JPH08136536A - 細胞分裂の観察方法及び抗癌剤の早期検定方法 - Google Patents
細胞分裂の観察方法及び抗癌剤の早期検定方法Info
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- JPH08136536A JPH08136536A JP30301594A JP30301594A JPH08136536A JP H08136536 A JPH08136536 A JP H08136536A JP 30301594 A JP30301594 A JP 30301594A JP 30301594 A JP30301594 A JP 30301594A JP H08136536 A JPH08136536 A JP H08136536A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来法では観察しえなかった細胞分裂前期や
中期にある分裂細胞を観察できる方法を提供する。 【構成】 細胞を死滅させることなく該細胞と結合する
蛍光色素を使用し、細胞の外形変化だけでなく、染色体
の変化の観察も可能にする。これにより細胞分裂自体の
観察が容易になるだけでなく、抗癌剤とともに癌細胞を
培養し、細胞分裂の状態にある細胞数の割合を算出して
コントロールと比較することにより抗癌剤の薬効を短時
間で検定できる。
中期にある分裂細胞を観察できる方法を提供する。 【構成】 細胞を死滅させることなく該細胞と結合する
蛍光色素を使用し、細胞の外形変化だけでなく、染色体
の変化の観察も可能にする。これにより細胞分裂自体の
観察が容易になるだけでなく、抗癌剤とともに癌細胞を
培養し、細胞分裂の状態にある細胞数の割合を算出して
コントロールと比較することにより抗癌剤の薬効を短時
間で検定できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞分裂を顕微鏡を使
用して観察する方法に関し、より詳細には細胞を死滅さ
せることなく観察時に細胞分裂を起こしている細胞の割
合及びその機構を観察するための方法、及び該観察方法
を利用する抗癌剤の早期検定方法に関する。
用して観察する方法に関し、より詳細には細胞を死滅さ
せることなく観察時に細胞分裂を起こしている細胞の割
合及びその機構を観察するための方法、及び該観察方法
を利用する抗癌剤の早期検定方法に関する。
【０００２】
【従来技術及び問題点】細胞は誕生から死滅まで各種形
態変化特に核の変化を起こしながら生存する。これらの
形態変化を追跡することは分子生物学的に興味深いこと
である。この追跡を行なうために通常は顕微鏡が使用さ
れ、視覚的に細胞の状態を観察している。しかし一般の
顕微鏡観察では細胞の内部での形態変化を追跡ことは不
可能で、そのために蛍光色素の利用が提案された。しか
しこの蛍光色素は細胞と結合して細胞を死滅させるた
め、蛍光色素使用時の細胞の形態を観察できても生きて
いる細胞の形態変化を継続して観察することは不可能で
あった。
態変化特に核の変化を起こしながら生存する。これらの
形態変化を追跡することは分子生物学的に興味深いこと
である。この追跡を行なうために通常は顕微鏡が使用さ
れ、視覚的に細胞の状態を観察している。しかし一般の
顕微鏡観察では細胞の内部での形態変化を追跡ことは不
可能で、そのために蛍光色素の利用が提案された。しか
しこの蛍光色素は細胞と結合して細胞を死滅させるた
め、蛍光色素使用時の細胞の形態を観察できても生きて
いる細胞の形態変化を継続して観察することは不可能で
あった。
【０００３】本発明者は、この問題点を解決するために
多数の蛍光色素を検討し、細胞に結合しても細胞を死滅
させることがなく、従って生きた細胞の形態変化を継続
して観察できる蛍光色素として４′，６−ジアミジノ−
２−フェニルインドール・２塩酸（以下ＤＡＰＩとい
う）を提案した〔日本癌学会総会記事（平成２年７月）
390 頁1946〕。一方前記形態変化の中でも細胞分裂は学
術的に特に興味のある現象であり、該細胞分裂は、分裂
前期、分裂中期、分裂後期及び分裂終期に分類される。
添付した図１〜９は細胞分裂の状態を細胞分裂開始時の
分裂前期から細胞分裂終期まで順に並べたもので、各図
の左側は細胞分裂を蛍光色素を使用することなく撮影し
た1500倍の顕微鏡写真である。これらの図のうち、図１
〜３は分裂前期の細胞を、図４〜６は分裂中期の細胞
を、図７は分裂後期の細胞を、図８〜９は分裂終期の細
胞をそれぞれ示している。
多数の蛍光色素を検討し、細胞に結合しても細胞を死滅
させることがなく、従って生きた細胞の形態変化を継続
して観察できる蛍光色素として４′，６−ジアミジノ−
２−フェニルインドール・２塩酸（以下ＤＡＰＩとい
う）を提案した〔日本癌学会総会記事（平成２年７月）
390 頁1946〕。一方前記形態変化の中でも細胞分裂は学
術的に特に興味のある現象であり、該細胞分裂は、分裂
前期、分裂中期、分裂後期及び分裂終期に分類される。
添付した図１〜９は細胞分裂の状態を細胞分裂開始時の
分裂前期から細胞分裂終期まで順に並べたもので、各図
の左側は細胞分裂を蛍光色素を使用することなく撮影し
た1500倍の顕微鏡写真である。これらの図のうち、図１
〜３は分裂前期の細胞を、図４〜６は分裂中期の細胞
を、図７は分裂後期の細胞を、図８〜９は分裂終期の細
胞をそれぞれ示している。
【０００４】図１〜９の細胞はいずれも細胞分裂の状態
にあるが、通常の顕微鏡観察では図６〜９が細胞分裂の
状態にあることが固定液で固定した標本のみで認識でき
るだけで、図１〜５については通常の顕微鏡観察のみで
は認識できない。細胞が細胞分裂の状態にあるか否かを
容易に認識することは学術的だけでなく各種薬剤の薬効
を確認する意味からも重要である。しかし以上述べたこ
とから細胞分裂の前記状態のうち、分裂前期及び分裂中
期の前半から後半当初に掛けての分裂状態は通常の顕微
鏡観察では識別できず、詳細な研究が不可能であった。
にあるが、通常の顕微鏡観察では図６〜９が細胞分裂の
状態にあることが固定液で固定した標本のみで認識でき
るだけで、図１〜５については通常の顕微鏡観察のみで
は認識できない。細胞が細胞分裂の状態にあるか否かを
容易に認識することは学術的だけでなく各種薬剤の薬効
を確認する意味からも重要である。しかし以上述べたこ
とから細胞分裂の前記状態のうち、分裂前期及び分裂中
期の前半から後半当初に掛けての分裂状態は通常の顕微
鏡観察では識別できず、詳細な研究が不可能であった。
【０００５】更に各種臓器癌の頻発から抗腫瘍性物質つ
まり抗癌剤の開発が精力的に行なわれているが、該抗癌
剤の開発に際しては抗癌剤としての薬効の検定（感受性
テスト）を如何に迅速に行なうかが開発経費の低減上必
要とされている。前記検定法は大別して２種類知られて
いる。第１の方法は、腫瘍細胞を培養し、試験管内で抗
癌剤と共に培養して、細胞の死滅まで待ってその死滅の
程度を判定する方法であり、第２の方法は、腫瘍細胞を
移植した腫瘍動物に抗癌剤を注射又は経口投与し、動物
の生存日数を比較することにより抗癌剤の薬効を判定す
る方法である。
まり抗癌剤の開発が精力的に行なわれているが、該抗癌
剤の開発に際しては抗癌剤としての薬効の検定（感受性
テスト）を如何に迅速に行なうかが開発経費の低減上必
要とされている。前記検定法は大別して２種類知られて
いる。第１の方法は、腫瘍細胞を培養し、試験管内で抗
癌剤と共に培養して、細胞の死滅まで待ってその死滅の
程度を判定する方法であり、第２の方法は、腫瘍細胞を
移植した腫瘍動物に抗癌剤を注射又は経口投与し、動物
の生存日数を比較することにより抗癌剤の薬効を判定す
る方法である。
【０００６】いずれの方法でも細胞の死滅又は動物の死
亡まで薬効の判定はできず、判定に必要な日数は通常１
週間から４週間となり、早期の判定が不可能であるだけ
でなく、テストを継続するための経費が嵩張るという欠
点がある。本発明者は、より迅速な薬効検定のための方
法を提案したが（特開昭58−184547号公報）が、該方法
でも試験管法では４日以上、動物法では７日以上４週間
の日数を判定のために必要としていた。
亡まで薬効の判定はできず、判定に必要な日数は通常１
週間から４週間となり、早期の判定が不可能であるだけ
でなく、テストを継続するための経費が嵩張るという欠
点がある。本発明者は、より迅速な薬効検定のための方
法を提案したが（特開昭58−184547号公報）が、該方法
でも試験管法では４日以上、動物法では７日以上４週間
の日数を判定のために必要としていた。
【０００７】更にこれらの方法では、薬効つまり癌細胞
の死滅効果が判明するのみで、抗癌剤がどのように作用
して癌細胞を死滅させるか（作用機序）については特定
できなかった。又前述のＤＡＰＩを蛍光色素として使用
する方法により、細胞が抗癌剤により死滅する過程を細
胞を生かしたままで視覚で捉えることが可能になった
が、該方法によっても細胞の死滅までを観察しなければ
抗癌剤の薬効を確認できず、少なくとも３〜６日を必要
とした。
の死滅効果が判明するのみで、抗癌剤がどのように作用
して癌細胞を死滅させるか（作用機序）については特定
できなかった。又前述のＤＡＰＩを蛍光色素として使用
する方法により、細胞が抗癌剤により死滅する過程を細
胞を生かしたままで視覚で捉えることが可能になった
が、該方法によっても細胞の死滅までを観察しなければ
抗癌剤の薬効を確認できず、少なくとも３〜６日を必要
とした。
【０００８】
【発明の目的】本発明は、これらの欠点を解消するため
になされたもので、細胞分裂の分裂後期及び分裂終期だ
けでなく、分裂前期及び分裂中期の状態にある細胞も容
易に識別しかつその形態を観察できる方法及び該方法を
利用して抗癌剤の薬効を検定する方法を提供することを
目的とする。
になされたもので、細胞分裂の分裂後期及び分裂終期だ
けでなく、分裂前期及び分裂中期の状態にある細胞も容
易に識別しかつその形態を観察できる方法及び該方法を
利用して抗癌剤の薬効を検定する方法を提供することを
目的とする。
【０００９】
【問題点を解決するための手段】本発明に係わる細胞分
裂の観察方法は、観察すべき細胞に蛍光色素を添加し各
細胞に該蛍光色素を結合し、該細胞を顕微鏡で観察して
その細胞分裂の状態を観察することを特徴とする細胞分
裂の観察方法であり、該方法を利用すると多数の癌細胞
のうち細胞分裂状態にある細胞数の割合を算出すること
により抗癌剤の薬効を検定できる。
裂の観察方法は、観察すべき細胞に蛍光色素を添加し各
細胞に該蛍光色素を結合し、該細胞を顕微鏡で観察して
その細胞分裂の状態を観察することを特徴とする細胞分
裂の観察方法であり、該方法を利用すると多数の癌細胞
のうち細胞分裂状態にある細胞数の割合を算出すること
により抗癌剤の薬効を検定できる。
【００１０】以下、本発明の詳細について説明する。本
発明では細胞を死滅させずに細胞と結合し蛍光を生じさ
せる蛍光色素を使用する。このような蛍光色素としては
前述のＤＡＰＩを使用する。該ＤＡＰＩ自体は公知であ
るが、生きたままの細胞で細胞分裂の観察用としての用
途は知られていない。本発明者らは、このＤＡＰＩ以外
にヘキスト33258 、アクリジンオレンジ及びアクリジン
イエロー等の蛍光色素を検討した。ＤＡＰＩと比較した
場合、いずれも毒性が強過ぎて細胞を生かしたまま使用
できなかった。蛍光色素であるＤＡＰＩを正常又は癌細
胞とともに培養すると、ＤＡＰＩが各細胞の核に結合し
て蛍光を発するようになる。このＤＡＰＩが結合した細
胞は特に細胞分裂時の細胞の核の状態をより鮮明にす
る。図１〜９の右側の写真は、図１〜９の左側の細胞と
同一の細胞分裂の状態にある、ＤＡＰＩが結合した細胞
の顕微鏡写真である。
発明では細胞を死滅させずに細胞と結合し蛍光を生じさ
せる蛍光色素を使用する。このような蛍光色素としては
前述のＤＡＰＩを使用する。該ＤＡＰＩ自体は公知であ
るが、生きたままの細胞で細胞分裂の観察用としての用
途は知られていない。本発明者らは、このＤＡＰＩ以外
にヘキスト33258 、アクリジンオレンジ及びアクリジン
イエロー等の蛍光色素を検討した。ＤＡＰＩと比較した
場合、いずれも毒性が強過ぎて細胞を生かしたまま使用
できなかった。蛍光色素であるＤＡＰＩを正常又は癌細
胞とともに培養すると、ＤＡＰＩが各細胞の核に結合し
て蛍光を発するようになる。このＤＡＰＩが結合した細
胞は特に細胞分裂時の細胞の核の状態をより鮮明にす
る。図１〜９の右側の写真は、図１〜９の左側の細胞と
同一の細胞分裂の状態にある、ＤＡＰＩが結合した細胞
の顕微鏡写真である。
【００１１】図１〜９の右側の写真では、細胞分裂中期
の後半（図６）、細胞分裂後期（図７）及び細胞分裂終
期（図８〜９）だけでなく、細胞分裂前期（図１〜３）
及び細胞分裂中期の当初から中盤（図４〜５）に掛けて
の細胞の状態も蛍光により識別できるようになる。つま
り通常の顕微鏡による観察では細胞の外形の変形に伴う
形態変化のみが可能であるのに対し、本発明によると生
きたままでの細胞内の染色体の分裂も識別できるため細
胞の外形変化を伴わない状態にある細胞分裂前期及び中
期でも観察しかつ識別できるのである。
の後半（図６）、細胞分裂後期（図７）及び細胞分裂終
期（図８〜９）だけでなく、細胞分裂前期（図１〜３）
及び細胞分裂中期の当初から中盤（図４〜５）に掛けて
の細胞の状態も蛍光により識別できるようになる。つま
り通常の顕微鏡による観察では細胞の外形の変形に伴う
形態変化のみが可能であるのに対し、本発明によると生
きたままでの細胞内の染色体の分裂も識別できるため細
胞の外形変化を伴わない状態にある細胞分裂前期及び中
期でも観察しかつ識別できるのである。
【００１２】次に該細胞分裂の観察方法を使用する抗癌
剤の検定方法を説明する。腫瘍つまり癌細胞が悪性であ
る第１の理由は、癌細胞が無制限に増殖することであ
る。従って抗癌剤の投与によりこの癌細胞の増殖が停止
すれば抗癌剤として作用していることを意味する。癌細
胞を培養して一定数以上の癌細胞を準備し、この癌細胞
に抗癌剤を添加して更に培養を継続して、各計測時間に
おける分裂している細胞数をカウントする。細胞分裂は
常に起こっている訳ではなく、例えば１日に１回約30分
掛けて起こるため、単一回の分裂細胞のカウントのみで
は正確に抗癌剤の薬効を判定できない。従って数回に渡
って一定数（例えば千個）の細胞中の分裂中の細胞数を
カウントし、前回の又はそれ以前の計測値と比較してそ
の増減により細胞分裂の進行状況を把握し、抗癌剤の薬
効を検定できる。
剤の検定方法を説明する。腫瘍つまり癌細胞が悪性であ
る第１の理由は、癌細胞が無制限に増殖することであ
る。従って抗癌剤の投与によりこの癌細胞の増殖が停止
すれば抗癌剤として作用していることを意味する。癌細
胞を培養して一定数以上の癌細胞を準備し、この癌細胞
に抗癌剤を添加して更に培養を継続して、各計測時間に
おける分裂している細胞数をカウントする。細胞分裂は
常に起こっている訳ではなく、例えば１日に１回約30分
掛けて起こるため、単一回の分裂細胞のカウントのみで
は正確に抗癌剤の薬効を判定できない。従って数回に渡
って一定数（例えば千個）の細胞中の分裂中の細胞数を
カウントし、前回の又はそれ以前の計測値と比較してそ
の増減により細胞分裂の進行状況を把握し、抗癌剤の薬
効を検定できる。
【００１３】この際に抗癌剤と共にＤＡＰＩを添加する
と、細胞分裂のどの段階にあろうとも分裂状態にある細
胞を識別できるため、正確な分裂細胞数をカウントでき
る。計測値の比較により分裂細胞数が減少している場合
には、癌細胞の増殖が抑制されている、つまり抗癌剤の
機能が果たされていると判定できるが、一方分裂細胞数
が対照よりも増加している場合にも、ある種の抗癌剤の
機能が果たされていると判定できる。これは通常の抗癌
剤は細胞分裂を抑制するように働くため、抗癌剤の投与
により分裂が抑制されるのに対し、抗癌剤の中には細胞
分裂の状態にある細胞がそれ以上の分裂の進行を抑制さ
れ、分裂途中のままで増殖が中止される、即ち抗腫瘍性
を発揮する薬剤もあり、この抗癌剤の場合には細胞分裂
の状態の細胞数が増加することになり、この場合にもそ
れは抗腫瘍性の存在を意味する。
と、細胞分裂のどの段階にあろうとも分裂状態にある細
胞を識別できるため、正確な分裂細胞数をカウントでき
る。計測値の比較により分裂細胞数が減少している場合
には、癌細胞の増殖が抑制されている、つまり抗癌剤の
機能が果たされていると判定できるが、一方分裂細胞数
が対照よりも増加している場合にも、ある種の抗癌剤の
機能が果たされていると判定できる。これは通常の抗癌
剤は細胞分裂を抑制するように働くため、抗癌剤の投与
により分裂が抑制されるのに対し、抗癌剤の中には細胞
分裂の状態にある細胞がそれ以上の分裂の進行を抑制さ
れ、分裂途中のままで増殖が中止される、即ち抗腫瘍性
を発揮する薬剤もあり、この抗癌剤の場合には細胞分裂
の状態の細胞数が増加することになり、この場合にもそ
れは抗腫瘍性の存在を意味する。
【００１４】
【実施例】次に本発明に係わる抗癌剤の検定方法に関す
る実施例を説明するが、本実施例は本発明を限定するも
のではない。
る実施例を説明するが、本実施例は本発明を限定するも
のではない。
【実施例１】対照癌細胞としてヒト白血球細胞株化細胞
（ＲＰＭＩ−8402）を105 個／ミリリットル含む５ミリ
リットルの培養液（ＲＰＭＩ−1640に15％の牛胎児血清
を加えた液）を、浮遊培養用フラスコ（スミロン）に入
れ、37℃、５％炭酸ガスの培養器で６日間培養した。各
培養液へ蛍光色素であるＤＡＰＩを１μｇ／ｍｌ、それ
ぞれ (1)コントロール（抗癌剤の添加なし）、 (2)５μ
ｇ／ｍｌのＣＰＴ（カンプトテシン）、 (3)10μｇ／ｍ
ｌのＣＰＴ−11（イリフテカン）、 (4)0.05μｇ／ｍｌ
のＡＤＲ（アドリアマイシン）、(5)0.05 μｇ／ｍｌの
ＤＮＲ（ダウノマイシン）、 (6)１μｇ／ｍｌのＥｔｏ
ｐｏｓｉｄｅ（エトポシド）、 (7)20μｇ／ｍｌのＭＳ
Ｔ−16（ソブゾキサン）、 (8)１μｇ／ｍｌのｍ−ＡＭ
ＳＡ（アムサクリン）、 (9)１μｇ／ｍｌのＡｃｔ−Ｄ
（アクチノマイシンＤ）、(10)0.1 μｇ／ｍｌのＭｉｔ
ｏｘａｎｔｒｏｎｅ（ミトキサントロン）、(11)20μｇ
／ｍｌの５−Ｆｕ（５−フルオロウラシル）、(12)10μ
ｇ／ｍｌのＡｒａ−Ｃ（サイトシンアラビノシド）、(1
3)50μｇ／ｍｌのＨｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ（ヒドレ
ア）、(14)２μｇ／ｍｌのＡｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ（ア
ヒデコリン）、(15)10μｇ／ｍｌのＭＴＸ（メソトレキ
セート）、(16)0.05μｇ／ｍｌのＶＣＲ（ビンクリスチ
ン）、(17)0.05μｇ／ｍｌのＶＤＳ（ｖｉｎｄｅｓｉｎ
ｅ、ビンデシン）、(18)５μｇ／ｍｌのＣｉｓｐｌａｔ
ｉｎ（シスプラチン）、(19)10μｇ／ｍｌルのＢｌｅｏ
ｍｙｃｉｎ（ブレオマイシン）、(20)10μｇ／ｍｌのＭ
ＭＣ（マイトマイシンＣ）及び(21)５μｇ／ｍｌのＣｙ
ｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（エンドキサン）を添加
し、培養開始後、１時間、４時間、24時間、それ以後は
24時間ごとに培養液から試料をサンプリングし、細胞観
察板（エレコン化学株式会社製ＺＯＧ−１）に入れ、15
00倍の蛍光装置付き倒立顕微鏡（ニコン株式会社製）で
細胞を観察し、細胞1000個当たりの分裂細胞数をカウン
トして分裂細胞の百分率比を算出した。その結果を図10
のグラフに示す。
（ＲＰＭＩ−8402）を105 個／ミリリットル含む５ミリ
リットルの培養液（ＲＰＭＩ−1640に15％の牛胎児血清
を加えた液）を、浮遊培養用フラスコ（スミロン）に入
れ、37℃、５％炭酸ガスの培養器で６日間培養した。各
培養液へ蛍光色素であるＤＡＰＩを１μｇ／ｍｌ、それ
ぞれ (1)コントロール（抗癌剤の添加なし）、 (2)５μ
ｇ／ｍｌのＣＰＴ（カンプトテシン）、 (3)10μｇ／ｍ
ｌのＣＰＴ−11（イリフテカン）、 (4)0.05μｇ／ｍｌ
のＡＤＲ（アドリアマイシン）、(5)0.05 μｇ／ｍｌの
ＤＮＲ（ダウノマイシン）、 (6)１μｇ／ｍｌのＥｔｏ
ｐｏｓｉｄｅ（エトポシド）、 (7)20μｇ／ｍｌのＭＳ
Ｔ−16（ソブゾキサン）、 (8)１μｇ／ｍｌのｍ−ＡＭ
ＳＡ（アムサクリン）、 (9)１μｇ／ｍｌのＡｃｔ−Ｄ
（アクチノマイシンＤ）、(10)0.1 μｇ／ｍｌのＭｉｔ
ｏｘａｎｔｒｏｎｅ（ミトキサントロン）、(11)20μｇ
／ｍｌの５−Ｆｕ（５−フルオロウラシル）、(12)10μ
ｇ／ｍｌのＡｒａ−Ｃ（サイトシンアラビノシド）、(1
3)50μｇ／ｍｌのＨｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ（ヒドレ
ア）、(14)２μｇ／ｍｌのＡｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ（ア
ヒデコリン）、(15)10μｇ／ｍｌのＭＴＸ（メソトレキ
セート）、(16)0.05μｇ／ｍｌのＶＣＲ（ビンクリスチ
ン）、(17)0.05μｇ／ｍｌのＶＤＳ（ｖｉｎｄｅｓｉｎ
ｅ、ビンデシン）、(18)５μｇ／ｍｌのＣｉｓｐｌａｔ
ｉｎ（シスプラチン）、(19)10μｇ／ｍｌルのＢｌｅｏ
ｍｙｃｉｎ（ブレオマイシン）、(20)10μｇ／ｍｌのＭ
ＭＣ（マイトマイシンＣ）及び(21)５μｇ／ｍｌのＣｙ
ｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（エンドキサン）を添加
し、培養開始後、１時間、４時間、24時間、それ以後は
24時間ごとに培養液から試料をサンプリングし、細胞観
察板（エレコン化学株式会社製ＺＯＧ−１）に入れ、15
00倍の蛍光装置付き倒立顕微鏡（ニコン株式会社製）で
細胞を観察し、細胞1000個当たりの分裂細胞数をカウン
トして分裂細胞の百分率比を算出した。その結果を図10
のグラフに示す。
【００１５】図10のグラフから分かるように、20種類の
抗癌剤のうち(16)ＶＣＲ及び(17)ＶＤＳはコントロール
と比較して分裂細胞数の顕著な増加が見られた。 (7)の
ＭＳＴ−16も一時的に分裂細胞数が増加するが、２日目
以降は急激に減少し、６日目では全て分裂細胞の出現率
は１％以下となる。これら３種以外の抗癌剤では、全て
培養開始後１日で分裂細胞の出現率は１％以下となり、
６日までには殆ど検出されなくなった。
抗癌剤のうち(16)ＶＣＲ及び(17)ＶＤＳはコントロール
と比較して分裂細胞数の顕著な増加が見られた。 (7)の
ＭＳＴ−16も一時的に分裂細胞数が増加するが、２日目
以降は急激に減少し、６日目では全て分裂細胞の出現率
は１％以下となる。これら３種以外の抗癌剤では、全て
培養開始後１日で分裂細胞の出現率は１％以下となり、
６日までには殆ど検出されなくなった。
【００１６】これらの結果から、20の抗癌剤の殆ど（1
7）の抗癌剤が培養開始後１日で分裂細胞数をコントロ
ールと比較して激減させること、つまり細胞分裂に入る
癌細胞数が大きく減少させることを意味し、従って各抗
癌剤が抗腫瘍性を示すことが明らかになった。従来の試
験管法や動物法では、培養開始後１〜２日では未だ検定
中の抗癌剤が抗腫瘍性を示すか予測さえ付かないでいる
段階であり、本実施例の前述の記載から分かるように、
百分率比を知るのみで対象とする抗癌剤の抗腫瘍性をつ
まり抗癌剤の薬効を確実に検定することができる。
7）の抗癌剤が培養開始後１日で分裂細胞数をコントロ
ールと比較して激減させること、つまり細胞分裂に入る
癌細胞数が大きく減少させることを意味し、従って各抗
癌剤が抗腫瘍性を示すことが明らかになった。従来の試
験管法や動物法では、培養開始後１〜２日では未だ検定
中の抗癌剤が抗腫瘍性を示すか予測さえ付かないでいる
段階であり、本実施例の前述の記載から分かるように、
百分率比を知るのみで対象とする抗癌剤の抗腫瘍性をつ
まり抗癌剤の薬効を確実に検定することができる。
【００１７】又前述の (7)、(16)及び(17)の３種類の抗
癌剤では、分裂細胞比が培養開始後に増加したが、これ
の分裂細胞の分裂段階は顕微鏡観察によると、いずれも
分裂前期と分裂中期であり、分裂後期及び分裂終期は全
く認められなかった。このことは分裂前期の細胞が引き
続く分裂中期等へ到達するが、それ以後の進行は抑制さ
れ、換言すると細胞分裂が分裂後期で停止していること
を示している。このように蛍光色素を使用する細胞分裂
の観察法を使用すると、核の形態変化を追跡できるた
め、細胞分裂の作用機序も明確になり、更に有用な情報
の入手が可能になる。
癌剤では、分裂細胞比が培養開始後に増加したが、これ
の分裂細胞の分裂段階は顕微鏡観察によると、いずれも
分裂前期と分裂中期であり、分裂後期及び分裂終期は全
く認められなかった。このことは分裂前期の細胞が引き
続く分裂中期等へ到達するが、それ以後の進行は抑制さ
れ、換言すると細胞分裂が分裂後期で停止していること
を示している。このように蛍光色素を使用する細胞分裂
の観察法を使用すると、核の形態変化を追跡できるた
め、細胞分裂の作用機序も明確になり、更に有用な情報
の入手が可能になる。
【００１８】
【発明の効果】本発明は、観察すべき細胞に蛍光色素を
添加し各細胞の核に該蛍光色素を結合させ、該細胞を顕
微鏡で観察してその細胞分裂の状態を観察することを特
徴とする細胞分裂の観察方法（請求項１）である。従来
の細胞分裂の観察は、分裂細胞を固定し顕微鏡で観察す
るものであったが、細胞分裂は顕微鏡で観察しにくい分
裂前期及び分裂中期を含み、この段階の細胞分裂を従来
法で観察することはだ困難であり、生きたままの細胞で
は不可能であった。
添加し各細胞の核に該蛍光色素を結合させ、該細胞を顕
微鏡で観察してその細胞分裂の状態を観察することを特
徴とする細胞分裂の観察方法（請求項１）である。従来
の細胞分裂の観察は、分裂細胞を固定し顕微鏡で観察す
るものであったが、細胞分裂は顕微鏡で観察しにくい分
裂前期及び分裂中期を含み、この段階の細胞分裂を従来
法で観察することはだ困難であり、生きたままの細胞で
は不可能であった。
【００１９】しかし本発明では正常細胞や癌細胞に結合
できる蛍光色素を培養中の前記細胞に添加して結合させ
ることにより、分裂前期や中期の観察しにくい分裂細胞
を観察することが可能になり、換言すると分裂細胞の外
形ではなく、染色体の変化を観察できるため、外形変化
が殆ど生じない前記分裂前期や中期の分裂細胞の観察を
も可能にしている。このように該観察方法によると多数
の細胞の中の細胞分裂期にある全ての細胞数を正確にカ
ウントし、全体に対する百分率比を算出できる。
できる蛍光色素を培養中の前記細胞に添加して結合させ
ることにより、分裂前期や中期の観察しにくい分裂細胞
を観察することが可能になり、換言すると分裂細胞の外
形ではなく、染色体の変化を観察できるため、外形変化
が殆ど生じない前記分裂前期や中期の分裂細胞の観察を
も可能にしている。このように該観察方法によると多数
の細胞の中の細胞分裂期にある全ての細胞数を正確にカ
ウントし、全体に対する百分率比を算出できる。
【００２０】検定されるべき抗癌剤が該抗癌剤を含まな
いコントロールと同等の分裂細胞数を示すのであれば、
前記検定される抗癌剤は抗腫瘍性を有しないことになる
が、前記コントロールと比較して分裂細胞数が増加又は
減少するのであれば、検定されている抗癌剤は抗腫瘍性
を有することになり、前記分裂細胞数をカウントし、コ
ントロールと比較することにより抗癌剤としての有効性
が判定できることになる（請求項２）。使用する蛍光色
素はＤＡＰＩとすることが望ましく（請求項３）、他の
類縁化合物の使用も可能である。
いコントロールと同等の分裂細胞数を示すのであれば、
前記検定される抗癌剤は抗腫瘍性を有しないことになる
が、前記コントロールと比較して分裂細胞数が増加又は
減少するのであれば、検定されている抗癌剤は抗腫瘍性
を有することになり、前記分裂細胞数をカウントし、コ
ントロールと比較することにより抗癌剤としての有効性
が判定できることになる（請求項２）。使用する蛍光色
素はＤＡＰＩとすることが望ましく（請求項３）、他の
類縁化合物の使用も可能である。
【図１】細胞分裂の分裂前期の第１段階の細胞を示す15
00倍の顕微鏡写真。
00倍の顕微鏡写真。
【図２】細胞分裂の分裂前期の第２段階の細胞を示す15
00倍の顕微鏡写真。
00倍の顕微鏡写真。
【図３】細胞分裂の分裂前期の第３段階の細胞を示す15
00倍の顕微鏡写真。
00倍の顕微鏡写真。
【図４】細胞分裂の分裂中期の第１段階の細胞を示す15
00倍の顕微鏡写真。
00倍の顕微鏡写真。
【図５】細胞分裂の分裂中期の第２段階の細胞を示す15
00倍の顕微鏡写真。
00倍の顕微鏡写真。
【図６】細胞分裂の分裂中期の第３段階の細胞を示す15
00倍の顕微鏡写真。
00倍の顕微鏡写真。
【図７】細胞分裂の分裂後期の細胞を示す1500倍の顕微
鏡写真。
鏡写真。
【図８】細胞分裂の分裂終期の第１段階の細胞を示す15
00倍の顕微鏡写真。
00倍の顕微鏡写真。
【図９】細胞分裂の分裂終期の第２段階の細胞を示す15
00倍の顕微鏡写真。
00倍の顕微鏡写真。
【図10】実施例１における抗癌剤の検定テストにおける
培養時間と分裂細胞の百分率比の関係を示すグラフ。
培養時間と分裂細胞の百分率比の関係を示すグラフ。
【手続補正書】
【提出日】平成６年１２月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
Claims (3)
- 【請求項１】 観察すべき細胞に蛍光色素を添加し各細
胞に該蛍光色素を結合し、該細胞を顕微鏡で観察してそ
の細胞分裂の状態を観察することを特徴とする細胞分裂
の観察方法。 - 【請求項２】 培養した多数の癌細胞に蛍光色素及び被
検抗癌剤を添加して培養を継続し、分裂期に入った前記
多数の癌細胞に出現する分裂期細胞数を計測することに
より、前記抗癌剤の効果を検定することを特徴とする抗
癌剤の早期検定方法。 - 【請求項３】 蛍光色素が４′，６−ジアミジノ−２−
フェニルインドール・２塩酸である請求項２に記載の方
法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30301594A JPH08136536A (ja) | 1994-11-11 | 1994-11-11 | 細胞分裂の観察方法及び抗癌剤の早期検定方法 |
| ES95203059T ES2206478T3 (es) | 1994-11-11 | 1995-11-10 | Composiciones carcinostaticas que contienen cis-oxaliplatino y otra u otras sustancias carcinostaticas compatibles. |
| DE69531722T DE69531722T2 (de) | 1994-11-11 | 1995-11-10 | Karzinostatische Zusammensetzungen, welche Cis-Oxaliplatin und eine oder mehrere andere verträgliche Karzinostatika enthalten |
| EP03016511A EP1369116A1 (en) | 1994-11-11 | 1995-11-10 | Oxalatoplatin and 5-fluorouracil for combination therapy of cancer |
| EP95203059A EP0715854B1 (en) | 1994-11-11 | 1995-11-10 | Carcinostatic compositions containing cis-oxaliplatinum and one or more other compatible carcinostatic substances |
| US09/496,603 US6518278B1 (en) | 1994-11-11 | 2000-02-02 | Carcinostatic substance for compatible administration, process of administrating same and process of rapidly inspecting same |
| US10/321,690 US20040005365A1 (en) | 1994-11-11 | 2002-12-17 | Carcinostatic substance for compatible administration, process of administrating same and process of rapidly inspecting same |
| HK04104174A HK1063004A1 (en) | 1994-11-11 | 2004-06-10 | Oxalatoplatin and 5-fluorouracil for combination therapy of cancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30301594A JPH08136536A (ja) | 1994-11-11 | 1994-11-11 | 細胞分裂の観察方法及び抗癌剤の早期検定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08136536A true JPH08136536A (ja) | 1996-05-31 |
Family
ID=17915917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30301594A Pending JPH08136536A (ja) | 1994-11-11 | 1994-11-11 | 細胞分裂の観察方法及び抗癌剤の早期検定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08136536A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007142044A1 (ja) * | 2006-06-07 | 2007-12-13 | Olympus Corporation | 画像処理装置および画像処理プログラム |
| JP2013230145A (ja) * | 2012-04-30 | 2013-11-14 | Masahiko Sato | 細胞集団の状態を評価するための方法、候補化合物の発癌性を評価するための方法、潜在的な抗癌化合物の抗癌活性を評価するための方法及び治療用細胞集団の品質を評価するための方法 |
| JP2018525644A (ja) * | 2015-05-26 | 2018-09-06 | クレアティブ マイクロテック インコーポレイテッド | 癌の層別化及び診断における末梢循環腫瘍細胞有糸分裂指数の使用 |
-
1994
- 1994-11-11 JP JP30301594A patent/JPH08136536A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007142044A1 (ja) * | 2006-06-07 | 2007-12-13 | Olympus Corporation | 画像処理装置および画像処理プログラム |
| JP2007327843A (ja) * | 2006-06-07 | 2007-12-20 | Olympus Corp | 画像処理装置および画像処理プログラム |
| US8129990B2 (en) | 2006-06-07 | 2012-03-06 | Olympus Corporation | Image processing apparatus and computer program product |
| JP2013230145A (ja) * | 2012-04-30 | 2013-11-14 | Masahiko Sato | 細胞集団の状態を評価するための方法、候補化合物の発癌性を評価するための方法、潜在的な抗癌化合物の抗癌活性を評価するための方法及び治療用細胞集団の品質を評価するための方法 |
| JP2018525644A (ja) * | 2015-05-26 | 2018-09-06 | クレアティブ マイクロテック インコーポレイテッド | 癌の層別化及び診断における末梢循環腫瘍細胞有糸分裂指数の使用 |
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