JP6282310B2 - 細胞集団に対する発癌化合物の最小発癌用量を算出する方法 - Google Patents
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Description
哺乳類細胞集団の培養と、
前記細胞集細胞集団内の一つまたはそれ以上の弁別的細胞イベントの発生の測定のため、そして、前記弁別的細胞イベントの頻度計算のための、前記細胞集団内の個々の細胞の追跡と、 前記頻度と細胞集団の状態との相関付けとを含んで構成され、
前記頻度は前記細胞集団中の表現形質的および遺伝系質的変化の有無の指標である。
外的イベント存在下での細胞集団の培養と、
前記細胞集団中での弁別的細胞イベントの発生の検出のための、そして、所定の時間にわたる弁別的細胞イベントの出現または非出現の頻度計算のための、前記細胞集団中の個々の細胞の追跡と、 候補化合物の発癌性の評価とを含んで構成される。
抗癌化合物候補存在下における細胞集団の顕微鏡観察下での培養と、
細胞系統追跡と撮像装置による前記集団内の個々の細胞追跡により、前記集団内での弁別的細胞イベントの発生の検出と、
一定期間にわたる前記イベントの出現または非出現の頻度の計算と、
候補化合物の抗癌活性の評価とを含んで構成され、
計算された頻度は候補化合物の抗癌活性の指標である。
患者に移植されるところの複数細胞の取得と、
前記複数の細胞の顕微鏡観察下での培養と、
細胞系統追跡・撮像装置による前記集団内の個々の細胞を追跡することによる弁別的細胞イベントの 前記複数細胞内での発生の検出と、
前記弁別的細胞イベントの頻度に基づいて許容できない品質の細胞を含有している細胞集団の特徴付けとを含んで構成される。
顕微鏡観察下での哺乳類細胞集団の培養と、
十分な期間にわたる前記培養細胞集団の前記顕微鏡観察下での連続的した画像の取得と、
個々の細胞を一定期間にわたり追跡するための連続した画像内の複数の細胞のインデックスの作成と、
前記細胞集団内での一つまたはそれ以上の弁別的細胞イベントの発生測定のため、および、前記弁別的細胞イベントの頻度計算のためのインデックス化された細胞を含む取得された連続画像の分析と、
前記頻度と前記細胞集団状態の相関付けとを含んで構成され、
前記頻度は前記細胞集団中における表現形質的及び遺伝系質的の変化を有する細胞の存在又は非存在の指標である。
本明細書に記載のように、本発明者らは細胞集団中のその頻度が哺乳類細胞の状態と相関する、弁別的細胞イベントを同定した。
CQI(式1)= [A x 二極分裂の数(DD)] + [B x三極分裂の数(TD)] + [C x四極分裂の数(QD)] + [D x六極分裂の数(HD)] + [E x細胞融合の数(CF)] + [F x細胞死の数(CD)] + [G x不完全または部分的な細胞分裂の数(IP)] + [H x細胞形状の変化示す細胞の数(CSA)] + [I x核形状の変化示す細胞の数(NSA)] + [J x細胞内物質蓄積を示す細胞の数(IA)] + [K x細胞肥大を示す細胞の数(CE)] + [L x取り込みを示す細胞の数(EG)] + [M x過移動性を示す細胞の数(HEM)] + [N x低移動性を示す細胞の数 (HPM)] + [O x分裂時間遅延を示す細胞の数(PD)] + [P x分裂時間短縮を示す細胞の数(SD)]であり、ここで、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、Pは-1.000と1.000の間の実数であり,
CQI(式2)=([B x三極分裂の数(TD)] + [C x四極分裂の数(QD)] + [D x六極分裂の数(HD)] + [E x細胞融合の数(CF)] + [F x細胞死の数(CD)] + [G x不完全または部分的な細胞分裂の数(IP)] + [H x細胞形状の変化示す細胞の数(CSA)] + [I x核形状の変化示す細胞の数(NSA)] + [J x細胞内物質蓄積を示す細胞の数(IA)] + [K x細胞肥大を示す細胞の数(CE)] + [L x取り込みを示す細胞の数(EG)] + [M x過移動性を示す細胞の数(HEM)] + [N x低移動性を示す細胞の数 (HPM)] + [O x分裂時間遅延を示す細胞の数(PD)] + [P x分裂時間短縮を示す細胞の数(SD)])/ ([A x 二極分裂の数(DD)] + [B x三極分裂の数(TD)] + [C x四極分裂の数(QD)] + [D x六極分裂の数(HD)] )であり、式中、A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、Pは-1.000と1.000の間の実数である。
別の態様によれば、本発明は、候補化合物を含むがそれに限定されない、外部イベントの発癌性を評価する方法に関連する。本明細書において、用語 "外部イベント"が用いられる場合、細胞を変えることが出来るいかなるイベントを指す。本発明によれば、外部イベントは、 候補化合物、ウイルス、細菌、寄生虫、微生物、電離放射線、光、磁場、が挙げられ、これらを含むがそれに限定されない、例を含む。好ましい実施形態では、候補化合物は外部のイベントである。本明細書において、用語 "候補化合物"が用いられた場合、本発明の方法のいずれかに従って試験されるいかなる種類の化合物を指す。候補化合物は、潜在的な発癌物質、ペプチド、医薬品(単離された分子または化学的合成物)、天然物、化学的に合成された化合物、金属イオン、粒子等、これらを含むがそれに限定されない、例を含む。
別の態様によれば、本発明は潜在的な抗がん化合物の抗癌活性を評価するための方法に関連する。本明細書において用いられる、用語 "潜在的な抗癌化合物"とは、有益な抗癌活性を有すると思われるあらゆる分子を指す。潜在的な抗癌化合物は、天然および合成分子、ペプチド、医薬品、天然物および抽出物等で、これらを含むが限定されるものではない、例を含む。特定の実施形態では、潜在的な抗癌化合物は、潜在的な抗癌剤であり、それは、その治療活性を評価するためにテストされる。
本研究では、しばしば用いられている発癌性/変異原性発物質の一つ、N-メチル-N'-ニトロソ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)、抗癌化合物でトポイソメラーゼ阻害剤ある、カンプトテシン(CPT)、他の発癌剤であるホルムアルデヒド、ヒ酸そしてカドミウム、非発癌性物質、アセトアミノフェンとイブプロフェンを使用した。
エンドポイントアッセイとは異なり、リアルタイムベースでの細胞生物学的手法を用いて得られたデータの分析には、進行中の弁別的細胞イベントを考慮に入れた、細胞系統および細胞集団の特性を表すための新しい定量的なアプローチが必要となる。したがって、私たちは、細胞系統毎に計算される細胞品質インデックス(CQI)を開発し、そして、 細胞集団内の細胞系統の平均CQIを決定することにより、細胞集団の特性の発見または質を評価するために用いている。 二つの式が使用されている。
HeLa細胞は、子宮頸部組織に由来し、頻繁にDNA損傷応答や細胞分裂の研究に使用されている。この細胞は非常に不均一な細胞集団を形成することが経験的に知られているが、そのような不均一性の長期間ライブセルイメージングによる定量的分析はなされていなっかた。そこで、そのような不均一性を明らかにすることにより、この方法で細胞集団の質を決定することができるかどうかをテストするため、100から200の前駆細胞の個々の追跡がおこなわれた。 その結果、114前駆細胞(T = 1)の内44細胞は自然に細胞死を起こしたが、5個の前駆細胞は、少なくとも4回細胞分裂を起こし、21以上の子細胞まで子孫を増やことができた。残りの65個の前駆細胞は生き残ったが、上記の4前駆細胞と較べて増殖率は低かった。また、HeLa細胞は頻繁に細胞融合(CF)と多極分裂(MD)を起こした。いくつかのケースでは、良く成長する細胞系統から、CFやMDを起こし易い細胞系統が形成された。これらの結果は、良く成長する幹細胞様の細胞集団が HeLa細胞集団全体の成長率を維持するために貢献することを示した。データはまた、CF、MDなどの弁別的細胞イベントを起こした子細胞の形成が不均一な細胞集団の形成に係っていることを示唆している。加えて、この方法によって、同様の細胞系統が A549肺癌細胞、MCF10A乳房上皮非形質転換細胞や初代肺上皮細胞でも定量的に識別された。これらの結果に基づいて、我々はこの方法が正確に与えられた細胞集団の品質を判断する能力を持っていると結論づけた。
この方法は顕微鏡上での用量反応実験を行うことができるため、 異なる用量の試験化合物に細胞を曝露し、同時に曝露と非曝露された細胞をモニターすることにより、本研究で使用される化学物質の準毒性と非細胞毒性用量の境界を定めた。カンプトテシン(CPT)の場合、古典的なエンドポイント分析であるコロニー形成分析が用いられた場合、HeLa細胞への30分間、0.25μMの曝露で、95%の細胞生存率が得られた。一方、その処理に対するHeLa細胞の生存能力が平均CQI(式1)に基づいて評価された場合、従来のコロニー形成分析では簡単に検出できない、CPTの細胞増殖の抑制のため、対照の60%と計算され(表1)。この用量は、細胞死(CD)を誘導しないが、それでも細胞の成長にマイナスの影響を与えるため、準細胞毒性用量と定義された。同様に、N-メチル-N'-ニトロソ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)2μMは、細胞成長に対する抑制効果のあることから、準細胞毒性用量と定義された。対照的に0.1μMCPTおよび1μMMNNGの用量は、CDの誘導も細胞増殖抑制効果も示さないことから、非細胞毒性用量として定義された(図5Aおよび5B)。ホルムアルデヒド、砒素酸とカドミウムの非細胞毒性用量も、この方法によって決定され、それらはそれぞれ、0.002から0.18μM、0.009から0.7μMおよび0.004から0.3μMであった。これらの結果は、この方法で低用量の領域での用量反応試験を遂行できることを示唆している。低用量の領域で、限られた数の細胞にのみに誘導される細胞応答を他の既存の方法によって検出することは極めて困難である。
他の細胞が用いられた:p53が機能している上皮細胞肺癌、A549細胞、および、乳房非形質転換上皮細胞、MCF10A。まず、我々はこれらの細胞に対するMNNGの非細胞毒性用量を決定した。A549細胞への2μMのMNNG曝露は平均CQIを20%減少させたが、1μMの曝露ではそのような減少はみられなかった。我々は、それぞれ2および1μMを準細胞毒性用量および非細胞毒性用量であると結論づけた。MCF10A細胞では、1.25μMのMNNGが非細胞毒性用量とであると決定した。次に、これらの細胞に対する非細胞毒性用量でのMNNGの効果を調べた。非処理のA549細胞で検出されたMDは、おそらくp53機能の存在のため、eLa細胞のそれに比べて有意に少なかった。一方A549細胞ではMDの頻度が準細胞毒性用量および非細胞毒性用量のMNNG曝露によって増加した。さらには、このような頻度が非細胞毒性用量のMNNGに曝露したMCF10A細胞でも見られることから、非細胞毒性用量のMNNGは、p53機能している非形質変換細胞においても、MDを起こすリスクを増加させることが示唆された。
Claims (6)
- 哺乳類の細胞集団を少なくとも2つの第1、第2細胞集団に分け、前記第1、第2細胞集団を、発癌化合物が異なる用量で存在する条件下で、所定期間に亘って培養する培養工程と、
前記培養工程において、前記第1、第2細胞集団内のそれぞれにおける個々の細胞について、予め設定した弁別的細胞イベントのうちの一つまたは複数の発生を、非蛍光顕微鏡観察、イメージングおよび追跡を行うことにより、測定する測定工程と、
前記培養工程中における前記第1、第2細胞集団のそれぞれにおける前記弁別的細胞イベントの頻度である第1頻度および第2頻度を、前記発癌化合物の発癌性を示す指標として算出する頻度算出工程と、
前記第1、第2頻度に基づき、前記細胞の生存能力を低下させない前記発癌化合物の最小発癌用量を算出する用量算出工程と、
を含み、
前記弁別的細胞イベントは、二極分裂(DD)、三極分裂(TD)、四極分裂(QD)、六極分裂(HD)、細胞融合(CF)、細胞死(CD)、不完全または部分的な分裂(IP)、細胞形状の変化(CSA)、核形状の変化(NSA)、細胞内物質の蓄積(IA)、細胞肥大(CE)、取り込み(EG)、過移動性(HEM)、貧移動性(HPM)、分裂時間遅延(PD)および分裂時間短縮(SD)からなるグループから選択した一つまたは複数であることを特徴とする細胞集団に対する発癌化合物の最小発癌用量を算出する方法。 - 前記細胞集団を、少なくとも、前記第1、第2細胞集団と第3細胞集団の3つに分け、
前記培養工程では、前記第3細胞集団を前記発癌化合物の非存在下で培養し、
前記測定工程では、前記第3細胞集団内の個々の細胞について、前記弁別的細胞イベントのうちの一つまたは複数の発生を、非蛍光顕微鏡観察、イメージングおよび追跡を行うことにより、測定し、
前記頻度算出工程では、前記培養工程中における前記第3細胞集団における前記弁別的細胞イベントの頻度を、前記発癌化合物の発癌性の対照指標である対照頻度として算出し、
前記用量算出工程では、前記第1、第2頻度および前記対照頻度に基づき、前記細胞の生存能力を低下させない前記発癌化合物の最小発癌用量を算出する
請求項1に記載の細胞集団に対する発癌化合物の最小発癌用量を算出する方法。 - 前記細胞集団は哺乳動物被験体に移植される治療用の哺乳動物細胞である請求項1または2に記載の細胞集団に対する発癌化合物の最小発癌用量を算出する方法。
- 前記細胞集団のための細胞品質インデクスの計算を更に含み、
細胞品質インデクスをCQIとするとき、以下の式1によって前記細胞品質インデクスを計算し、
(式1)CQI= [A x 二極分裂の数(DD)] + [B x 三極分裂の数(TD)] + [C x 四極分裂の数(QD)] + [D x 六極分裂の数(HD)] + [E x 細胞融合の数(CF)] + [F x 細胞死の数(CD)] + [G x 不完全または部分的な細胞分裂の数(IP)] + [H x 細胞形状の変化を示す細胞の数(CSA)] + [I x 核形状の変化を示す細胞の数(NSA)] + [J x 細胞内物質蓄積を示す細胞の数(IA)] + [K x 細胞肥大を示す細胞の数(CE)] + [L x 取り込みを示す細胞の数(EG)] + [M x 過移動性を示す細胞の数(HEM)] + [N x 低移動性を示す細胞の数 (HPM)] + [O x 分裂時間遅延を示す細胞の数(PD)] + [P x 分裂時間短縮を示す細胞の数(SD)]
前記の式1における各係数A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、Pは-1.000と1.000の間の実数であり、かつ、前記係数が同時に全て0になる場合は除かれ、
前記最小発癌用量の計算は前記細胞品質インデクスに基づいて行う請求項1ないし3のうちのいずれか一つの項に記載の細胞集団に対する発癌化合物の最小発癌用量を算出する方法。 - A=1, B=0.8, C=0.8, D=0.8, E=-0.1, F=0, G=0, H=0, I=0, J=0, K=0, M=0, N=0, O=0,
P=0である請求項4に記載の細胞集団に対する発癌化合物の最小発癌用量を算出する方法。 - 前記細胞集団のための細胞品質インデクスの計算を更に含み、
細胞品質インデクスをCQIとするとき、以下の式2によって細胞品質インデクスを計算し、
(式2)CQI= [A x 二極分裂の数(DD)] + [B x 三極分裂の数(TD)] + [C x 四極分裂の数(QD)] + [D x 六極分裂の数(HD)] + [E x 細胞融合の数(CF)] + [F x 細胞死の数(CD)] + [G x 不完全または部分的な細胞分裂の数(IP)]
前記の式2における各係数A、B、C、D、E、F、Gは、1であり、
前記最小発癌用量の計算は前記細胞品質インデクスに基づいて行う請求項1ないし3のうちのいずれか一つの項に記載の細胞集団に対する発癌化合物の最小発癌用量を算出する方法。
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