JP2007510893A - 細胞試料の自動分析 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】この課題は、(a)試料の細胞核を染色すること、(b)試料の少なくとも1つのデジタル画像を取得すること、および(c)前記画像をデジタル的に分析することからなり、細胞核の染色ステップ(2)では、DNAに非特異的な染色が行われることを特徴とする、細胞試料の自動的分析の方法によって解決される。また、本発明は、培地を選択するための方法、物質の毒性を測定するための方法、およびウイルスの細胞病理学的特性を測定するための方法に関する。さらに、本発明は、過体重症および肥満症を治療するための薬理物質を選択するための方法、および骨粗鬆症を治療するための物質を選択する方法も開示する。
【選択図】図1
Description
・組み換えたんぱく質の生成のための細胞
・薬物分子のスクリーニングのための細胞
・診断テスト用の細胞
・毒性予測の構築のための細胞
・修復および再生による細胞治療のための細胞
・多数の技術的操作が手作業であるため、ノウハウがきわめて重要になっている点、
・培地に入る多数の不特定因子が使用される点、および
・散在性細胞が定性性および定量性分析に適していない点
である。
a)試料の細胞の核を染色するステップ、
b)試料の少なくとも1つのデジタル画像を取得するステップ、および
c)前記画像をデジタル的に分析するステップ、
を有する細胞試料の分析プロセスを提案する。
・染色ステップa)が、細胞化学染色を含んでいる。
・染色ステップa)が、少なくとも1つの抗体による酵素抗体法の使用を含んでいる。
・染色ステップa)が、少なくとも1つの抗体による酵素免疫化学法の使用を含んでいる。
・染色ステップa)が、DNAに非特異的な染色を行う。
・前記分析プロセスが、ステップb)とc)の間に、所定の色による画像の分解ステップを含んでいる。
・画像の分解ステップが、染色の色または染色に対して相補的である色に従って行なわれる。
・分解ステップが、Nrgb空間規格の原色のうちの1つに従って行なわれる。
・染色がマゼンタであり、色分解のステップが、色空間規格の緑色成分に従って行なわれる。
・前記分析プロセスが、ステップc)に先立って、細胞の核を背景から区別するために、画像の画素を2値化するステップを含んでいる。
・2値化のステップが、前記所定の色に従って分解された画像にRidlerアルゴリズムを適用することによって行なわれる。
・前記分析プロセスが、ステップc)に先立って、第1の所定のしきい値よりも少ない数の画素を有している少なくとも1つの物体を、2値化画像において除去するステップを含んでいる。
・前記分析プロセスが、ステップc)に先立って、2値化画像において、第2の所定のしきい値よりも多数の画素を有している少なくとも1つの物体を、この物体に相当する細胞の核と同じ数の物体へと分割するステップを含んでいる。
・分割ステップが、根源を得るために前記少なくとも1つ物体を最大限に浸食すること、および分水界法の適用によって、物体の分割線を決定するために、前記根源を成長させることを含んでいる。
・ステップc)が、画像の物体をカウントすることを含んでいる。
・細胞の核を背景から区別するために、画像の画素を2値化するステップ、および
・2値化した画像を分析するステップ
を含んでいる。
・デジタル画像の各画素が、異なる3つの成分色の強度レベルによって定められており、前記分析プロセスが、2値化ステップに先立って、所定の色に従って画像を分解し、画像の各画素を、3つ以上である複数の強度レベルのうちの1つの強度レベルに結びつけるステップを含んでいる。
・分解ステップが、Nrgb色空間規格の原色のうちの1つに従って行なわれる。
・分解ステップが、色空間規格の緑色成分に従って行なわれる。
・2値化のステップが、任意の所定の色に従って分解された画像にRidlerアルゴリズムを適用することによって行なわれる。
・前記分析プロセスが、分析ステップに先立って、第1の所定のしきい値よりも少ない数の画素を有する少なくとも1つの物体を、2値化画像において除去するステップを含んでいる。
・前記分析プロセスが、分析ステップに先立って、2値化画像において、第2の所定のしきい値よりも多数の画素を有している少なくとも1つの物体を、この物体に相当する細胞の核と同じ数の物体へと分割するステップを含んでいる。
・分割ステップが、根源を得るために前記少なくとも1つ物体を最大限に浸食すること、および分水界として知られている方法を適用することによって、物体の分割線を決定するために、前記根源を成長させることを含んでいる。
・分析ステップが、画像の物体をカウントすることを含んでいる。
・分析しようとする試料のマルチウェルボックスを配置するためのプレート、
・顕微鏡、
・前記顕微鏡に接続され、画像を画素の形態で提供するデジタルカメラであって、各画素が、少なくとも1つの色または黒および白の成分の、3つの強度レベルのうちの1つの強度レベルによって定められているデジタルカメラ、
・前記プレートに配置されたマルチウェルボックスを、顕微鏡に対して移動させるためのシステム、および
・前記移動システムおよび前記カメラを制御し、前記カメラによって得たデジタル画像を受け取るコンピュータを有しており、
前記コンピュータは、上述した本発明による細胞試料のデジタル画像の分析プロセスを使用するソフトウェアを含んでいる装置を提案する。
・顕微鏡2:PRIOR型の動力付きプレート5x‐yを備えたNikon TE 2000-E
・3CCDカメラ:Nikon DMX1200
g=G/(R+G+B)
ここで、R、GおよびBはそれぞれ、カメラ3によって得られた赤色、緑色および青色成分の値である。
・核の表面
・核の外周
・主方向
・画像における座標
・物体を最良にモデル化する楕円の短軸および長軸の長さ
・T. Pun, A new method for gray level picturethresholding using the entropy of the histogram, Signal Processing, 1980, vol.2, p.223-237、
・N. Otsu, A threshold selection method from gray level histograms, IEEE Transactions on systems, man, and cybernetics, vol.9, p.62-66.
を特に参照されたい。
・R. Gonzales, R. Woods, Digital Image Processing, Addison Wesley, 1993, p. 443-458
・0. Lezoray, Histogram and watershed based segmentation of color images, Proceedings of CGIV 2002, April 2002, p. 358-362
を参照されたい。
細胞の成長は、細胞成長に係わる特有のコード(codes)を構成する因子の組み合わせに依存する。生体外細胞培養のために必要な要素の大部分は、既知であり、容易に入手可能である。問題は、それらのコードを構成する要素の組み合わせを定めることにある。
・マルチウェルボックスの種類:12ウェルを有するマルチウェルボックスを2つ(TPP)
・基質:ゼラチン
・密度:5000個の細胞/ウェル
・培地の交換:2002年5月24日、2002年5月27日、2002年5月29日 2002年5月31日
・培養期間:7日間
・ギムザ染色:
画像を、本発明による装置を用いて取得し、詳しくは例として挙げた装置を用いて取得する。
分子の毒性学的プロファイルを決定することは、治療を行うために欠くことのできないプロセスである。細胞系が、この観点において有用なツールを提供する。
・マルチウェルボックスの種類:96ウェルを有するマルチウェルボックスを2つ(TPP)
・密度:2500個の細胞/ウェル
・ロバスタチン(Lovastatine)、セリバスタチン(Cerivistatine)、アトルバスタチン(Atorvastatin)、プラバスタチン(Pravastatine)、フルバスタチン(Fluvastatine)またはシンバスタチン(Simvastatine)を0、0.01、0.05、0.1、0.5および1gMの濃度で含む標準の培養培地
・7月11日:培地の交換
・7月13日:染色。培養期間:5日間
培地吸引の後、細胞をPBSで洗浄し、100%のエタノールで固定する。10分後に、細胞を水で洗浄し、ついで10%のギムザ溶液で10分間にわたって染色する。最後に、水で洗浄する。
画像を、本発明による装置で取得し、詳しくは例として挙げた装置で取得する。
ウイルスの機能性が、特定の標的細胞に対するウィルスの細胞病理学的能力によって検出される。ウイルス感染の結果の1つは、細胞の溶解である。
・6ウェルのマイクロプレートでの標的細胞の培養。
・ゲロース内のウイルス量の増加によるウイルス感染。このステップは数日間続く。
・固定および染色後の細胞溶解の範囲の明確化。
・細胞溶解の範囲の手動によるカウント。
・96ウェルのマイクロプレートでの標的細胞の培養。
・ウイルス量の増加による直接的な(ゲロースなしの)ウイルス感染。
・(アルコールによる)固定およびギムザ(あるいは、オルトカーミン(Orth carmine)、クレシルバイオレット(Cresyl violet)、サフラニンQ(Safrinine Q)、マラカイトグリーン(Malachite green)、クリスタルバイオレット(Violet crystal)、ヘマトキシリン(Hematoxyline)、エオシン(Eosine)、ギムザ(Giemsa)、ライト染色(Wright colouring)、メチルグリーン(Methyl Green)またはチオニン(Thionine))による染色。
・本発明による装置および分析プロセス、詳しくは例としてあげた装置による培養の分析を含む。
脂質の代謝は、重要なエネルギー源であり、特にCO2の生成に基づく筋組織または酸化の測定を、筋組織に対して直接実行でき、あるいは分離および培養された筋肉細胞に対して実行できる。
Claims (6)
- 細胞試料の分析のためのプロセスであって、
a)試料の細胞の核を染色するステップ、
b)試料の少なくとも1つのデジタル画像を取得するステップ、および
c)前記画像をデジタル的に分析するステップ
を含んでおり、
染色ステップa)が、DNAに非特異的な染色を行うことを特徴とするプロセス。 - 請求項1において、染色ステップa)が、ギムザ、オルトカーミン、クレシルバイオレット、サフラニンQ、マラカイトグリーン、クリスタルバイオレット、ヘマトキシリン、エオシン、ライト染色、メチルグリーンおよびチオニンで構成されるグループから選択された試薬による染色を含んでいることを特徴とするプロセス。
- 請求項1において、染色ステップa)が、ギムザによる染色を含んでいることを特徴とするプロセス。
- 培地を選択するためのプロセスであって、
・複数の細胞試料をそれぞれ異なる培地で培養するステップ、および
・請求項1〜3の何れか一項に記載のプロセスによって細胞試料を分析するステップ
を含んでいることを特徴とするプロセス。 - 物質の毒性を測定するためのプロセスであって、
・前記物質の存在下で細胞試料を培養するステップ、および
・請求項1〜3の何れか一項に記載のプロセスによって細胞試料を分析するステップ
を含んでいることを特徴とするプロセス。 - ウイルスの細胞病理学的特性を測定するためのプロセスであって、
・前記ウイルスの存在下で細胞試料を培養するステップ、および
・請求項1〜3の何れか一項に記載のプロセスによって細胞試料を分析するステップ
を含んでいることを特徴とするプロセス。
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