CN111788297A - 细胞菌落挑取系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包括如下方法和设备的系统：用于使能存活的单克隆菌落生长、在已证实其存活力之后将菌落识别为是单克隆的并且将它们挑取出来并放置到目标环境中。方法可以包括：将细胞以低密度铺板在孔中，在铺板之后不久的第一时间捕获示出细胞位置的孔的竖直间隔开的一系列图像，在较晚的第二时间捕获示出候选细胞菌落位置的同一孔的图像，基于第一组图像中的信息确定候选菌落是单克隆的可能性，以及基于该可能性，使用挑取头将候选菌落挑取出来，以转移到目标环境。

Description

细胞菌落挑取系统
优先权申请的交叉引用
本申请根据美国35U.S.C.§119(e)要求2017年6月2日提交的美国临时申请No.62/514,747的优先权，出于所有目的，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
其它材料的交叉引用
出于所有目的，以下美国专利的全部内容通过引用并入本文：美国专利No.7,776,584。
背景技术
用于筛选和选择细胞菌落的自动化装置已在市场上销售了好几年。然而，目前的系统具有许多缺点。特别是，这些系统不适用于识别和挑取单克隆菌落(即，源自单个细胞的菌落)。不过，因为单克隆菌落中的细胞在基因上是相同的，所以这种菌落在研究和工业中都很重要。目前，使用多个步骤和仪器来产生单克隆菌落。例如，首先使用诸如荧光激活细胞分选法(FACS)等技术将单个细胞隔离。接下来，将这些单个细胞铺板(plate)于高密度多孔板中，优选地一个细胞铺板于一个孔(well)中。最后，细胞生长成菌落。这涉及大量试剂和大量多孔板的使用。此外，以该方式产生的细胞菌落的存活力很低。
发明内容
本公开提供了如下系统，包括方法和设备：用于使能存活的单克隆菌落生长、在已证实其存活力之后将菌落识别为是单克隆的并且将它们挑取出来并放置到目标环境中。方法可以包括：将细胞以低密度铺板在孔中，在铺板之后不久的第一时间捕获示出细胞位置的孔的竖直间隔开的一系列图像，在较晚的第二时间捕获示出候选细胞菌落位置的同一孔的图像，基于第一组图像中的信息确定候选菌落是单克隆的可能性，以及基于该可能性，使用挑取头将候选菌落挑取出来，以转移到目标环境。
附图说明
图1是描绘了用于识别和挑取单克隆细胞菌落的说明性方法中的示例性第零日步骤的流程图。
图2是描绘了用于识别和挑取单克隆细胞菌落的说明性方法中的示例性挑取日步骤的流程图。
图3是描绘了用于确认单克隆性(monoclonality)的示例性步骤的流程图，该步骤可结合图1和图2的方法执行，例如，作为图2中的步骤PD-S4的一部分。
图4是描绘了用于确认挑取单克隆菌落的示例性步骤的流程图，该步骤可结合图1和图2的方法执行，例如，作为图2中的步骤PD-S5的一部分。
图5是用于识别和挑取单克隆细胞菌落的示例性设备的高度示意性的图。
图6是图5的设备的一部分的更具体的示意图。
图7是图6的设备的等距视图。
具体实施方式
本公开提供了如下系统，包括方法和设备：用于使能存活的单克隆菌落生长、在已证实其存活力之后将菌落识别为是单克隆的并且将它们挑取出来并放置到目标环境中。值得注意的是，方法可能涉及首先使能存活的单克隆菌落生长，然后在证明存活力之后，将菌落识别或确认为是单克隆的。相比之下，目前的技术涉及首先将单个细胞(根据定义是单克隆的)隔离，然后尝试将隔离的细胞培养成能存活的菌落。这些目前的技术是手动密集型且耗时的，通常涉及多个步骤，包括将单个细胞放置到96孔板中的每个孔中。此外，利用目前的技术，细胞存活力较差(通常低于40％的存活率)，并且需要大量试剂和大量多孔板才能获得期望数量的单克隆菌落(例如，400个板才能收获10,000个菌落)。本公开的进一步目的在以下部分中描述：(I)方法概述，(II)设备概述，和(III)实例。
I.方法概述
图1至图4是示出用于生成单克隆细胞菌落的示例性方法的流程图。与该方法相关联的步骤中的大多数或所有步骤在铺板细胞时的最初一日(称为“第零日”或“第0日”)执行，以及在当挑取并转移单克隆细胞菌落时的最后一日(称为“挑取日”)执行。简而言之，这些步骤包括在第零日对细胞进行成像，以及在挑取日对细胞菌落进行成像。这些图像的比较允许用户查明在挑取日选择的菌落是否对应于在第零日成像的单个细胞(即，菌落中的所有细胞是否都因为产生自单个起源细胞而是单克隆的)。下面描述该方法的细节。
A.第零日活动
第零日活动包括：铺板细胞，根据需要执行操作以促进细胞的均匀空间分布和随后的生长，以及捕获细胞的第零日位置；参见图1。可以在第零日步骤之间将孔存放在培养箱中。
步骤DZ-S1.将关注的细胞与合适的生长培养基组合在一起，并且在称为“铺板”的过程中添加到样品孔中。孔通常包括用于保持细胞和支持材料的任何合适的容器。通常，孔将是样品板(诸如，组织培养板、微孔板(microplate)或其它多孔板)中的多个孔中的一个。一个或多个孔可以具有透明底部，该透明底部允许孔的内容物从下方被观察和成像。作为替代方案，或者另外地，内容物可以从上方被观察和成像。正常情况下，将细胞和生长培养基装载到多孔样品板的所有孔中。生长培养基可以被设计或选择成在添加到孔中之后凝胶化和/或以其它方式增加其粘度。凝胶化可以减慢或停止细胞和细胞菌落的移动，并因此有助于随时间的推移追踪它们的位置；然而，凝胶化不阻止细胞分裂。理想情况下，凝胶化相对于细胞分裂所需的特征时间而言快速地发生，例如，在约6小时、约4小时、约2小时、约1小时、或者约30分钟内，等等。否则，细胞分裂可能使得无法将邻近的两个无关细胞与源自在该位置的已经历细胞分裂的单个细胞的两个单克隆细胞区分开。合适的生长培养基包括市售的半固体基质(SSM)。
步骤DZ-S2.可以执行各种后续步骤来促进高质量的铺板和随后的细胞存活力。例如，可以对样品孔进行离心操作，以加速细胞朝向孔底部的移动(沉降)。在一些实施例中，可以在该步骤之后添加附加的培养基，从而确保大多数或所有细胞菌落都将位于孔的底部，同时还提供了附加的培养基以促进细胞的生长和存活力。在相同或其它实施例中，可以用透气性密封件或其它覆盖物覆盖孔，以保护孔的内容物并防止蒸发。这些步骤将在实例3中进一步探讨。
步骤DZ-S3.可以将孔或样品板放置或以其它方式装载到具有成像系统(诸如数字成像系统)和用于支撑孔的机构(诸如工作台或平台)的设备上。通常，该步骤在支持材料已凝胶化之后(以避免推撞(jostling)细胞)并且在成像之前(见下文)执行。在该步骤和其它成像步骤中的图像可以以任何合适的格式创建和存储。
步骤DZ-S4.可以使用数字成像装置捕获孔的竖直间隔开的多个图像。这些图像可以在遍及孔或者更具体地遍及孔的含有生长培养基部分的不同Z高度处拍摄，从而生成体积图像堆栈(其可以替代地称为Z堆栈)。可以把体积图像堆栈比作一副纸牌，其中个体纸牌代表个体图像，并且该一组纸牌代表图像堆栈。继续类推，在一整副的顶部与底部之间的垂直走向代表Z(竖直)方向，并且纸牌的平面代表XY(水平)方向。在一些情况下，取决于孔的尺寸和成像装置的细节，成像装置可以捕获遍及整个孔的水平切片。然而，更常见的是，尤其是在大孔的情况下，成像装置将仅捕获遍及孔的一部分XY平面。在这种情况下，可以在每个Z高度处捕获多个水平上偏移的图像，然后可以将这些图像拼贴(邻接)或拼接(重叠)在一起，以覆盖孔的较大水平区域。图像堆栈的目的是能够识别孔内的个体细胞的初始位置，以便以后与菌落位置进行比较。成像的进一步方面(包括光源和检测器)将在本申请的其它地方进行讨论。
步骤DZ-S5.在成像完成之后将孔从设备中移出并存放起来(通常是进行培养)以允许菌落生长。
B.第1天到挑取日前一天的活动
在有利于细胞生长的条件下，从第零日到挑取日对孔进行培养。这些条件可以包括适当的大气成分、湿度和温度。这些条件还可以包括提供适当的营养物质、缓冲液、辅助因子或类似物。能存活的细胞将在这段时间内分裂形成菌落。例如，哺乳动物细胞的典型倍增时间是24小时；因此，在第N天，来自每个起源细胞的细胞将形成包括大概2N个细胞的菌落。因此，在理想条件下，在第10天、第12天和第14天，细胞菌落可以分别含有约1000个、约4000个和约16000个细胞。
可选地，可以在第零日和挑取日之间对孔进行成像或以其它方式进行分析。该可选的成像可以包括收集平面图像，从而显示单个水平截面的一部分或全部，或者收集体积图像，从而显示整个Z堆栈。这些中间时间图像可以用于任何合适的目的，包括：提供细胞位置的进一步历史证据，评估菌落的健康状况，决定何时安排挑取日，诸如此类的。
C.挑取日活动
挑取日活动包括：对细胞的菌落进行成像，确定成像的菌落是单克隆的可能性的量度，基于该可能性创建合适菌落的“挑取清单”，以及通过物理检索每个菌落的至少一部分并将其放置到目标环境中，从而挑取菌落并放置在清单上；参见图2至图4。
步骤PD-S1.可以将含有候选菌落的样品板放置在成像区域中。成像区域可以包括样品支撑件，诸如工作台和/或平台，以在照明和成像期间保持和操纵样品板。
步骤PD-S2.可以使用合适的光来照明含有样品板的成像区域。该光可以凭借从光源穿过样品被导向检测器的透射照明(trans-illumination)、凭借从光源被导向样品并沿着相同路径从样品被导回到光源的落射照明(epi-illumination)和/或凭借以一离轴角度从光源被导向样品且从样品被导向检测器的侧面照明(side-illumination)来提供。照明光可以包括白光或彩色光，这取决于样品。白光通常用于未经染色的菌落，而彩色光通常用于经过染色的菌落。照明光也可以被过滤或以特定的颜色生成，以供荧光测定中使用。
步骤PD-S3.可以使用所施加的照明、通常在单个平面中对样品板进行成像。使用数字成像装置捕获图像，该数字成像装置可以与用于捕获第零日图像的成像装置相同或不同。
步骤PD-S4.可以对捕获到的图像进行处理，以识别候选菌落并评估候选菌落是单克隆的可能性。候选菌落的识别可以使用软件来执行，该软件因菌落的颜色、其相对于背景的光吸收度或反射度和/或其它性质来辨识菌落。在一些情况下，可以利用荧光使细胞菌落可见。例如，可以使用荧光标记的抗体，该抗体与从细胞菌落分泌的、表现在细胞菌落的表面上的或者含在细胞菌落内的关注的蛋白相结合。在荧光成像期间，当用适当的激发波长照明时，细胞菌落将显示为明亮的发光点。还可能发生荧光抗体在紧邻细胞菌落位置处的耗尽，这具有产生“逆晕”的附加益处(即，有助于图像处理的在每个明亮菌落周围的较暗区域)。作为替代方案，在染色的情况下，可以通过将合适的染色剂混合到培养基中来使得细胞菌落可见。最后，许多菌落可以在没有荧光或染色的情况下被识别。如下面结合图3描述的，把进一步满足单克隆选择标准的菌落的位置编译成菌落坐标的挑取清单。
步骤PD-S5.接下来，使用机器人装置挑取出或收集来自挑取清单上的菌落的细胞，并转移到新环境中，通常转移到另一样品板中。下面结合图4进一步描述菌落挑取。
步骤PD-S6.将图像和其它数据存储起来以备将来参考。
步骤PD-S7.将容纳有挑取出的菌落的样品板移走，以便进一步生长和/或分析。
图3是示出步骤PD-S4的与菌落选择和挑取清单的生成有关的进一步方面的流程图。对每个候选菌落进行二次分析，在该二次分析中检查第零日图像，并估计该菌落是源自单个细胞的概率。换言之，通过使挑取日图像中的菌落的位置与第零日图像中的单个起源细胞的位置相关联来进行菌落作是单克隆的识别。这涉及对细胞移动做出某些假定，如果需要可以利用从第1天到挑取日前一天拍摄的图像明确地确认。细胞趋向于随时间的推移而穿过培养基向下漂移或以其它方式移动。该移动中的大部分发生在铺板之后不久，因为半固体培养基的粘度通常随时间而增加。因此，通常在铺板与第零日成像之间存在延迟。这允许更好地确定第零日位置并因此更好地确定挑取日(例如，10天至14天后)细胞菌落的起源。尽管如此，细胞也可能继续移动，通常向下移动，即使培养基已经凝胶化了。对应于给定起始位置的可能位置的分布形成一个倒置圆锥，其顶点在起始位置。当在挑取日识别候选菌落时，基于第零日生成的体积图像堆栈执行附加分析，以确认单克隆性。例如，可以确定只有单个细胞具有与以候选菌落为圆心由选定半径限定的半球相交的可能位置的圆锥，在这种情况下，将存在很高的单克隆性的可能性。用户使用菌落是单克隆的可能性的量度来最终选择挑取哪个菌落。在一些情况下，可以通过对来自第零日并且如果采用多时间点追踪的话来自更晚时候的支持图像进行再次检查来告知该选择。
图4是示出步骤PD-S5的与细胞菌落挑取有关的进一步方面的流程图。步骤PD-S5具有几个子步骤。在PD-S5.1中，从供挑取的挑取清单中选择菌落。在PD-S5.2中，将销针或其它取回装置移动到要挑取的细胞菌落的指定XY坐标。将销针“发射”(即，降低)到菌落挑取位置，使得销针的末端在目标细胞菌落的上方导入培养基中。如果菌落是粘附性的，则可以搅动销针的末端，以使目标细胞菌落脱离。接下来，销针抽吸或以其它方式挑取出包括部分或全部目标菌落的限定体积的培养基。最后，收回销针并保留样品。在PD-S5.3中，确定是否针对另一菌落和另一销针重复挑取过程，除非使用了所有销针或收集到了挑取清单中的所有菌落，否则将会重复挑取过程。在PD-S5.4中，将挑出的菌落分配到目标环境(例如，多孔板)中。分配可以连续地(一次一个目标孔)和/或并行地(同时多个目标孔，如果销针和目标孔具有相同的占用面积则可能发生该情况)发生。在PD-S5.5中，更换销针，或者更常见的是，将销针进行清洗并干燥，以备将来使用。在PD-S5.6中，确定是否重复步骤PD-S5.1到PDS5.5，除非收集到并转移了挑取清单中的所有菌落，否则将会重复步骤PD-S5.1到PDS5.5。在美国专利No.7,776,584中描述了用于执行步骤PD-S5的合适的设备和进一步细节。
II.设备概述
图5至图7示出用于识别和挑取单克隆细胞菌落的示例性设备100。该设备可以包括主床或工作台102，主床102用于将具有样品孔105的多孔板104支撑在数字成像装置(即，照相机)106的上方，数字成像装置106包括物镜108和检测器(例如，CCD照相机、CMOS照相机等)，用于捕获孔的内容物的图像。主床102和安装在其上的细胞挑取装置112可以被上壳体114覆盖。挑取装置可以包括用于接合和挑取出一部分细胞菌落的销针(示出为自细胞挑取装置112突出的竖直突出部)。在一些情况下，销针可以是中空的，从而允许它们“吸起”菌落的一部分，然后将其“喷射”到目的孔或其它位置。设备的基部可以将照相机容纳在下壳体116中。上、下壳体可以共同形成外壳。物镜或整个照相机可以安装在X-Y轴平台118和/或Z轴平台120上，以进行三维定位。在一些实施例中，照相机可以拍摄多个共面图像，并且这些图像可以拼接或拼贴在一起以形成单个图像。在相同的或其它实施例中，照相机可以捕获处于各种Z高度的进一步图像。一个或多个控制器122可以与设备通信，并且可以用于协调和控制照相机活动，以及进行细胞挑取和机器视觉活动。可以利用各种照明装置来照亮孔板区域以进行成像。例如，可以使用白光透射照明源124和/或荧光落射照明源126。设备可以进一步包括用于供应适当培养基和试剂的可接触的流体站。在美国专利No.7,776,584中描述了合适设备的进一步方面。
图6和图7示出照明系统的进一步细节。透射照明器124可以定位在样品孔的上方，并产生光128，该光128行进穿过孔105以及相关联的细胞和培养基并进入物镜108到达检测器110。落射照明器126可以定位在样品孔的下方，并产生荧光激发光130，该荧光激发光130向上行进穿过孔105，激发来自孔中的选定菌落的荧光发射光132，然后其中一些向下行进穿过孔并进入物镜108到达检测器110。落射照明器126可以进一步包括光源134、荧光激发滤光器(如果合适的话)136、荧光发射滤光器138以及用于将光从光源引导到孔以及从孔引导到检测装置的光学器件(例如，反射镜和透镜)140。光源、一个或多个照相机、滤光器和/或其它光学器件可以经由合适的有线或无线连接部142A、142B和触发器144A、144B而处于电子控制之下。
图6和图7还示出X-Y-Z平台和控制器的进一步细节。X-Y(水平)和Z(竖直)运动可以独立地支持和控制。例如，X-Y移动和位置可以由XY轴控制器146、X轴编码器148A、Y轴编码器148B和各种X-Y轴控制线150控制。类似地，Z移动可以由Z轴控制器152、Z轴编码器154和各种Z轴控制线156控制。
实例
以下实例描述了本公开的选定方面和实施例，包括产生单克隆菌落的示例性工作流程和示例性方法。可以在一个设备中执行细胞菌落的成像、分析和挑取。在菌落生长开始时记录起源细胞的位置。该位置信息稍后用于评估候选菌落是单克隆的可能性。给出这些实例仅用于说明，而不旨在限定或限制本公开的范围。
实例1.示例性仪器/软件工作流程
该实例描述了示例性仪器/软件工作流程。通常，软件/仪器工作流程(诸如这里所描述的)应与生物工作流程(例如，参见下面的实例4和5)交替。
A.第零日.“第零日”发生在铺板之后不久，并且包括在X、Y和Z平面中的初始三维图像捕获。在第零日或更晚时候的三维图像捕获通常采用透射的白光(WL)。在六孔板(或其它合适的板)中接种细胞。之后不久，将板放置在仪器中。为了查明个体细胞的初始位置，使用体积成像横跨六个孔以合适的竖直间隔捕获图像的Z堆栈。捕获性能(包括图像的数量和它们之间的距离)将取决于培养基的深度、曝光时间和任何实验特定的标准。图像捕获所需的时间可能有所不同，但通常对每个板而言应小于约45分钟。例如，每30μm至35μm收集图像，则对于板的捕获时间可以小于约30分钟。图像通常以十二位灰度存储为jpeg格式，以便在证明菌落作为用于挑取的单克隆是合格的时使用。
B.平面成像.可以在关注的任何时间使用透射光(WL)或荧光(FL)照明执行平面成像。横跨六个孔在板的底部处或附近，在相同平面或多个平面中拍摄图像。每个孔被100至140个图像覆盖，这取决于排除区域。图像被拼贴或拼接成板的整体图(cohesive view)。
C.挑取日.使用如上所述的平面成像、通常利用FL照明来执行挑取日成像。图像通常以十二位灰度存储起来，以便在验证用于挑取的候选菌落时用于分析。使用两阶段过程来选择单克隆菌落。第1阶段包括在一个或多个挑取日图像中识别关注的菌落。识别准则可以包括大小、形态、可用挑取头取回菌落的难易度，诸如此类。第2阶段包括评估第1阶段中识别出的菌落是单克隆的可能性。对于每个候选菌落，这涉及查看第零日图像中的示出了候选菌落附近面积(或体积)的区域并且应用合适的单克隆性准则，诸如当第零日在菌落的位置处或附近有单个细胞的情况，以及是否有任何其它细胞足够靠近该细胞，以致于启动了可能与候选菌落融合并因此污染候选菌落的菌落。用户可以基于第2阶段的概率和支持图像做出最终选择。在最终选择之后，例如，按照美国专利No.7,776,584中描述的方法，可以挑取出菌落并将其从源孔转移到合适的目的地。
实例2.示例性处理量和存储计算
该实例描述了一种假想情景，以说明所公开的方法的处理量和存储要求。
处理量计算.假设孔中生长培养基的深度为1mm并且以50μm的间隔收集Z堆栈的图像。这些条件将产生总共约20个图像。每个图像的曝光设定为5ms。为了限制图像模糊，移动的照相机在曝光期间所覆盖的距离应小于或等于2μm。这个条件可以通过使照相机以0.4mm/秒的恒定速度移动来实现。因此，横跨1mm的Z行进时间为2.5秒。每次向下一帧的过渡添加1.5秒(运动开销)将为每个体积图像堆栈产生4.0秒。假定每孔收集100个体积图像堆栈，则对六孔板成像所需的总时间约为40分钟。
存储计算.可以使用2048×2048照相机(每个像素八位)获得可接受的图像质量。这对应于每个图像4MB，每个体积图像堆栈80MB，且每个六孔板48GB。所需的数据处理量平均为32MB/秒。
替代实施例.以上计算旨在显示本文描述的用于创建单克隆菌落的方法具有相对适中的处理量和存储要求。此外，在相对标准的条件下，甚至可以进一步降低这些要求。例如，通过横跨更小竖直高度(例如，0.8mm)收集图像以及通过减少曝光时间(例如，减少到1ms至3ms)，总帧时间可以减少到每个体积图像堆栈约2.2秒以及每个板约25分钟。类似地，通过使用合适的图像压缩(例如，JPEG压缩)，可以减小存储大小(例如，减小到每个体积图像堆栈小于10MB，即使对于每个图像相隔约35μm的十二位灰度图像也是如此)。
实例3.创建单克隆菌落的示例性方法
该实例描述了创建单克隆菌落的示例性方法。该方法可以包括遍及整个过程在一个仪器中对细胞菌落进行成像、分析和挑取。该方法可以形成六孔板中的高的细胞存活力和/或较少板(例如，10至25个)的使用。值得注意的是，如在其它地方所指出的，方法可以涉及首先使能存活的单克隆菌落生长，然后在建立它们的存活力之后识别或确认菌落为单克隆，接着挑取出选定的菌落并将其放置到目标环境中。
A.引言
在半固体培养基中铺板的细胞的行为是硬件和软件要求的重要决定因素。该实例总结了对在半固体培养基中铺板的细胞的XYZ(三维)运动的观察结果。这些观察结果用于提出和评估可减少这种XYZ运动的潜在工作流程改进，这进而可以通过促进候选细胞菌落的位置与其单个起源细胞的位置的相关性来提高评估单克隆性的能力。
B.材料和方法
细胞系.CHO-S(中国仓鼠卵巢)。
半固体培养基.具有L-Gln(L-谷氨酰胺)的CloneMedia CHO Growth A(MolecularDevices(美谷分子)K8810)。
铺板和培养条件.除非另有说明，否则将细胞铺板于中央板贮存器中具有4ml H2O的葛莱娜(Greiner)6孔培养板中的2ml/孔的半固体培养基(根据产品数据表制备)中。加入培养基/细胞之后立即对板以100xg离心力执行离心操作达5分钟。半固体培养优选地具有足够的粘性以使细胞位置稳定，还具有足够的光学透明性以允许实现从顶部到底部的可视化和成像。
多孔板.细胞可以在任何合适的容器中生长。六孔板非常适合生长、成像和挑取的组合。
成像.除非另有说明，否则所有成像均在具有4×/0.2NA Plan Apo(平场复消色差)物镜的Molecular Devices ImageXpress Micro C高内涵成像系统(IXM-C)或Molecular Devices ImageXpress Micro 4高内涵成像系统(IXM-4)上执行。在平面之间具有50μm间隙的每个成像位置处拍摄图像Z堆栈。照相机、照相机/板定位以及光学路径的合适组合允许实现单个细胞的清晰成像以及细胞和碎片之间的区分。
C.研究结果
使用CHO谱系细胞系获得以下结果。在细胞类型、培养箱年限(age)/功能以及用户方面的差异可能会对研究结果产生影响。
数据汇总表.细节请参见文本
Figure BDA0002379318140000131
(i)在标准条件下将细胞铺板在半固体培养基中，使得极难追溯菌落与其起源细 胞的关联性
在铺板之后的最初24小时内执行的对标准条件(参见上述方法：2000个细胞/ml)下铺板的细胞(n＝46个细胞)进行的静态成像延时分析证实：在时间0时仅～70％的细胞位于孔底部的50μm内。其余30％的细胞遍布在培养基体积中；这些细胞在最初的几个小时期间沉降到孔底部(在8小时之时达到100％的细胞)。在孔底部的细胞之中，在最初的12小时内观察到平均为90μm的XY(水平)移动，移动范围为5μm到170μm。在培养基中分布更高的细胞之中，观察到平均为400μm的XY运动，运动范围为250μm到520μm。12小时之后，仅观察到少量XY移位，这表明培养基已充分凝胶化以阻止细胞的显著运动。
在非静态(动态)成像条件(其涉及板在培养箱与仪器之间的转移以及成像平台在成像捕获期间的移动(n＝1066个细胞，3个单独的实验，第零日成像时间为铺板后2-8小时))下，2小时之后，平均85％的细胞位于孔底部的50μm内。其余15％的细胞遍布在培养基中。这些细胞中的大多数在接下来的几个小时内沉降到孔底部。然而，在实验之间观察到差异：24小时之后，观察到80％至100％的细胞位于孔底部。在位于孔底部的细胞之中，在最初的24-48小时内观察到平均为90μm的XY移动，移动范围为5μm到350μm。在培养基中分布更高的细胞之中，观察到平均为840μm的XY运动，运动范围为180μm到1350μm。这些较大的XYZ运动(空间位移)使得很难将菌落与其起源细胞相关联。另外，存在着移动的细胞与未检测到的其它菌落会合的可能性；因此，即使显示菌落起源于第零日观察到的单个细胞，但由于起源于移动细胞的菌落会合的可能性，单克隆性的确定性降低了。
避免在第零日成像之后出较大XYZ位移的可能的解决方案是增加细胞铺板与第零日成像之间的时间间隔，由此允许最大数量的细胞到达孔底部，或者通过增加离心速度或时间来加速该沉降过程。
对于前者，推荐铺板与成像之间最少为8小时，以允许尽可能多的细胞沉降。然而，实验之间的差异显示8小时可能还不够；在该时间之后，可能仍然有高达20％的细胞经历大XYZ位移。另外，在铺板之后8小时，～30％的细胞将分裂，因此随后将因单克隆性的不确定性而被取消作为关注的菌落的资格。这种大群体细胞的排除会显著地降低处理量。另外，因为第零日工作日有可能延长到16小时或更多小时(基于10个板的计时，每个板估计有45分钟成像时间)，所以铺板与成像之间的显著延迟可能会有劳动力和资源的后果。
对于后者(增加的离心作用)，离心作用从以100xg离心力持续5分钟增加到以100xg离心力持续10分钟在第零日的细胞Z分布中没有产生差异。因此，XYZ位移仍然显著。对离心速度和时间的进一步探索可以改善该结果；然而，还需要调查研究这种增加的离心作用对细胞存活力的影响。
总之，在标准条件(2ml/孔)下的细胞的大XYZ位移导致菌落追溯与其起源细胞之间的相关性很差，由此降低了单克隆性的确定性。
(ii)培养基体积的减少可以减小细胞XYZ移动，由此允许易于将菌落追踪溯源到 其起源细胞
进行了一项调查研究，以确定是否可以减少细胞的Z坐标分布。如上所述将细胞铺板，除了在此处将培养基体积从2ml/孔减少到1ml/孔并且将细胞浓度增加到4000个细胞/ml。对细胞(n＝56个细胞)进行的静态成像延时分析已证实在时间0时100％的细胞位于孔底部的50μm内。在最初的12小时内观察到平均为40μm的XY运动，运动范围为8μm到101μm。12小时之后，仅观察到少量XY移位，这表明培养基已充分凝胶化以阻止显著运动。
在非静态(动态)成像条件(其涉及板在培养箱与仪器之间的转移以及成像平台在成像捕获期间的移动(n＝377个细胞，3个单独的实验，第零日成像时间为铺板后3-8小时))下，第零日100％的细胞位于孔底部的50μm内。在最初的24-48小时内观察到平均为110μm的XY移动，移动范围为5μm到300μm。这些有限的XYZ位移允许更易于将菌落追踪到其第零日的起源细胞。另外，用于挑取的最佳菌落间距所需的低细胞浓度降低了细胞会合到单个菌落中的机会，因为最近的邻居通常相隔＞0.5mm。
总之，在减少培养基体积(1ml/孔)情况下的减小的细胞Z分布，将会造成减小的XYZ位移。这有助于将菌落位置与起源细胞位置相关联，从而使得如果第零日在候选菌落附近可见单个细胞，而附近没有其它细胞，则单克隆性的确定性是高的。
(iii)减少培养基体积对细胞存活力和生长具有负面影响
减少每孔培养基体积提供了用于解决与起源细胞位置和菌落位置的匹配相关联的难题的解决方案，并因此增加了单克隆菌落的识别的确定性。然而，减少培养基体积对菌落健康和生长具有影响。
置于孔中的1ml培养基在孔表面上形成非常薄的层，从而使得与2ml的较大培养基体积相比细胞更易于脱水得多。第5日的培养基看起来可见地干燥；培养基层薄得多，并且其外观/纹理从孔中心朝向边缘可见地变化。当在1ml和2ml培养基中生长时，菌落具有不同的形态(形状)。另外，在体积减少时菌落较小(第6日是2ml大小的60％，第8日是45％)。这些数据表明减少培养基体积对细胞健康具有有害影响。
总之，尽管通过减少每孔培养基体积可以提高单克隆菌落的识别的确定性，但是细胞健康受到负面影响，这进而会对关注的菌落的存活率产生负面影响。
(iv)可能的解决方案可用于减轻由减少每孔培养基产生的存活力问题
有多个选项可用于减轻培养基脱水及其对细胞健康的影响问题。这些选项包括在铺板之后添加额外的培养基以及使用透气板密封件。
额外的培养基.在生长几天之后添加培养基(半固体或液体)的调查研究未能成功；细胞和菌落被附加的培养基破坏，导致细胞的大XYZ位移，由此降低了将菌落追踪溯源到单个起源细胞的能力。
几天后添加额外培养基的替代方案是在初始成像运行之前第零日添加额外的培养基。为此，将细胞铺板在1ml的半固体培养基中并以100xg的离心力进行离心5分钟。等待30分钟以允许大多数细胞到达孔底部之后，在附加的5分钟离心步骤之前，通过沿孔边缘滴下，将附加的1ml CloneMedia培养基小心地添加到顶层。在第零日初始铺板之后的大约3小时以及在第2日对细胞进行成像。在控制孔(仅1ml的培养基；n＝107个细胞)中，在第零日100％的细胞位于孔底部，并且平均XY位移为90μm(范围为10μm至190μm)。对于该测试孔中的细胞(1ml培养基/孔，在顶部铺一层1ml培养基；n＝247个细胞，2个独立实验)，在第零日大约95％的细胞位于孔底部，其平均XY位移为85μm(范围为1μm到275μm)。在培养基中分布更高的5％细胞之中，平均XY位移为710μm(范围为170μm到1500μm)。这些XY距离值类似于每孔2ml培养基时观察到的那些。然而，相比之下，展现这种运动的细胞群体的百分比显著地降低，在培养基中分布更高的细胞仅占5％而不是高达20％。因此，在第零日铺一层培养基的方法既可以维持培养基的水合水平并因此维持细胞健康，而且与标准铺板条件相比还可以降低(但没有消除)错误识别单克隆菌落的风险。
板密封件.板密封件提供了用于减少培养基脱水的另一种机制。商业上可购得许多透气且无菌的板密封件。与没有密封性的板相比，使用这些透气密封件中的一种(美国科学公司的易透气密封件(USA Scientific Breathe-Easy seal))似乎减少了以1ml/孔分配的培养基的脱水。然而，尽管与板密封相比透气密封改善了菌落生长，但是与2ml培养基中的菌落相比，菌落生长仍然受到损害；在第9日、第11日和第13日，1ml培养基(有密封件)中的菌落分别是2ml培养基中的那些菌落的尺寸的81％、71％和67％。细胞生长上的这种差异可能是因为培养基脱水到可接受的水平以下，或者可能是由于在一半体积的培养基中生长相同数量的细胞并因此更快地消耗营养物质供应从而缺乏培养基营养物质所致。尽管与2ml培养基且没有密封件相比，在1ml培养基且具有密封件的情况下菌落生长更慢，但菌落形态是类似的，没有可见的不良细胞健康迹象，挑取后观察到生长物表明细胞仍然能存活。然而，鉴于在生长概况和对培养基条件敏感度上的差异，该结果可能不适用于不同的细胞系。
总之，尽管仍然牵涉到风险，但我们已经证实了在减少的1ml培养基体积的情况下维持细胞存活力和生长的可能的解决方案。然而，这些解决方案将需要附加的测试来限定其适用范围。
实例4.第一示例性生物学工作流程
该实例描述了第一示例性生物性工作流程
第零日-将细胞铺板.将关注的细胞铺板在1mL半固体培养基中。用透气的板密封件将板密封。将板以100xg的离心力进行离心5分钟。将板在潮湿的培养箱中培养最少2小时。
第零日-对细胞进行成像.用透射光(WL)捕获板图像。在相隔最大50μm的一系列高度处收集板孔的平面图像，以形成覆盖半固体培养基整个体积的图像Z堆栈。
第4日到第14日-对细胞进行成像(可选).用透射光(WL)在一个或多个平面中对板进行成像，以监测生长。
第7日到第14日-对细胞进行成像和挑取.移除板密封件。使用透射光(WL)和荧光(FL)在一个或多个平面中对板进行成像。基于一个或多个用户限定的标准(包括荧光强度、形态和/或单克隆性的确定性)来选择和挑取菌落。
实例5.第二示例性替代生物学工作流程
该实例描述了第二示例性替代生物学工作流程。
第零日-将细胞铺板.将关注的细胞铺板在1mL半固体培养基中。将板以100xg的离心力进行离心5分钟。将板培养30分钟。利用孔的侧部，在现有的半固体培养基上面小心地铺一层附加的1mL半固体培养基。根据需要，用透气板密封件将板密封。将板以100xg的离心力另外离心5分钟。将板在潮湿的培养箱中培养最少2小时。
第零日-对细胞进行成像.用透射光(WL)对板进行成像。在相隔最大50μm的一系列高度处收集板孔的平面图像，以形成覆盖半固体培养基的整个体积的图像Z堆栈。
第4日到第14日-对细胞进行成像(可选).用透射光(WL)在一个或多个平面中对板进行成像，以监测生长。
第7日到第14日-对细胞进行成像和挑取.移除板密封件(如果存在的话)。使用透射光(WL)和荧光(FL)在一个或多个平面中对板进行成像。基于一个或多个用户限定的标准(包括荧光强度、形态和/或单克隆性的确定性)来选择和挑取菌落。
实例6.选择的实施例1
该部分描述了不受限地呈现为一系列段落的细胞菌落选择、分析和挑取方法的进一步方面和特征，为清楚和有效起见，可以用字母数字方式指定其中的一些或全部。这些段落中的每一个可以与一个或多个其它段落组合，和/或以任何合适的方式与本申请中其它部分的公开相结合。下面的某些段落可以明确地引用并进一步限制其它段落，不受限制地提供一些合适组合的实例。更一般地，包括所有合适的组合。例如，段落A6在引用段落A0时可以与其它在先段落(诸如段落A5)或后续段落(诸如段落A7)组合，等等。类似地，一组中的段落可以与其它组中的段落组合。例如，段落A6可以与B、C和D组中的段落组合。
段落A0.一种用于使用具有数字成像装置的设备选择一个或多个单克隆细胞菌落的方法，该方法包括：(a)将样品板装载到设备中，样品板包括孔，孔具有保持在半固体培养基中的多个细胞；(b)在第一时间并使用数字成像装置捕获孔的竖直间隔开的多个第一图像，该间隔开的多个第一图像中的每个图像具有相对于水平面的相同位置以及沿Z轴的不同高度，使得关于孔生成第一体积图像堆栈；(c)基于显著晚于第一时间的第二时间捕获的孔的一个或多个共面图像，识别细胞的候选菌落的位置；(d)基于第一体积图像堆栈，确定候选菌落是单克隆的可能性(例如，细胞菌落与在第一时间捕获的一组图像中一个或多个细胞的位置之间的概率和/或距离)的量度；以及(e)响应于可能性的量度超过选定阈值(例如，特定概率和/或指定距离值，诸如50μm)，使用设备的挑取头将候选菌落挑取出来，以将该菌落的至少一部分进行隔离。
段落A0.1.根据段落A0所述的方法，其中，识别细胞的候选菌落的位置进一步基于包括菌落的形状、密度和/或大小在内的标准。
段落A0.2.根据段落A0所述的方法，其中，识别细胞的候选菌落的位置进一步基于该菌落与任何其它菌落的接近度。
段落A1.根据段落A0所述的方法，进一步包括：将多个细胞铺板在半固体培养基中，其中，捕获多个第一图像的步骤是在铺板之后不到二十个四小时内执行的。
段落A2.根据段落A0所述的方法，进一步包括：(f)在第二时间之前并使用数字成像装置，捕获孔的竖直间隔开的多个第二图像，使得关于孔生成第二体积图像堆栈；以及(g)将第二体积图像堆栈与第一体积图像堆栈进行比较，以确定细胞在半固体培养基中的移动(例如，漂移)。
段落A3.根据段落A0所述的方法，其中，第一体积图像堆栈中的每个图像具有离散的Z高度。
段落A4.根据段落A3所述的方法，其中，第一体积图像堆栈中的顺序图像的各Z高度相差至少大约20μm。
段落A5.根据段落A4所述的方法，其中，第一体积图像堆栈中的顺序图像的各Z高度相差小于大约50μm。
段落A6.根据段落A0所述的方法，其中，第一体积图像堆栈跨越孔中半固体培养基的整个深度。
段落A7.根据段落A0所述的方法，其中，确定候选菌落是单克隆的可能性的量度包括：观察到在候选菌落的选定半径内、在第一体积图像堆栈中发现不多于一个的细胞。
段落A8.根据段落A7所述的方法，其中，确定候选菌落是单克隆的可能性的量度包括：观察多少细胞位置概率锥与由候选菌落的选定半径限定的半球形体积相交。
段落A9.根据段落A7所述的方法，其中，观察到发现不多于一个的细胞包括观察到发现不少于一个的细胞。
段落A10.根据段落A0所述的方法，其中，识别细胞的候选菌落包括除单克隆性以外的至少一种标准。
段落A11.根据段落A0所述的方法，其中，间隔开的多个第一图像中的每个图像包括组合起来的多个较小图像。
段落A12.根据段落A11所述的方法，其中，多个较小图像是基于数字成像装置相对于水平面的相应已知位置通过裁剪和拼贴而组合起来的。
段落A13.根据段落A0所述的方法，其中，第一时间和第二时间相差至少大约10天。
段落A14.根据段落A13所述的方法，其中，第一时间对应于第零日并且第二时间对应于第10日或更晚时候。
段落A15.根据段落A0所述的方法，其中，用于捕获孔的竖直间隔开的多个第一图像的数字成像装置是第一数字成像装置，并且孔的一个或多个共面图像是使用第二数字成像装置在第二时间捕获的。
段落A16.根据段落A0所述的方法，进一步包括：在样品板的第二孔上重复进行捕获、识别、确定和挑取的步骤。
段落B0.一种用于使用设备选择一个或多个单克隆细胞菌落的方法，该方法包括：(a)将样品板装载到设备的工作台上，样品板包括孔，孔具有透明基部和保持在半固体培养基中的多个细胞，其中，孔被透气性密封件覆盖；(b)在相对于细胞的铺板而言的第零日，使用具有布置在工作台下方的物镜的数字成像装置来捕获孔的竖直间隔开的多个第一图像，每个第一图像都是透过透明基部拍摄的并具有沿Z轴的不同高度，使得关于孔生成体积图像堆栈；(c)基于在铺板之后至少5天捕获的孔的一个或多个第二图像，识别细胞的候选菌落的位置；(d)将候选菌落的位置与体积图像堆栈中的对应位置进行比较，确定候选菌落是单克隆的可能性的量度；以及(e)响应于可能性的量度超过选定阈值，使用设备的挑取头将候选菌落挑取出来，以将菌落的至少一部分重新定位到分配容器中。
段落B1.根据段落B0所述的方法，进一步包括：(f)基于体积图像堆栈，将第零日知道的多个细胞位置进行映射；(g)根据多个细胞位置，识别与所有其它细胞相隔至少第一选定半径的单个细胞；以及(h)将细胞的候选菌落的潜在位置限制为与所识别的单个细胞相对应的位置。
段落B2.根据段落B0所述的方法，其中，将候选菌落的位置与体积图像堆栈中的对应位置进行比较包括：确定候选菌落与能在体积图像堆栈中定位的一个或多个个体细胞之间的相应距离。
段落B3.根据段落B0所述的方法，其中，物镜的放大率在2×至7×之间。
段落B4A.根据段落B0所述的方法，其中，物镜的数值孔径在0.1至0.4之间。
段落B4B.根据段落B0所述的方法，其中，物镜是干式物镜。
段落B5.根据段落B0所述的方法，其中，孔的一个或多个第二图像是在铺板之后至少5天使用布置在工作台上方的第二数字成像装置捕获的。
段落B6.根据段落B0所述的方法，其中，使用X-Y定位器和Z轴定位器可在三个维度上定位物镜，方法进一步包括：(f)针对每个相应Z高度在X-Y平面中捕获多个较小图像；以及(g)将多个较小图像组合起来以产生体积图像堆栈中的第一图像中的一个。
段落B7.根据段落B6所述的方法，其中，组合多个较小图像包括对多个较小图像进行裁剪和拼贴。
段落B8.根据段落B0所述的方法，进一步包括：在样品板的第二孔上重复进行使用、识别、确定和挑取的步骤。
段落C0.一种用于使用设备选择一个或多个单克隆细胞菌落的方法，该方法包括：(a)将多个细胞铺板于在孔中具有选定深度的半固体培养基中，使得半固体培养基限定一体积；(b)将孔放置在设备上，并且使用设备的数字成像装置来捕获该体积的多个第一图像，每个第一图像与其它第一图像平行地以及正交地间隔开离散距离，使得多个第一图像跨越该体积；(c)在捕获多个图像之后，将孔培养几天；(d)在培养之后，捕获孔的单个平面的一个或多个第二图像；(e)基于一个或多个第二图像，使用一个或多个标准来选择细胞的候选菌落；(f)基于多个第一图像，确认细胞的候选菌落的单克隆性；以及(g)使用设备的挑取头，将细胞的候选菌落挑取出来。
段落C1A.根据段落C0所述的方法，其中，多个第一图像是在多个细胞中的大多数已经分裂之前收集的。
段落C1B.根据段落C0所述的方法，其中，多个第一图像是在半固体培养基已经凝固之后大约十二小时内收集的。
段落C1C.根据段落C0所述的方法，其中，多个第一图像的分辨率允许识别单个细胞。
段落C1D.根据段落C0所述的方法，进一步包括：在培养之前用透气性膜将孔密封。
段落C2.根据段落C0所述的方法，进一步包括：在将孔放置在设备上并捕获第一图像之前，将孔以100倍重力的离心力进行离心至少大约5分钟。
段落C3.根据段落C2所述的方法，进一步包括：在离心步骤之后，将附加的半固体培养基层添加到孔中。
段落C4.根据段落C0所述的方法，其中，第一图像之间的离散距离小于大约50μm。
段落C5.根据段落C0所述的方法，其中，第一图像基本上是水平的并且沿着竖直轴线间隔开。
段落C6.根据段落C0所述的方法，其中，确认细胞的候选菌落的单克隆性包括：确定在该体积的多个第一图像中，在候选菌落的位置的选定半径内，存在多少个个体细胞。
段落C7.根据段落C6所述的方法，其中，选定半径是恒定的，从而限定了在该体积内的半球形子体积。
段落C8.根据段落C6所述的方法，其中，选定半径是基于高度而变化的。
段落C9.根据段落C6所述的方法，其中，确认单克隆性进一步包括：确定在该体积的多个第一图像中，在候选菌落的位置的选定半径内正好存在一个细胞。
段落C10.根据段落C0所述的方法，其中，半固体培养基的选定深度为大约1mm。
段落C11.根据段落C0所述的方法，其中，用于选择候选菌落的一个或多个标准包括荧光强度。
段落D0.一种用于挑取细胞菌落的设备，包括：(a)设备床，其构造成接收样品容器，其中，样品容器包括透明底板，透明底板支撑一体积的半固体培养基，多个细胞存在于该体积的半固体培养基中；(b)数字照相机，其具有物镜，物镜布置在设备床的下方，使得能透过样品容器的透明底板捕获半固体培养基中的细胞的数字图像；(c)Z轴定位器，其联接至物镜并且构造成将物镜定位在可选的竖直高度；(d)X-Y定位器，其联接至物镜并且构造成将物镜定位在可选的水平位置；(e)设备的挑取头，其将菌落的至少一部分进行隔离；以及(f)控制器，其联接至数字照相机、Z轴定位器、X-Y定位器和挑取头，控制器具有处理器，处理器构造成执行存储的一组指令以(i)捕获该体积的半固体培养基的竖直间隔开的多个图像，每个图像都是透过透明底板拍摄的并具有沿Z轴的不同高度，使得生成体积图像堆栈，并且(ii)定位挑取头以将菌落的至少一部分进行隔离。
段落D1.根据段落D0所述的设备，其中，物镜的放大率在2×至7×之间。
段落D2.根据段落D0所述的设备，其中，物镜的数值孔径在0.1至0.4之间。
段落D3.根据段落D0所述的设备，其中，物镜是干式物镜。
段落D4.根据段落D0所述的设备，其中，竖直间隔开的图像的连续高度相差不超过大约50μm。
段落D5.根据段落D0所述的设备，样板容器包括多孔板的孔，其中，处理器进一步构造成在多孔板的另一孔上执行存储的一组指令。
段落D6.根据段落D0所述的设备，其中，单个细胞的图像占据数字照相机的至少约4个像素。
实例7.选择的实施例2
该实例描述了不受限地呈现为一系列索引段落的细胞菌落选择、分析和挑取方法的又进一步方面和特征。
段落E0.一种用于使用具有数字成像装置的设备选择一个或多个单克隆细胞菌落的方法，该方法包括：(a)将样品板装载到设备上，样品板包括孔，孔具有保持在半固体培养基中的多个细胞；(b)在第一时间并使用数字成像装置捕获孔的多个竖直间隔开的第一图像，每个图像具有沿Z轴的不同高度，使得关于孔生成体积图像堆栈(或Z堆栈)；(c)基于在显著晚于第一时间的第二时间捕获的孔的一个或多个图像，识别细胞的候选菌落的位置；(d)基于体积图像堆栈，确定候选菌落是单克隆的可能性的量度；以及(e)响应于所确定的可能性的量度，使用设备的挑取头将候选菌落挑取出来，以将菌落的至少一部分进行隔离。
段落E1.根据段落E0所述的方法，进一步包括：将多个细胞铺板在半固体培养基中的步骤，其中，捕获多个第一图像的步骤是在铺板之后不到二十个小时内执行的。
段落E2.根据段落E1所述的方法，其中，捕获多个第一图像的步骤是在铺板之后不到六个小时内执行的。
段落E3.根据段落E1或E2所述的方法，进一步包括：在铺板多个细胞的步骤与将样品板装载到设备上的步骤之间，将容纳铺板细胞的孔进行离心。
段落E4.根据段落E3所述的方法，其中，将孔进行离心的步骤以至少50倍重力的离心力执行至少3分钟。
段落E5.根据段落E4所述的方法，其中，将孔进行离心的步骤以约100倍重力的离心力执行约5分钟。
段落E6.根据段落E3-E5中任一段落所述的方法，进一步包括：在离心步骤之后将附加的半固体培养基添加到孔中的步骤。
段落E7.根据前述段落中任一段落所述的方法，进一步包括：在装载板的步骤之前，用透气性密封件覆盖孔的步骤。
段落E8.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，孔中的半固体培养基的深度不超过大约1mm。
段落E9.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，体积图像堆栈中的顺序图像的各Z坐标相差至少大约20μm。
段落E10.根据段落E9所述的方法，其中，体积图像堆栈中的顺序图像的各Z坐标相差小于大约50μm。
段落E11.根据段落E10所述的方法，其中，体积图像堆栈中的顺序图像的各Z坐标相差25μm至45μm之间。
段落E12.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，体积图像堆栈跨越孔中的半固体培养基的整个深度。横跨培养基的整个深度收集图像可能是期望的，即使根据段落E0的方法覆盖扫描仅一部分深度，因为扫描整个深度提供了关于尽可能多的细胞位置的信息，从而潜在地增加方法的可靠性。
段落E13.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，多个第一图像是在多个细胞中的大多数已经分裂之前收集的。
段落E14.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，多个第一图像是在半固体培养基已经凝胶化之后大约六个小时内收集的。
段落E15.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，多个第一图像的分辨率允许识别单个细胞。
段落E16.根据段落E15所述的方法，其中，单个细胞的图像占据数字成像装置的至少约4个像素。
段落E17.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，孔具有透明基部，并且数字成像装置具有布置在基部下方的物镜。
段落E18.根据段落E17所述的方法，其中，物镜的放大率在2×至7×之间。
段落E19.根据段落E17或E18所述的方法，其中，物镜的数值孔径在0.1至0.4之间。
段落E20.根据段落E17-E19中任一段落所述的方法，其中，物镜是干式物镜。
段落E21.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，多个第一图像中的每个图像包括组合起来的多个较小图像，这些较小图像是在相同Z高度处捕获的。
段落E22.根据段落E21所述的方法，其中，多个较小图像是基于数字成像装置相对于水平面的相应已知位置而组合起来的。
段落E23.根据前述段落中任一段落所述的方法，进一步包括：(f)基于体积图像堆栈将多个细胞位置进行映射；(g)根据多个细胞位置，识别与所有其它细胞相隔至少第一选定距离(例如，50μm)的单个细胞；以及(h)将细胞的候选菌落的潜在位置限制为与识别的该单个细胞相对应的位置(即，如果这些位置与所有其它细胞没有相隔至少第一选定距离，则排除将以别的方式被接受的潜在位置)。
段落E24.根据前述段落中任一段落所述的方法，体积图像堆栈是第一体积堆栈，该方法进一步包括：(f)在第二时间之前并使用数字成像装置，捕获孔的多个竖直间隔开的第二图像，使得关于孔生成第二体积图像堆栈；以及(g)将第二体积图像堆栈与第一体积图像堆栈进行比较，以确定细胞在半固体培养基中的移动。
段落E25.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，用于捕获孔的竖直间隔开的多个第一图像的数字成像装置是第一数字成像装置，并且孔的一个或多个图像是使用第二数字成像装置在第二时间捕获的。
段落E26.根据段落E25所述的方法，其中，第二数字成像装置布置在孔的上方。
段落E27.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，第一时间和第二时间相差至少10天。
段落E28.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，识别细胞的候选菌落的位置的步骤进一步包括除单克隆性以外的至少一种标准。
段落E29.根据段落E28所述的方法，其中，至少一种标准选自由菌落的形状、密度和大小构成的组。
段落E30.根据段落E28或E29所述的方法，其中，至少一种标准至少部分地基于候选菌落与细胞的任何其它菌落的接近度。
段落E31.根据段落E28的方法，其中，至少一种标准包括来自候选菌落的荧光的强度。
段落E32.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，确定候选菌落是单克隆的可能性的量度的步骤包括：观察在体积图像堆栈中、在候选菌落的位置的选定距离内发现不多于一个细胞的步骤。
段落E33.根据段落E32所述的方法，其中，该距离不大于约50μm。
段落E34.根据段落E0所述的方法，其中，确定候选菌落是单克隆的可能性的量度的步骤包括：观察多少细胞位置概率锥与由候选菌落的选定距离限定的半球形体积相交。
段落E35.根据前述段落中任一段落所述的方法，其中，确定候选菌落是单克隆的可能性的量度的步骤包括：将候选菌落的位置与体积图像堆栈中的对应位置进行比较的步骤。
段落E36.根据段落E35所述的方法，其中，将候选菌落的位置与体积图像堆栈中的对应位置进行比较的步骤包括：对候选菌落与能在体积图像堆栈中找到的一个或多个个体细胞之间的相应距离进行评价的步骤。
段落E37.根据前述段落中任一段落所述的方法，进一步包括：在挑取步骤之后，将菌落的至少一部分重新定位在分配容器中的步骤。
段落E38.根据前述段落中任一段落所述的方法，进一步包括：在样品板的第二孔上重复进行捕获、识别、确定和挑取的步骤。
F0.一种用于挑取细胞菌落的设备，包括：(a)设备床，其构造成接收样品容器，其中，样品容器包括透明基部，透明基部支撑一体积的半固体培养基，多个细胞存在于该体积的半固体培养基中；(b)数字照相机，其具有物镜，物镜布置在设备床的下方，使得能透过样品容器的透明基部捕获半固体培养基中的细胞的数字图像；(c)Z轴定位器，其联接至物镜并且构造成将物镜定位在可选的竖直高度；(d)设备的挑取头，以将菌落的至少一部分进行隔离；以及(e)控制器，其联接至数字照相机、Z轴定位器和挑取头，控制器具有处理器，处理器构造成执行存储的一组指令以(i)捕获该体积的半固体培养基的竖直间隔开的多个图像，每个图像都是透过透明基部拍摄的并具有沿Z轴的不同高度，使得生成体积图像堆栈，并且(ii)定位挑取头以将菌落的至少一部分进行隔离。
段落F1.根据段落F0所述的设备，进一步包括：X-Y定位器，其联接至物镜和控制器并且构造成将物镜定位在可选的水平位置。
段落F2.根据段落F0或F1所述的设备，其中，竖直间隔开的多个图像是在第一时间捕获的，并且处理器进一步构造成执行存储的一组指令，以在显著晚于第一时间的第二时间捕获该体积的半固体培养基的一个或多个图像。
段落F3.根据段落F0至F2中任一段落所述的设备，其中，单个细胞的图像占据数字照相机的至少约4个像素。
结论
以上阐述的公开内容可以包括具有独立效用的多个不同的发明。尽管已经以其一个或多个优选形式公开了这些发明中的每一个，但是本文公开和示出的本发明的特定实施例不应被认为是限制性的，因为可以进行多种变化。本发明的主题包括本文公开的各种元件、特征、功能和/或特性的所有新的和非显而易见的组合和子组合。以下权利要求特别指出了被认为是新的且非显而易见的某些组合和子组合。可以在要求本申请或相关申请的优先权的申请中要求保护以特征、功能、元件和/或特性的其它组合和子组合体现的发明。这样的权利要求，无论是针对不同的发明还是相同的发明，以及与原始权利要求的范围相比是更宽、更窄、相同还是不同，也都被认为被包括在本公开的发明的主题内。此外，除非另外具体说明，否则用于所标识的元素的顺序指示符(诸如第一、第二或第三)用于区分这些元素，并且不指示这些元素的特定位置或顺序。

Claims (43)

1.一种用于使用具有数字成像装置的设备选择一个或多个单克隆细胞菌落的方法，所述方法包括：
将样品板装载到所述设备中，所述样品板包括孔，所述孔具有保持在半固体培养基中的多个细胞；
在第一时间并使用所述数字成像装置，捕获所述孔的竖直间隔开的多个第一图像，每个第一图像具有沿Z轴的不同高度，使得关于所述孔生成体积图像堆栈；
基于在显著晚于所述第一时间的第二时间捕获到的所述孔的一个或多个图像，识别细胞的候选菌落的位置；
基于所述体积图像堆栈，确定所述候选菌落是单克隆的可能性的量度；以及
响应于所确定的可能性的量度，使用所述设备的挑取头将所述候选菌落挑取出来，以将菌落的至少一部分进行隔离。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：将所述多个细胞铺板在所述半固体培养基中的步骤，其中，捕获所述多个第一图像的步骤是在铺板之后不到二十个四小时内执行的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，捕获所述多个第一图像的步骤是在铺板之后不到六个小时内执行的。
4.根据权利要求2所述的方法，进一步包括：在将所述多个细胞铺板的步骤与将样品板装载到所述设备中的步骤之间，对容纳经铺板的细胞的所述孔进行离心。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，对所述孔进行离心的步骤以至少50倍重力的离心力执行至少3分钟。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，对所述孔进行离心的步骤以约100倍重力的离心力执行约5分钟。
7.根据权利要求4所述的方法，进一步包括：在离心步骤之后将附加的半固体培养基添加到所述孔中的步骤。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：在装载所述样品板之前用透气性密封件覆盖所述孔的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述半固体培养基在所述孔中的深度不超过大约1mm。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积图像堆栈中的顺序图像的各Z坐标相差至少大约20μm。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述体积图像堆栈中的顺序图像的各Z坐标相差小于大约50μm。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述体积图像堆栈中的顺序图像的各Z坐标相差25μm到45μm。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积图像堆栈跨越所述孔中所述半固体培养基的整个深度。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个第一图像是在所述多个细胞中的大多数已经分裂之前收集的。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个第一图像是在所述半固体培养基已经凝胶化之后大约六个小时内收集的。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个第一图像的分辨率允许识别单个细胞。
17.根据权利要求16所述的设备，其中，单个细胞的图像占据所述数字成像装置的至少约4个像素。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孔具有透明的基部，并且所述数字成像装置具有布置在所述基部下方的物镜。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述物镜的放大率在2×至7×之间。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述物镜的数值孔径在0.1至0.4之间。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述物镜是干式物镜。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个第一图像中的每个图像包括组合起来的多个较小图像，所述多个较小图像全部是在沿所述Z轴的相同高度处捕获到的。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述多个较小图像是基于所述数字成像装置相对于水平面的相应已知位置而组合起来的。
24.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
基于所述体积图像堆栈，将多个细胞位置进行映射；
根据所述多个细胞位置，识别与所有其它细胞相隔至少第一选定距离的单个细胞；以及
将所述候选菌落的潜在位置限制为与所识别的单个细胞相对应的位置。
25.根据权利要求1所述的方法，所述体积图像堆栈是第一体积图像堆栈，所述方法进一步包括：
在所述第二时间之前并使用所述数字成像装置，捕获所述孔的竖直间隔开的多个第二图像，使得关于所述孔生成第二体积图像堆栈；以及
将所述第二体积图像堆栈与所述第一体积图像堆栈进行比较，以确定细胞在所述半固体培养基中的移动。
26.根据权利要求1所述的方法，其中，用于捕获所述孔的竖直间隔开的所述多个第一图像的所述数字成像装置是第一数字成像装置，并且所述孔的所述一个或多个图像是使用第二数字成像装置在所述第二时间捕获的。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述第二数字成像装置布置在所述孔的上方。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一时间和所述第二时间相差至少10天。
29.根据权利要求1所述的方法，其中，识别细胞的候选菌落的位置的步骤进一步包括除单克隆性以外的至少一种标准。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述至少一种标准选自由菌落的形状、密度和大小构成的组。
31.根据权利要求29所述的方法，其中，所述至少一种标准至少部分地基于所述候选菌落与细胞的任何其它菌落的接近度。
32.根据权利要求29所述的方法，其中，所述至少一种标准包括来自所述候选菌落的荧光强度。
33.根据权利要求1所述的方法，其中，确定所述候选菌落是单克隆的可能性的量度的步骤包括：观察在所述体积图像堆栈中、在所述候选菌落的位置的选定距离内发现不多于一个细胞的步骤。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述距离不大于约50μm。
35.根据权利要求1所述的方法，其中，确定所述候选菌落是单克隆的可能性的量度的步骤包括：观察多少细胞位置概率锥与由所述候选菌落的选定距离限定的半球形体积相交。
36.根据权利要求1所述的方法，其中，确定所述候选菌落是单克隆的可能性的量度的步骤包括：将所述候选菌落的位置与所述体积图像堆栈中的对应位置进行比较的步骤。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，将所述候选菌落的位置与所述体积图像堆栈中的对应位置进行比较的步骤包括：对所述候选菌落与能在所述体积图像堆栈中找到的一个或多个个体细胞之间的相应距离进行评价的步骤。
38.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：在挑取步骤之后，将菌落的至少一部分重新定位在分配容器中的步骤。
39.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：在所述样品板的第二孔上重复进行捕获、识别、确定和挑取的步骤。
40.一种用于挑取细胞菌落的设备，包括：
设备床，其构造成接收样品容器，其中，所述样品容器包括透明基部，所述透明基部支撑一体积的半固体培养基，多个细胞存在于所述体积的半固体培养基中；
数字照相机，其具有物镜，所述物镜布置在所述设备床的下方，使得能透过所述样品容器的所述透明基部捕获所述半固体培养基中的所述细胞的数字图像；
Z轴定位器，其联接至所述物镜并且构造成将所述物镜定位在能选择的竖直高度；
所述设备的挑取头，其将所述菌落的至少一部分进行隔离；以及
控制器，其联接至所述数字照相机、所述Z轴定位器和所述挑取头，所述控制器具有处理器，所述处理器构造成执行存储的一组指令以(i)捕获所述体积的半固体培养基的竖直间隔开的多个图像，每个图像都是透过所述透明基部拍摄的并具有沿Z轴的不同高度，使得生成体积图像堆栈，并且(ii)定位所述挑取头以将所述菌落的至少一部分进行隔离。
41.根据权利要求40所述的设备，进一步包括：X-Y定位器，所述X-Y定位器联接至所述物镜和所述控制器，并且构造成将所述物镜定位在能选择的水平位置。
42.根据权利要求40所述的设备，其中，所述竖直间隔开的多个图像是在第一时间捕获的，并且所述处理器进一步构造成执行存储的一组指令以在显著晚于所述第一时间的第二时间捕获所述体积的半固体培养基的一个或多个图像。
43.根据权利要求40所述的设备，其中，单个细胞的图像占据所述数字照相机的至少约4个像素。
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