JP2014502146A - 弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置及び方法 - Google Patents

Abstract

非蛍光のアプローチを用いて、細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別のための装置。装置の構成は、カメラ、光源、 細胞集団中の少なくとも一つの細胞培養を許容するエンバイロメントチャンバーを備えた微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡；所定の時間に細胞集団のイメージを取得するための画像取得ユニット、画像の細胞集団の少なくとも一つの細胞個々を追跡する細胞追跡手段、 弁別的細胞イベントの発生を検出する弁別的細胞イベント検出器、 三極分裂（TD）、四極分裂（QD）、五極分裂（HD）、細胞融合（CF）、細胞死（CD）、不完全分裂（IP）、細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、そして 分裂時間遅延からなるグループから選ばれた弁別的細胞イベントのレポートジェネレータである。

Description

本発明は、非蛍光アプローチにより細胞集団中の少数の細胞で発生する稀な弁別的細胞イベントの一細胞毎での定量的識別に関するものである。

多くの疾病、例えば癌、は数多くの正常細胞中に見出され得る一つまたは少数の特徴的細胞から発生し得る 。

人体では、特徴的または悪性形質転換細胞は環境を汚染している発癌性物質への曝露によって生成し得る。このような特徴的または悪性形質転換細胞は、発癌性物質に曝露された人間の体液や血液中にも見られ得る。したがって、ヒト癌または発癌性物質研究のための実験室技術には、特徴的細胞、悪性形質転換、または、悪性形質転換や疾病に導くカスケードの開始の瞬間を正確にピンポイントできる能力の必要であること、は自明である。

しかし、どの既存の試験管内遺伝毒性や変異原性試験でもこのような研究は容易に行えない。なぜならば、環境中の発癌性物質の濃度は一般的には数多くの細胞に何らかの反応を誘導するためには低過ぎるからである。言い換えれば、現在利用可能なテストはある物質によって引き起こされる主要でかつ頻繁に見られる現象の検出のみに最適化されており、ヒトが曝露されていると考えられる濃度によって引き起こされる稀な現象を検知するには感受性が十分ではない。

ヒト発癌物質の同定および検索を目的とするこれらのテストでは、実験的な妥協また既存技術で検出可能なレベルの反応を誘導するため、高濃度の物質が用いられている。したがって、悪性形質転換機構解明およびヒトに対して発癌性のある物質の同定、またはあらゆるタイプの病気の起源の解明において、実験室の研究は、不正確であることが知られているにもかかわらず、 高低濃度外挿に頼らざるを得ないのである。

既存の方法やテストは細胞反応の共通性の検出や分析に最適化されている。したがって、これらの方法では重要な情報を見逃す可能性がある。なぜならば、これらは少数の変異細胞に見られる特殊性やこのような"発端"細胞のみに起こるイベントといった、固有な特徴を無視しているからである。 悪性形質転換機構、ヒト発癌性物質の同定または多くの病気の起源の研究における既存の方法の不正確性または限界は、それゆえに、既存の方法の基となる概念やデザインと極めて高く関連している可能性がある 。

細胞培養レベルでは、 環境濃度の発癌性物質は、例えば 細胞増殖速度、細胞死誘導の頻度や細胞の倍加時間に、検出可能な影響を及ぼさないであろう。一方、これらの濃度の発癌性物質は実際にヒトに癌を起こす事から、これらの濃度でも少数の細胞に特徴性を誘導し得る。

米国特許出願６１／４０６３６２号公報

本発明は、特徴的細胞、弁別的細胞イベント、および、頻度や優勢に係らず、細胞集団中の他の細胞とは異なる弁別的な挙動を示す細胞を、一細胞追跡により、検索および定量的に識別することを課題とする。

本発明は、長期間のライブセルイメージング、個々の細胞追跡、細胞系統データベース構築そして定量分析として実施される。

所定の波長の光による蛍光物質の励起は細胞毒性の原因となり得るため、非蛍光のイメージングが用いられ、全ての細胞イベントが経時的に記録されるため、１６０００細胞中、１６０時間に一回しか起こらない程度の稀な弁別的細胞イベントも検出可能である。

ライブセルイメージング動画を作成するために、細胞は顕微鏡のステージ上で培養される。これらの動画は、その後個々の細胞追跡に使用される。次に、そして試験物質、一実施形態では低濃度（例えば、非細胞毒性濃度や環境濃度）、に曝露された細胞または細胞集団の反応を分類するため、これらの動画のデータベースが分析のために作製され、細胞イベントの性質および量が決定および収集される。

従って、第一の実施形態において、本発明は試験条件下における細胞培養期間中、正常なイベントに混ざって起こる弁別的細胞イベントの識別に関連する方法であり、包含されるステップは：顕微鏡観察下で細胞培養を維持すること、正常環境下で少なくとも一つの前駆細胞が分裂し少なくとも一つの子細胞を生成するのに十分な時間内で行われたその前駆細胞の観察中に撮られた連続的なイメージによる経時的データを収集すること、インデックス作成のために時間点= 1における特徴的な識別子を持った少なくとも一つの培養前駆細胞の経時的データを使用すること、インデックス化された前駆細胞の細胞系統を確立するために前駆細胞に由来する少なくとも一つの子細胞を識別するために経時的データを使用すること、細胞系統に関連する少なくとも一つの細胞イベントを識別すること、イベントカテゴリーを樹立するために細胞イベントを分類すること、 細胞系統に関連したイベントカテゴリーの数の記録をすること、である。
分類されたベントカテゴリーの発生および/または数は試験条件に対する細胞系統の反応と相関し得る。

この方法は通常の細胞イベントに混ざって起きた弁別的イベントの頻度や優勢に関わり無く実施できる。

第二の実施形態において、本発明は試験物質に曝露または処理された際の弁別的細胞イベントの発生するリスクの増加に関する評価と関連し、上述されたステップおよびさらに以下のステップを包含する：試験物質を含まない、または、処理を行わない対照培養と処置培養との間で少なくとも一つのイベントカテゴリーの発生および／または数を比較すること。対照培養と比較して処置培養の中で少なくとも一つの弁別的イベントカテゴリー数の増加した場合、試験物質が培養細胞中の細胞に特徴性のある、または、ユニーク／弁別的な細胞挙動を誘導する効果のあることの示唆となる。

第一および第二の実施形態について、 イベントカテゴリーは正常、弁別的細胞イベント、ある細胞マーカーの存在、または非存在あるいはそのマーカーのレベルから選択される。

本発明の更なる様態において、細胞イベントは 以下から選ばれる：二極分裂（DD）、三極分裂（TD）、四極分裂（QD）、五極分裂（HD）、細胞融合（CF）、細胞死（CD）、不完全または部分的な分裂（IP）、細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、及び分裂時間遅延。現在確認されていないか、まだ分類されていない新しい細胞イベントタイプも追加され得る。

第三の実施形態において、本発明は "発端"細胞とそれを引き起こす可能性のある試験物質の濃度と関連し、以下のステップを包含する： 顕微鏡観察下、 非細胞毒性濃度の試験物質の存在条件で細胞培養を維持すること、少なくとも一つの前駆細胞が分裂し少なくとも一つの子細胞を生成するのに十分な時間内で行われた観察中に撮られた連続的なイメージによる経時的データを収集すること、インデックス作成のためのユニークな識別子を持った少なくとも一つの培養前駆細胞の時間点= 1における経時データを使用すること、インデックス化された前駆細胞の細胞系統を確立するために前駆細胞から由来する少なくとも一つの子細胞を識別するために経時的イメージを使用すること、細胞系統に関連する少なくとも一つの細胞イベントの識別をすること、 細胞系統に関連した弁別的細胞イベント数を記録すること。 少なくとも一つの細胞系統に関連する弁別的細胞イベントの存在は試験物質が培養細胞中の少数の細胞に特徴性またはユニークな挙動を誘導し得る有力な候補であることの示唆となる。

一実施形態では、上述した実施形態に関連して、試験物質はその非細胞毒性濃度での弁別的細胞イベントの誘導剤（以下DCEI）であり得る。

一実施形態では、本発明は有力なDCEIの同定のための方法を提供し、その方法は以下のステップを包含する：顕微鏡観察下、 非細胞毒性濃度の試験物質の存在条件で細胞培養を維持すること、少なくとも一つの前駆細胞が分裂し少なくとも一つの子細胞を生成するのに十分な時間内で行われた観察中に撮られた連続的なイメージによる経時的データを収集すること、インデックス作成のためのユニークな識別子を持った少なくとも一つの培養前駆細胞の時間点= 1における経時的データを使用すること、 インデックス化された前駆細胞の細胞系統を確立するために前駆細胞に由来する少なくとも一つの子細胞を識別するための経時的イメージを使用すること、細胞系統に関連した弁別的イベント数を記録すること。少なくとも1つの弁別的な細胞イベントは以下からなるグループから選ばれる：TD、QD、HD、CF、IP、 細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、分裂時間遅延、そして現在確認されていないか、まだ分類されていない新しい細胞イベントタイプ。それによって少なくとも1つの細胞系統に関連付けられた弁別的細胞イベントの存在は試験物質が有力な DCEIであることを示唆する。

一実施形態では、本発明に関連して、この方法は、DCEIとしての多くのかつ様々な有力な発癌性、遺伝毒性、変異原性および細胞毒性物質のスクリーニング法を提供する。また、有力なDCEIの一部は感染性病原体、例えば細菌やウイルス、または、炎症性物質、例えば尿素結晶、凝集したタンパク質またはプリオン、または生理活性天然物や遺伝物質であり得る。

一実施形態では、DCEIは細胞毒性化合物、または腫瘍プロモーター、または放射線、例えば紫外線、赤外線、電磁場、電子線、または粒子や材料、例えば、アスベスト繊維、または、排気ガスや煙草の煙に含まれる化学物質または粒状物質であり得る。

一実施形態では、この方法を非細胞毒性濃度で慢性曝露条件下（すなわち、長い潜伏期間）、どの試験物質が有力なDCEIとして作用するかを確立するための手段を提供する。

一実施形態では、本発明に関連して、この方法は弁別的細胞イベントのタイミング、感染、細胞による物質の取り込みのタイミングや細胞-細胞（病原体）接触のタイミングを観察するための手段を提供する。

一実施形態において、本発明の方法は、一旦DCEIが本発明の方法によって同定された場合、 DCEIの阻害または阻止または対抗し得る物質の分析法提供をする。

一実施形態では、本方法は、変異原性や毒性的副作用を持つ抗がん剤とより安全な抗がん剤を区別する手段を提供し得る。

一実施形態では、本発明の第三の実施に関して、弁別的細胞イベントは以下から選択される：弁別的細胞イベント（TD、QD、HD、CF、IP、 細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、分裂時間遅延）、または細胞マーカーレベルの正常状態からの変化、または現在確認されていないか、まだ分類されていない新しい細胞タイプのイベント。

一実施形態では、 細胞マーカーレベルの変化を、通常存在しない細胞内または上のマーカーの観察、または、通常細胞内または上に存在するマーカーの欠損の観察、により定性的に評価でき得る。

本発明の別の態様では、弁別的細胞イベントが以下のグループからなる弁別的細胞イベントとして観察され得る：TD、QD、HD、CF、IP、細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、分裂時間遅延そして現在確認されていないか、まだ分類されていない新しい細胞タイプのイベント。

本発明の更なる態様では、弁別的細胞イベント の原因となるDCEIを起こす濃度の決定は、異なる濃度でテストされた、そして、細胞系統内で特徴性と関連しているかもしれないイベントを発現している"発端"細胞の形成をうながした最初の濃度を確立する際に決定される。そのような弁別的細胞イベントは以下からなるグループから選択される：TD、QD、HD、CF、IP、 細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、分裂時間遅延そして現在確認されていないか、まだ分類されていない新しい細胞タイプのイベント。

本発明の更なる態様では、所定の画像を捉えるステップは顕微鏡のステージ上に制御された条件下、密閉かつ安定化された方法によって細胞が培養されているところの顕微鏡に装着されたカメラによってなされる。一実施形態では、 細胞はマルチウエルチャンバー内で培養される。いくつかのケースでは、チャンバーの異なるウエル内にある細胞を、種々のテスト条件下と同時に対照条件で培養ができ、それにより、例えば比較目的での適切な対照を確実にする。

本発明の更なる態様では、細胞は、弁別的細胞イベントを捉えるため、任意の時間の観察のために培養される。この点において、対照条件下においても有害な影響を及ぼし得る蛍光物質の励起および発光に由来する光毒性を回避するため、蛍光を使用せずに顕微鏡下で細胞は観察される。一実施形態では、細胞は顕微鏡下で、微分干渉コントラスト（DIC）を使用して観察される。

一実施形態では、培養した細胞は真核細胞である。一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞であり、例えばヒトの細胞である。

一実施形態では、細胞は接着細胞である。それでも、一実施形態では、細胞不死化細胞株由来、または新鮮な組織サンプル由来、または、ウエルの中で培養できるあらゆる細胞である。

別の態様によれば、 本明細書に記載された方法はコンピュータに実装された方法を提供する。特に、一旦、 一定の時間数の間、観察下の細胞が記録されれば、細胞の変化は、細胞系統図の生成、そして正常と弁別的細胞イベントに関するコンパイルされたデータを比較も、自動化された方法で追跡される。その細胞系統図および比較も コンピュータの実装法の一部となり得、従って自動化された方法で行われる。

したがって、本明細書ではテスト条件下での培養において稀な弁別的細胞イベントの発生の識別に係るコンピュータ実装方法、およびテスト条件下での培養において稀な弁別的細胞イベントの発生の識別に係るシステムが記載されている。システムはコンピュータに実装された方法を協調的に実施するためのハードウェアとソフトウェアの組み合わせで構成されている。ソフトウェアの部分は、プロセッサーに対し単一のアプリケーションまたは二種以上を組み合わせたアプリケーションとして提供し得る 。

広範な態様によれば、 非蛍光アプローチを用いて細胞集団で発生する弁別的細胞イベントを定量的に識別する装置が提供されている。装置はカメラを備えた微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡画像取得ユニット、光源、細胞集団中の少なくとも1つの細胞の培養を前駆細胞が分裂によって少なくとも一つ子細胞を形成するのに十分な期間行うことができるエンバイロメンタルチャンバー、チャンバー内の細胞集団のイメージを決められた時間数捉えるためのイメージ取得ユニットを制御するためのコントローラー、 イメージ取得ユニットによって得られたイメージ中の細胞集団の内、少なくとも一つの細胞を個々に追跡するための細胞追跡ユニット、細胞追跡ユニットによって個々に追跡された少なくとも一つの細胞に対する弁別的細胞イベントを検出するための弁別的細胞イベント検出ユニット、検出された弁別的な細胞イベントの識別を含むレポートを生成するレポート生成ユニット。弁別的な細胞イベントは以下を構成するグループから選ばれる：二極分裂（DD）、三極分裂（TD）、四極分裂（QD）、五極分裂（HD）、細胞融合（CF）、細胞死（CD）、不完全または部分的な分裂（IP）、細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、そして 分裂時間遅延から選ばれる。

一実施形態では、光源は可視の波長か近赤外線を発光する。

一実施形態では、一定の期間は、少なくとも一つの細胞によって何世代の子孫生成するための十分な期間。

一実施形態においては、その期間は7分から200時間の間である。

一実施形態では、細胞集団内の少なくとも1つの細胞は最初の期間では100以上である。

一実施形態では、顕微鏡システムは、コントローラーによって制御されたXYステージとZドライブを含む。

一実施形態では、画像取得ユニットはさらに少なくとも一つの光学フィルター、高倍率レンズおよびカップラーを含む。

一実施形態で、本装置は、イメージ取得ユニットによって生成されたイメージを整理するためのイメージファイル整理ユニットを含む。

一実施形態では、チャンバーは少なくとも二つの視野フィールドの画像にわけられる。その中でコントローラーが各々の視野フィールドの画像からのイメージファイルを生成するイメージ取得ユニットをコントロールし、イメージ整理ユニットがイメージ取得ユニットによって生成されたイメージを少なくとも二つの視野フィールドの画像を含むセットに整理する。

一実施形態では、細胞追跡ユニットは細胞集団中の少なくとも一つの細胞の各々そして全てを個々に追跡する。

一実施形態では、装置はさらに細胞追跡ユニットによって個々に追跡された少なくとも一つの細胞にユニークな識別子を割り振るための細胞系統追跡を含む。

一実施形態では、弁別的細胞イベントは細胞集団中、１０％以下の細胞で起こる。

一実施形態では、装置は個々に追跡された細胞に関連した弁別的細胞イベントのインデクスの保存ユニットを含む。

一実施形態では、レポート生成ユニットはレポート中に細胞系統情報を含む。

一実施形態では、チャンバーは試験物質で処置される。

一実施形態では、チャンバーは少なくとも二つのウエルを持つマルチウエルチャンバーである。

拡張された態様として、非蛍光アプローチを用いて細胞集団で発生する弁別的細胞イベントを定量的に識別する装置が提供されている。その方法は、カメラを備えた微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡画像取得ユニット、光源、細胞集団中の少なくとも1つの細胞の培養を前駆細胞が分裂によって少なくとも一つ子細胞を形成するのに十分な期間、行うことができるエンバイロメンタルチャンバー、チャンバー内の細胞集団のイメージを決められた時間数捉えるためのイメージ取得ユニットを制御するためのコントローラー、 イメージ取得ユニットによって得られたイメージ中の細胞集団の内、少なくとも一つの細胞を個々に追跡するための細胞追跡ユニット、細胞追跡ユニットによって個々に追跡された少なくとも一つの細胞に対する弁別的細胞イベントを検出するための弁別的細胞イベント検出ユニット、検出された弁別的細胞イベントの識別を含むレポートを生成するレポート生成ユニット。弁別的な細胞イベントは以下からなるグループから選ばれる：二極分裂（DD）、三極分裂（TD）、四極分裂（QD）、五極分裂（HD）、細胞融合（CF）、細胞死（CD）、不完全または部分的な分裂（IP）、細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、そして 分裂時間遅延から選ばれる。

拡張された態様として、細胞集団中の細胞の個性を検出するために、非蛍光アプローチを用い細胞集団で発生する稀な弁別的細胞イベントを定量的に識別する装置の使用が記載されている。

一実施形態において、細胞集団は非細胞毒性濃度の物質で処理される。

特段の定義がない限り、すべての技術用語、本明細書において使用される他の科学用語は、本発明が属する当分野の技術者によって共通に理解される意味を有する 。いくつかのケースでは、一般的に理解される意味は明確化および/または参考のために本明細書中で定義されており、このような定義を含めることは、必ずしもここに、当該技術分野において一般的に理解されている以上の実質的な違いを表現することとは解釈されるべきではない。本明細書に記述または参照された技術および手順は、一般的に良く理解されそして当分野の技術者によって従来の方法論を用いて一般的に採用されている。

本明細書において、表現 "弁別的細胞イベント"は二つの子細胞を生成する通常の細胞増殖過程で起こらないイベントを意味する。このようなイベントは多極分裂（三極分裂（TD）、 四極分裂（QD）、五極分裂（HD）を含む）、不完全分裂（IP）、細胞融合（CF）、細胞死（CD）、細胞形状の変化、核細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、そして 分裂時間遅延を含む。

本明細書において、表現 "非細胞毒性濃度"はその曝露濃度によって細胞倍加時間の延長、細胞増殖速度の低下、および死細胞の形成のための頻度の増加を起こさない濃度を意味する。例えば、非細胞毒性濃度は対照と比較した場合、エンドポイント分析において5％未満の細胞死を誘導する濃度を意味し、最も具体的には、1％未満、0.1％未満または0.01％未満の細胞死の細胞死を誘導することができる。

本明細書において、表現 "弁別的細胞イベントの誘導剤（本明細書中ではDCEI） "は非細胞毒性濃度によって弁別的細胞イベントを誘導する物質を意味する。

用語 "稀な細胞イベント"は通常のイベントとは異なる細胞イベントを意味する。多極細胞分裂、細胞分裂抑制および細胞融合はその例である。これらの稀な細胞イベントは、非処理細胞および非細胞毒性濃度で処理した細胞で起こる。この文脈において、用語、稀、は、巨視的なレベルでの細胞集団で明らかにされていないような低い頻度で起こるイベントを意味する。例えば、本発明の方法は、観察時間１６０時間内に16000細胞中に一回の頻度で発生する弁別的細胞イベント、または約10％の頻度またはそれ以上、 0.1％の頻度またはそれ以上、特に約0.01％またはそれ以上、さらに具体的には約0.001％またはそれ以上でする観察または検出能力がある。

用語 "発端"は細胞集団中、幾つかの異なる形質を獲得した最初のケースまた細胞ゼロを意味する。用語 "インデックスケース"も、例えば腫瘍細胞のように、結果的に生成した細胞集団が弁別的細胞行動を引き起こし得る、弁別的細胞イベントを経験した最初の細胞を表す 。

特徴的細胞、弁別的細胞イベント、および、頻度や優勢に係らず、細胞集団中の他の細胞とは異なる弁別的な挙動を示す細胞を、一細胞追跡により、検索および定量的に識別する。

図1は弁別的細胞イベント分析のための装置の例を示すブロック図である。 図2は、図1の装置の画像取得ユニットを用いて実施される主要なステップのフローチャートである。 図3は、図1の装置の画像品質コントローラーを用いて実施される主要なステップのフローチャートである。 図4は、図1の装置の動画作製ユニットを用いて実施される主要なステップのフローチャートである。 図5は、図1の装置のライブセルイベント分析ユニットを用いて実施される主要なステップのフローチャートである。 図6は、図1の装置の細胞系統作成およびデータープロセッサーを用いて実施される主要なステップのフローチャートである。 図7は、図1の装置のレポート作成ユニットを用いて実施される主要なステップのフローチャートである。 図8は図8A、8B、8C含み、図8Aは図1の装置を図式的に表現したもの、図8Bはチャンバー・カバーガラスを図式的に表現したもの、図8Cはチャンバー・カバーガラスのウエルの視野フィールドを図式的に表現したものである。 図9は一つの視野フィールド内に存在する細胞の量の変化を表示すために、異なる時間に撮影した画像から抽出された画像の連続である。 図10は典型的なパノラマ・ビューを示す写真、細胞系統と細胞の番号を示す図10A、10B、10C、10D、10E、10Fを含み、図10Aではパノラマビュー（T = 1）の例が示されている。図10Bでは、それぞれの前駆細胞に番号が付けられている。 視野フィールドから外に移動した細胞は番号づけされていない。パノラマ・ビュー（T = 1）の拡大画像は図10Cに示されている。細胞系統41は図10Cに示されている。 パノラマビュー（T =852）の例を図10Dに示す。図10 Eではすべての子細胞は識別され、番号が付けられている。 図10Fに示された拡大図中には、細胞系統41（41-4、41-8、41-10、41-12および41-14）の５個の生き残った子細胞を見つけることができる。 図11は、図10に示されたデータに基づいて、細胞系統図を図式的に表現したものであり、このマップは図10Cに示されている細胞系統41に対応する。 長期間のライブセルイメージングの間、子細胞は細胞死（CD）、ニ極分裂（DD）、三極分裂（TD）と細胞融合（CF）を起こした。 図12は、図12Aおよび図12Bを含み、細胞系統のデータに基づいて決定された細胞増殖曲線のグラフであり、非処理細胞（図12A）と1μメチルニトロソグアニジン（MNNG）（図12B）処理された細胞が個々の細胞追跡のために使用され、データベースにデータを入力後、10分毎の細胞数が計算される。平均と標準偏差が示されている。 図13は、図13Aおよび図13Bを含み、細胞系統のデータに基づいて決定された倍加時間のグラフである。データベースを用いる事により非処理細胞（図13A）および1μMのMNNG（図13B）曝露細胞の倍加時間が決定され、標準偏差が表示されている。 図14は、HeLa細胞の二極分裂（DD）、 三極分裂（TD）、四極分裂（QD）と不完全分裂（IP）の分類を示す写真が含まれている。 図15は、HeLa細胞の細胞融合（CF）の分類を示す写真が含まれており、そのT= 1のHeLa細胞をF0、最初のレベルの子細胞および第2レベルの子細胞をそれぞれF1とF2と定義し、F1Mは有糸分裂期に入った子細胞にあたる。 図16にはHeLa細胞の細胞死（CD）の分類を示す写真が含まれており、これらは細胞のタイプに依存的に観察されるパターンに係らないすべてのタイプのCDを含む。

図1は、非細胞毒性濃度により誘導され、正常の細胞イベントでは低い割合で発生する弁別的細胞イベントを分析するための装置の実施形態を示すブロック図である。例えば、この低い割合は10％または以下であり得る。 一例の場合、割合は0.001％であり得る。このようなイベントは、細胞培養中のどの瞬間でも発生する可能性があるため、この装置は処理および非処理の細胞イメージング動画を作成し、記録された細胞を個々に分析する。

画像取得ユニット100は、顕微鏡、CCDカメラ、光源、光学フィルターや要素、画像の拡大のためのカップラー、エンバイロメントチャンバー、マルチウエル培養チャンバーを保持するためのアダプタ、XYステージ、およびZドライブから構成される。光源はハロゲンライトまたは白色光または近赤外などのある可視波長領域の光を放つ LEDであり得る。エンバイロメントチャンバーは、例えば少なくとも160時間、所定の温度、酸素、二酸化炭素や窒素ガス濃度また湿度のもと、長期間顕微鏡ステージ上での細胞培養を行うことができる。細胞は、細胞の構造を可視化ができる方法によって照らされる。照明方法は微分干渉コントラスト（DIC）であり得る。

ノマルスキー干渉コントラスト（NIC）またはノマルスキー顕微鏡として知られているDIC顕微鏡は、染色されていない、透明試料のコントラストを高めるために使用される光学顕微鏡照明技術である。 DICは、さもなければ目に見えない特徴を視覚化のため、サンプルの光路長に関する情報を得る干渉計の原理で動作する。比較的複雑な照明法はグレーの背景に白から黒にかかるイメージを生成する。図8AはDIC顕微鏡を図式的に表現したものである。

画像取得ユニットは、光源、シャッター、フィルター、CCDカメラ、XYステージとZドライブまたは細胞の画像を得るために必要なドライバを含むソフトウェアで制御される。ソフトウェアは、１０分毎にまたはそれ以下の時間で、複数のz-スタック、例えば２０ z-スタック、で少なくとも100の視野フィールドの原画像を生成する機能を持っている。顕微鏡システムを駆動することができるいかなるソフトウェア、例えばMetamorphまたはVolocityを使用することができる。

図2は、このステップのフローチャートを示す。ステップ202、204および206の順序は変更することができる。このプロセスは、細胞播種200によって開始される。 マルチウエルチャンバーの各々に、特定数の細胞、例えば5000細胞を8ウエルチャンバーの各ウエルに播種する。細胞は、初代培養哺乳動物細胞、それ由来の細胞、樹立された哺乳動物細胞、それ由来の細胞またはウエル内で培養及び維持することが出来るいかなる細胞でもあり得る。撮影エリアの選択202が一定平方ミクロンメートル内に必要な数の細胞を含む領域を見つけるために行われる。細胞数はウエルに収まる任意の細胞数であり得る 。具体的には細胞の数は100細胞または以上、 より詳細には1000細胞またはそれ以上、特に10000細胞またはそれ以上。もし平方ミクロンメートルの画像を一回の画像取得で得られない場合、複数の視覚ビュー領域がその領域を覆うように配置される。図8Bは、チャンバー・カバーガラスのウエルを図式的に表現したものである。図8Cは、チャンバー・カバーガラスのウエルの視覚フィールドを図式的に表現したものである。画像取得は、あらかじめ決められた時間に、各々のウエルの各視覚フィールドのイメージを取得できるよう制御する事ができる。図8の例示的な実施形態では、ウエル当たり15の視覚フィールド、チャンバー・カバーガラスには8ウエルあり、合計120の視覚フィールドがある。 そのため、ステージは最初のウエル（W1）の最初の視覚フィールド（FOV1）からW1の最後の視覚フィールド（FOV15）、次に第2ウエル（W2）の最初の視覚フィールド（FOV1）、最後のウエル（W8）の最後のフィールド・オブ・ビューのFOV15に至たり、そして再びW1のFOV1へ移動する事ができる。画像取得は、各視覚フィールドにおいて10分毎に行える。

画像取得頻度の設定204は細胞の移動度によって決定される。その画像取り込みの頻度において、 大多数の細胞位置は次のイメージ中の細胞の位置に重なる。各細胞の移動度は時間と共に、そして、細胞ごとに変化するため、必要とされる重複％は様々である。細胞処理206では、各ウエル中の細胞は、非処理または有機化合物、無機物質、電離放射線、光、磁場、タンパク質/酵素、因子、核酸、糖鎖、ウイルス、細菌そして寄生虫を含む生物物質、金属イオンおよび/または粒子によって処理されたものである。細胞は、例えば、siRNAトランスフェクション、または因子で前処理する事ができる。いくつかのケースでは、異なる種類の細胞を使用することができる。一つのウエルは対照として使用できる。細胞照明 208では、紫外線やある波長により励起された蛍光物質からの発光による光毒性を最小限に抑えるため、細胞に対して非毒性または少毒性の波長の光によって照明される。例えば、可視光または近赤外光が使用される。

細胞画像取得210は、核小体、核、ミトコンドリア、細胞顆粒、細胞周囲、細胞の輪郭、細胞によって生成された影および/または光反射部位を含む細胞の構造を可視化する方法で行われる。各視野フィールドにおいて、細胞の最上部から最下部までのイメージを得るため、細胞内の様々な深さの平面の画像が取られる（z -スタックへと呼ぶ）。z -スタック数は細胞の高さと長期イメージング中に発生する焦点プレーンのドリフトの程度に依存する。最小のz -スタック数は1であり、例えば、HeLa細胞の場合、21のzスタックが取られる。イメージ画像生成212はグレースケールイメージであり、グラフィックのフォーマットは例えば、TIFF、JPEG、EPS、PICTまたはBMPである。

画質品質コントローラー102は画像取得ユニット100からイメージファイルを受け取る。コントラストを調整後、焦点の合ったイメージが選択され、もし各視野フィールドから得られた画像を結合することが必要な場合、これらの画像は縫合される。得られた画像ファイルは、動画生成104に転送される。

図3はこのステップのフローチャートを示す。ステップ300、302および304の順序は変更することができる。点線の箱で示された手順が必要でない場合、これらを省くことができる。画像バックグラウンド補正300は画像取得ユニット100によって作成されたイメージから背景画像を差し引く事によって行われる。背景画像は細胞を含まない対応するマルチウエルチャンバーの画像取得によって得られた画像であり得る。次に、画像のコントラストはグレースケール画像の適切な平均値と上および下限の閾値を設定することによって調整される。焦点画像の識別302は細胞の最上から最下の部分までをカバーする複数のzスタックの中で最も焦点の合った、または、最も焦点の合ったイメージに近い画像を選択する。もし複数の視野フィールドが撮像領域202によってセットされた場合、画像の位置調整306は、画像取得ソフトウェアによって記録されたXY位置データを基に、すべての視野フィールドに対応するイメージの位置を設定する。もしXY位置データが利用できない場合、画像の位置調整は手動で行うことができる。複数の画像縫合308は画像位置調整306から調整XY位置データを受信し、1つの画像ファイルに個々の画像を統合する。

動画作成104は画質品質コントローラー102から画像ファイルを受信し、ファイルを動画用にファイルのイメージ配列に配置する。

図4この手順のフローチャートを示す。縫合画像ファイルの配置400は、マルチウエルチャンバーのウエル番号に基づいて、画像ファイルを整理する。イメージ配列の作成402は画像配列を作成するため、画像取得の順序に従って縫合されたイメージを配列する。一から始まるイメージ配列ファイル番号が各々のファイルに割り振られる。

ライブセルイベント分析106は動画作成104からイメージ配列ファイルを受信する 。イメージ配列作成402によって生成されたイメージ画像ファイルの配列中、タイムポイント１と指定されるイメージが選択される。タイムポイント１は細胞処理206直後のイメージであり得る。したがって、タイムポイント１は、例えばイメージ配列10であり得る。それ以降のイメージ配列ファイルはタイムポイント2、タイムポイント3など、となる。そして、細胞系統番号がタイムポイント１の画像内にある細胞に割り当てられる。タイムポイント１の画像内の細胞は前駆細胞として定義される。各前駆細胞およびその子細胞が追跡される。細胞画像取得210によって記録される細胞構造が、細胞追跡のマーカーとして使用される。細胞追跡のための最後のイメージファイルであるタイムポイントエンドまで追跡を続けることができる。細胞追跡中、もし正常および弁別的細胞イベントが起こった場合、これらのイベントはインデックス化される。その後、ライブセルイベント分析106は、例えばインデックス化されたデータ、タイムポイント番号そして細胞のXY位置の情報を含むデータベースを作製する。

図5はこのステップのフローチャートを示す。ステップ502、504および506、およびステップ508、510および512の順序は変更することができる。ステップ502、504および506は全ての前駆細胞に適用される。ステップ508、510および512はすべての子細胞に適用される。前駆細胞位置検出500はタイムポイント１で見つかった全部または一部の細胞に細胞系統番号割り振る。細胞系統番号は細胞のXY位置を持つ。細胞系統番号に加え、細胞番号が割り当てられ、前駆細胞の番号は"0"となる。前駆細胞追跡502の過程で、以降のタイムポイントにおける各細胞のXY位置が決定される。もし細胞がイメージの外に移動した場合、細胞は"アウト・オブ・フレーム"またはOFとマークされる。もし画像内に移動する細胞がある場合、これらの細胞は未追跡とされるかまたは追跡することができる。前駆細胞の正常イベント検出504は通常のイベントを検出する。このようなイベントは有糸分裂期（M）と二極分裂（DD）を含む。インデックス化されたデータはタイムポイント番号と細胞のXY位置を持つ。前駆細胞の弁別的細胞イベント検出506は弁別的細胞イベントを検出する。このようなイベントは、三極分裂（TD）、四極分裂（QD）、五極分裂（HD）、細胞融合（CF）、細胞死（CD）、および、不完全または部分的な分裂（IP）を含む。もしより正確な情報が得られた場合、それぞれの弁別的細胞イベントを細分化することができる。例えば、CDが有糸分裂破局およびG1期中に発生した細胞死にサブインデックス化できる。インデックス化されたデータはタイムポイント番号と細胞のXY位置を持つ。もしイベントが細胞分裂に繋がった場合、生成された子細胞は子細胞検出508によって識別される。これらの子細胞に細胞番号が割り当てられる。子細胞形成に繋がり得るイベントは、DD、TD、QDとHDである。子細胞追跡510、子細胞の正常イベント検出512と子細胞弁別的細胞イベント検出514は前駆細胞のステップ502、504および506に相当する。もし子細胞がその子細胞を生成した場合、ステップ508、510、512および514がその子細胞に対して行われる。これらの手順は画像がタイムポインエンドに達するまで繰り返すことができる。前駆細胞およびその全ての子細胞の追跡後、XY位置、インデクス化されたデータ、そして前駆細胞とその子細胞を関連付けるデータはデータ確認516によって検証される。もしエラーが発見された場合、関連する手順、例えばステップ502、504および506および/またはステップ508、510、512および514が繰り返される。このようなエラーは、細胞の見失い、そして、別の細胞との混同であり得る。得られたデータは、データベース・エントリ518によってデータベースに入力される。データベースは、細胞系統番号、細胞番号、XY位置、タイムポイント番号、インデックス化されたイベントおよび、各細胞間の関係を決定する情報である。

弁別的細胞のイベントは次のものがある。細胞の形状の変化は観察中に細胞の全体的な形状が変化したもの。核形状の変化は観察中に細胞の核の形状が変化したもの。細胞内物質蓄積は細胞が少なくとも一つの他の細胞を含む場合、または、微生物や粒子などの異物を飲み込むか、タンパク質、核酸や脂質によって構成された構造を形成したもの。細胞肥大は、細胞の大きさが観察中に子細胞を生成することなく、成長したもの。過移動性は、例えば細胞が平均移動速度よりも200％以上で移動するような、細胞の移動度が大多数の細胞の平均移動範囲よりも大きいもの。低移動性は、例えば細胞が平均移動速度よりも30％以下で移動するような、細胞の移動度が大多数の細胞の平均移動範囲よりも小さいもの。別のケースでは、もしその/それらの移動率が十分に低い場合、細胞は接触または"抱きしめる"可能性がある。これは貧移動性であり得る。分裂時間遅延はある細胞の分裂と次の分裂との間の時間が、例えば大多数の細胞のその平均時間よりも50％長くなった場合。

細胞系統作成とデータ処理108 ライブセルイベント分析106によってデータベースに入力されたデータを受信する。タイムポイント番号、インデクス化されたデータ、および、一つの細胞と他の細胞の関連を示すデータが細胞系統マップを作成するために使われる。様々なパラメータは、例えば、細胞増殖率、細胞倍加時間、細胞死 、細胞融合や異常細胞分裂の頻度が決定される。一定のバイアスを特定のインデックス化されたイベントや細胞の倍加時間に適用して数学的および統計的計算を行うことにより、細胞集団の弁別的および/または通常のイベントの特性も決定される。分析されたデータは、マスター・データベースに入力され、すでにデータベースに入力されたデータが処理に対する細胞の効果の評価に用いられる。

図6はこのステップのフローチャートを示す。細胞系統マップ作成600はライブセルイベント分析106によって生成されたデータベースから細胞系統番号、細胞番号、タイムポイント番号と前駆細胞とその子細胞のインデックス化されたイベントデーターを収集する。細胞数は各々の細胞の描画順番の決定に用いる。基礎データ分析602は細胞増殖速度、細胞の倍加時間と細胞死、細胞融合、正常な細胞分裂と異常な細胞分裂の頻度を分析する。他のタイプのイベントも基礎データ分析に加える事ができる。オプションデータ解析604は、特定のイベントおよび/または統計分析に一定のバイアスを加えることによって数学的な計算を実行する．例えばあるインデックスは数式、１-DDの数×1+TDの数 ×0.8+QDの数× 0.8+HDの数×0.8-CDの数×0.1-CFの数×0.1-IPの数×0.1で計算できる。得られたインデックス値は前駆細胞に由来する細胞の生存能力や細胞の個性の評価に用いることができる。別の式と定数を計算に使用することもできる。得られた分析データは、マスター・データベースに入力される。データベース内のデータは、細胞の種類、処理および/または濃度によって整理できる。マスターデータベース検索606は細胞に対する処理の効果を評価するために、マスター・データベースから関連するデータを収集する。

レポート生成108は結果を生成する。

図7は、このステップのフローチャートを示す。結果書式設定700は表と図の形に結果を整理する。レポート作成702はコンピュータのモニターに表示し、または、印刷することができるレポートを作成する。

細胞が観察下に置かれる期間は少なくとも1つの前駆細胞が子細胞に分裂するのに十分な時間である。例えば、その期間は7分、100分、160時間、330時間、1ヶ月などである。

顕微鏡システム例

異なった顕微鏡システムを本システムで使用するために設計することができる。以下の説明は顕微鏡システムの例である。

細胞は最適な細胞生存率と細胞分裂を毀損しない条件下に保たれるべきである。顕微鏡システムは、多数の個々の細胞の追跡を容易にするものである。いくつかの実施形態では、異なるサブセットの細胞が同じ時間枠と条件で平行して映像化される。画質と撮影頻度は細胞の分裂イベントと細胞生存能力を自動追跡するのに必要な細胞の詳細な細胞特徴の
識別が出来るのに十分な品質のものでなくては成らない。

近赤外（NIR）光（＞700nm）による微分干渉コントラスト（DIC）は最適な予防照明条件と連続的な細胞イメージングに必要な解像度を提供する。 DICイメージングは、コンピュータ解析のための高コントラストのデータを提供しつつ、細胞の挙動を追跡するのに十分詳細を提供する。顕微鏡システムは、裏面照射型電子増倍カメラ（BT EMCCD）を使用している。

顕微鏡システム例は、異なったサンプル集団間を自由に移動するのに十分な作動距離を与え、また 局所的な温度変動による焦点変化や細胞生存率に対する懸念を排除するため、非液浸の高解像の対物レンズを使用し得る。拡大システムでは、解像度の小さな損失を補償する。

細胞培養用の加温された収納部は、光学グレードガラスを中心に設計され、マルチチャンバーを用いた細胞のシステムのために ３種類のガスまたは一種類のガスの還流および湿度制御に対処することが必要とされる。

追跡ソフトウェア例

異なった追跡ソフトウェア・ルーチンを、追跡プロセスの部分を自動化するための設計することができる。以下は、細胞追跡と細胞イベントを分類（識別）するためのルーチン例である。

自動細胞追跡システムは重心の追跡と非蛍光画像処理を採用し、次のように要約することができる：1、ノイズを除去するためガウスぼかしが適用される。 2、閾値を適用し、その閾値以上の明るい領域を塗りつぶす（細胞の明るい部分が抽出される）。 3、連結分析を行う。 4、標的細胞の結合ピクセルを同定する。 5、結合ピクセルの重心を決定する。 6、次の画像をロードする。 7、ステップ1-5を繰り返す。重心は、標的細胞の位置を示す。したがって、このソフトウェアは細胞を追跡することができる。

もし隣接する有糸分裂期細胞が標的細胞の近くに移動した場合、二つの結合ピクセルは融合される。このソフトウェアは、もはや二つの細胞をセグメントすることができなくなる。標的細胞の重心は融合によって移動するため、このコンピュータプログラムは移動を検出した場合、細胞追跡を終了する。

細胞分裂の識別は以下のように行われる：1、連結分析までは上記と同様のアプローチが用いられる。2、結合ピクセルの周りにベクトルを描画する。 3、ベクトルパターンライブラリを作成する（ライブラリは約100の反復的なパターンを含む）。 4、ライブラリ内のパターンと標的細胞のベクトルパターンを比較する。標的細胞のパターンがライブラリ内のいずれかと一致する場合、その細胞は有糸分裂期に入ったと考慮する。 5、有糸分裂期細胞の結合ピクセル画素数とその重心を決める。6、次の画像をロードする。 7、有糸分裂細胞の重心と結合ピクセル画素数を確認する。画素数が大幅に減少した場合（40から60％）、ソフトウェアは細胞分裂が発生したと認識する。 8、その兄弟細胞を見つけるために、最も近傍の結合ピクセルを探す。このコンピュータプログラムは、大多数の二極分裂で機能する。

もし結合ピクセル画素数の減少が40％未満または60％以上である場合、二極または三極分裂が発生したとして、自動細胞追跡は終了する。

終了したプロセスに対して、マニュアル細胞追跡が再導入される。

標的細胞に近い有糸分裂期細胞の動きを追跡するための分析ソフトウェアのステップ以下の通りである：1、接近中の細胞を認識するためには、画像内のすべての結合のピクセルの重心が決定される。 2、もし接近中の細胞が標的細胞に移動した場合、接近中の細胞の結合ピクセルは標的細胞の結合ピクセルとの融合し、これは重心の一つが消失することを示唆する。これは、“有糸分裂期細胞の標的細胞近傍への移動”事態の処理を開始するための信号となる。 3、有糸分裂期細胞はより多くの光を反射するため、通常、標的細胞より明るい。有糸分裂期細胞の位置は、明るいピクセルの連結分析により推定する。4、ソフトウェアは明るい結合ピクセルおよび残りの結合ピクセルの両方に焦点を当てる（それぞれの重心を決定）。 5、明るい結合ピクセルが移動を開始した場合、ソフトウェアは標的細胞のセグメントを試みる。これは、画像に複数の異な閾値を適用し、連結分析を行うことによってなし得る。標的細胞をセグメントすることができる場合は、プロセスは通常の追跡に戻る。

細胞分裂では、ソフトウェアは次のような画像チェックを行う。1、標的細胞細胞が有糸分裂期に入った場合、細胞の結合ピクセルの重心を決定し、もしソフトウェアが細胞分裂期の検出に失敗した場合、次の画像をロードする。 2、分裂した細胞がその有糸分裂期細胞の近傍に生成されるため、ソフトウェアはその付近の結合ピクセルを検索し、もし結合ピクセルを見つけた場合、それが非標的細胞に属しているかどうかを調べる。 3、それが非標的細胞に属していない場合、結合ピクセルは有糸分裂期細胞の子細胞の候補としてマークされる。 4、次の画像をロードし、ステップ2から3を繰り返す。 このプロセスを二つ（二極分裂）または三つ（三極分裂）の結合ピクセルが識別されるまで続ける。

使用例

本明細書中に記載された装置は弁別的な挙動を追跡するために、細胞集団中の細胞の個性をモニターするために使用することができる。例えば、これは、患者に注入される細胞集団がその細胞集団の中に、一般的に期待されている挙動に対して弁別的な挙動を示す細胞がそれに含まれていないことを保証するために、患者に生物学的な製品が注入される前に、テストされることから、品質管理の観点で使用し得る。

本明細書中に記載された装置は細胞集団の処置に対する反応を比較するために使用することができる。 例えば、二つの同一の細胞集団を装置のチャンバーの異なるウエルに入れ、同じ環境条件の下で維持する。一つの細胞集団は処置し、他方は対照集団として保持される。両方のウエルの細胞の個性は弁別的な挙動を追跡されることにより記録される。記録された処理細胞の弁別的な挙動はそれに対する対照集団との比較により、細胞集団の処理効果についての興味深い結論を得ることができる。

実験例

HeLa細胞はATCCから購入した。HeLa細胞（ウエル当たり50μl中1×104細胞）は最適な光学観察のためLab-Tekの8ウエルチャンバーのカバーガラスの中央に慎重に播種した。細胞を安定的に付着させた後、500μlの培地を加えた。HeLa細胞は24時間後に使用された。培養は各チャンバーの表面の90％以上を細胞が占有するまで維持した。

8ウエルチャンバーのカバーガラスを採用することにより、種々の濃度の試験物質で処理した細胞を同時にモニターできることから、適切なコントロールを伴ったリアルタイム細胞生物学的分析を顕微鏡のステージ上で実行できる（図８）。

HeLa細胞は、約10〜50μmの直径範囲を移動することから、最適な移動度を示す。さらに、その移動度は、 HeLa細胞の蓄積のチャンスを減らすことから、正確な個々の細胞の追跡を可能にさせた 。

Volocity V4.0によって制御された、Quorum WaveFX スピニングディスク共焦点システム (Quorum Technologies Inc., カナダ) とライカ顕微鏡が長期ライブセルイメージングのために採用された。光毒性の危険を排除するために、微分干渉コントラスト（DIC）の画像はハロゲンランプが光源として用いられ（ランプからのUV光はDICプリズムフィルターによりほぼ100％除去された）、HCX PL APO40xオイル対物レンズ （NA= 1.25）を通して撮影された。Lab-Tekの8ウエルチャンバー上で培養された細胞は次に顕微鏡ステージ上に設置され、37℃の7.5％加湿CO2（LiveCellTMシステム、Pathology Devices Inc, MD）下、エンバイロメントチャンバーを用いて培養した。 パノラマの視野フィールド（FOVs）のXY位置はVolocity v4.0を使用して登録された。典型的には、4×3または4×4 FOVsがHeLa細胞では用いられた。初期細胞密度の変化によるバイアスを最小にするため、 典型的なパノラマ・ビュー（図10Aのパノラマ・ビューの例を参照）が印刷され、FOVの位置を決定するための基準として使用された。次に、各FOVの焦点調整が行われた。 DICイメージは１０分毎に、ピエゾフォーカス駆動を用いた1μmの増分で焦点面に対して相対して+10から-10 μmの位置まで撮影された（FOVの各々の面に 対し34ミリ秒露光） 。従って、各FOVに対し、21のz-面が作成された。各ウエルでは、顕微鏡ステージはウエル1（W1）のFOV1から8ウエル（W8）のFOV15に移動した。 FOVの総数は120である。

図9は一つの視野フィールド内の細胞の量的変化を示すための異なる時刻に撮影された画像から抽出された連続画像である。

典型的な細胞播種時には、例えば、細胞懸濁液を調製し既知数の細胞を培養皿またはマルチウエルチャンバーのウエルに播種する時、チャンバーの底の平坦性の微妙な違いのために、細胞はしばしば培養皿またはウエルの周囲または中心に、蓄積される。そのような蓄積は培養皿またはウエル内で細胞密度の高いまたは低い領域を作るが、局所的な細胞濃度の変動は、細胞生物学的研究の大部分にはほとんど影響を及ぼさないと考えられてきた。しかし、成長率、そして、おそらく処理に対する細胞の応答は、高および低密度の領域の間で異なる可能性がある。そのため、再現性のある結果を得るために、我々は非処理のHeLa細胞の場合約60〜70％密度のFOVを選択した。

siRNAの処理はカバーガラスのLab-Tek 8ウエルチャンバーを顕微鏡ステージ上に設置した後行った。コントロールとしてスクランブルsiRNA（2μgの、中位長、Invitrogen）またはp53のsiRNA（2μgを、New England Bio Labs）は8μlのECのバッファと0.4μlのエンハンサー試薬（Effectenキット、Qiagen）に5分間混合した。その後、1μlのeffectante（Qiagen）を加え、１０分のインキューベーション後、120μlの培地を加えた。各ウエルには、118μlの混合物を加え、細胞は顕微鏡上のエンバイロメントチャンバー中で24時間培養した。混合物を完全培地と交換した後、細胞をさらに24時間培養した後、メチルニトロソグアニジン（MNNG）に曝露した。トランスフェクトされた細胞は脂質小胞を含んでいるため、トランスフェクション効率は目視検査で評価し、効率は99％以上であることが結論された。Cy3結合siRNAのトランスフェクション効率も98％であった。また抗p53抗体（Calbiochem）によって検出されたp53の発現レベルは、トランスフェクションの48時間後、コントロールの10％未満に減少した（データは示さず）。

細胞のモニタリング開始後、FOVの位置を変更することはできない。そのため、全体の観察期間を通じて100個以上の細胞系統をカバーする長期的な細胞イメージングを行うために、我々は適切な数の細胞が含まれていた領域を選択した。HeLaコントロール細胞または非毒性濃度のMNNGで処理されたHeLa細胞の場合、約70％の面積が占有されている領域を選択した。HeLa細胞は10〜50μmで直径に動き回ることが出来るので、HeLa細胞のほとんどは空いている培養表面で見つけることができ、160時間以内に少なくとも5から6の細胞分裂が可能であった。

Volocityイメージ・シーケンスファイル（多層TIFF）は単層のTIFFファイルに分割された。分割したイメージは、視覚的に焦点画像を決定するため、Volocityのv4.0コンピュータプログラムを使用して表示された。選択された焦点画像は、その後Volocity V4.0内に作成されたフォルダに移動した。焦点画像を含む画像はTIFFファイルとしてエクスポートされた。ムービーはQuickTime Player Proによって作成された。もし画質が細胞追跡には最適で無かった場合、TIFF画像のコントラストは、Photoshop V7.0のバッチ処理機能を使用して調整した。

細胞は、低頻度の細胞イベントを検出するため、DIC画像を用いて100〜160時間、同時にモニターした。典型的な実験では、細胞のモニタリングは160時間、120のパノラマFOV、（図8参照）を用いて行われ、2268000の画像ファイルが生成され、最終的に120の独立したイメージ動画に変換された。

細胞追跡を行った。各ウエルのパノラマ・ビューが（図10A）、個々の細胞追跡によって追跡される各々の細胞にユニークな細胞系統番号を割り振るために（我々は、T = 1で特定された前駆細胞に由来する細胞の集団を細胞系譜として定義した）、作製された（図10Bおよび10C参照）。この割り当てでは、客観的に分析を行うため、全ての細胞が含まれている。細胞系統番号を割り当てた後、有糸分裂期、細胞分裂、細胞融合と細胞死の時間が細胞の形態に基づいて決定され、データベースに入力された。有糸分裂期の場合、最初の時間点は、形態学的観察で特定することは困難であるため、そのイベントが発生したことの指標的なものである。同様に、細胞融合は、多くの場合、徐々進行するため、最初の時間点、特にF1（前駆細胞の子細胞）とF2（前駆細胞の第2レベルの子細胞）との細胞融合イベントは、指標的なものである。追跡エラーを低減させるために、追跡のほとんどは動画を一度再巻き戻して再確認した。

細胞系統マップの作成時に、それぞれの子細胞にユニークな識別番号が割り当てられた
（個々の細胞追跡結果の例は図10Eを参照、子細胞識別番号が割り当例は図10Fを参照）。この番号付けを使用して、追跡された細胞の画像は、ライブセルイメージング動画から取得することができる。

細胞追跡中に決定されたイベントの時間点はデータベースに入力される。

図11は、図10で見られるデータに基づいて、細胞系統図を視覚的に表現したものであり、このマップは、図10Cに示されている細胞系統41に対応する。長期のライブセルイメージングの間、子細胞は細胞死（CD）、二極分裂（DD）、三極分裂（TD）と細胞融合（CF）を起こす。

10分毎の細胞数が四回の独立した対照実験と分析のデータベースから抽出されてプロットされ、 個々の細胞追跡、細胞系統マップの作成と細胞増殖速度を決定するためのデータ分析を含む結果が図12Aに示されている。4000分時点での平均値と標準偏差は、それぞれ301および22である。標準偏差は8000分の時点で増加したが、それでも平均値の10％以内に留まるため、システムが再現性の或る結果を生成したことを示唆している。

我々は、1μMのMNNGは細胞増殖速度に影響を示さなかったことを見いだした（図12B）。また、1μMのMNNGに曝露した細胞での倍加時間の顕著な延長が見られなかったことから（図13Aおよび13B）、細胞増殖がこの濃度のMNNGによって干渉され無かった事を示唆している。また、1μMのMNNGで処理した細胞の培養で見つかった死んだ細胞の数は、コントロールのそれ（表1、CD）とほぼ同様であった。したがって、我々は1μMのMNNGがHeLa細胞の非細胞毒性濃度であると結論づけた。

図14は、二極分裂（DD）、三極分裂（TD）、四極分裂（QD）と不完全分裂（IP）の分類を示す写真を含む。

図15は、HeLa細胞の細胞融合（CF）の分類を示す写真が含まれ、T= 1のHeLa細胞をF0、最初のレベルの子細胞および第2レベルの子細胞をそれぞれF1とF2と定義し、F1Mは有糸分裂期に入った子細胞を現している。

図16はHeLa細胞の細胞死（CD）の分類を示す写真が含まれており、これらは細胞のタイプに依存的に観察されるパターンに係らないすべてのタイプのCDを含む。

表1は、弁別的な細胞イベント（HeLa細胞）の概要を示す。120から200の前駆細胞が追跡された。データは200前駆細胞によって標準化した。表1の凡例は以下の通りである。a、成長倍数は T= 900時の細胞数をT= 1の細胞数で割る事によって計算し、b、総細胞分裂（DV）は細胞分裂イベントの合計数； 合計のDV=二極分裂（数）+三極分裂（数）+四極分裂（数）、c、多極分裂（MD）は、MDのイベントの合計数；三極分裂（数）+四極分裂（数）、d、細胞融合（CF）はCFのイベントの合計数；合計のCF=（F1-F1）+（F1-F1M）+（F1MF1M）+（F1-F2）+（F1M-F2）+（F2-F2）。 T = 1の細胞はF0、そして、最初のレベルの子細胞と第二レベルの子細胞はそれぞれ、F1とF2と定義した。 F1Mは有糸分裂期に入った子細胞を現している。e、CD：細胞死、p値は非処理細胞で発生するイベントと比較することによって計算された、*：P ＜0.05、**：p ＜0.1。

次に、非細胞毒性濃度のMNNGが弁別的細胞イベント、例えば多極分裂や細胞融合、を誘導するかどうかを決めるため、我々はまず非処理のHeLa細胞によって得られたデータベースと細胞系統データを用いてこれらの基礎的な頻度を決定した。非処理のHeLa細胞も多極分裂、主に三極分裂（TD）と細胞融合（CF）を起こした。表1にまとめたように、多極分裂や細胞融合（CF）のイベントの合計数は、それぞれ53および115であった。また、多極分裂イベントの約73％は、細胞融合に引き続き発生した。この場合、二つの細胞はリンクされており、融合し、三極分裂に入った。しかし、かなりの数のケースでは、このようなリンクは明確ではなかった。非細胞毒性濃度のMNNGに曝露した細胞を用いて得られたデータベースと細胞系統のデータを分析した場合、合計で88の多極分裂が見つかり、これは非処理細胞に比べて約1.7倍高かった。我々はまた、非細胞毒性濃度のMNNGには HeLa細胞の成長（表1）に対して若干の成長促進作用を有することを見出した。したがって、総細胞分裂の％は、この効果を正規化するために算出した。そのような正規化後でも非処理細胞と比較した場合、非細胞毒性濃度のMNNGで曝露された細胞の多極分裂イベントの％は統計学的に有意であった。一方、細胞融合イベントの場合、その総数は非細胞毒性濃度のMNNGをHeLa細胞に曝露することによってわずかに増加したものの、総細胞分裂イベントの％は（表1）変化しなかった。これらの結果は、細胞融合イベントの合計数は細胞の分裂回数に比例して増加し、他方、非細胞毒性濃度のMNNGは細胞が多極分裂に入るリスクを有意に増加させることを示唆する 。

我々の結果は、非細胞毒性濃度のMNNGは、HeLa細胞の細胞増殖速度および倍加時間に検出可能な効果を示さないが、この曝露によってこれらの細胞が多極分裂に入るリスクの増加することを示唆している。このようなイベントは大多数の正常または影響を受けない細胞のうち、ほんの一握りの細胞でのみ発生するため、これらは既存の手法では検出が困難であった。

ブロック図では異なるデータ信号接続を介して相互に通信し合う別々のコンポーネントの集合体として描かれているが、当業者は、図に示された実施形態は、あるハードウェアやソフトウェアの与えられた機能や操作によって実装されているいくつかのコンポーネント、そして、コンピュータのアプリケーションやオペレーティング・システム内でのデータ通信によって実装されている図示した多くのデータパスとともに、ハードウェアおよびソフトウェア・コンポーネントの組み合わせるであることを理解するであろう。示されている構造は、記述された実施形態の効率的教示のため提供された。

上述した実施の形態は、例示のみを目的としている。したがって、本発明の範囲は、もっぱら添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることを意図している。

Claims (19)

1. 非蛍光のアプローチを用いて、細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置であって、
   カメラ、光源、エンバイロメントチャンバー、一つの前駆細胞の分裂により少なくとも一つの子細胞の形成が許容される十分な時間にわたり、細胞集団中の少なくとも一つの細胞培養を許容するエンバイロメントチャンバーを備えた微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡を含む画像取得ユニットと、
   所定の時間にチャンバー中の前記細胞集団のイメージを取得するための、イメージ取得ユニットを制御するためのコントローラーと、
   前記画像取得ユニットによって取得された前記のイメージ中の細胞集団の前記の少なくとも一つの細胞を個々に追跡する細胞追跡手段と、
   前記の細胞追跡手段によって前記の個々に追跡された細胞の少なくとも一つの弁別的な細胞イベントの発生を検出する弁別的な細胞イベント検出器と、
   検出された弁別的細胞イベントの識別を保持するレポートを生成するためのレポートジェネレータとを備え、
   前記弁別的な細胞イベントは：三極分裂（TD）、四極分裂（QD）、五極分裂（HD）、細胞融合（CF）、細胞死（CD）、不完全な分裂（IP）、細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、そして 分裂時間遅延、からなるグループから選ばれることを特徴とする、細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
2. 前記光源は可視光および近赤外線の一つの波長の光を発光する ことを特徴とする、請求項1に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
3. 前記時間は前記の少なくとも一つの細胞によって生成される複数世代の子細胞の生成を十分許容することを特徴とする、請求項1又は２に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
4. 前記時間は 7分から350時間の間であることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
5. 前記細胞集団中、前記少なくとも一つの細胞の数が前記時間の最初において100以上であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
6. 前記顕微鏡システムはXYステージと前記コントローラーによって制御されるZドライブとを備えることを特徴とする、請求項1から５のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
   
7. 前記画像取得ユニットはさらに 光学フィルタ、高倍率対物レンズ及びカプラのうち少なくとも一つを有することを特徴とする、請求項1から６のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
   
8. 前記画像取得ユニットによって前記の生成された画像を整理するための画像ファイルアレンジャーをさらに備えることを特徴とする、請求項1から７のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
9. 前記チャンバーは少なくとも二つの視野フィールドに分割され、
   前記コントローラーは前記視野フィールド各々からの画像ファイルを生成するための前記の画像取得ユニットを制御し、
   前記画像アレンジャーはセット内の前記の画像取得ユニットにより作成された少なくとも二つの視野フィールドの各々に対しての画像を整理することを特徴とする、請求項８に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
10. 前記細胞追跡手段は前記細胞集団の前記の少なくとも一つの細胞の全てを個別に追跡することを特徴とする、請求項1から９のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
11. 前記細胞追跡手段によって追跡した前記の少なくとも一つの個々の細胞に対しユニークな識別子を割り当てるための細胞系統追跡手段を含むことを特徴とする、請求項1から１０のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
12. 前記弁別的な細胞イベントは前記細胞集団の10％未満で発生することを特徴とする、請求項1から１１のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
13. 個々に追跡された細胞と関連した前記の弁別的細胞イベントのインデックス化のためのイベント保存ユニットをさらに含むことを特徴とする、請求項1から１２のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
14. 前記レポート生成は前記レポート中の細胞系統を含むことを特徴とする、請求項1３に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
15. 前記チャンバーはある処置で処理されることを特徴とする、請求項1から１４のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
16. 前記エンバイロメントチャンバーは少なくとも2ウエルのマルチウエル培養チャンバーであることを特徴とする、請求項1から１５のいずれか一項に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置。
17. 非蛍光のアプローチを用いて、細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う方法であって、
    カメラ、光源、エンバイロメントチャンバー、一つの前駆細胞の分裂により少なくとも一つの子細胞の形成が 許容される十分な時間にわたり、細胞集団中の少なくとも一つの細胞培養を許容するエンバイロメントチャンバーを備えた微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡を含む画像取得ユニットの提供と、
    所定の時間にチャンバー中の前記細胞集団のイメージを取得するための、イメージ取得ユニットの制御と、
    前記画像取得ユニットによって取得された前記のイメージ中の細胞集団の前記の少なくとも一つの細胞を個々に追跡する細胞追跡と、
    前記の細胞追跡によって前記の個々に追跡された細胞の少なくとも一つの弁別的な細胞イベントの発生の検出と、
    検出された弁別的な細胞イベントの識別を保持するレポートの生成とを行う手順を含み、
    前記の弁別的細胞イベントは：三極分裂（TD）、四極分裂（QD）、五極分裂（HD）、細胞融合（CF）、細胞死（CD）、不完全（IP）、細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、そして 分裂時間遅延、からなるグループから選ばれることを特徴とする、細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う方法。
18. 非蛍光のアプローチを用いて、前記細胞集団中で起こった細胞の個性を検出するために、細胞集団中の低頻度で起きる弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う方法であって、
    カメラ、光源、エンバイロメントチャンバー、一つの前駆細胞の分裂により少なくとも一つの子細胞の形成が許容される十分な期間の時間、細胞集団中の少なくとも一つの細胞培養を許容するエンバイロメントチャンバーを備えた微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡を含む画像取得ユニットと、
    所定の時間にチャンバー中の前記細胞集団のイメージを取得するための、イメージ取得ユニットを制御するためのコントローラーと、
    前記画像取得ユニットによって取得された前記のイメージ中の細胞集団の前記の少なくとも一つの細胞個々に追跡する細胞追跡手段と、
    前記の細胞追跡手段によって前記の個々に追跡された細胞の少なくとも一つの弁別的な細胞イベントの発生を検出する弁別的な細胞イベント検出器と、
    検出された弁別的な細胞イベントの識別を保持するレポートを生成するためのレポートジェネレータとを備え、
    前記の弁別的細胞イベントは：三極分裂（TD）、四極分裂（QD）、五極分裂（HD）、細胞融合（CF）、細胞死（CD）、不完全分裂（IP）、細胞形状の変化、細胞核形状の変化、細胞内物質の蓄積、細胞肥大、取り込み、過移動性、低移動性、そして 分裂時間遅延、からなるグループから選ばれることを特徴とする、細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う装置を利用する、細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う方法。
19. 前記細胞集団は非細胞毒性濃度の物質で処理されることを特徴とする、請求項１８に記載の細部集団中で起こった弁別的細胞イベントの定量的な識別を行う方法。

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