、および任意の他の細胞がその細胞に十分に近いため、候補コロニーと融合し、したがって、それを汚染した可能性があるコロニーを開始したかどうか等の好適な単クローン性基準の適用とを伴う。ユーザは、段階2の確率および証明となる画像に基づいて、最終選択を行ってもよい。最終選択後、コロニーが、例えば、米国特許第7,776,584号に説明されるプロセスに従って、採集され、ソースウェルから好適な目的地に移送されてもよい。
(実施例2)
例示的スループットおよび記憶計算
本実施例は、開示される方法のためのスループットおよび記憶要件を例証するための仮説的シナリオを説明する。
例示的スループットおよび記憶計算
本実施例は、開示される方法のためのスループットおよび記憶要件を例証するための仮説的シナリオを説明する。
スループット計算。ウェル内の成長培地の深度が、1mmであり、Zスタックのための画像が、50μm間隔で収集されると仮定されたい。これらの条件は、合計約20枚の画像を生産するであろう。画像あたりの露出は、5msに設定される。画像ぶれを限定するために、露出の間に可動カメラによって網羅される距離は、2μm以下であるべきである。本条件は、0.4mm/秒の一定の速度においてカメラを移動させることによって達成されることができる。したがって、1mmにわたるZ進行時間は、2.5秒である。次のフレームへの遷移あたり1.5秒を追加すること(運動オーバーヘッド)は、体積画像スタックあたり4.0秒をもたらす。100個の体積画像スタックがウェルあたりに収集されると仮定して、6ウェルプレートを撮像するために要求される合計時間は、約40分であるであろう。
記憶計算。許容画質が、ピクセルあたり8ビットを伴って、2,048×2,048カメラを使用して取得されることができる。これは、画像あたり4MB、体積画像スタックあたり80MB、および6ウェルプレートあたり48GBに対応する。要求されるデータスループットは、平均で32MB/秒である。
代替実施形態。上記の計算は、本明細書に説明される単クローン性コロニーを作成するための方法が、比較的に低スループットおよび記憶要件を有することを示すことを意図している。また、これらの要件は、比較的に標準的な条件下でさらに低減され得る。例えば、より小さい垂直高さ(例えば、0.8mm)にわたって画像を収集することによって、かつ露出時間を(例えば、1~3msまで)短縮することによって、全フレーム時間が、体積画像スタックあたり約2.2秒およびプレートあたり約25分まで短縮されることができる。同様に、好適な画像圧縮(例えば、JPEG圧縮)を使用することによって、記憶サイズが、(例えば、画像あたり約35μmだけ分離される12ビットグレースケール画像に関しても、体積画像スタックあたり約10MB未満まで)縮小されることができる。
(実施例3)
単クローン性コロニーを作成するための例示的方法
本実施例は、単クローン性コロニーを作成するための例示的方法を説明する。本方法は、プロセス全体を通して1つの計器の中で、細胞コロニーの撮像、分析、および採集を含んでもよい。本方法は、6ウェルプレート内の高い細胞生存能力および/またはより少ない(例えば、10~25枚の)プレートの使用をもたらし得る。有意に、他の場所で記述されるように、本方法は、最初に、生存単クローン性コロニーを成長させ、次いで、それらの生存能力を確立した後に、コロニーを単クローン性として識別または確認するステップを伴ってもよい。選択されたコロニーが、次いで、採集され、標的環境の中に設置されてもよい。
単クローン性コロニーを作成するための例示的方法
本実施例は、単クローン性コロニーを作成するための例示的方法を説明する。本方法は、プロセス全体を通して1つの計器の中で、細胞コロニーの撮像、分析、および採集を含んでもよい。本方法は、6ウェルプレート内の高い細胞生存能力および/またはより少ない(例えば、10~25枚の)プレートの使用をもたらし得る。有意に、他の場所で記述されるように、本方法は、最初に、生存単クローン性コロニーを成長させ、次いで、それらの生存能力を確立した後に、コロニーを単クローン性として識別または確認するステップを伴ってもよい。選択されたコロニーが、次いで、採集され、標的環境の中に設置されてもよい。
A.イントロダクション
半固形培地の中に定着された細胞の挙動は、ハードウェアおよびソフトウェア要件の両方の重要な決定要因である。本実施例は、半固形培地の中に定着された細胞のXYZ(3次元)運動の観察を要約する。これらの観察は、そのようなXYZ運動を低減させ得る、潜在的ワークフロー改良を提案および査定するために使用され、これは、ひいては、候補細胞コロニーおよびそれらの単一起源細胞の位置の相関を促進することによって、単クローン性を査定する能力を改善し得る。
半固形培地の中に定着された細胞の挙動は、ハードウェアおよびソフトウェア要件の両方の重要な決定要因である。本実施例は、半固形培地の中に定着された細胞のXYZ(3次元)運動の観察を要約する。これらの観察は、そのようなXYZ運動を低減させ得る、潜在的ワークフロー改良を提案および査定するために使用され、これは、ひいては、候補細胞コロニーおよびそれらの単一起源細胞の位置の相関を促進することによって、単クローン性を査定する能力を改善し得る。
B.材料および方法
細胞株。CHO-S(チャイニーズハムスター卵巣)。
細胞株。CHO-S(チャイニーズハムスター卵巣)。
半固体培地。L-Gln(L-グルタミン)を伴うCloneMedia CHO Growth A(Molecular Devices K8810)。
定着および培養条件。別様に記述されない限り、細胞は、中央プレートリザーバ内に4mlのH2Oを伴うGreiner 6ウェル培養プレートの中に、2ml/ウェル半固形培地(製品データシートに従って調製される)で定着された。培地/細胞の添加の直後に、プレートは、5分間、100xgにおいて遠心分離された。半固形培地は、好ましくは、細胞位置を安定させるために十分に粘性であるが、上部から底部の可視化および撮像を可能にするために十分に光学的に透明である。
マルチウェルプレート。細胞は、任意の好適なコンテナの中で成長されることができる。6ウェルプレートは、成長、撮像、および採集の組み合わせに非常に好適である。
撮像:別様に記述されない限り、全ての撮像は、Molecular Devices
ImageXpress Micro C ハイコンテント撮像システム(IXM-C)または4x/0.2NA Plan Apo対物レンズレンズを伴うMolecular Devices ImageXpress Micro 4 ハイコンテント撮像システム(IXM-4)のいずれかの上で実施された。画像Zスタックが、平面の間に50μm間隙を伴って、各撮像部位において撮影された。カメラ、カメラ/プレート位置付け、および光学経路の好適な組み合わせは、単一細胞の明確な撮像、および細胞と残渣との区別を可能にする。
ImageXpress Micro C ハイコンテント撮像システム(IXM-C)または4x/0.2NA Plan Apo対物レンズレンズを伴うMolecular Devices ImageXpress Micro 4 ハイコンテント撮像システム(IXM-4)のいずれかの上で実施された。画像Zスタックが、平面の間に50μm間隙を伴って、各撮像部位において撮影された。カメラ、カメラ/プレート位置付け、および光学経路の好適な組み合わせは、単一細胞の明確な撮像、および細胞と残渣との区別を可能にする。
(i)標準条件下の半固形培地中の細胞の定着が、コロニーをそれらの起源細胞に戻るように相関させることを極めて困難にする
定着後の最初の24時間にわたって実施された、標準条件(上記の方法を参照、2,000個の細胞/ml)下で定着された細胞(n=46個の細胞)の静的撮像時間経過分析が、細胞の約70%のみが時間0においてウェル底部の50μm以内に位置することを実証した。細胞の残りの30%は、培地体積の全体を通して分布し、これらの細胞は、最初の数時間の間にウェル底部に沈降した(8時間で細胞の100%)。ウェル底部における細胞のうち、平均90μmのXY(水平)移動が、5~170μmの範囲を伴って最初の12時間にわたって観察された。培地中でより高く分布した細胞のうち、平均400μmのXY運動が、250~520μmの範囲を伴って観察された。12時間後、軽微なXY偏移のみが、観察され、培地が細胞の有意な運動を防止するために十分にゲル化していたことを示唆した。
定着後の最初の24時間にわたって実施された、標準条件(上記の方法を参照、2,000個の細胞/ml)下で定着された細胞(n=46個の細胞)の静的撮像時間経過分析が、細胞の約70%のみが時間0においてウェル底部の50μm以内に位置することを実証した。細胞の残りの30%は、培地体積の全体を通して分布し、これらの細胞は、最初の数時間の間にウェル底部に沈降した(8時間で細胞の100%)。ウェル底部における細胞のうち、平均90μmのXY(水平)移動が、5~170μmの範囲を伴って最初の12時間にわたって観察された。培地中でより高く分布した細胞のうち、平均400μmのXY運動が、250~520μmの範囲を伴って観察された。12時間後、軽微なXY偏移のみが、観察され、培地が細胞の有意な運動を防止するために十分にゲル化していたことを示唆した。
インキュベータと計器との間のプレート移送と、画像捕捉の間の撮像ステージの移動とを伴う、非静的(動的)撮像条件(n=1,066個の細胞、3つの個々の実験、第0日撮像は定着後2~8時間に及んだ)下で、細胞の平均85%が、2時間後にウェル底部の50μm以内に位置した。細胞の残りの15%は、培地の全体を通して分布した。これらの細胞の大部分は、次の数時間にわたってウェル底部に沈降した。しかしながら、変動が、実験の間で観察され、細胞の80%~100%が、24時間後にウェル底部上にあることが観察された。ウェル底部に位置する細胞のうち、平均90μmのXY移動が、5~350μmの範囲を伴って最初の24~48時間にわたって観察された。培地中でより高く分布した細胞のうち、平均840μmのXY運動が、180~1,350μmの範囲を伴って観察された。これらの大きいXYZ運動(空間変位)は、コロニーをそれらの起源細胞と関連付けることを困難にする。加えて、細胞を移動させ、検出されていない他のコロニーと融合させるための可能性が存在し、したがって、コロニーが第0日に観察された単一細胞から生じたことが示されたとしても、単クローン性の確実性は、移動する細胞から生じるコロニーが融合したという可能性に起因して、低減される。
第0日撮像後に大きいXYZ変位を回避するための潜在的解決策は、細胞定着と第0日撮像との間の時間周期を増加させることになり、それによって、最大数の細胞がウェル底部に到達すること、または遠心分離速度または時間を増加させることによって本沈降プロセスを加速することを可能にすることであろう。
前者に関して、最低8時間が、可能な限り多くの細胞が沈降することを可能にするように、定着と撮像との間で推奨されるであろう。しかしながら、実験の間の変動性は、8時間が十分ではない場合があり、細胞の最大で20%が、依然として、本時間後に大きいXYZ変位を被り得ることを示している。加えて、定着から8時間後に、細胞の約30%が分裂しており、したがって、後に、単クローン性の不確実性に起因して、着目コロニーとして不適格と見なされるであろう。本細胞の大集団の除外は、スループットを有意に低減させるであろう。加えて、定着と撮像との間の有意な遅延が、第0日作業日が潜在的に16時間以上の時間(10枚のプレートに基づくタイミング、プレートあたり推定45分の撮像)まで延長し得るため、作業および資源結果を有し得る。
後者(増加された遠心分離)に関して、100xgにおいて5分から100xgにおいて10分までの遠心分離の増加は、第0日に細胞Z分布の差異をもたらさなかった。したがって、XYZ変位は、依然として、有意であった。遠心分離速度および時間のさらなる追究が、本結果を向上させ得るが、しかしながら、細胞生存能力への本増化された遠心分離の影響の調査もまた、要求されるであろう。
要約すると、標準条件(2ml/ウェル)下の細胞の大きいXYZ変位が、それらの起源細胞に戻るコロニーの不良な相関をもたらし、それによって、単クローン性の確実性を低減させた。
(ii)培地体積の低減が、細胞XYZ移動を低減させ、それによって、それらの起源細胞に戻るコロニーの容易な追跡を可能にする
細胞のZ座標分布が低減され得るかどうかを決定するための調査が、行われた。細胞は、本明細書では、ウェルあたりの培地の体積が2mlから1mlまで低減され、細胞の濃度が4,000個の細胞/mlまで増加されたことを除いて、上記で説明されるように定
着された。細胞(n=56個の細胞)の静的撮像時間経過分析が、細胞の100%が時間0においてウェル底部の50μm以内に位置することを実証した。平均40μmのXY運動が、8~101μmの範囲を伴って最初の12時間にわたって観察された。12時間後、軽微なXY偏移のみが、観察され、培地が有意な運動を防止するために十分にゲル化していたことを示唆した。
細胞のZ座標分布が低減され得るかどうかを決定するための調査が、行われた。細胞は、本明細書では、ウェルあたりの培地の体積が2mlから1mlまで低減され、細胞の濃度が4,000個の細胞/mlまで増加されたことを除いて、上記で説明されるように定
着された。細胞(n=56個の細胞)の静的撮像時間経過分析が、細胞の100%が時間0においてウェル底部の50μm以内に位置することを実証した。平均40μmのXY運動が、8~101μmの範囲を伴って最初の12時間にわたって観察された。12時間後、軽微なXY偏移のみが、観察され、培地が有意な運動を防止するために十分にゲル化していたことを示唆した。
インキュベータと計器との間のプレート移送と、画像捕捉の間の撮像ステージの移動とを伴った、非静的(動的)撮像条件(n=377個の細胞、3つの個々の実験、第0日撮像は定着後3~8時間に及んだ)下で、細胞の100%が、第0日においてウェル底部の50μm以内に位置した。平均110μmのXY運動が、5~300μmの範囲を伴って最初の24~48時間にわたって観察された。これらの限定されたXYZ変位は、第0日にそれらの起源細胞へのコロニーのはるかに容易な追跡を可能にする。加えて、採集のための最適なコロニー間隔のために要求される低い細胞濃度は、最も隣接するものが、概して、>0.5mmだけ分離されるであろうため、細胞が単一コロニー内で融合する可能性を減少させる。
要約すると、低減された培地体積(1ml/ウェル)を伴う細胞の縮小されたZ分布は、低減されたXYZ変位をもたらすであろう。これは、起源細胞位置とのコロニー位置の相関を促進し、単一細胞が第0日に、他の細胞が近接しない状態で候補コロニーに近接して可視である場合、単クローン性の確実性を高くする。
(iii)培地体積の低減が、細胞生存能力および成長に悪影響を及ぼす
ウェルあたりの低減された培地体積は、起源細胞およびコロニーの位置を合致させることと関連付けられる困難への解決策を提供し、したがって、単クローン性コロニーの識別の確実性を増大させる。しかしながら、低減された培地体積は、コロニー健全性および成長に影響を及ぼす。
ウェルあたりの低減された培地体積は、起源細胞およびコロニーの位置を合致させることと関連付けられる困難への解決策を提供し、したがって、単クローン性コロニーの識別の確実性を増大させる。しかしながら、低減された培地体積は、コロニー健全性および成長に影響を及ぼす。
ウェルの中に設置された1mlの培地は、ウェル表面にわたって非常に薄い層を形成し、細胞を、2mlのより大きい培地体積を用いるよりもはるかに脱水を起こしやすくさせる。第5日の培地は、明白に乾燥して見え、培地層は、はるかにより薄く、その外観/質感は、ウェル中心から縁に向かって明白に変化する。コロニーは、1mlおよび2mlの培地中で成長されたときに、異なる形態(形状)を有する。加えて、コロニーは、低減された体積においてより小さい(第6日に2mlサイズの60%、第8日に45%)。これらのデータは、低減された培地体積が、細胞健全性に悪影響を及ぼしていることを示唆する。
要約すると、単クローン性コロニーの識別の確実性は、ウェルあたりの培地体積を低減させることによって改善されるが、細胞健全性は、悪影響を受け、これは、ひいては、着目クローンの生存率に悪影響を及ぼす。
(iv)ウェルあたりの低減された培地体積に起因する細胞生存能力問題を軽減するための潜在的解決策が、利用可能である
培地脱水および細胞健全性へのその影響を軽減するためのいくつかのオプションが、利用可能である。これらは、定着後の余剰培地の添加および通気性プレートシールの使用を含む。
培地脱水および細胞健全性へのその影響を軽減するためのいくつかのオプションが、利用可能である。これらは、定着後の余剰培地の添加および通気性プレートシールの使用を含む。
余剰培地。数日の成長後の培地(半固体または液体のいずれか)の添加に対する調査は、不成功であり、細胞およびコロニーは、付加的培地によって妨害され、細胞の大きいXYZ変位をもたらし、それによって、単一起源細胞までコロニーを遡る能力を低減させた。
数日後の余剰培地の添加の代替物は、初期撮像工程の前の第0日の余剰培地の添加である。本目的のために、細胞が、1mlの半固形培地の中に定着され、100xgにおいて5分間、遠心分離された。30分待機し、細胞の大部分がウェル底部に到達することを可能にした後、付加的な1mlのCloneMedia培地が、付加的な5分の遠心分離ステップの前に、ウェル縁から滴下させることによって、上層に慎重に添加された。細胞は、第0日に、初期定着から約3時間後、および第2日に撮像された。対照ウェル(1ml培地のみ、n=107個の細胞)では、細胞の100%が、第0日にウェル底部上にあり、90μmの平均XY変位(範囲10~190μm)を有した。試験ウェル内の細胞(1ml培地/細胞、上部で層状である1ml培地、n=247個の細胞、2つの個々の実験)に関して、細胞の約95%が、第0日にウェル底部に位置し、85μmの平均XY変位(範囲1~275μm)を伴った。培地中でより高く分布した細胞の5%のうち、平均XY変位は、710μm(範囲170~1,500μm)であった。これらのXY距離値は、ウェルあたり2mlの培地で観察されるものに類似する。しかしながら、本運動を呈する細胞集団の割合は、比較すると有意に低減され、細胞の5%のみが、最大20%の代わりに培地中に高く分布する。したがって、第0日に培地を層状にする方法は、培地水和レベル、したがって、細胞健全性を維持することと、標準定着条件と比較して単クローン性コロニーを誤認するリスクを低減させる(但し、排除しない)こととの両方を行う。
プレートシール。プレートシールは、培地脱水を低減させるための別の機構を提供する。ガス透過性および無菌である、いくつかの市販のプレートが、存在する。これらの通気性シールのうちの1つ(USA Scientific Breathe-Easyシール)を使用することは、密閉を伴わないプレートと比較して、1ml/ウェルにおいて分注される培地の脱水を低減させると考えられた。しかしながら、通気性シールは、プレート密閉と比較してコロニー成長を改良したが、コロニー成長は、依然として、2mlの培地中のコロニーと比較して減損され、(シールを伴う)1ml中のコロニーは、それぞれ、第9、11、および13日に、2mlの中のもののサイズの81、71、および67%であった。本細胞成長の差異は、許容レベルを下回る培地脱水によるものである、またはおそらく、同数の細胞が培地の体積の半分で成長され、したがって、栄養素供給が、より迅速に消費されるであろうことを前提として、培地栄養素の欠如に起因し得る。コロニー成長は、1ml培地およびシールを用いると、シールを伴わない2ml培地を用いるよりも遅いが、コロニー形態は、類似し、不良な細胞健全性の可視的兆候がなく、細胞が依然として生存していることを示す派生物が、採集後に観察される。しかしながら、本結果は、それらの成長プロファイルおよび培地条件への感受性の差異を前提として、異なる細胞株に関して適用可能ではない場合がある。
要約すると、依然として、伴われるリスクが、存在するが、1mlの低減された培地体積を用いて、細胞生存能力および成長を維持するための潜在的解決策を実証している。しかしながら、これらの解決策は、それらの適用可能性の領域を定義するために付加的試験を要求するであろう。
(実施例4)
第1の例示的な生物学的ワークフロー
本実施例は、第1の例示的な生物学的ワークフローを説明する。
第1の例示的な生物学的ワークフロー
本実施例は、第1の例示的な生物学的ワークフローを説明する。
第0日-細胞を定着させる。着目細胞を1mL半固形培地の中に定着させる。プレートを通気性プレートシールでシールする。100xgで5分間、プレートを遠心分離する。加湿インキュベータの中で最低2時間、プレートを培養する。
第0日-細胞を撮像する。透過光(WL)を用いてプレート画像を捕捉する。最大50μmだけ分離される、一連の高さにおいて、プレートウェルの平面画像を収集し、半固形培地の体積全体を被覆する画像zスタックを形成する。
第4~14日-細胞を撮像する(随意)。透過光(WL)を用いて、1つ以上の平面内でプレートを撮像し、成長を監視する。
第7~14日-細胞を撮像および採集する。プレートシールを除去する。透過光(WL)および蛍光(FL)を使用して、1つ以上の平面内でプレートを撮像する。蛍光強度、形態、および/または単クローン性の確実性を含む、1つ以上のユーザ定義基準に基づいて、コロニーを選択および採集する。
(実施例5)
第2の例示的な代替生物学的ワークフロー
本実施例は、第2の例示的な代替生物学的ワークフローを説明する。
第2の例示的な代替生物学的ワークフロー
本実施例は、第2の例示的な代替生物学的ワークフローを説明する。
第0日-細胞を定着させる。着目細胞を1mL半固形培地の中に定着させる。100xgで5分間、プレートを遠心分離する。プレートを30分間培養する。ウェルの側面を使用して、既存の半固形培地にわたって付加的な1mL半固形培地を慎重に層状にする。所望される場合、プレートを通気性プレートシールでシールする。100xgでさらに5分間、プレートを遠心分離する。加湿インキュベータの中で最低2時間、プレートを培養する。
第0日-細胞を撮像する。透過光(WL)を用いてプレート画像を撮像する。最大50μmだけ分離される、一連の高さにおいて、プレートウェルの平面画像を収集し、半固形培地の体積全体を被覆する画像zスタックを形成する。
第4~14日-細胞を撮像する(随意)。透過光(WL)を用いて、1つ以上の平面内でプレートを撮像し、成長を監視する。
第7~14日-細胞を撮像および採集する。存在する場合、プレートシールを除去する。透過光(WL)および蛍光(FL)を使用して、1つ以上の平面内でプレートを撮像する。蛍光強度、形態、および/または単クローン性の確実性を含む、1つ以上のユーザ定義基準に基づいて、コロニーを選択および採集する。
(実施例6)
選択された実施形態1
本節は、限定ではないが、そのうちの一部または全てが、明確性および効率のために英数字によって指定され得る、一連の段落として提示される、細胞コロニー選択、分析、および採集方法のさらなる側面および特徴を説明する。これらの段落はそれぞれ、任意の好適な様式で、1つ以上の他の段落と、および/または本願の他の場所からの開示と組み合わせられることができる。下記の段落のうちのいくつかは、他の段落を明示的に参照し、それらをさらに限定し、限定ではないが、好適な組み合わせのうちのいくつかの実施例を提供し得る。より一般的には、全ての好適な組み合わせが、含まれる。例えば、段落A6は、段落A0を参照する一方で、とりわけ、段落A5等の他の先行する段落と、または段落A7等の後続の段落と組み合わせられることができる。同様に、1つの群の中の段落は、他の群の中の段落と組み合わせられることができる。例えば、段落A6は、B、C、およびD群の段落と組み合わせられることができる。
選択された実施形態1
本節は、限定ではないが、そのうちの一部または全てが、明確性および効率のために英数字によって指定され得る、一連の段落として提示される、細胞コロニー選択、分析、および採集方法のさらなる側面および特徴を説明する。これらの段落はそれぞれ、任意の好適な様式で、1つ以上の他の段落と、および/または本願の他の場所からの開示と組み合わせられることができる。下記の段落のうちのいくつかは、他の段落を明示的に参照し、それらをさらに限定し、限定ではないが、好適な組み合わせのうちのいくつかの実施例を提供し得る。より一般的には、全ての好適な組み合わせが、含まれる。例えば、段落A6は、段落A0を参照する一方で、とりわけ、段落A5等の他の先行する段落と、または段落A7等の後続の段落と組み合わせられることができる。同様に、1つの群の中の段落は、他の群の中の段落と組み合わせられることができる。例えば、段落A6は、B、C、およびD群の段落と組み合わせられることができる。
段落A0.デジタル撮像デバイスを有する装置を使用して、1つ以上の単クローン性細胞コロニーを選択するための方法であって、(a)装置上にサンプルプレートを装填するステップであって、サンプルプレートは、半固形培地の中で保持される複数の細胞を有する、ウェルを含む、ステップと、(b)第1の時間に、デジタル撮像デバイスを使用して、ウェルの第1の複数の垂直に離間した画像を捕捉するステップであって、第1の複数の離間した画像のうちの各画像は、第1の体積画像スタックがウェルに対して生成されるように、水平面に対して同一の場所と、Z軸に沿って異なる高さとを有する、ステップと、(c)第1の時間よりも実質的に遅い第2の時間に捕捉される、ウェルの1つ以上の共平面画像に基づいて、細胞の候補コロニーの場所を識別するステップと、(d)第1の体積画像スタックに基づいて、候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値(例えば、確率および/または細胞コロニーと第1の時間に捕捉される画像のセットの中の1つ以上の細胞の場所との間の距離)を決定するステップと、(e)選択された閾値(例えば、具体的確率および/または50μm等の規定距離値)を超える可能性の測定値に応答して、装置の採集ヘッドを使用して候補コロニーを採集し、コロニーの少なくとも一部を単離するステップとを含む、方法。
段落A0.1.細胞の候補コロニーの場所を識別するステップはさらに、コロニーの形状、密度、および/またはサイズを含む、基準に基づく、段落A0に記載の方法。
段落A0.2.細胞の候補コロニーの場所を識別するステップはさらに、任意の他のコロニーへのコロニーの近接性に基づく、段落A0に記載の方法。
段落A1.半固形培地の中に複数の細胞を定着させるステップをさらに含み、第1の複数の画像を捕捉するステップは、定着から24時間未満後に実施される、段落A0に記載の方法。
段落A2.(f)第2の時間に先立って、デジタル撮像デバイスを使用して、第2の体積画像スタックがウェルに対して生成されるように、ウェルの第2の複数の垂直に離間した画像を捕捉するステップと、(g)第2の体積画像スタックを第1の体積画像スタックと比較し、半固形培地内の細胞の移動(例えば、漂流)を決定するステップとをさらに含む、段落A0に記載の方法。
段落A3.第1の体積画像スタック内の各画像は、離散Z高さを有する、段落A0に記載の方法。
段落A4.第1の体積画像スタック内の連続画像の個別のZ高さは、少なくとも約20マイクロメートルだけ異なる、段落A3に記載の方法。
段落A5.第1の体積画像スタック内の連続画像の個別のZ高さは、約50マイクロメートル未満だけ異なる、段落A4に記載の方法。
段落A6.第1の体積画像スタックは、ウェル内の半固形培地の深度全体に及ぶ、段落A0に記載の方法。
段落A7.候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、1つ以下の細胞が候補コロニーの選択された半径内の第1の体積画像スタックの中で見出されたことを観察するステップを含む、段落A0に記載の方法。
段落A8.候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、候補コロニーの選択された半径によって画定される半球体積に交差する細胞場所確率円錐の数を観察するステップを含む、段落A7に記載の方法。
段落A9.1つ以下の細胞が見出されたことを観察するステップは、1つ以上の細胞が見出されたことを観察するステップを含む、段落A7に記載の方法。
段落A10.細胞の候補コロニーを識別するステップは、単クローン性以外の少なくとも1つの基準を含む、段落A0に記載の方法。
段落A11.第1の複数の離間した画像のうちの各画像は、組み合わせられた複数のより小さい画像を備える、段落A0に記載の方法。
段落A12.複数のより小さい画像は、水平面に対するデジタル撮像デバイスの個別の既知の位置に基づいて、切り取りおよびタイル化することによって組み合わせられる、段落A11に記載の方法。
段落A13.第1の時間および第2の時間は、少なくとも約10日だけ異なる、段落A0に記載の方法。
段落A14.第1の時間は、第0日に対応し、第2の時間は、第10日またはそれ以降に対応する、段落A13に記載の方法。
段落A15.ウェルの第1の複数の垂直に離間した画像を捕捉するために使用される、デジタル撮像デバイスは、第1のデジタル撮像デバイスであり、ウェルの1つ以上の共平面画像は、第2のデジタル撮像デバイスを使用して、第2の時間に捕捉される、段落A0に記載の方法。
段落A16.サンプルプレートの第2のウェル上で捕捉するステップ、識別するステップ、決定するステップ、および採集するステップを繰り返すステップをさらに含む、段落A0に記載の方法。
段落B0.装置を使用して、1つ以上の単クローン性細胞コロニーを選択するための方法であって、(a)装置のテーブル上にサンプルプレートを装填するステップであって、サンプルプレートは、透明基部と、半固形培地の中で保持される複数の細胞とを有する、ウェルを含み、ウェルは、空気透過性シールによって被覆される、ステップと、(b)細胞の定着に対する第0日に、ウェルの複数の垂直に離間した第1の画像を捕捉するようにテーブルの下方に配置される対物レンズを有する、デジタル撮像デバイスを使用するステップであって、各第1の画像は、体積画像スタックがウェルに対して生成されるように、透明基部を通して撮影され、Z軸に沿って異なる高さを有する、ステップと、(c)定着から少なくとも5日後に捕捉される、ウェルの1つ以上の第2の画像に基づいて、細胞の候補コロニーの場所を識別するステップと、(d)候補コロニーの場所を体積画像スタック内の対応する場所と比較することによって、候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップと、(e)選択された閾値を超える可能性の測定値に応答して、装置の採集ヘッドを使用して候補コロニーを採集し、コロニーの少なくとも一部を分注コンテナに再配置するステップとを含む、方法。
段落B1.(f)体積画像スタックに基づいて、第0日に把握される複数の細胞場所をマップするステップと、(g)複数の細胞場所から、少なくとも選択された第1の半径によって全ての他の細胞から離間される単一細胞を識別するステップと、(h)細胞の候補コロニーの潜在的場所を識別された単一細胞に対応する場所に限定するステップとをさらに含む、段落B0に記載の方法。
段落B2.候補コロニーの場所を体積画像スタック内の対応する場所と比較するステップは、候補コロニーと体積画像スタック内で位置特定可能な1つ以上の個々の細胞との間の個別の距離を決定するステップを含む、段落B0に記載の方法。
段落B3.対物レンズの倍率は、2倍~7倍である、段落B0に記載の方法。
段落B4A.対物レンズの開口数は、0.1~0.4である、段落B0に記載の方法。
段落B4B.対物レンズは、乾燥対物レンズである、段落B0に記載の方法。
段落B5.ウェルの1つ以上の第2の画像は、テーブルの上方に配置される第2のデジタル撮像デバイスを使用して、定着から少なくとも5日後に捕捉される、段落B0に記載の方法。
段落B6.対物レンズは、X-YポジショナおよびZ軸ポジショナを使用して、3次元で位置付け可能であり、本方法はさらに、(f)個別のZ高さ毎にX-Y平面内で複数のより小さい画像を捕捉するステップと、(g)複数のより小さい画像を組み合わせ、体積画像スタック内の第1の画像のうちの1つを生産するステップとを含む、段落B0に記載の方法。
段落B7.複数のより小さい画像を組み合わせるステップは、複数のより小さい画像を切り取りおよびタイル化するステップを含む、段落B6に記載の方法。
段落B8.サンプルプレートの第2のウェル上で使用するステップ、識別するステップ、決定するステップ、および採集するステップを繰り返すステップをさらに含む、段落B0に記載の方法。
段落C0.装置を使用して、1つ以上の単クローン性細胞コロニーを選択するための方法であって、(a)半固形培地が体積を画定するように、ウェルの中に選択された深度を有する、半固形培地の中に複数の細胞を定着させるステップと、(b)装置上にウェルを設置し、装置のデジタル撮像デバイスを使用して、体積の複数の第1の画像を捕捉するステップであって、各第1の画像は、複数の第1の画像が体積に及ぶように、他の第1の画像と平行であり、離散距離だけそれから直交して離間される、ステップと、(c)複数の画像の捕捉に続く複数日間、ウェルを培養するステップと、(d)培養に続いて、ウェルの単一平面の1つ以上の第2の画像を捕捉するステップと、(e)1つ以上の基準を使用して、1つ以上の第2の画像に基づいて細胞の候補コロニーを選択するステップと、(f)複数の第1の画像に基づいて、細胞の候補コロニーの単クローン性を確認するステップと、(g)装置の採集ヘッドを使用して、細胞の候補コロニーを採集するステップとを含む、方法。
段落C1A.複数の第1の画像は、複数の細胞の大部分が分裂する前に収集される、段落C0に記載の方法。
段落C1B.複数の第1の画像は、半固形培地が凝固した後の約12時間以内に収集される、段落C0に記載の方法。
段落C1C.複数の第1の画像の分解能は、単一細胞の識別を可能にする、段落C0に記載の方法。
段落C1D.培養するステップに先立って、ウェルを空気透過性膜でシールするステップをさらに含む、段落C0に記載の方法。
段落C2.装置上にウェルを設置し、第1の画像を捕捉するステップに先立って、100倍重力において少なくとも約5分、ウェルを遠心分離するステップをさらに含む、段落C0に記載の方法。
段落C3.遠心分離するステップに続いて、付加的半固形培地の層をウェルに添加するステップをさらに含む、段落C2に記載の方法。
段落C4.第1の画像の間の離散距離は、約50マイクロメートル未満である、段落C0に記載の方法。
段落C5.第1の画像は、略水平であり、垂直軸に沿って離間される、段落C0に記載の方法。
段落C6.細胞の候補コロニーの単クローン性を確認するステップは、候補コロニーの場所の選択された半径内の体積の複数の第1の画像の中に存在する、個々の細胞の数を決定するステップを含む、段落C0に記載の方法。
段落C7.選択された半径は、一定であり、体積内の半球サブボリュームを画定する、段落C6に記載の方法。
段落C8.選択された半径は、高さに基づいて可変である、段落C6に記載の方法。
段落C9.単クローン性を確認するステップはさらに、正確に1つの細胞が候補コロニーの場所の選択された半径内の体積の複数の第1の画像の中に存在することを決定するステップを含む、段落C6に記載の方法。
段落C10.半固形培地の選択された深度は、約1ミリメートルである、段落C0に記載の方法。
段落C11.候補コロニーを選択するために使用される1つ以上の基準は、蛍光強度を含む、段落C0に記載の方法。
段落D0.細胞コロニーを採集するための装置であって、(a)サンプルコンテナを受容するように構成される、装置台であって、サンプルコンテナは、複数の細胞が存在する半固形培地の体積を支持する、透明床面を備える、装置台と、(b)半固形培地中の細胞のデジタル画像が、サンプルコンテナの透明床面を通して捕捉可能であるように、装置台の下方に配置される対物レンズを有する、デジタルカメラと、(c)対物レンズに結合され、選択可能な垂直高さにおいて対物レンズを位置付けるように構成される、Z軸ポジショナと、(d)対物レンズに結合され、選択可能な水平位置において対物レンズを位置付けるように構成される、X-Yポジショナと、(e)コロニーの少なくとも一部を単離するための装置の採集ヘッドと、(f)デジタルカメラ、Z軸ポジショナ、X-Yポジショナ、および採集ヘッドに結合される、コントローラであって、該コントローラは、プロセッサを有し、該プロセッサは、記憶された命令のセットを実行することにより、(i)体積画像スタックが生成されるように、各画像が透明床面を通して撮影され、Z軸に沿って異なる高さを有する、半固形培地の体積の複数の垂直に離間した画像を捕捉することと、(ii)採集ヘッドを位置付けてコロニーの少なくとも一部を単離することとを行うように構成されている、コントローラとを備える、装置。
段落D1.対物レンズの倍率は、2倍~7倍である、段落D0に記載の装置。
段落D2.対物レンズの開口数は、0.1~0.4である、段落D0に記載の装置。
段落D3.対物レンズは、乾燥対物レンズである、段落D0に記載の装置。
段落D4.垂直に離間した画像の連続的な高さは、約50マイクロメートル以下だけ異なる、段落D0に記載の装置。
段落D5.サンプルコンテナは、マルチウェルプレートのウェルを備え、プロセッサはさらに、マルチウェルプレートの別のウェル上で記憶された命令のセットを実行するように構成される、段落D0に記載の装置。
段落D6.単一細胞の画像は、デジタルカメラの少なくとも約4ピクセルを占有する、段落D0に記載の装置。
(実施例7)
選択された実施形態2
本実施例は、限定ではないが、一連のインデックス付き段落として提示される、細胞コロニー選択、分析、および採集方法のその上さらなる側面および特徴を説明する。
選択された実施形態2
本実施例は、限定ではないが、一連のインデックス付き段落として提示される、細胞コロニー選択、分析、および採集方法のその上さらなる側面および特徴を説明する。
段落E0.デジタル撮像デバイスを有する装置を使用して、1つ以上の単クローン性細胞コロニーを選択するための方法であって、(a)装置上にサンプルプレートを装填するステップであって、サンプルプレートは、半固形培地の中で保持される複数の細胞を有する、ウェルを含む、ステップと、(b)第1の時間に、デジタル撮像デバイスを使用して、ウェルの第1の複数の垂直に離間した画像を捕捉するステップであって、各画像は、体積画像スタック(すなわち、Zスタック)がウェルに対して生成されるように、Z軸に沿って異なる高さを有する、ステップと、(c)第1の時間よりも実質的に遅い第2の時間に捕捉される、ウェルの1つ以上の画像に基づいて、細胞の候補コロニーの場所を識別するステップと、(d)体積画像スタックに基づいて、候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップと、(e)決定された可能性の測定値に応答して、装置の採集ヘッドを使用して候補コロニーを採集し、コロニーの少なくとも一部を単離するステップとを含む、方法。
段落E1.半固形培地の中に複数の細胞を定着させるステップをさらに含み、第1の複数の画像を捕捉するステップは、定着から24時間未満後に実施される、段落E0に記載の方法。
段落E2.第1の複数の画像を捕捉するステップは、定着から6時間未満後に実施される、段落E1に記載の方法。
段落E3.複数の細胞を定着させるステップと、装置上にサンプルプレートを装填するステップとの間に、定着された細胞を含有するウェルを遠心分離するステップをさらに含む、段落E1またはE2に記載の方法。
段落E4.ウェルを遠心分離するステップは、少なくとも3分間、重力の少なくとも50倍の遠心力で実施される、段落E3に記載の方法。
段落E5.ウェルを遠心分離するステップは、約5分間、重力の約100倍の遠心力で実施される、段落E4に記載の方法。
段落E6.遠心分離するステップの後に、付加的半固形培地をウェルに添加するステップをさらに含む、段落E3-E5のいずれかに記載の方法。
段落E7.プレートを装填するステップの前に、空気透過性シールでウェルを被覆するステップをさらに含む、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E8.ウェル内の半固形培地の深度は、約1ミリメートル以下である、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E9.体積画像スタック内の連続画像の個別のZ座標は、少なくとも約20マイクロメートルだけ異なる、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E10.体積画像スタック内の連続画像の個別のZ座標は、約50マイクロメートル未満だけ異なる、段落E9に記載の方法。
段落E11.体積画像スタック内の連続画像の個別のZ座標は、25マイクロメートル~45マイクロメートルだけ異なる、段落E10に記載の方法。
段落E12.体積画像スタックは、ウェル内の半固形培地の深度全体に及ぶ、任意の前述の段落に記載の方法。深度全体に及ぶことが、可能な限り多くの細胞の場所についての情報を提供し、潜在的に方法の信頼性を増大させるため、段落E0の方法が深度の一部のみを走査することを対象としても、培地の深度全体にわたって画像を収集することが、望ましくあり得る。
段落E13.第1の複数の画像は、複数の細胞の大部分が分裂する前に収集される、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E14.第1の複数の画像は、半固形培地がゲル化した後の約6時間以内に収集される、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E15.第1の複数の画像の分解能は、単一細胞の識別を可能にする、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E16.単一細胞の画像は、デジタル撮像デバイスの少なくとも約4ピクセルを占有する、段落E15に記載の装置。
段落E17.ウェルは、透明基部を有し、デジタル撮像デバイスは、基部の下方に配置される対物レンズを有する、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E18.対物レンズの倍率は、2倍~7倍である、段落E17に記載の方法。
段落E19.対物レンズの開口数は、0.1~0.4である、段落E17またはE18に記載の方法。
段落E20.対物レンズは、乾燥対物レンズである、段落E17-E19のいずれかに記載の方法。
段落E21.第1の複数の画像のうちの各画像は、全て同一のZ高さにおいて捕捉される、組み合わせられた複数のより小さい画像を備える、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E22.複数のより小さい画像は、水平面に対するデジタル撮像デバイスの個別の既知の位置に基づいて組み合わせられる、段落E21に記載の方法。
段落E23.(f)体積画像スタックに基づいて、複数の細胞場所をマップするステップと、(g)複数の細胞場所から、少なくとも選択された第1の距離(例えば、50μm)だけ全ての他の細胞から離間される単一細胞を識別するステップと、(h)細胞の候補コロニーの潜在的場所を識別された単一細胞に対応する場所に限定するステップ(すなわち、場所が全ての他の細胞から少なくとも選択された第1の距離だけ離間されない場合に、別様に容認可能であろう潜在的場所を除外するステップ)とをさらに含む、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E24.体積画像スタックは、第1の体積スタックであり、(f)第2の時間の前に、デジタル撮像デバイスを使用して、第2の体積画像スタックがウェルに対して生成されるように、ウェルの第2の複数の垂直に離間した画像を捕捉するステップと、(g)第2の体積画像スタックを第1の体積画像スタックと比較し、半固形培地内の細胞の移動を決定するステップとをさらに含む、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E25.ウェルの第1の複数の垂直に離間した画像を捕捉するために使用される、デジタル撮像デバイスは、第1のデジタル撮像デバイスであり、ウェルの1つ以上の画像は、第2のデジタル撮像デバイスを使用して、第2の時間に捕捉される、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E26.第2のデジタル撮像デバイスは、ウェルの上方に配置される、段落E25に記載の方法。
段落E27.第1の時間および第2の時間は、少なくとも10日だけ異なる、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E28.細胞の候補コロニーの場所を識別するステップはさらに、単クローン性以外の少なくとも1つの基準を含む、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E29.少なくとも1つの基準は、コロニーの形状、密度、およびサイズから成る群から選択される、段落E28に記載の方法。
段落E30.少なくとも1つの基準は、任意の他の細胞のコロニーへの候補コロニーの近接性に少なくとも部分的に基づく、段落E28またはE29に記載の方法。
段落E31.少なくとも1つの基準は、候補コロニーからの蛍光強度を含む、段落E28に記載の方法。
段落E32.候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、1つ以下の細胞が候補コロニーの場所の選択された距離内の体積画像スタックの中で見出されたことを観察するステップを含む、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E33.距離は、約50μm以下である、段落E32に記載の方法。
段落E34.候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、候補コロニーの選択された距離によって画定される半球体積に交差する細胞場所確率円錐の数を観察するステップを含む、段落E0に記載の方法。
段落E35.候補コロニーが単クローン性である可能性の測定値を決定するステップは、候補コロニーの場所を体積画像スタック内の対応する場所と比較するステップを含む、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E36.候補コロニーの場所を体積画像スタック内の対応する場所と比較するステップは、候補コロニーと体積画像スタック内で位置特定可能な1つ以上の個々の細胞との間の個別の距離を評価するステップを含む、段落E35に記載の方法。
段落E37.採集するステップの後に、コロニーの少なくとも一部を分注コンテナに再配置するステップをさらに含む、任意の前述の段落に記載の方法。
段落E38.サンプルプレートの第2のウェル上で捕捉するステップ、識別するステップ、決定するステップ、および採集するステップを繰り返すステップをさらに含む、任意の前述の段落に記載の方法。
段落F0.細胞コロニーを採集するための装置であって、(a)サンプルコンテナを受容するように構成される、装置台であって、サンプルコンテナは、複数の細胞が存在する半固形培地の体積を支持する、透明基部を備える、装置台と、(b)半固形培地中の細胞のデジタル画像が、サンプルコンテナの透明基部を通して捕捉可能であるように、装置台の下方に配置される対物レンズを有する、デジタルカメラと、(c)対物レンズに結合され、選択可能な垂直高さにおいて対物レンズを位置付けるように構成される、Z軸ポジショナと、(d)コロニーの少なくとも一部を単離するための装置の採集ヘッドと、(e)デジタルカメラ、Z軸ポジショナ、および採集ヘッドに結合される、コントローラであって、(i)体積画像スタックが生成されるように、各画像が透明基部を通して撮影され、Z軸に沿って異なる高さを有する、半固形培地の体積の複数の垂直に離間した画像を捕捉するため、かつ(ii)採集ヘッドを位置付けてコロニーの少なくとも一部を単離するための記憶された命令のセットを実行するように構成される、プロセッサを有する、コントローラとを備える、装置。
段落F1.対物レンズおよびコントローラに結合され、選択可能な水平位置において対物レンズを位置付けるように構成される、X-Yポジショナをさらに備える、段落F0に記載の装置。
段落F2.複数の垂直に離間した画像は、第1の時間に捕捉され、プロセッサはさらに、記憶された命令のセットを実行することにより、第1の時間よりも実質的に遅い第2の時間に、半固形培地の体積の1つ以上の画像を捕捉するように構成される、段落F0またはF1に記載の装置。
段落F3.単一細胞の画像は、デジタルカメラの少なくとも約4ピクセルを占有する、段落F0-F2のいずれかに記載の装置。
結語
上記に記載される開示は、独立した有用性を伴う複数の明確に異なる発明を包含し得る。これらの発明はそれぞれ、その好ましい形態で開示されているが、本明細書に開示および図示されるようなその具体的実施形態は、多数の変形例が可能性として考えられるため、限定的な意味で考慮されるものではない。本発明の主題は、本明細書に開示される種々の要素、特徴、機能、および/または性質の全ての新規かつ非自明の組み合わせおよび副次的組み合わせを含む。以下の請求項は、特に、新規かつ非自明と見なされる、ある組み合わせおよび副次的組み合わせを指摘する。特徴、機能、要素、および/または性質の他の組み合わせおよび副次的組み合わせで具現化される発明は、本出願または関連出願からの優先権を主張する出願において請求され得る。そのような請求項はまた、異なる発明または同一の発明を対象とするかどうか、出願当初の請求項に対して範囲がより広い、より狭い、等しい、または異なるかどうかにかかわらず、本開示の発明の主題内に含まれると見なされる。さらに、識別された要素に関する第1、第2、または第3等の序数指標が、要素を区別するために使用され、別様に具体的に記述されない限り、そのような要素の特定の位置または順序を示さない。
上記に記載される開示は、独立した有用性を伴う複数の明確に異なる発明を包含し得る。これらの発明はそれぞれ、その好ましい形態で開示されているが、本明細書に開示および図示されるようなその具体的実施形態は、多数の変形例が可能性として考えられるため、限定的な意味で考慮されるものではない。本発明の主題は、本明細書に開示される種々の要素、特徴、機能、および/または性質の全ての新規かつ非自明の組み合わせおよび副次的組み合わせを含む。以下の請求項は、特に、新規かつ非自明と見なされる、ある組み合わせおよび副次的組み合わせを指摘する。特徴、機能、要素、および/または性質の他の組み合わせおよび副次的組み合わせで具現化される発明は、本出願または関連出願からの優先権を主張する出願において請求され得る。そのような請求項はまた、異なる発明または同一の発明を対象とするかどうか、出願当初の請求項に対して範囲がより広い、より狭い、等しい、または異なるかどうかにかかわらず、本開示の発明の主題内に含まれると見なされる。さらに、識別された要素に関する第1、第2、または第3等の序数指標が、要素を区別するために使用され、別様に具体的に記述されない限り、そのような要素の特定の位置または順序を示さない。
Claims (1)
- 本明細書に記載の発明。
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