WO2005047896A2 - Analyse automatique d’echantillons cellulaires - Google Patents

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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a cell sample.
  • the invention also relates to a method for analyzing a digital image of a cell sample capable of being implemented by software.
  • the invention also relates to a device for analyzing cellular samples.
  • the industrial and cognitive applications of cells in culture are always increasing. Without being exhaustive, the following applications can be cited: - cells for the production of recombinant proteins, - cells for screening pharmacological molecules, - cells for diagnostic tests, - cells for constructing predictive toxicology, - cells for cell therapy of repair of reconstruction and regeneration. Many factors still make it difficult to fully exploit the potential of cells in culture.
  • Said cell samples may be either tissue samples from a biopsy, or primary cell cultures or cultures of cell lines and are not limited to a particular source.
  • the invention aims to contribute to satisfying this need and aims in particular to at least partially automate this analysis while allowing a simple procedure that is economical in terms of time and resources.
  • the present invention provides a method of analyzing a cell sample, comprising the steps of: a) staining the nuclei of the cells of the sample; b) acquisition of at least one digital image of the sample; c) digital analysis of said image.
  • the method comprises one or more of the following characteristics: - step a) of staining comprises cytochemical staining - step a) of staining comprises the use of an immunoenzymatic technique with at least one antibodies; - step a) of staining comprises the use of an immunoperoxidase technique with at least one antibody; - Step a) of coloring the nuclei of the cells is a non-DNA specific coloring; - between steps b) and c), the method comprises a step of decomposing the image according to a given color; - the image decomposition step is done according to either the color of the coloring, or according to the color complementary to the coloring; - the decomposition step is done according to one of the primary colors of the normalized colorimetric space Nrgb; - the coloring is magenta, the decomposition step being carried out according to the green component of the standardized colorimetric space; - prior to step c), the process comprises a step of binarizing the pixels of the image to bring out
  • the invention also proposes a method for analyzing a digital image of a cell sample capable of being implemented by software, each pixel of the image being defined by a level of intensity d '' at least one color component or black and white among a number of possible intensity levels greater than two, the method comprising the steps of: - binarization of the pixels of the image to bring out the nuclei of the cells on a background; and - analysis of the binarized image.
  • the method comprises one or more of the following characteristics: - each pixel of the digital image is defined by an intensity level of three components of different color, the method comprising prior to the binarization step a step of decomposing the image according to a given color associating with each pixel of the image a level of intensity among a number of possible levels greater than 2; - the decomposition is done according to one of the primary colors of the normalized colorimetric space Nrgb; - the decomposition step is carried out according to the green component of the standardized colorimetric space; - the binarization step is carried out by applying the Ridler algorithm to the image decomposed according to a given color; the method comprises, prior to the analysis step, a step of eliminating from the binarized image at least one object having a number of pixels less than a first predetermined threshold; the method comprises, prior to the analysis step, a step of dividing, in the binarized image, of at least one object having a number of pixels greater than a second predetermined threshold, into
  • the invention provides a device for analyzing cellular samples, comprising: - a plate for receiving a multiwell box of samples to be analyzed; - a microscope; a digital camera associated with the microscope, the camera providing images in the form of pixels, each pixel being defined by an intensity level of at least one color or black and white component from a number of higher possible intensity levels together ; - a system for moving the box placed in the stage relative to the microscope; a computer controlling the movement system and the camera and receiving digital images supplied by the camera, the computer further comprising software implementing the method of analysis of a digital image of a cell sample according to the previously described invention.
  • the computer is programmed to acquire a given number of images for at least one well of the box placed in the stage by command of the movement system and of the camera, and to analyze said images by application. said software.
  • the invention also provides a method for selecting a culture medium, characterized in that it comprises the stages of culture of several cell samples each in a different culture medium and then an analysis as previously described.
  • the invention proposes, according to another aspect, a method for measuring the toxicity of a substance, characterized in that it comprises the steps of culturing a cell sample in the presence of the substance and then an analysis as previously described.
  • the invention also provides a method for measuring the cytopathological characteristics of a virus characterized in that it comprises the steps of culturing a cell sample in the presence of the virus and then an analysis as previously described.
  • the invention also provides a process for the selection of pharmacological substances involved in diseases of overweight or obesity, characterized in that it comprises the stages of cell culture in the presence of the substances to be tested, the coloring of intracellular fatty acids, then the acquisition of at least one digital image of the sample and the digital analysis of said image.
  • the invention finally provides a method for selecting pharmacological substances involved in osteoporosis, characterized in that it comprises the steps of culturing cells in the presence of the substances to be tested, staining the cells, then acquiring at least a digital image of the sample and the digital analysis of said image.
  • FIG. 1 illustrates a multiwell box for cell sample used with the device according to the invention of FIG. 2.
  • FIG. 2 schematically illustrates the hardware part of a device according to the invention.
  • FIG. 3 illustrates an example image according to the green component of the normalized RGB space of a cell sample colored in magenta.
  • FIG. 4 represents the distribution of the pixels of an image according to their intensity.
  • Figures 5a and 5b illustrate the images obtained from the image of Figure 3 after binarization and selection of small objects in the first and large in the second.
  • FIG. 6 illustrates the image of the germs obtained after erosion of the objects of the image of FIG. 5b.
  • FIG. 7 illustrates the result of region growth from the seeds of Figure 6, also showing the original objects of Figure 5b.
  • FIG. 8 illustrates the final image obtained by combining the images of FIGS. 5a and 5b after splitting the contiguous nuclei.
  • FIG. 9 illustrates the results of a toxicity test carried out according to a method claimed by the invention.
  • FIG. 10 illustrates the results of a lipid density measurement carried out according to a method claimed by the invention.
  • FIG. 2 schematically illustrates the hardware part of a device according to the invention. It includes a computer (not shown), a microscope 2 coupled to a camera 3, a lighting system 4 and a stage 5 for receiving a multi-well box 1 containing cell samples to be analyzed.
  • the multiwell box 1 can be of a type known per se.
  • the wells of a box 1 all have the same section.
  • An example of a multiwell box 1 having 12 wells is illustrated in FIG. 1.
  • the wells are, in this case, regularly arranged in four columns, each having three wells.
  • it may be a multi-well box 1 having 96 wells in which case the wells have a lower section and are regularly arranged in 12 columns each having 8 wells.
  • Each well is designed to receive a cell sample to be analyzed.
  • the microscope 2 can be an optical microscope known per se.
  • the device comprises a motorization making it possible to position the objective 2a of the microscope 2 in front of any of the wells of the dish and therefore to observe the sample contained in the corresponding well.
  • microscope 2 is fixed horizontally and its observation axis is vertical - z axis - while the stage 5 is motorized to move the box 1 in a horizontal plane xy in front of the objective 2a of the microscope 2.
  • the device also includes a motorization enabling the focal point of microscope 2 on the sample in the selected well.
  • the plate 5 is fixed vertically while the objective 2a is motorized to be moved vertically along the axis z.
  • the microscope 2 is preferably of the inverted type.
  • the objective 2a of the microscope 2 is placed under the box 1 and observes the sample contained in the well placed in front of its objective 2a through the bottom of the box 1.
  • the box 1 is made of a material transparent which can advantageously be a plastic material.
  • the use of an inverted type microscope 2 makes it possible to comply with the focal distance for focusing the microscope on the sample contained in the well. On the contrary, in the case of observation from above the box, compliance with the focal distance may require the penetration of the objective 2a of the microscope 2 into the well, which is generally excluded because of the size of objective 2a.
  • the camera 3 makes it possible to acquire in digital form the image of the sample provided by the microscope 2.
  • the camera 3 supplies the digital image to the computer via any suitable link 3a.
  • the camera 3 is preferably of the color type coding for each pixel three primary colors on a certain number of intensity levels, preferably at least 16 levels for each component so that the nuclei of the cells are sufficiently distinguished from the background and from the cytoplasm.
  • the camera 3 can advantageously be of the CCD or tri-CCD type providing a digital color image, for example of the conventional type providing the R, G and B components of each pixel with the intensity of the component coded on 256 levels, and therefore making it possible to code 256 colors.
  • the lighting system 4 illuminates the well of the box 1 located in front of the objective 2a of the microscope 2. In this case, the lighting is carried out from above the box 1. In other words, the microscope 2 observes the samples contained in box 1 in transmitted light.
  • the lighting system 4 can advantageously comprise filters making it possible to select a given type of light as a function of the nature of the sample to be analyzed.
  • the intensity of the lighting can be adjustable to select a given intensity according to the nature of the sample to be analyzed.
  • the exposure time and the aperture of the camera 3 to acquire an image supplied by the microscope 2 can also be variable and selected according to the nature of the sample to be analyzed.
  • the computer can control all of the elements described using suitable control software.
  • the computer can control the movement of the stage 5, the focal focus and the magnification of the microscope 2 and the camera 3.
  • the computer controls the triggering of the shooting as well as the settings exposure time and diaphragm.
  • the adjustment of the lighting system 4 is possibly manual, since the lighting intensity and the selected filter (s) are generally the same for all the wells of the same box 1 and therefore do not require intervention during successive analysis of all the wells in the box.
  • the lighting system 4 can advantageously be controlled by the computer, which allows more complete automation and avoids possible manual adjustment errors concerning the light intensity or the selected filter or filters.
  • the following commercially available equipment can be used: - microscope 2: Nikon TE 2000-E with an xy motorized stage 5 of the PRIO type; - 3 CCD camera: Nikon DMX 1200.
  • the computer can be of a conventional type such as a PC compatible with the input / output interfaces required to control the device and receive digital images from camera 3. Conventionally, it also includes user interfaces such as a keyboard and display screen.
  • the software for controlling the microscope 2, the camera 3, the lighting system 4 and the stage 5 can be the LUCIA-G software from the company Laboratory Imaging (Czech Republic).
  • the fixing of the cells also makes it possible to freeze their distribution in the sample for the sake of reliability of the analysis. in the case where distinct zones of the sample are observed successively under a microscope 2.
  • the cells are colored to reveal the naturally translucent nuclei.
  • colorings it is advantageous to use cytochemical staining in particular after having resorted to an alcoholic fixation. Cytochemistry dyes have the advantage of simplicity of implementation, robustness, a good signal to noise ratio and very good conservation.
  • the analyzes can be done simply in white light.
  • alcoholic fixation it is advantageous because it constitutes a form of rapid fixation, which does not interfere with the coloring techniques.
  • nuclei allows the device of the invention to acquire images of the sample and automatically process these to determine for example the number of nuclei in the sample, their morphology and characterize their distribution. Consequently, it also makes it possible to quantify the number of cells in the sample from the number of nuclei observed.
  • the majority of mammalian cells have only one nucleus.
  • several wells from box 1 can contain samples cultivated under identical conditions. Thus, account may be taken of the variations intrinsic to the biological and experimental systems between samples of the same condition. This allows in particular to average the analyzes made on these wells and therefore to have a more reliable result. Simply put, it can be agreed that each well column in box 1 is dedicated to the same culture condition.
  • the number of wells containing samples of the same condition in other words, the number of wells actually used in each column in our example - can be chosen according to the admissible error rate for the analysis result, this rate decreasing with increasing number of wells with the same culture condition.
  • control and analysis software controls the hardware part of the device by means of the aforementioned control software and performs the analysis of the digital images supplied by the camera 3.
  • an operator places in the plate 5 a multi-well box 1 containing cell samples to be analyzed in his wells.
  • the computer requests the operator to indicate the type of cell samples to be analyzed. This can be done by operator choice in a predefined catalog of types proposed by the computer. The type of sample takes into account both the type of cells to be analyzed and the type of histological stains applied to them.
  • the computer requests the operator to indicate the type of box 1 placed in the platinum 5.
  • automatic recognition of the type of box 1 can be provided by the device, for example using a color mark specific to the type of box and placed at a predetermined location thereof.
  • the computer controls the stage 5 to observe the mark under a microscope 2 and provide the corresponding digital image to the computer by means of the camera 3.
  • the computer determines the type of box 1 concerned. As indicated, it can be provided that the dish 1 has, for each culture condition, a given number of wells presenting samples of this culture condition. This number can be left to the operator's choice to allow him to select the acceptable analysis error rate. In this case, the computer requests the operator to indicate this number to him.
  • the topology for distributing samples of the same condition in the wells of box 1 is preferably predefined to avoid the operator having to supply it to the computer.
  • the computer adjusts the lighting of the lighting system 4 according to the type of cellular samples previously selected by the operator. Otherwise, it is the operator who adjusts the lighting system 4 if it is not controlled by the computer. In this case, the computer can optionally indicate the settings to be made.
  • the lighting system 4 does not include selectable filters and / or intensity adjustment. In particular, it can be provided that the lighting is always the same regardless of the type of sample concerned, for example white light.
  • the computer acquires images of the samples to be analyzed. For this, it successively places the wells of the box 1 containing the samples in front of the objective 2a of the microscope 2 by controlling the stage 5. For each well, the computer takes a predetermined number N of distinct images of the sample by camera 3, each time shifting the well in front of the lens
  • the computer controls the focal point of the microscope 2. It also adjusts the diaphragm and the exposure time of the camera 3 as well as the magnification of microscope 2, these settings can be dependent on the type of sample selected.
  • These digital images are transmitted to the computer as they are acquired.
  • the computer receives the values of the R, G and B components for each pixel of an image, the intensity of each being coded on 8 bits and therefore providing 256 intensity levels for each component.
  • the computer preferably stores these images on its hard drive.
  • the N images are preferably written inside the well in order to prevent the images from comprising parts outside the well. Otherwise, the analysis of the images would require additional processing to distinguish the interior of the well from the exterior.
  • the N images can be taken at predetermined positions of the sample or at random positions.
  • each image covers an area of the sample which is specific to it and which does not cover all or part of other images so as to avoid redundancy which would reduce the representativeness of the images acquired in relation to the whole of the sample.
  • the computer breaks down each color image into an image according to a given unique color which provides good distinction between the objects to be analyzed - the nuclei - and the background of the image.
  • the unique color in which each image is broken down depends on the type of sample to be analyzed, and more particularly on the histological staining performed.
  • the decomposition of the image can be done either according to the color of the histological coloring, or according to the color complementary thereto.
  • the computer it is advantageous for the computer to decompose each color image into an image according to the green component of the normalized RGB space (conventionally noted Nrgb).
  • Nrgb the normalized RGB space
  • the normalized RGB space provides better discrimination compared to the R, G, B components provided by the camera because the normalized space is less sensitive to variations in brightness.
  • FIG. 3 illustrates an example image according to the green component of the normalized RGB space of a cell sample colored in magenta. The lower the intensity level, the more the representation of the pixel is dark. Thus, the pixels of the cores have a significantly lower intensity level compared to the background pixels which have a high intensity level.
  • the computer instead of decomposing each image according to a component of another color space, the computer can retain each image according to one of the components R, G, B supplied by the camera 3, for example the image according to the component V in the case of a cytochemistry staining in magenta, although the distinctiveness is less.
  • the camera 3 provides black and white images instead of being in color in which case this fourth step is omitted.
  • the computer provides a binarized version of each image from the fourth step, discriminating between the nuclei and the background.
  • an intensity threshold is defined to discriminate the pixels considered to belong to the nuclei of the pixels considered to belong to the background.
  • the computer compares the intensity of each pixel in the image from the fourth step with this threshold and assigns it a first value - 0 - or a second value - 1 - depending on the result of the comparison.
  • the value '1' corresponds to the pixels of nuclei and '0' to the rest.
  • the computer determines this threshold each time rather than to apply a predetermined fixed value of this threshold for a given type of staining of cytochemistry, given the variability of staining of the nuclei. In other words, it is preferable that the computer determines this threshold specifically for each image.
  • the computer can implement any suitable technique known per se to automatically determine such a threshold. The technique applied by the computer may depend on the type of sample.
  • the computer can in particular apply to the image resulting from the fourth step an algorithm implementing the iterative method of Ridler which is known per se. This algorithm gives an excellent result in the case of a histogram of bi-modal distribution of pixels according to their intensity.
  • the distribution is bi-modal in the case where only the nuclei of the cells are stained by histological staining.
  • FIG. 4 represents such a histogram for the image of the cell sample in FIG. 3.
  • the abscissa axis represents the light intensity coded in 256 levels and the ordinate axis the number of pixels.
  • the distribution is tri-modal. This may be the case when the cytoplasm of the cells is also colored, but to a lesser degree than the nuclei, during histological staining.
  • the threshold can be determined by two successive applications of the Ridler algorithm. The first application provides the threshold for discriminating the background from the rest: nucleus and cytoplasm in our example.
  • a second application of the algorithm to the part of the histogram comprising only the remainder, that is to say the part of histogram limited to this threshold makes it possible to provide a second threshold making it possible to discriminate the nuclei from all the rest: both the background and the cytoplasm in our example.
  • the fact that the computer can apply the Ridler algorithm once or twice may depend on the type of samples. But it is preferable that the computer determines itself - in a manner known per se - whether an image has a bi-modal or tri-modal distribution in order to apply either once or twice the Ridler algorithm. As mentioned, it is preferable that the computer determines this threshold for each image.
  • the computer determines this threshold for a single image of a well and also uses it for the other images of this well, or even for the images of the other wells having samples of the same condition, or even ultimately for all the images relating to the wells of the same box 1. It is preferable that, in a sixth step, the computer eliminates small objects from the binarized image because they do not correspond to nuclei , but to artifacts. For this, the computer can simply count the number of pixels of each object and eliminate it in the case where this number is less than a predetermined number experimentally, for example 50 pixels for a 150-fold magnification of the microscope 2. This predetermined number is advantageously a function of the type of cell samples. In our example, eliminating an object consists in placing the pixel value of the object at 'O'.
  • the computer can advantageously carry out processing on the image to distinguish possible contiguous nuclei from large nuclei.
  • the computer can create two separate images from the binarized image resulting from the sixth step.
  • the computer retains in the first image all the objects of the binarized image each corresponding to an isolated nucleus due to the small size of the object.
  • the computer retains in the second image the larger objects which can in fact correspond either to a large isolated nucleus, or to several nuclei joined together.
  • the computer places in the first image only the objects having a size smaller than a predetermined value, for example 450 pixels for a magnification of 150 times of the microscope 2, and it places in the second image the other objects.
  • FIGS. 5a and 5b respectively illustrate the first image and the second image obtained in the case of the sample image of FIG. 3.
  • the computer then processes the second image to divide the objects corresponding to several nuclei. Such an object is divided into as many parts as there are nuclei it represents.
  • the computer can advantageously implement the method known per se called the watershed (or "watershed" in English). For this, from a copy of the second image, the computer performs ultimate erosion of each object to provide its germ (s). Each germ corresponds to a cell nucleus.
  • FIG. 6 illustrates the image of the germs obtained after erosion of the objects of the image of FIG. 5b.
  • the computer then proceeds to region growth from the germs, the growth being stopped when two regions meet.
  • Figure 7 illustrates the result of the region growth by showing the initial objects of Figure 5b.
  • the borders between regions are then used to segment the objects of the second image.
  • the computer places the border pixels at the background value in the second image; in our example, it assigns the value '0' to these pixels. Consequently, the objects are divided accordingly into as many parts as there are seeds obtained by ultimate erosion.
  • the second image after splitting the nuclei if necessary is combined with the first image which contains the objects of small sizes deemed to each correspond to an isolated nucleus.
  • FIG. 8 illustrates the resulting image obtained for the sample image of FIG. 3 with the arrows referenced 'S' which point to some segmentations resulting from the seventh step.
  • the computer proceeds to the analysis of the objects contained in the image resulting from the seventh step by image analysis techniques known per se. In particular, it counts the number of objects contained in the image, which provides the number of nuclei contained in the sample since each object corresponds to a nucleus.
  • the computer can also determine for each core one or more of the following information: - the surface of the core; - the perimeter of the nucleus; - the main management; - the coordinates in the image; - the length of the minor axis and the major axis of the ellipse which best models the object. The computer can obviously save these results in a file.
  • the computer can determine information relating to the complete sample of a well from the data obtained for all the images of this well. Thus, he can estimate the total number of nuclei contained in the well according to the number of nuclei contained in the N images acquired from this well in view of the predetermined ratio between the partial surface of the well covered by the N images and the total surface of the well. It is also possible to determine the cell density by calculating the number of nuclei present as previously described and by dividing this number by the surface of the image.
  • the computer can also establish statistics on each well concerning the other determined characteristics, in particular those listed above. In the case of a plurality of wells containing samples of the same condition, the computer can average the information relating to these wells to reduce the error rate.
  • the computer can also calculate the number of cell divisions and the time it takes for the number of cells to double if the operator provides the number of cells originally seeded in the wells of box 1 and the culture time considering that the cell growth is exponential.
  • the computer can store, for example in the form of files, the results of the analysis as well as the images acquired and or obtained after processing according to the different stages of the process.
  • the method can be implemented with cytochemical dyes other than magenta.
  • the dye can be determined experimentally, providing good distinctiveness of the nuclei compared to the rest.
  • the lighting setting if provided and the camera settings - exposure time and aperture of the diaphragm - shooting can also be determined experimentally for each type of sample in order to provide images presenting a good contrast of the nuclei with respect to the background.
  • the number N of images taken for the sample from a well is at least one.
  • the larger the number N the larger the area of the sample covered by the images and the lower the information estimated by the computer for a given well.
  • This number N can be determined experimentally to obtain an acceptable analysis error rate.
  • 300 separate images of each well of a box 1 to 12 wells are acquired - each well having a diameter of 2.159 cm for 1 well and an area of 3.66 cm 2 with a 150-fold magnification of the microscope 2. These 300 images then cover approximately 90% of the total surface of the well.
  • the method of the invention can be implemented on the basis of the Image J® software made available by the National Ihstitute of Health in the United States.
  • nuclei marked with histological dyes advantageously makes it possible to analyze with the device of the invention in a sensitive and quantitative manner the consequences of the different culture conditions on cell density and therefore on cell growth. With these quantitative results, there may be associated a digital image of the cellular samples provided by the device thus obtained, which then constitutes an archived and reference document. This way of proceeding makes it possible to configure experimental approaches and therefore to increase traceability.
  • An advantageous embodiment uses a nuclear dye such as Giemsa. allowing a staining of the cell nucleus which is not a staining of DNA.
  • Non-DNA specific nuclear reagents can be used and are well known to those skilled in the art, such as Carmin d'Orth, Cresyl violet, Safrinine Q, Malachite green, Violet crystal, Hematoxyline, Eosine , Wright's dye, Methyl green or Thionin. This results in greater homogeneity of the signal originating from the nucleus and an absence of variation in the intensity of the signal as a function of the stages of DNA replication during the cell cycle. It is also possible to use the device of the invention and the method implemented with staining techniques other than cytochemical staining.
  • specific stains of the cells can be used, in which case it is advantageous to use immunoenzymatic techniques with antibodies characterized by their specificity and by the existence of a large choice of specific antibodies.
  • immunoperoxidase techniques can be used, the results of which can be observed under white light.
  • the use of these specific colorations makes it possible in particular to analyze with the device of the invention, either cell cycle parameters, or differentiation parameters.
  • the number of cells in S phase can be determined after labeling the cells with BrdU and recognition of the positive nuclei using an antibody directed against BrdU.
  • Antibodies directed against various proteins involved in cell cycle control such as PCNA, P21, PI 6 and cyclin A, can also be used.
  • the differentiation analysis can be performed using antibodies directed against specific transcription factors of a particular differentiating state.
  • antibodies are used against the specific transcription factors of muscle tissue, the proteins of the MyoD family.
  • Cell staining can also be obtained by the use of fluorescent markers. Vital dyes like bisbenzimide, which bind with high affinity to AON, make it possible to follow the growth on living cells and to analyze modifications of the organization of nuclear DNA which are associated with apoptosis.
  • the fluorescent markers associated with antibodies directed against membrane proteins makes it possible to count the cells possessing this markers.
  • the present invention is not limited to the examples and to the embodiment described and shown, but it is susceptible of numerous variants accessible to those skilled in the art.
  • the acquired images can each be processed completely according to steps four to eight before proceeding to the complete processing of the following acquired image. Furthermore, it is not necessary to wait until all the N images have been acquired in the third step to start processing those already acquired.
  • Concerning the iterative method of Ridler one can refer to the article by Ridler, Calvard, “Picture Thresholding Using an Interative Selection Method”, IEEE transactions on Systems, Man and Cybernetics, 1978. More generally concerning the determination of threshold (in English "thresholding”), we can in particular refer to: - T. Pun, "A new method for gray level picture thresholding using the entropy of the histogram", Signal Processing, 1980, vol. 2, p. 223-237; - N.
  • a first example concerns the construction of a predictive toxicity cell test implemented in the form of a high throughput screening machine.
  • the consequences of toxicity are multiple. The most frequent are modifications of the parameters of cell growth, cell death by apoptosis or by necrosis, morphological and functional modifications.
  • the culture then the automated analysis according to the invention of cells cultured in multiple plates of for example 96 wells - which makes it possible to multiply the number of analyzes - makes it possible to provide predictive toxicological systems with high throughput.
  • image analysis it is possible to extract quantitative data on cell growth, cell death, morphology and cellular functions.
  • Ex vivo culture systems make it possible to control the cellular environment and to use specific cells.
  • the use of cells from different tissues - such as liver, muscle, skin, nervous system, vessels - of the body allows to test the toxicity of molecules on these different tissues and therefore to build specific toxicological tests.
  • the method according to the invention makes it possible to analyze the role of the presence of growth factor on cell density and on nuclear morphology.
  • the steps are as follows.
  • the different cell types are cultivated on multi-wells of 12 to 96 wells under different culture conditions to analyze the consequences of these experimental conditions, either on cell growth, or on cell cycle parameters and or on the frequency of differentiation.
  • the cells are fixed, then stained.
  • nuclear histological stains such as Giemsa after alcoholic fixation.
  • Other histological dyes that can be used are the Carmine Orth,
  • the cells are amplified in culture in the presence of human serum (PAA laboratory) and then seeded under the various conditions described. Growth factors can be added to the culture medium to promote cell growth. The cells are seeded in multiples of 12.
  • the substrate used is gelatin and the seed density is 5000 cells per well.
  • Giemsa staining After aspiration of the culture medium, the cells are washed with PBS and then fixed with 100% ethanol. 10 minutes later the cells are washed with water and then stained with a 10% Giemsa solution for 10 minutes. The final step is washing with water.
  • Table 1 results of the selection of media XI, X2, X3 and X4 are different additives based on mixtures of growth factors.
  • statins recent data indicates that the subjects presenting muscular attacks show neither correlations between the plasma level of this pharmacological agent and the toxic attack, nor of elevation of CPK. In these cases histology reveals in the muscle tissue modifications of the mitochondria (swelling) and accumulations of lipid droplets.
  • Giemsa coloring After aspiration of the culture medium, the cells are washed with PBS and then fixed with 100% ethanol. 10 minutes later the cells are washed with water and then stained with a 10% Giemsa solution for 10 minutes. The final step is washing with water.
  • Shooting The images are taken by a device according to the invention, and more particularly with the material given as an example. The digital processing is presented in Figure 9. This figure reveals the high toxicity of Cerivisatin. This statin class molecule has caused a very large number of toxic muscle accidents. This experiment shows that the combination of adapted cell type with automated analysis systems makes it possible to develop specific toxicological tests. The experiments being carried out in 96-well multi-well plates allow the development of high-throughput analysis.
  • viruses The functionality of viruses is detected by their cytopathological capacity on specific target cells.
  • One of the consequences of viral infection is cell lysis. This property is used for a test which makes it possible to detect the number of functional viruses. Briefly, the different stages of this test are: - the culture in micro-plates of 6 wells of the target cells - the viral infection by growing virus in the agar. This stage can last several days - the revelation of the lysis ranges after fixing and staining - the manual counting of these lysis ranges.
  • the main limitations of this test are the complexity of the different stages depending on know-how.
  • toxicology tests we use the 96 microplate culture associated with image analysis to count the cells and thus quantify the results.
  • the different stages of this test are: - the culture of the target cells in a 96-well microplate - direct viral infection (without agar) by increasing amounts of virus - fixation (alcoholic) and staining with Giemsa (or alternatively
  • this cell test makes it possible to screen for pharmacological agents involved in bone formation (osteoporosis).

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Abstract

Le procédé d’analyse d’un échantillon cellulaire, comprend les étapes de : a) coloration des noyaux des cellules de l’échantillon ; b) acquisition d’au moins une image numérique de l’échantillon ; c) analyse numérique de ladite image caractérisé en ce que l’étape a) de coloration des noyaux des cellules est une coloration non spécifique à l’ADN. En application de ce procédé, l’invention propose aussi un procédé de sélection d’un milieu de culture, un procédé de mesure de la toxicité d’une substance et un procédé de mesure des caractéristiques cytopathologiques d’un virus. L’invention porte aussi sur un procédé de sélection de substances pharmacologiques intervenant dans les maladies du surpoids ou de l’obésité et un procédé de sélection de substances pharmacologiques intervenant dans l’ostéoporose.

Description

ANALYSE AUTOMATIQUE D'ECHANTILLONS CELLULAIRES
La présente invention concerne un procédé d'analyse d'un échantillon cellulaire. L'invention concerne aussi un procédé d'analyse d'une image numérique d'un échantillon cellulaire apte à être mis en œuvre par un logiciel. L'invention concerne encore un dispositif d'analyse d'échantillons cellulaires. Les applications industrielles et cognitives des cellules en culture sont toujours croissantes. Sans être exhaustif, on peut citer les applications suivantes : - cellules pour la production de protéines recombinantes, - cellules pour cribler des molécules pharmacologiques, - cellules pour des tests diagnostiques, - cellules pour construire une toxicologie prédictive, - cellules pour la thérapie cellulaire de réparation de reconstruction et régénération. De nombreux facteurs rendent encore difficiles la pleine exploitation du potentiel des cellules en culture. Ces facteurs sont entre autres : - le caractère manuel de trop nombreuses opérations techniques rendant la notion de savoir-faire extrêmement critique, - l'utilisation de nombreux facteurs mdéfinis entrant dans les milieux de culture, et - la pauvreté qualitative et quantitative de systèmes cellulaires les plus diffusés. Ces raisons expliquent qu'à l'heure actuelle les techniques de culture cellulaire sont plus proches d'une somme de savoir-faire que d'une technologie pouvant être industrialisée. La quantification du nombre de cellules et de leur analyse morphologique est un élément critique pour le suivi cellulaire. Actuellement, pour une grande part, cette activité est manuelle et dépendant d'un savoir-faire de l'opérateur. Par ailleurs, les méthodes usuelles pour déterminer le nombre de cellules attachées, sont associées à des étapes de détachement ou de lyse cellulaire. Ces techniques font, de ce fait, disparaître toutes notions morphologiques et conduisant à des pertes d'informations importantes. Ainsi, il existe un besoin de faciliter et d'accélérer l'analyse quantitative et/ou qualitative - telle que l'analyse de morphologie ou de répartition - des noyaux dans les échantillons cellulaires. Lesdits échantillons cellulaires pouvant être soit des échantillons de tissu provenant d'une biopsie, soit des cultures primaires de cellules soit des cultures de lignées cellulaires et ne se limitent pas à une provenance particulière. L'invention a pour but de contribuer à satisfaire ce besoin et vise notamment à automatiser au moins partiellement cette analyse tout en permettant une procédure simple et économe en temps et en moyens. A cette fin, la présente invention propose un procédé d'analyse d'un échantillon cellulaire, comprenant les étapes de : a) coloration des noyaux des cellules de l'échantillon ; b) acquisition d'au moins une image numérique de l'échantillon ; c) analyse numérique de ladite image. Suivant des modes de réalisation préférés, le procédé comprend une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : - l'étape a) de coloration comprend une coloration cytochimique - l'étape a) de coloration comprend l'utilisation d'une technique immunoenzymatique avec au moins un anticorps ; - l'étape a) de coloration comprend l'utilisation d'une technique d'immunoperoxidase avec au moins un anticorps ; - l'étape a) de coloration des noyaux des cellules est une coloration non spécifique à l'ADN ; - entre les étapes b) et c), le procédé comprend une étape de décomposition de l'image suivant une couleur donnée ; - l'étape de décomposition de l'image est faite suivant soit la couleur de la coloration, soit suivant la couleur complémentaire à la coloration ; - l'étape de décomposition est faite suivant une des couleurs primaires de l'espace normalisé de colorimétrie Nrgb ; - la coloration est magenta, l'étape de décomposition étant réalisée suivant la composante verte de l'espace normalisé de colorimétrie ; - préalablement à l'étape c), le procède comprend une étape de binarisation des pixels de l'image pour faire ressortir les noyaux des cellules sur un fond ; - l'étape de binarisation est effectuée par application de l'algorithme de Ridler sur l'image décomposée suivant ladite couleur donnée ; - préalablement à l'étape c), le procédé comprend une étape d'élimination dans l'image binarisée d'au moins un objet ayant un nombre de pixels inférieur à un premier seuil prédéterminé ; - préalablement à l'étape c), le procédé comprend une étape de division, dans l'image binarisée, d'au moins un objet présentant un nombre de pixels supérieur à un deuxième seuil prédéterminé, en autant d'objets que de noyaux de cellules correspondant à cet objet ; - l'étape de division comprend l'érosion ultime dudit au moins un objet pour fournir des germes, puis croissance desdits germes pour déterminer des lignes de division pour l'objet par application de la méthode dite ligne de séparation des eaux ; - l'étape c) comprend le comptage des objets de l'image. Selon un autre aspect, l'invention propose aussi un procédé d'analyse d'une image numérique d'un échantillon cellulaire apte à être mis en œuvre par un logiciel, chaque pixel de l'image étant défini par un niveau d'intensité d'au moins une composante de couleur ou noir et blanc parmi un nombre de niveaux d'intensité possibles supérieurs à deux, le procédé comprenant les étapes de : - binarisation des pixels de l'image pour faire ressortir les noyaux des cellules sur un fond ; et - analyse de l'image binarisée. Suivant des modes de réalisation préféré, le procédé comprend une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : - chaque pixel de l'image numérique est défini par un niveau d'intensité de trois composantes de couleur différente, le procédé comprenant préalablement à l'étape de binarisation, une étape de décomposition de l'image suivant une couleur donnée associant à chaque pixel de l'image un niveau d'intensité parmi un nombre de niveaux possibles supérieur à 2 ; - la décomposition est faite suivant une des couleurs primaires de l'espace normalisé de colorimétrie Nrgb ; - l'étape de décomposition est réalisée suivant la composante verte de l'espace normalisé de colorimétrie ; - l'étape de binarisation est effectuée par application de l'algorithme de Ridler sur l'image décomposée selon une couleur donnée ; - le procédé comprend, préalablement à l'étape d'analyse, une étape d'élimination dans l'image binarisée d'au moins un objet ayant un nombre de pixels inférieur à un premier seuil prédéterminé ; - le procédé comprend, préalablement à l'étape d'analyse, une étape de division, dans l'image binarisée, d'au moins un objet présentant un nombre de pixels supérieur à un deuxième seuil prédéterminé, en autant d'objets que de noyaux de cellules correspondant à cet objet ; - l'étape de division comprend l'érosion ultime dudit au moins un objet pour fournir des germes, puis croissance desdits germes pour déterminer des lignes de division pour l'objet par application de la méthode dite ligne de séparation des eaux : - l'étape d'analyse comprend le comptage des objets de l'image. Selon encore un autre aspect, l'invention propose un dispositif d'analyse d'échantillons cellulaires, comprenant : - une platine de réception d'une boîte multipuits d'échantillons à analyser ; - un microscope ; - une caméra numérique associée au microscope, la caméra fournissant des images sous forme de pixels, chaque pixel étant défini par un niveau d'intensité d'au moins une composante de couleur ou noir et blanc parmi un nombre de niveaux d'intensité possibles supérieurs à deux ; - un système de déplacement de la boite placée dans la platine relativement au microscope ; - un ordinateur commandant le système de déplacement et la caméra et recevant des images numériques fournies par la caméra, l'ordinateur comprenant en outre un logiciel mettant en œuvre le procédé d'analyse d'une image numérique d'un échantillon cellulaire selon l'invention précédemment décrite. Selon un mode de réalisation préféré, l'ordinateur est programmé pour acquérir un nombre donné d'images pour au moins un puits de la boîte placée dans la platine par commande du système de déplacement et de la caméra, et pour analyser lesdites images par application dudit logiciel. Selon un autre aspect, l'invention propose aussi un procédé de sélection d'un milieu de culture caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture de plusieurs échantillons cellulaires chacun dans un milieu de culture différent puis une analyse comme précédemment décrit. L'invention propose selon un autre aspect un procédé de mesure de la toxicité d'une substance caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture d'un échantillon cellulaire en présence de la substance puis une analyse comme précédemment décrit. Selon encore un autre aspect, l'invention propose aussi un procédé de mesure des caractéristiques cytopathologiques d'un virus caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture d'un échantillon cellulaire en présence du virus puis une analyse comme précédemment décrit. L'invention propose aussi un procédé de sélection de substances pharmacologiques intervenant dans les maladies du surpoids ou de l'obésité caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture de cellules en présence des substances à tester, la coloration des acides gras intracellulaires, puis l'acquisition d'au moins une image numérique de l'échantillon et l'analyse numérique de ladite image. L'invention propose finalement un procédé de sélection de substances pharmacologiques intervenant dans l'ostéoporose caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture de cellules en présence des substances à tester, la coloration des cellules, puis l'acquisition d'au moins une image numérique de l'échantillon et l'analyse numérique de ladite image.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui suit d'un mode de réalisation préféré de l'invention, donnée à titre d'exemple et en référence au dessin annexé. La figure 1 illustre une boîte multipuits pour échantillon cellulaire utilisée avec le dispositif selon l'invention de la figure 2. La figure 2 illustre schématiquement la partie matérielle d'un dispositif selon l'invention. La figure 3 illustre un exemple d'image selon la composante verte de l'espace normalisé RGB d'un échantillon cellulaire coloré en magenta. La figure 4 représente la répartition des pixels d'une image suivant leur intensité. Les figures 5a et 5b illustrent les images obtenues à partir de l'image de la figure 3 après binarisation et sélection des objets de petite taille dans la première et de grande taille dans la deuxième. La figure 6 illustre l'image des germes obtenue après érosion des objets de l'image de la figure 5b. La figure 7 illustre le résultat de la croissance de région à partir des germes de la figure 6, en montrant également les objets initiaux de la figure 5b. La figure 8 illustre l'image finale obtenue par combinaison des images des figures 5a et 5b après scission des noyaux accolés. La figure 9 illustre les résultats d'un test de toxicité effectué selon un procédé revendiqué par l'invention. La figure 10 illustre les résultats d'une mesure de densité de lipides effectuée selon un procédé revendiqué par l'invention. La figure 2 illustre schématiquement la partie matérielle d'un dispositif selon l'invention. Il comprend un ordinateur (non représenté), un microscope 2 couplé à une caméra 3, un système d'éclairage 4 et une platine 5 pour recevoir une boîte multipuits 1 contenant des échantillons cellulaires à analyser. La boîte multipuits 1 peut être d'un type connu en soi. Généralement, les puits d'une boîte 1 ont tous une même section. Un exemple de boîte multipuits 1 présentant 12 puits est illustré par la figure 1. Les puits sont, dans ce cas, disposés régulièrement suivant quatre colonnes présentant chacune trois puits. Alternativement, il peut s'agir d'une boîte multipuits 1 présentant 96 puits auquel cas les puits ont une section inférieure et sont disposés régulièrement suivant 12 colonnes présentant chacune 8 puits. Chaque puits est prévu pour recevoir un échantillon cellulaire à analyser. Le microscope 2 peut être un microscope optique connu en soi. Le dispositif comprend une motorisation permettant de positionner l'objectif 2a du microscope 2 devant n'importe lequel des puits de la boîte et donc d'observer l'échantillon contenu dans le puits correspondant. Elle permet aussi de décaler l'objectif 2a devant un même puits dans le cas où il est souhaitable d'observer successivement une pluralité de zones distinctes de l'échantillon d'un même puits, le champ d'observation du microscope 2 ne couvrant qu'une petite partie de la surface d'un puits. Préférentiellement, le microscope 2 est fixe horizontalement et son axe d'observation est vertical - axe z - tandis que la platine 5 est motorisée pour déplacer la boîte 1 dans un plan horizontal x-y devant l'objectif 2a du microscope 2. Le dispositif comprend également une motorisation permettant la mise au point focale du microscope 2 sur l'échantillon dans le puits sélectionné. Préférentiellement, la platine 5 est fixe verticalement alors que l'objectif 2a est motorisé pour être déplacé verticalement suivant l'axe z. Par ailleurs, le microscope 2 est préférentiellement du type inversé. Autrement dit, l'objectif 2a du microscope 2 est placé sous la boîte 1 et observe l'échantillon contenu dans le puits placé devant son objectif 2a à travers le fond de la boîte 1. Pour cela, la boîte 1 est fait dans un matériau transparent qui peut avantageusement être une matière plastique.
L'utilisation d'un microscope 2 de type inversé permet le respect de la distance focale pour la mise au point du microscope sur l'échantillon contenu dans le puits. Au contraire, dans le cas de l'observation par le dessus de la boîte, le respect de la distance focale peut nécessiter la pénétration de l'objectif 2a du microscope 2 dans le puits, ce qui est généralement exclu en raison de la taille de l'objectif 2a. La caméra 3 permet d'acquérir sous forme numérique l'image de l'échantillon fournie par le microscope 2. La caméra 3 fournit l'image numérique à l'ordinateur via une liaison 3a quelconque adéquate. La caméra 3 est préférentiellement de type couleur codant pour chaque pixel trois couleurs primaires sur un certain nombre de niveaux d'intensité, de préférence au moins 16 niveaux pour chaque composante pour que les noyaux des cellules se distinguent suffisamment du fond et du cytoplasme. En fait, la caméra 3 peut avantageusement être du type CCD ou tri-CCD fournissant une^ image numérique en couleur, par exemple du type classique fournissant les composantes R, V et B de chaque pixel avec l'intensité de cifaque composante codée sur 256 niveaux, et permettant donc de coder 256 couleurs. Le système d'éclairage 4 éclaire le puits de la boîte 1 situé devant l'objectif 2a du microscope 2. En l'occurrence, l'éclairage est réalisé par le dessus de la boîte 1. Autrement dit, le microscope 2 observe les échantillons contenus dans la boîte 1 en lumière transmise. Le système d'éclairage 4 peut avantageusement comprendre des filtres permettant de sélectionner un type de lumière donné en fonction de la nature de l'échantillon à analyser. Similairement, l'intensité de l'éclairage peut être réglable pour sélectionner une intensité donnée en fonction de la nature de l'échantillon à analyser. Le temps de pose et l'ouverture de diaphragme de la caméra 3 pour acquérir une image fournie par le microscope 2 peuvent également être variables et sélectionnés en fonction de la nature de l'échantillon à analyser. Pour une automatisation complète du dispositif, il est avantageux que l'ordinateur commande tous les éléments décrits grâce à un logiciel de pilotage adéquat. Ainsi, l'ordinateur peut commander le déplacement de la platine 5, la mise au point focale et le grossissement du microscope 2 et la caméra 3. Concernant la caméra 3, l'ordinateur commande le déclenchement de la prise de vue ainsi que les réglages du temps de pose et de diaphragme. Le réglage du système d'éclairage 4 est éventuellement manuel, car l'intensité d'éclairage et le ou les filtres sélectionnés sont généralement les mêmes pour tous les puits d'une même boîte 1 et ne nécessitent donc pas d'intervention au cours de l'analyse successive de l'ensemble des puits de la boîte. Néanmoins, le système d'éclairage 4 peut avantageusement être piloté par l'ordinateur, ce qui permet une automatisation plus complète et évite d'éventuelles erreurs de réglage manuel concernant l'intensité lumineuse ou le ou les filtres sélectionnés. A titre d'exemple, il peut être utilisé le matériel disponible dans le commerce suivant : - microscope 2 : Nikon TE 2000-E avec une platine 5 motorisée x-y du type PRIO ; - caméra 3 CCD : Nikon DMX 1200. L'ordinateur peut être d'un type classique tel qu'un compatible PC muni des interfaces entrées/sorties requises pour commander le dispositif et recevoir les images numériques de la caméra 3. De façon classique, il comprend aussi des interfaces utilisateurs telles que clavier et écran d'affichage. Le logiciel de pilotage du microscope 2, de la caméra 3, du système d'éclairage 4 et de la platine 5 peut être le logiciel LUCIA-G de la société Laboratory îmaging (République Tchèque).
Nous allons maintenant décrire la préparation des échantillons cellulaires à analyser qui sont placés dans les puits d'une boîte multipuits 1. Des cellules sont cultivées dans les puits de la boîte multipuits 1 dans différentes conditions de culture pour analyser les conséquences de ces conditions expérimentales par exemple sur la croissance cellulaire, sur des paramètres de cycle cellulaire ou sur la fréquence de différenciation. A la fin du temps expérimental, les cellules sont colorées et éventuellement fixées, l'analyse pouvant être pratiquée au choix sur des cellules vivantes ou fixées. Si les cellules sont fixées, on procède préférentiellement à leur fixation avant de procéder à leur coloration. La fixation des cellules stoppe l'évolution cellulaire des échantillons afin d'assurer que le temps expérimental défini soit respecté notamment dans le cas où l'analyse de l'échantillon n'intervient pas immédiatement à l'issue de ce temps. Par ailleurs, la fixation des cellules permet aussi de figer leur répartition dans l'échantillon dans un souci de fiabilité de l'analyse dans le cas où des zones distinctes de l'échantillon sont observées successivement au microscope 2. Les cellules sont colorées pour révéler les noyaux naturellement translucides. A cette fin, s'agissant des colorations , il est avantageux de recourir à une coloration de cytochimie notamment après avoir recouru à une fixation alcoolique. Les colorants de cytochimie présentent l'avantage de la simplicité de mise en œuvre, de la robustesse, d'un bon rapport signal sur bruit et de la très bonne conservation. De plus, les analyses peuvent se faire simplement en lumière blanche. Quant à la fixation alcoolique, elle est avantageuse car elle constitue une forme de fixation rapide, qui n'interfère pas avec les techniques de coloration.
Le fait de révéler les noyaux permet au dispositif de l'invention d'acquérir des images de l'échantillon et traiter automatiquement celles-ci pour déterminer par exemple le nombre de noyaux de l'échantillon, leur morphologie et caractériser leur distribution. Par voie de conséquence, il permet aussi de quantifier le nombre de cellules dans l'échantillon à partir du nombre de noyaux observés. La majorité des cellules de mammifères ne possèdent qu'un seul noyau. Pour une analyse plus fiable, plusieurs puits de la boîte 1 peuvent contenir des échantillons cultivés dans des conditions identiques. Ainsi, il peut être tenu compte des variations intrinsèques aux systèmes biologiques et expérimentales entre échantillons de même condition. Cela de permet notamment de moyenner les analyses faites sur ces puits et donc d'avoir un résultat plus fiable. De façon simple, il peut être convenu que chaque colonne de puits de la boîte 1 soit dédiée à une même condition de culture. Le nombre de puits contenant des échantillons d'une même condition - autrement dit, le nombre de puits effectivement utilisés dans chaque colonne dans notre exemple - peut être choisi en fonction du taux d'erreur admissible pour le résultat de l'analyse, ce taux diminuant avec l'augmentation du nombre d& puits avec une même condition de culture.
Nous allons maintenant décrire le procédé d'analyse mis en œuvre par un logiciel de commande et d'analyse exécuté par l'ordinateur du dispositif selon l'invention décrit précédemment. Ce logiciel de commande et d'analyse commande la partie matérielle du dispositif par le biais du logiciel de pilotage précité et réalise l'analyse des images numériques fournies par la caméra 3. Avant de lancer l'analyse d'échantillons par l'ordinateur, un opérateur place dans la platine 5 une boîte multipuits 1 contenant des échantillons cellulaires à analyser dans ses puits.
Dans une première étape, l'ordinateur sollicite l'opérateur pour que celui-ci indique le type des échantillons cellulaires à analyser. Cela peut être réalisé par choix de l'opérateur dans un catalogue prédéfini de types proposé par l'ordinateur. Le type d'échantillon prend en compte à la fois le type de cellules à analyser et le type de colorations histologiqu.es appliquées à celles-ci. Dans le cas où le dispositif est prévu pour fonctionner avec différents types prédéterminés de boîtes multipuits 1 tels que les boîtes 12 puits et 96 puits précités, l'ordinateur sollicite l'opérateur pour que celui-ci indique le type de boîte 1 placé dans la platine 5. Alternativement, il peut être prévu une reconnaissance automatique du type de boîte 1 par le dispositif par exemple à l'aide d'une marque de couleur spécifique au type de la boîte et placé à un endroit prédéterminé de celle-ci. L'ordinateur pilote la platine 5 pour faire observer la marque au microscope 2 et fournir l'image numérique correspondante à l'ordinateur par le biais de la caméra 3. En déterminant la couleur de la marque, l'ordinateur détermine le type de boîte 1 concerné. Comme indiqué, il peut être prévu que la boîte 1 ait, pour chaque condition de culture, un nombre de puits donné présentant des échantillons de cette condition de culture. Ce nombre peut être laissé au choix de l'opérateur pour lui permettre de sélectionner le taux d'erreur d'analyse acceptable. Dans ce cas, l'ordinateur sollicite l'opérateur pour qu'il lui indique ce nombre. La topologie de répartition des échantillons de même condition dans les puits de la boîte 1 est préférentiellement prédéfinie pour éviter à l'opérateur de devoir la fournir à l'ordinateur.
Dans une deuxième étape, si le dispositif le permet, l'ordinateur règle l'éclairage du système d'éclairage 4 en fonction du type d'échantillons cellulaires précédemment sélectionné par l'opérateur. A défaut, c'est l'opérateur qui règle le système d'éclairage 4 si celui-ci n'est pas commandé par l'ordinateur. Dans ce cas, l'ordinateur peut éventuellement olui indiquer les réglages à faire. Dans une variante simplifiée, le système d'éclairage 4 ne comprend pas de filtres sélectionnables et/ou de réglage d'intensité. En particulier, il peut être prévu que l'éclairage soit toujours le même quel que soit le type d'échantillon concerné, par exemple de la lumière blanche.
Dans une troisième étape, l'ordinateur procède à l'acquisition d'images des échantillons à analyser. Pour cela, il place successivement les puits de la boîte 1 contenant les échantillons devant l'objectif 2a du microscope 2 en commandant la platine 5. Pour chaque puits, l'ordinateur fait prendre un nombre prédéterminé N d'images distinctes de l'échantillon par la caméra 3 en décalant à chaque fois le puits devant l'objectif
2a par commande de la platine 5. L'ordinateur commande la mise au point focal du microscope 2. Il procède aussi au réglage du diaphragme et du temps de pose de la caméra 3 ainsi qu'au grossissement du microscope 2, ces réglages peuvent être fonction du type d'échantillon sélectionné. Ces images numériques sont transmises à l'ordinateur au fur et à mesure de leur acquisition. Dans l'exemple d'une caméra CCD ou tri-CCD classique à 2563 couleurs, l'ordinateur reçoit les valeurs des composantes R, V et B pour chaque pixel d'une image, l'intensité de chacune étant codée sur 8 bits et fournissant donc 256 niveaux d'intensité pour chaque composante. L'ordinateur stocke ces images de préférence sur son disque dur. Les N images sont de préférence inscrites à l'intérieur du puits afin d'éviter que les images ne comprennent des parties extérieures au puits. A défaut, l'analyse des images nécessiterait des traitements supplémentaires pour distinguer l'intérieur du puits de l'extérieur. Les N images peuvent être prises en des positions prédéterminées de l'échantillon ou en des positions aléatoires. Préférentiellement, chaque image couvre une zone de l'échantillon qui lui est spécifique et qui ne recouvre pas tout ou partie d'autres images de façon à éviter la redondance qui viendrait diminuer la représentativité des images acquises par rapport à l'ensemble de l'échantillon.
Dans une quatrième étape, l'ordinateur décompose chaque image couleur en une image suivant une couleur unique donnée qui fournit une bonne distinctivité entre les objets à analyser - les noyaux - et le fond de l'image. La couleur unique dans laquelle chaque image est décomposée est fonction du type d'échantillon à analyser, et plus particulièrement de la coloration histologique effectuée.
Typiquement, pour fournir une bonne distinctivité, la décomposition de l'image peut se faire soit suivant la couleur de la coloration histologique, soit suivant la couleur complémentaire à celle-ci. Dans le cas d'une coloration de cytochimie en magenta, il est avantageux que l'ordinateur décompose chaque image couleur en une image suivant la composante verte de l'espace RGB normalisé (noté classiquement Nrgb). En effet, «- le vert est la couleur complémentaire du magenta. De plus, l'espace RGB normalisé fournit une meilleure discrimination en comparaison des composantes R, V, B fourmes par la caméra du fait que l'espace normalisé est moins sensible aux variations de luminosité. Ainsi, pour chaque pixel d'une image acquise, l'ordinateur calcule le niveau d'intensité de la composante verte 'g' de l'espace RGB normalisé comme suit : g = G/(R + G + B) avec R, G et B les valeurs des composantes rouge, verte et bleue fournies par la caméra 3. La figure 3 illustre un exemple d'image selon la composante verte de l'espace normalisé RGB d'un échantillon cellulaire coloré en magenta. Plus le niveau d'intensité est faible, plus la représentation du pixel est sombre. Ainsi, les pixels des noyaux présentent un niveau d'intensité nettement plus faible en comparaison des pixels du fond qui présentent un niveau d'intensité élevé. Dans une variante simple, au lieu de décomposer chaque image suivant une composante d'un autre espace colorimétrique, l'ordinateur peur retenir chaque image suivant l'une des composantes R, V, B fournie par la caméra 3, par exemple l'image suivant la composante V dans le cas d'une coloration de cytochimie en magenta, bien que la distinctivité soit moindre. Dans une variante encore plus simple, la caméra 3 fournit des images en noir et blanc au lieu d'être en couleur auquel cas cette quatrième étape est omise.
Dans une cinquième étape, l'ordinateur fournit une version binarisée de chaque image issue de la quatrième étape discriminant les noyaux et le fond. Pour cela, un seuil d'intensité est défini pour discriminer les pixels considérés comme appartenant aux noyaux des pixels considérés comme appartenant au fond. En d'autres termes, l'ordinateur compare l'intensité de chaque pixel de l'image issue de la quatrième étape à ce seuil et lui attribue une première valeur - 0 - ou une deuxième valeur - 1 - en fonction du résultat de la comparaison. Dans la suite, nous considérons que la valeur '1 ' correspond aux pixels de noyaux et '0' au reste. Dans un souci de fiabilité de l'analyse, il est préférable pour l'ordinateur de déterminer à chaque fois ce seuil plutôt que d'appliquer une valeur fixe prédéterminée de ce seuil pour un type de coloration de cytochimie donnée, étant donné la variabilité de la coloration des noyaux. Autrement dit, il est préférable que l'ordinateur détermine ce seuil spécifiquement pour chaque image. Pour déterminer le seuil à appliquer, l'ordinateur peut mettre en œuvre une technique quelconque adéquate connue en soi pour déterminer automatiquement un tel seuil. La technique appliquée par l'ordinateur peut être fonction du type de l'échantillon. Dans ce but, l'ordinateur peut notamment appliquer à l'image issue de la quatrième étape un algorithme mettant en œuvre la méthode itérative de Ridler qui est connu en soi. Cet algorithme procure un excellent résultat dans le cas d'un histogramme de répartition bi-modale des pixels suivant leur intensité. La répartition est bi-modale dans le cas où seuls les noyaux des cellules sont colorés par la coloration histologique. La figure 4 représente un tel histogramme pour l'image de l'échantillon cellulaire de la figure 3. L'axe des abscisses représente l'intensité lumineuse codée en 256 niveaux et l'axe des ordonnées le nombre de pixels. Dans certains cas, la répartition est tri-modale. Ce peut être le cas lorsque le cytoplasme des cellules se colore également, mais à un degré moindre que les noyaux, lors de la coloration histologique. Dans ce cas, le seuil peut être déterminée par deux applications successives de l'algorithme de Ridler. La première application fournit le seuil permettant de discriminer le fond du reste : noyau et cytoplasme dans notre exemple. Une deuxième application de l'algorithme à la partie de l'histogramme comprenant seulement le reste, c'est- à-dire la partie de histogramme limitée à ce seuil, permet de fournir un second seuil permettant de discriminer les noyaux de tout le reste : à la fois du fond et du cytoplasme dans notre exemple. Le fait pour l'ordinateur d'appliquer une fois ou deux fois l'algorithme de Ridler peut être fonction du type des échantillons. Mais il est préférable que l'ordinateur détermine lui- même - de façon connue en soi - si une image présente une répartition bi-modale ou tri- modale afin d'appliquer soit une fois soit deux fois l'algorithme de Ridler. Comme mentionné, il est préférable que l'ordinateur détermine ce seuil pour chaque image. Dans une variante simplifiée, l'ordinateur détermine ce seuil pour une seule image d'un puits et l'utiliser aussi pour les autres images de ce puits, voire encore pour les images des autres puits présentant des échantillons d'une même condition, voire en définitive pour l'ensemble des images relatives aux puits d'une même boîte 1. II est préférable que, dans une sixième étape, l'ordinateur élimine de l'image binarisée les objets de petite taille car ils correspondent non pas à des noyaux, mais à des artefacts. Pour cela, l'ordinateur peut simplement compter le nombre de pixels de chaque objet et l'éliminer dans le cas où ce nombre est inférieur à un nombre prédéterminé de façon expérimentale, par exemple 50 pixels pour un grossissement de 150 fois du microscope 2. Ce nombre prédéterminé est avantageusement fonction du type d'échantillons cellulaires. Dans notre exemple, éliminer un objet consiste à placer la valeur des pixels de l'objet à 'O'.
Dans une septième étape, l'ordinateur peut avantageusement effectuer un traitement sur l'image pour distinguer d'éventuels noyaux accolés de gros noyaux. Pour cela, l'ordinateur peut créer deux images distinctes à partir de l'image binarisée issue de la sixième étape. L'ordinateur retient dans la première image tous les objets de l'image binarisée correspondant chacun à un noyau isolé en raison de la petite taille de l'objet. Au contraire, l'ordinateur retient dans la deuxième image les objets plus grands qui peuvent en fait correspondre soit à un gros noyau isolé, soit à plusieurs noyaux accolés. Pour cela, l'ordinateur place dans la première image uniquement les objets présentant une taille inférieure à une valeur prédéterminée, par exemple 450 pixels pour un grossissement de 150 fois du microscope 2, et il place dans la deuxième image les autres objets. Là encore, dans notre exemple, les pixels des objets non repris dans une de ces images sont placées à la valeur '0'. Cette valeur prédéterminée peut être déterminée expérimentalement. Elle peut être fonction du type des échantillons cellulaires. Les figures 5a et 5b illustrent respectivement la première image et la deuxième image obtenues dans le cas de l'image d'échantillon de la figure 3. L'ordinateur traite ensuite la deuxième image pour diviser les objets correspondant à plusieurs noyaux. Un tel objet est divisé en autant de parties que de noyaux qu'il représente. A cette fin, l'ordinateur peut avantageusement mettre en œuvre la méthode connue en soi dite ligne de partage des eaux (ou « watershed » en anglais). Pour cela, à partir d'une copie de la deuxième image, l'ordinateur effectue une érosion ultime de chaque objet pour en fournir son ou ses germes. Chaque germe correspond à un noyau de cellule. La figure 6 illustre l'image des germes obtenue après érosion des objets de l'image de la figure 5b. L'ordinateur procède ensuite à une croissance de région à partir des germes, la croissance étant stoppée lorsque deux régions se rencontrent. La figure 7 illustre le résultat de la croissance de région en montrant les objets initiaux de la figure 5b. Les frontières entre régions servent ensuite à segmenter les objets de la deuxième image. A cet effet, l'ordinateur place les pixels des frontières à la valeur du fond dans la deuxième image ; dans notre exemple, il affecte la valeur '0' à ces pixels. Par conséquent, les objets sont scindés en conséquence en autant de parties que de germes obtenus par érosion ultime. La deuxième image après scission des noyaux le cas échéant est combinée avec la première image qui contient les objets de petites tailles réputés correspondre chacun à un noyau isolé. Il en résulte une image qui montre tous les noyaux de l'échantillon et qui sont chacun séparés des autres. La figure 8 illustre l'image résultante obtenue pour l'image d'échantillon de la figure 3 avec les flèches référencées 'S' qui pointent quelques segmentations résultant de la septième étape.
Dans une huitième étape, l'ordinateur procède à l'analyse des objets contenus dans l'image issue de la septième étape par des techniques d'analyse d'image connues en soi. En particulier, il compte le nombre d'objets contenus dans l'image, ce qui fournit le nombre de noyaux contenus dans l'échantillon puisque chaque objet correspond à un noyau. A titre d'exemple non limitatif, l'ordinateur peut également déterminer pour chaque noyau l'une ou plusieurs des informations suivantes : - la surface du noyau ; - le périmètre du noyau ; - la direction principale ; - les coordonnées dans l'image ; - la longueur du petit axe et du grand axe de l'ellipse qui modélise le mieux l'objet. L'ordinateur peut bien évidemment sauvegarder ces résultats dans un fichier. Dans une neuvième étape, l'ordinateur peut déterminer des informations relatives à l'échantillon complet d'un puits à partir des données obtenues pour l'ensemble des images de ce puits. Ainsi, il peut estimer le nombre total de noyaux contenus dans le puits en fonction du nombre de noyaux contenus dans les N images acquises de ce puits au vu du rapport prédéterminé entre la surface partielle du puits couverte par les N images et la surface totale du puits. Il est aussi possible de déterminer la densité cellulaire en calculant le nombre de noyaux présents comme précédemment décrit et en divisant ce nombre par la surface de l'image. L'ordinateur peut également établir des statistiques sur chaque puits concernant les autres caractéristiques déterminées, notamment celles listées précédemment. Dans le cas d'une pluralité de puits contenant des échantillons d'une même condition, l'ordinateur peut moyenner les informations relatives à ces puits pour diminuer le taux d'erreur. A partir de là, l'ordinateur peut aussi calculer le nombre de divisions cellulaires et le temps nécessaire pour que le nombre de cellules double si l'opérateur lui fournit le nombre de cellules ensemencés à l'origine dans les puits de la boîte 1 et le temps de culture en considérant que la croissance des cellules est exponentielle. Bien entendu, l'ordinateur peut stocker, par exemple sous forme de fichiers, les résultats de l'analyse ainsi que les images acquises et ou obtenues après traitement suivant les différentes étapes du procédé.
Pour chaque type de cellules considéré, il peut être déterminé expérimentalement les choix et paramètres procurant les meilleures résultats d'analyse qui sont ensuite mis en œuvre de façon automatique par le procédé de l'invention. Ainsi, le procédé peut être mis en œuvre avec des colorants cytochimies autres que le magenta. Pour chaque type de cellules, il peut être déterminé expérimentalement le colorant fournissant une bonne distinctivité des noyaux par rapport au reste. De même, le réglage de l'éclairage s'il est prévu et les réglages de la caméra — temps de pose et ouverture du diaphragme - prise de vue peuvent également être déterminés expérimentalement pour chaque type d'échantillons afin de fournir des images présentant un bon contraste des noyaux par rapport au fond. Dans la troisième étape, le nombre N d'images prises pour l'échantillon d'un puits est au moins un. Mais, bien entendu, plus le nombre N est grand, plus la surface de l'échantillon couverte par les images est grande et plus les informations estimées par l'ordinateur pour un puits donné présenteront un taux d'erreur faible. Ce nombre N peut être déterminé de façon expérimentale pour obtenir un taux d'erreur acceptable d'analyse. A titre d'exemple, il est acquis 300 images distinctes de chaque puits d'une boîte 1 à 12 puits - chaque puits ayant un diamètre de 2.159 cm pour 1 puits et une aire de 3.66 cm2 avec un grossissement de 150 fois du microscope 2. Ces 300 images couvrent alors environ 90 % de la surface totale du puît. A titre d'exemple, le procédé de l'invention peut être mis en œuvre sur la base du logiciel Image J® mis à disposition par le National Ihstitute of Health aux Etats-Unis. Le recours aux noyaux marqués par des colorants histologiques permet avantageusement d'analyser avec le dispositif de l'invention de manière sensible et quantitative les conséquences des différentes conditions de culture sur la densité cellulaire et donc sur la croissance cellulaire. A ces résultats quantitatifs, il peut être associé une image numérisée des échantillons cellulaires fournie par le dispositif ainsi obtenue qui constitue alors un document d'archivé et de référence. Cette manière de procéder permet de paramétrer les approches expérimentales et donc d'en augmenter la traçabilité. Un mode de réalisation avantageux utilise un colorant nucléaire tel que le Giemsa. permettant une coloration du noyau cellulaire qui n'est pas une coloration de l'ADN. D'autres réactifs nucléaires non- spécifiques à l'ADN peuvent être utilisés et sont bien connus de l'homme du métier, tels que les Carmin d'Orth, Cresyl violet, Safrinine Q, Vert de malachite, Violet crystal, Hematoxyline, Eosine, Colorant de Wright, Methyl green ou le Thionin. Il en résulte une plus grande homogénéité du signal provenant du noyau et une absence de variation de l'intensité du signal en fonction des étapes de réplication de l'ADN durant le cycle cellulaire. II est également possible d'utiliser le dispositif de l'invention et le procédé mis en œuvre avec des techniques de coloration autres que les colorations de cytochimie. Ainsi, il peut être recouru à des colorations spécifiques des cellules auquel cas il est avantageux de recourir aux techniques immunoenzymatiques avec des anticorps caractérisés du fait de leur spécificité et de l'existence d'un grand choix d'anticorps spécifiques. En particulier, il peut être recouru aux techniques d'immunoperoxidase dont les résultats sont observables sous lumière blanche. L'emploi de ces colorations spécifiques permet notamment d'analyser avec le dispositif de l'invention, soit des paramètres de cycle cellulaire, soit des paramètres de différenciation. A titre d'exemple, le nombre de cellules en phase S peut être déterminé après marquage des cellules par du BrdU et reconnaissance des noyaux positifs à l'aide d'un anticorps dirigé contre le BrdU. Des anticorps dirigés contre différentes protéines impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire, comme PCNA, P21, PI 6 et la cycline A, sont aussi utilisables. L'analyse de la différenciation peut être effectuée en utilisant des anticorps dirigés contre des facteurs de transcription spécifique d'un état de différenciation particulier. A titre d'exemple, pour la différenciation musculaire, il est recouru à des anticorps dirigés contre les facteurs de transcription spécifique du tissu musculaire, les protéines de la famille MyoD. La coloration des cellules peut également être obtenue par l'emploi de marqueurs fluorescents. Les colorants vitaux comme le bisbenzimide qui se lient avec une affinité importante à l'AON permettent de suivre la croissance sur des cellules vivantes et d'analyser des modifications de l'organisation de l'ADN nucléaire qui sont associés à l'apoptose. Les marqueurs fluorescents associés à des anticorps dirigés contres des protéines membranaires permet de dénombrer les cellules possédant ce marqueurs. Bien entendu, la présente invention n'est pas limitée aux exemples et au mode de réalisation décrits et représentés, mais elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art. En particulier, les images acquises peuvent être traitées chacune complètement selon les étapes quatre à huit avant de passer au traitement complet de l'image acquise suivante. Par ailleurs, il n'est pas nécessaire d'attendre que toutes les N images aient été acquises dans la troisième étape pour commencer le traitement de celles déjà acquises. Concernant la méthode itérative de Ridler, l'on peut se référer à l'article de Ridler, Calvard, « Picture Thresholding Using an Interative Sélection Method », IEEE transactions on Systems, Man and Cybernetics, 1978. Concernant plus généralement la détermination de seuil (en anglais « thresholding »), l'on peut notamment se référer à : - T. Pun, « A new method for gray level picture thresholding using the entropy of the histogram », Signal Processing, 1980, vol. 2, p. 223-237 ; - N. Otsu, « A threshold sélection method from gray level histograms », IEEE Transactions on Systems, man, and cybernetics, vol. 9, p. 62-66 . Concernant la méthode dite ligne de partage des eaux, l'on peut se référer à : - R. Gonzales, R. Woods, « Digital Image Processing », Addison Wesley, 1993, p. 443-458 ; - O. Lezoray, « Histogram and watershed based segmentation of color images », Proceedings of CGιV'2002, avril 2002, p. 358-362. L'ensemble des documents précités sont incorporés par référence dans la présente description.
Le dispositif de l'invention et le procédé mis en œuvre reçoivent diverses applications. Un premier exemple concerne la construction de test cellulaire de toxicité prédictive mise en œuvre sous forme d'une machine de criblage à haut débit. Au niveau cellulaire, les conséquences de la toxicité sont multiples. Les plus fréquentes sont des modifications des paramètres de la croissance cellulaire, la mort cellulaire par apoptose ou par nécrose, des modifications morphologiques et fonctionnelles. La culture, puis l'analyse automatisée selon l'invention de cellules cultivées dans des plaques multiples de par exemple 96 puits - qui permet de multiplier le nombre d'analyses - permet de fournir des systèmes toxicologiques prédictifs à haut débit. Par l'analyse d'image, il est possible d'extraire des données quantitatives sur la croissance cellulaire, sur la mort cellulaire, la morphologie et les fonctions cellulaires. Les systèmes de cultures ex vivo permettent de contrôler l'environnement cellulaire et d'utiliser des cellules spécifiques. Ainsi, l'utilisation de cellules provenant des différents tissus - tels que foie, muscle, peau, système nerveux, vaisseaux - de l'organisme permet de tester la toxicité de molécules sur ces différents tissus et donc de construire des tests toxicologiques spécifiques.
Différent modes de réalisation de la présente invention appliqués à des tests cellulaires sont décrites ci-dessous.
I Comptage cellulaire par analyse d'image pour la détermination de la densité cellulaire afin de sélectionner un milieu de culture La croissance cellulaire est dépendante de combinaisons de facteurs qui composent des codes de croissance spécifiques. La grande majorité des éléments nécessaires pour la culture cellulaire ex vivo est à la fois connue et facile d'accès. La question est de définir les combinaisons de ces éléments, qui constituent ces codes. L'approche décrite permet de construire un système simple et versatile pour analyser la densité cellulaire de manière quantitative et la fréquence d'expression d'un marqueur et pour stocker des images cellulaires. Les méthodes usuelles pour déterminer le nombre de cellules sont associées à des étapes de détachement cellulaire (Coulter) ou à des étapes de lyse cellulaire (MTT). Ces techniques font, de ce fait, disparaître toute notion morphologique et résultent en une perte d'informations importantes.
Le procédé selon l'invention permet d'analyser le rôle de la présence de facteur de croissance sur la densité cellulaire et sur la morphologie nucléaire. Les étapes sont les suivantes. Les différents types cellulaires sont cultivés sur des multipuits de 12 à 96 puits dans différentes conditions de culture pour analyser les conséquences de ces conditions expérimentales, soit sur la croissance cellulaire, soit sur des paramètres de cycle cellulaire et soit sur la fréquence de différenciation. A la fin du temps expérimental, les cellules sont fixées, puis colorées. Pour les colorations cytochimiques, nous utilisons les colorants histologiques nucléaires tel que le Giemsa après une fixation alcoolique. D'autres colorants histologiques pouvant être utilisés sont les Carmin d'Orth,
Cresyl violet, Safrinine Q, Vert de malachite, Violet crystal, Hematoxyline, Eosine, Colorant de Wright, Methyl green ou Thionin. Les cellules ainsi colorées sont observées à l'aide du dispositif et procédé d'analyse selon l'invention, et plus particulièrement avec le matériel donné en exemple. Avec ce procédé simple, robuste, versatile et d'un bon rapport signal bruit nous pouvons analyser de manière sensible et quantitative les conséquences des différentes conditions de . culture sur la densité cellulaire et donc sur la croissance cellulaire. A ces résultats quantitatifs, nous associerons une image digitalisée de cellules ainsi obtenues qui constituera un document d'archives et de référence. Cette manière de procéder nous permettra de paramétrer nos approches expérimentales et donc d'en augmenter la traçabilité, gage de qualité. Dans cette expérience les cellules utilisées sont des cellules musculaires humaines. Dans un premier temps, les cellules sont amplifiées en culture en présence de sérum humain (laboratoire PAA) puis ensemencées dans les différentes conditions décrites. Des facteurs de croissance peuvent être ajoutés au milieu de culture afin de promouvoir la croissance cellulaire. Les cellules sont ensemencées sur des multiples de 12. Le substrat utilisé est la gélatine et la densité d'ensemencement est 5000 cellules par puits.
Conditions de l'expérimentation : - type de boîte : 2 multipuits de 12 (TPP) - substrat : Gélatine - densité : 5 000 cellules/puits
Changement de milieu : 24/05/02 27/05/02 29/05/02 31/05/02
Temps de culture : 7 jours
Coloration Giemsa : Après aspiration du milieu de culture, les cellules sont lavées avec du PBS puis fixées avec de l'éthanol à 100%. 10 minutes plus tard les cellules sont lavées à l'eau puis colorées avec une solution de Giemsa à 10% pendant 10 minutes. L'étape finale est un lavage à l'eau.
Prise de vue Les images sont obtenues avec le dispositif selon l'invention, plus particulièrement avec le matériel donné en exemple. Les résultats de cette étude sont présentés dans la table 1.
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000021_0001
Table 1 : résultats de la sélection de milieux XI, X2, X3 et X4 sont différents additifs basés sur des mélanges de facteurs de croissance.
II Analyse d'image et tests toxicologiques
Définir le profil toxicologique d'une molécule est une étape indispensable pour envisager une application thérapeutique. Les systèmes de cellules fournissent de bons outils dans cette perspective. ° Les accidents mortels avec les inhibiteurs de la synthèse du cholestérol de la famille des statines ont remis le tissu musculaire au premier plan comme cible toxicologique. La mauvaise évaluation de ce risque connu par Bayer pour la Cerivistatin au eu des conséquences humaines et économiques considérables. De très nombreuses drogues sont susceptibles d'entraîner des myopathies. Dans les cas aigus et graves, on assiste à une lyse importante du tissu musculaire (rhabdomyolyse) dont le mécanisme est encore mal connu. Plusieurs hypothèses ont été émises. Certaines invoquent une augmentation de la perméabilité membranaire et d'autres des anomalies au niveau des mitochondries. Dans la grande majorité des cas, il s'agit d'accidents survenant dans un contexte de poly chimiothérapie suggérant le rôle d'interactions médicamenteuses (macrolides, immunosuppresseurs, anticancéreux, fibrates, cocaïne, antiprotéases du HIV, anesthésiques...). Parmi les nombreux acteurs impliqués : les cytochromes P450, les molécules impliquées dans l'apoptose comme BCL2, les antioxydants, les protéines du complexe NFKb, les PPARs ou les interventions chirurgicales. À l'exception des accidents aigus, menaçant le pronostic vital (rhabdomyolyse), les signes cliniques d'une atteinte musculaire sont frustres, douleurs musculaires (myalgies), fatigabilité, crampes et les signes biologiques en dehors des accidents aigus les CPK sont très fréquemment normaux. Dans les cas des statines, des données récentes indiquent que les sujets présentant des atteintes musculaires ne montrent ni de corrélations entre le niveau plasmatique de cet agent pharmacologique et l'atteinte toxique, ni d'élévation des CPK. Dans ces cas l'histologie révèle dans le tissu musculaire des modifications des mitochondries (gonflement) et des accumulations de gouttelettes lipidiques.
La multiplicité des hypothèses, le rôle des interactions médicamenteuses, la pauvreté des signes cliniques et des signes biologiques obligent à la création de nouveaux outils permettant de prévoir et comprendre la toxicité au niveau du tissu musculaire. Dans ce cas, les modèles animaux sont lourds et donc difficiles à mettre en œuvre. Pour résoudre ces questions nous avons construit des modèles cellulaires prédictifs de la toxicité musculaire. Dans cette expérience, nous avons utilisé des cellules musculaires humaines normales pour tester la toxicité des statines commerciales ;
Conditions de l'expérimentation
- type de boîte : 2 multipuits de 96 (TPP) - densité : 2 500 cellules/puit - milieu de culture standard contenant des doses croissantes de Lovastatine, Cerivistatine, Atorvastatine, Pravastatine, Fluvastatine ou Simvastatine à des concentrations de 0, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 et 1 μM
Suivi de l'expérimentation :
- 11/07 : Changement des milieux - 13/07 : Coloration. Temps de culture : 5 jours
Coloration Giemsa : Après aspiration du milieu de culture, les cellules sont lavées avec du PBS puis fixées avec de l'éthanol à 100%. 10 minutes plus tard les cellules sont lavées à l'eau puis colorées avec une solution de Giemsa à 10% pendant 10 minutes. L'étape finale est un lavage à l'eau. Prise de vue Les images sont prises par un dispositif selon l'invention, et plus particulièrement avec le matériel donné en exemple. L'exploitation numérique est présenté sur la figure 9. Cette figure révèle la toxicité élevée de la Cérivisatine. Cette molécule de la classe des statines a provoqué un très grand nombre d' accident toxique musculaire. Cette expérimentation montre que l'association de type cellulaire adapté avec des systèmes d'analyse automatisée permet de développer des tests de toxicologique spécifique. Les expériences étant menées en plaque multipuits de 96 puits permettent le développement d'analyse à haut débit.
III Analyse d'image et tests virologiques.
La fonctionnalité des virus est détectée par leur capacité cytopathologique sur des cellules cibles spécifiques. Une des conséquences de l'infection virale est la lyse cellulaire. Cette propriété est utilisée pour un test qui permet de détecter le nombre de virus fonctionnel. Brièvement les différentes étapes de ce test sont : - la culture en micro plaque de 6 puits des cellules cibles - l'infection virale par des croissante de virus dans la gélose. Cette étape peut durer plusieurs jours - la révélation des plages de lyse après fixation et coloration - le comptage manuel de ces plages de lyse.
Les principales limitations de ce test sont la complexité des différentes étapes dépendantes de savoir-faire. Comme pour les tests de toxicologie nous utilisons la culture en micro plaque de 96 associé à l'analyse d'image pour dénombrer les cellules et ainsi quantifier les résultats. Brièvement les différentes étapes de ce test sont : - la culture des cellules cible en micro plaque de 96 puits - l'infection virale directe (sans gélose) par des quantité croissante de virus - la fixation (alcoolique) et la coloration au Giemsa (ou alternativement les
Carmin d'Orth, Cresyl violet, Safrinine Q, Vert de malachite, Violet crystal, Hematoxyline, Eosine, Giemsa, Colorant de Wright, Methyl green ou Thionin). - l'analyse des cultures avec le dispositif et procédé d'analyse selon l'invention, et plus particulièrement avec le matériel donné en exemple.
Les avantages de ce test sont la simplification des étapes biologiques, l'automatisation de la lecture des résultats. De cette manière il est possible de construire des automates dédiés à la lecture de ce type de test.
IV Analyse d'image pour la détermination de l'accumulation cellulaire de lipides Le métabolisme des lipides est une source d'énergie vitale et ce particulièrement pour le tissu musculaire ou les mesures d'oxydations qui sont basées sur la production de C02 peuvent se pratiquer directement sur du tissu musculaire ou sur les cellules musculaires isolées et cultivées. Les déficits oxydatifs des acides gras ne sont pas limités aux pathologies monogéniques.
Ces anomalies sont aussi observées dans des maladies de surcharge comme l'obésité. La réduction des capacités d'oxydation des acides gras, par les tissus périphériques comme le muscle, est associée à certaines formes de surcharge pondérale. Dans ces conditions de déséquilibre de la balance énergétique, les acides gras non métabolisés en excès sont alors stockés par les adipocytes et par d'autres types cellulaires. Non oxydés, les acides gras servent aussi de substrats pour la formation de molécules comme les céramides impliquées dans l'apoptose. Cette lipoapoptose a pour cibles les cellules B- Langerhans du pancréas et les cellules cardiaques et est l'un des mécanismes physiopathologiques de l'insuffisance cardiaque et pancréatique observés dans l'obésité et le diabète de type 2.
L'utilisation de colorant de cytochimie spécifique des lipides comme l'Huile Rouge permet de visualiser au niveau cellulaire l'accumulation intracytoplasmique des acides gras. Ce procédé permet de rendre ce type, de coloration quantitative.
L'acquisition numérique des images observées au microscope avec le dispositif selon l'invention permet ensuite leur analyse pour extraire des données quantifiables ; de telles données sont présentées sur la figure 10.
Ce type d'approche combinant des cellules cibles, des colorations histologiques spécifiques et des procédés d'analyses automatisables permet de développer des tests cellulaires pour le criblage d'agents pharmacologiques intervenants dans l'obésité ou les maladies de surcharge.
En changeant de cellules cibles (cellules adhérentes de la moelle osseuse) et de coloration histologique (Von Kossa) ce test cellulaire permet de cribler des agents pharmacologiques intervenant dans la formation osseuse (ostéoporose).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'analyse d'un échantillon cellulaire, comprenant les étapes de : a) coloration des noyaux des cellules de l'échantillon ; b) acquisition d'au moins une image numérique de l'échantillon ; et c) analyse numérique de ladite image caractérisé en ce que l'étape a) de coloration des noyaux des cellules est une coloration non spécifique à l'ADN.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape a) de coloration comprend une coloration par un réactif sélectionné parmi le groupe consistant en : Giemsa, Carmin d'Orth, Cresyl violet, Safrimne Q, Vert de malachite, Violet crystal, Hematoxyline, Eosine, Colorant de Wright, Methyl green et le Thionin.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape a) de coloration comprend une coloration au Giemsa.
4. Procédé de sélection d'un milieu de culture, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : - culture de plusieurs échantillons cellulaires chacun dans un milieu de culture différent ; - analyse des échantillons cellulaires par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Procédé de mesure de la toxicité d'une substance, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : - culture d'un échantillon cellulaire en présence de la substance ; - analyse de l'échantillon cellulaire par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
6. Procédé de mesure des caractéristiques cytopathologiques d'un virus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : - culture d'un échantillon cellulaire en présence du virus ; - analyse de l'échantillon cellulaire par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
7. Procédé de sélection de substances pharmacologiques intervenant dans les maladies du surpoids ou de l'obésité, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : - culture d'un échantillon cellulaire en présence des substances à tester ; - coloration des acides gras intracytoplasmiques ; - acquisition d'au moins une image numérique de l'échantillon ; - analyse numérique de ladite image.
8. Procédé de sélection de substances pharmacologiques intervenant dans l'ostéoporose, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : - culture d'un échantillon cellulaire en présence des substances à tester ; - coloration des cellules ; - acquisition d'au moins une image numérique de l'échantillon ; - analyse numérique de ladite image.
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