JP5446868B2 - プログラム、コンピュータおよび培養状態解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、所定の環境条件に調整された恒温室内で培養された細胞の状態を解析するプログラムおよびその関連技術に関する。

従来から、所定の雰囲気に維持された恒温室で細胞を培養する培養装置が知られている。また、かかる培養装置で培養された細胞の状態を評価するために、同一視野を撮像した細胞の透過観察画像と蛍光画像とを組み合わせて、特定の観察時点での細胞の形態や蛍光発現状態を解析することも提案されている。なお、特許文献１では、位相差画像と蛍光画像とを用いて、細胞の輪郭抽出を行う技術が開示されている。
特開２００４−５４３４７号

しかし、従来の技術では、あくまで特定の観察時点ごとに細胞の形態や蛍光発現状態を評価するにすぎなかった。そのため、タイムラプス観察で観察時点の異なる透過観察画像および蛍光画像を得たとしても各々の培養状態の情報がリンクしていないため、着目する細胞の経時的な培養状態の情報を得ることが非常に困難である点で改善の余地があった。

本発明は上記従来技術の課題を解決するものであって、着目する細胞について時間的に連続した培養状態の情報を取得できる手段を提供することを目的とする。

本発明の一の態様は、所定の環境条件で細胞を培養する恒温室と、恒温室内で細胞の顕微観察画像を撮像する撮像装置とを備えた培養装置を用いて細胞の培養状態を解析するコンピュータによって実行されるプログラムである。このプログラムは、画像入力処理と、透過観察画像解析処理と、蛍光画像解析処理と、発光判定処理と、テーブル生成処理と、同一性判定処理と、データベース生成処理とをコンピュータに実行させる。

画像入力処理では、撮像装置が同一視野を連続的に撮像して生成された透過観察画像のデータおよび蛍光画像のデータをコンピュータに読み込ませる。透過観察画像解析処理では、コンピュータが、透過観察画像のデータを用いて、各々の細胞に対応する識別データと各々の細胞の位置および形態を示す細胞形態データとを生成する。蛍光画像解析処理では、コンピュータが、蛍光画像のデータを用いて、視野内での蛍光検出状態を示す蛍光データを生成する。発光判定処理では、コンピュータが、細胞形態データの示す細胞の位置と蛍光データの示す発光位置とを写像して、各々の細胞の発光状態を求める。テーブル生成処理では、コンピュータが、細胞形態データおよび発光状態のデータを識別データにそれぞれ対応付けして、タイムラプス観察における各観察時期での各々の細胞の状態を示す細胞解析テーブルを生成する。同一性判定処理では、コンピュータが、細胞形態データを用いて細胞の同一性を判定し、観察時期の異なる複数の細胞解析テーブル間での識別データの対応関係を求める。データベース生成処理では、コンピュータが、同一性判定処理で求めた識別データの対応関係に基づいて、観察時期の異なる複数の細胞解析テーブルを、共通性のある細胞ごとに時間軸方向へ検索可能にデータベース化して記憶媒体に記録する。

なお、上記の発明に関する構成を、上記のプログラムを実行させるコンピュータや、上記のプログラムを記憶した記憶媒体や、培養装置に接続されたコンピュータに細胞の状態解析を実行させる培養状態解析方法などに変換して表現したものも本発明の具体的態様として有効である。

本発明によれば、細胞の位置や形態から求めた対応関係に基づいて、観察時期の異なる複数の細胞解析テーブルを共通性のある細胞ごとに時間軸方向に検索できる。

本実施形態の培養装置のブロック図 本実施形態の培養装置の正面図 本実施形態の培養装置の平面図 本実施形態の培養装置での観察動作の一例を示す流れ図 図４のＳ１０５での細胞解析テーブル生成処理のサブルーチンを説明する流れ図 （ａ）観察時点ｔ₀での位相差画像の例を示す図、（ｂ）観察時点ｔ₁での位相差画像の例を示す図 本実施形態での培養情報の検索処理の一例を説明する流れ図 培養履歴画面の一例を示す図 識別コードおよび矩形枠が重畳された位相差画像の一例を示す図 各観察時点における細胞形態データ等の一覧表示画面の一例を示す図 樹形図とともに細胞の発光時期を表示した画面の一例を示す図

（培養装置の構成の説明）
以下、図面を参照しつつ、本実施形態の培養装置の構成を説明する。図１は、本実施形態の培養装置のブロック図である。また、図２，図３は、本実施形態の培養装置の正面図および平面図である。

本実施形態の培養装置１１は、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３とを有している。培養装置１１の組立状態において、上部ケーシング１２は下部ケーシング１３の上に載置されている。なお、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３との内部空間は、ベースプレート１４によって上下に仕切られている。

まず、上部ケーシング１２の構成の概要を説明する。上部ケーシング１２の内部には、細胞の培養を行う恒温室１５が形成されている。この恒温室１５は温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂを有しており、恒温室１５内は細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されている（なお、図２，図３での温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂの図示は省略する）。

恒温室１５の前面には、大扉１６、中扉１７、小扉１８が配置されている。大扉１６は、上部ケーシング１２および下部ケーシング１３の前面を覆っている。中扉１７は、上部ケーシング１２の前面を覆っており、大扉１６の開放時に恒温室１５と外部との環境を隔離する。小扉１８は、細胞を培養する培養容器１９を搬出入するための扉であって、中扉１７に取り付けられている。この小扉１８から培養容器１９を搬出入することで、恒温室１５の環境変化を抑制することが可能となる。なお、大扉１６、中扉１７、小扉１８は、パッキンＰ１，Ｐ２，Ｐ３によりそれぞれ気密性が維持されている。

また、恒温室１５には、ストッカー２１、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、搬送台２４が配置されている。ここで、搬送台２４は、小扉１８の手前に配置されており、培養容器１９を小扉１８から搬出入する。

ストッカー２１は、上部ケーシング１２の前面（図３の下側）からみて恒温室１５の左側に配置される。ストッカー２１は複数の棚を有しており、ストッカー２１の各々の棚には培養容器１９を複数収納することができる。そして、各々の培養容器１９には細胞が培地とともに収容される。

観察ユニット２２は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の右側に配置される。この観察ユニット２２では、培養容器１９内の細胞のタイムラプス観察を実行することができる。

この観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出したスタンドアーム３２と、顕微光学系および撮像装置（３３ａ）を内蔵した本体部分３３とを有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。

試料台３１は透光性の材質で構成されており、その上に培養容器１９が載置することができる。この試料台３１は水平方向に移動可能に構成されており、上面に載置した培養容器１９の位置を調整することができる。また、スタンドアーム３２にはＬＥＤ光源が内蔵されている。そして、撮像装置３３ａは、スタンドアーム３２によって試料台３１の上側から透過照明された培養容器１９の細胞を顕微光学系を介して撮像することで、細胞の位相差画像を取得できる。

また、観察ユニット２２の本体部分３３は、蛍光観察用の励起照明ユニット（３３ｂ）を有している。そして、撮像装置３３ａは、励起光の落射照明によって細胞で発現した蛍光を顕微光学系を介して撮像することで、細胞の蛍光画像を取得できる。

容器搬送装置２３は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の中央に配置される。この容器搬送装置２３は、ストッカー２１、観察ユニット２２の試料台３１および搬送台２４との間で培養容器１９の受け渡しを行う。

図３に示すように、容器搬送装置２３は、多関節アームを有する垂直ロボット３４と、回転ステージ３５と、ミニステージ３６と、アーム部３７とを有している。回転ステージ３５は、垂直ロボット３４の先端部に回転軸３５ａを介して水平方向に１８０°回転可能に取り付けられている。そのため、回転ステージ３５は、ストッカー２１、試料台３１および搬送台２４に対して、アーム部３７をそれぞれ対向させることができる。

また、ミニステージ３６は、回転ステージ３５に対して水平方向に摺動可能に取り付けられている。ミニステージ３６には培養容器１９を把持するアーム部３７が取り付けられている。

次に、下部ケーシング１３の構成の概要を説明する。下部ケーシング１３の内部には、観察ユニット２２の本体部分３３や、培養装置１１の各部の統括的な制御を行う制御装置４１が収納されている。

制御装置４１は、温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂ、観察ユニット２２および容器搬送装置２３とそれぞれ接続されている。この制御装置４１は、所定のプログラムに従って培養装置１１の各部を統括的に制御する。一例として、制御装置４１は、温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂをそれぞれ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御装置４１は、所定の観察スケジュールに基づいて、観察ユニット２２および容器搬送装置２３を制御して、培養容器１９の観察シーケンスを自動的に実行する。

また、制御装置４１は、通信部４２と、ＣＰＵ４３と、記憶部４４とを有している。なお、通信部４２および記憶部４４はそれぞれＣＰＵ４３と接続されている。

通信部４２は、無線または有線の通信回線４５を介して、培養装置１１の外部にある端末装置４６とのデータ送受信を実行する。この端末装置４６には、例えば、一般的なパーソナルコンピュータを用いることができる。なお、端末装置４６は、モニタ，プリンタ等の出力装置と、キーボード，ポインティングデバイス等の入力装置を有している（これらの図示は省略する）。

ＣＰＵ４３は、制御装置４１の各種の演算処理を実行するプロセッサである。また、ＣＰＵ４３は、プログラムの実行によって、撮像装置３３ａから取得した位相差画像および蛍光画像の画像解析を行なって、その解析結果から細胞解析テーブルを生成する（なお、細胞解析テーブルについては後述する）。

記憶部４４は、ハードディスクや、フラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体などで構成される。この記憶部４４には、ストッカー２１に収納されている各培養容器１９に関する管理データと、位相差画像および蛍光画像のデータと、上記の細胞解析テーブルのデータとが記憶されている。

なお、上記の管理データには、（ａ）個々の培養容器１９を示すインデックスデータ、（ｂ）ストッカー２１での培養容器１９の収納位置、（ｃ）培養容器１９の種類および形状（ウェルプレート、ディッシュ、フラスコなど）、（ｄ）培養容器１９で培養されている細胞の種類、（ｅ）培養容器１９内に投与した薬剤の情報、（ｆ）培養容器１９の観察スケジュール、（ｇ）タイムラプス観察時の撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点等）、などが記録されている。また、ウェルプレートのように複数の小容器で同時に細胞を培養できる培養容器１９については、各々の小容器ごとにそれぞれ管理データが生成される。

（培養装置での観察動作の説明）
以下、図４の流れ図を参照しつつ、本実施形態の培養装置１１での観察動作の一例を説明する。ここで、以下の例では、恒温室１５内に搬入された培養容器１９を、登録された観察スケジュールに従ってタイムラプス観察する場合を説明する。

ここで、以下の例では、一例として、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）などの蛍光蛋白質の遺伝子が導入された細胞を観察する場合を説明する。なお、細胞周期の解析を行うときに時間軸方向での分解能を確保するために、タイムラプス観察の間隔は少なくとも観察対象の細胞の分裂周期よりも短く設定される。より好ましくは、タイムラプス観察の間隔は、細胞周期において観察しようとする定性状態の持続期間よりも短く設定される。

ステップＳ１０１：ＣＰＵ４３は、記憶部４４の管理データの観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器１９の観察開始時間が到来したか否かを判定する。観察開始時間となった場合（ＹＥＳ側）にはＳ１０２に移行する。一方、培養容器１９の観察時間ではない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ４３は次の観察スケジュールの時刻まで待機する。

ステップＳ１０２：ＣＰＵ４３は、観察スケジュールに対応する培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９をストッカー２１から搬出して観察ユニット２２の試料台３１に載置する。なお、培養容器１９が試料台３１に載置された段階で、スタンドアーム３２に内蔵されたバードビューカメラ（不図示）によって培養容器１９の全体観察画像が撮像される。

ステップＳ１０３：ＣＰＵ４３は、観察ユニット２２に対して細胞の位相差画像の撮像を指示する。観察ユニット２２は、スタンドアーム３２の光源を点灯させて培養容器１９を照明する。そして、観察ユニット２２の撮像装置３３ａが培養容器１９内の細胞の位相差画像を撮像する。このとき、撮像装置３３ａは、記憶部４４に記憶されている管理データに基づいて、ユーザーの指定した撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点）に基づいて位相差画像を撮像する。なお、位相差画像のデータは、制御装置４１に入力されて、ＣＰＵ４３が記憶部４４に記録する。

ステップＳ１０４：ＣＰＵ４３は、位相差画像の撮像（Ｓ１０３）に連続して、観察ユニット２２に対して細胞の蛍光画像の撮像を指示する。観察ユニット２２は、励起照明ユニット３３ｂからの励起光を細胞に落射するとともに、撮像装置３３ａで培養容器１９内の細胞の蛍光画像を撮像する。このＳ１０４で撮像装置３３ａが撮像する視野範囲は、上記の位相差画像と同一の視野範囲に設定される。なお、蛍光画像のデータは、制御装置４１に入力されて、ＣＰＵ４３が記憶部４４に記録する。

ここで、培養容器１９内の複数のポイントを観察する場合には、観察ユニット２２は各々のポイント毎にＳ１０３およびＳ１０４の動作を繰り返し、同一視野の位相差画像および蛍光画像を２枚１組で生成する（なお、図４においてこの場合のループの図示は省略する）。

ステップＳ１０５：ＣＰＵ４３は、位相差画像のデータ（Ｓ１０３）および蛍光画像のデータ（Ｓ１０４）を解析して細胞解析テーブルを生成する。

ステップＳ１０６：ＣＰＵ４３は、観察スケジュールの終了後に培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９を観察ユニット２２の試料台３１からストッカー２１の所定の収納位置に搬送し、観察シーケンスを終了してＳ１０１に戻る。以上で、図４の流れ図の説明を終了する。

（細胞解析テーブルの生成処理の説明）
図５は、図４のＳ１０５での細胞解析テーブル生成処理のサブルーチンを説明する流れ図である。

ステップＳ２０１：ＣＰＵ４３は、記憶部４４から位相差画像のデータ（Ｓ１０３）を読み出して、位相差画像に含まれる各細胞を抽出する。

一例として、位相差顕微鏡で細胞を撮像すると、細胞壁のように位相差の変化の大きな部位の周辺にはハロが現れる。そのため、ＣＰＵ４３は、細胞壁に対応するハロを公知のエッジ抽出手法で抽出し、そのエッジで囲まれた閉空間内を細胞の輪郭と推定する。これにより位相差画像から個々の細胞を抽出することができる。なお、本実施形態の培養装置では位相差画像および蛍光画像を同一視野で撮像しているため、上記の特許文献１に記載された手法を用いて細胞の輪郭を抽出することも可能である。

ステップＳ２０２：ＣＰＵ４３は、位相差画像から抽出した各細胞をそれぞれ識別するためにラベリング処理を実行する。具体的には、ＣＰＵ４３は、位相差画像から抽出できた各細胞ごとにそれぞれ識別コード（あるいは番号）を付与する。

ステップＳ２０３：ＣＰＵ４３は、位相差画像に基づいてラベリングされた各細胞ごとに、細胞の位置および形態を示す細胞形態データを生成する。具体的には、ＣＰＵ４３は、以下の（１）〜（６）の処理を実行する。

（１）ＣＰＵ４３は、位相差画像のうちから逐次細胞形態データを生成する対象細胞を決定する。

（２）ＣＰＵ４３は、位相差画像上での対象細胞の位置データを生成する。ＣＰＵ４３は、公知の重心演算のアルゴリズムによって注目細胞の重心を求め、位相差画像上での注目細胞の重心の座標を位置データとする。

（３）ＣＰＵ４３は、注目細胞の形態データを生成する。ＣＰＵ４３は、注目細胞の輪郭に外接する矩形の枠を設定する。そして、ＣＰＵ４３は、注目細胞を取り囲む矩形の枠のサイズと、その矩形の枠内で細胞が占める面積の比率（％）を形態データとする。また、ＣＰＵ４３は、注目細胞の重心位置と矩形の枠との相対的な位置関係も求めておく。

（４）ＣＰＵ４３は、上記の細胞形態データ（位置データおよび形態データ）を注目細胞の識別コードに対応付けして記憶部４４に記録する。また、ＣＰＵ４３は、位相差画像から矩形の枠内の画像を切り出して、このトリミング画像のデータを注目細胞の識別コードに対応付けて記憶部４４に記録する。

（５）ＣＰＵ４３は、画像解析によって、注目細胞が単独細胞または連結細胞のいずれであるかを判別する。一例として、ＣＰＵ４３は、位相差画像の輪郭などに基づいて細胞内にある核を推定する。そして、ＣＰＵ４３は、細胞壁の輪郭内にある核の数に基づいて注目細胞が単独細胞または連結細胞であるかを判別する。あるいは、ＣＰＵ４３は、位相差画像から抽出した細胞壁の輪郭の形状や大きさに基づいて、注目細胞が単独細胞または連結細胞であるかを判別してもよい。

そして、ＣＰＵ４３は、上記の判別結果に基づいて、注目細胞の属性（単独細胞または連結細胞）示す属性データを生成する。ＣＰＵ４３は、この属性データを注目細胞の識別コードに対応付けて記憶部４４に記録する。

（６）ＣＰＵ４３は、位相差画像に含まれる細胞のうち、細胞形態データおよび属性データが生成されていないものを新たな注目細胞に指定する。そして、ＣＰＵ４３は、上記（２）〜（５）の処理を繰り返すことで、全ての細胞について細胞形態データおよび属性データを生成する。

ステップＳ２０４：ＣＰＵ４３は、記憶部４４から蛍光画像のデータ（Ｓ１０４）を読み出して、蛍光画像内で蛍光検出状態を示す蛍光データを生成する。まず、ＣＰＵ４３は、蛍光画像内における蛍光領域を抽出する。次に、ＣＰＵ４３は、抽出した各々の蛍光領域ごとに蛍光領域の重心位置、蛍光領域の面積、蛍光領域内の輝度平均値を求めて、各蛍光領域ごとの蛍光データを生成する。そして、ＣＰＵ４３は、各蛍光データを記憶部４４に記録する。

ステップＳ２０５：ＣＰＵ４３は、位相差画像から抽出した各細胞の位置と、蛍光データ（Ｓ２０４）の示す蛍光領域の位置とを写像して、各細胞と蛍光領域との対応関係を求める。これにより、ＣＰＵ４３は、各々の蛍光領域がいずれの細胞に属するかを特定し、細胞の識別コードと蛍光データとの対応付けを行う。

ここで、１つの細胞内に複数の蛍光領域がある場合には、ＣＰＵ４３は１つの識別コードに複数の蛍光データを対応付けする。また、１つの細胞内に蛍光領域がない場合には、ＣＰＵ４３は、細胞に蛍光領域がない旨のデータを識別コードに対応付けする。

なお、Ｓ２０１からＳ２０５までの処理により、細胞形態データ、蛍光データおよび属性データが各識別コードにそれぞれ対応付けされ、所定の観察時期における各細胞の状態を示す細胞解析テーブルが記憶部４４に生成されることとなる。

ステップＳ２０６：ＣＰＵ４３は、同一の対象についての過去の細胞解析テーブルが記憶部４４に存在するか（すなわち、今回の培養容器１９について同一視野を対象として過去に細胞解析テーブルを生成したか）否かを判定する。

ここで、以下の説明では、簡単のため、今回新たに生成された細胞解析テーブルを「新規生成テーブル」と称する。また、新規生成テーブルと同一の対象について過去に生成された細胞解析テーブルであって、新規生成テーブルとは細胞の観察時点が異なる過去の細胞解析テーブルを「既登録テーブル」と称する。また、既登録テーブルが記憶部４４に複数ある場合には、最も新しいテーブルが処理対象として選択されるものとする。

記憶部４４に既登録テーブルがある場合（ＹＥＳ側）にはＳ２０７に処理が移行する。一方、記憶部４４に既登録テーブルがない初回生成時の場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ４３はサブルーチンの処理を終了し、Ｓ１０６の処理に復帰する。

ステップＳ２０７：ＣＰＵ４３は、既登録テーブルと新規生成テーブルとの細胞形態データを用いて、テーブル間での各細胞の対応関係を求める同一性判定を行う。

まず、ＣＰＵ４３は、既登録テーブルから細胞の位置データおよび形態データを読み出す。

次に、ＣＰＵ４３は、既登録テーブルにおける細胞の位置に基づいて、新規生成テーブルにおいて細胞のマッチングを行う範囲を絞り込む。具体的には、ＣＰＵ４３は、画像上での細胞位置がテーブル間で大きく異なる組み合わせについては、マッチングの対象から除外する。特に、対象となる細胞が付着細胞である場合、ＣＰＵ４３は、画像上での細胞位置を重視して、マッチングの対象を浮遊細胞の場合よりも狭い範囲に限定する。

そして、ＣＰＵ４３は、既登録テーブルおよび新規生成テーブルで各細胞の輪郭形状のパターンマッチングを行なう。その結果、ＣＰＵ４３は、既登録テーブルおよび新規生成テーブルとの間で細胞の形状の類似度が最も高くなった組み合わせを同一の細胞のものであると推定する。なお、図６に観察時点ｔ₀，ｔ₁での位相差画像の例をそれぞれ示す。

ステップＳ２０８：ＣＰＵ４３は、細胞の形態の変化に基づいて、細胞の分裂または結合を検出するグループ判定を実行する。

まず、ＣＰＵ４３は、既登録テーブルおよび新規生成テーブルをそれぞれ読み出す。

そして、新規生成テーブルにおいて、既登録テーブルで連結細胞の存在した位置の近傍に新たに２以上の単独細胞が発生している場合、ＣＰＵ４３は、既登録テーブルに存在した連結細胞が新規生成テーブルでは分裂したものと推定する。このとき、ＣＰＵ４３は、既登録テーブルにおける連結細胞の属性データに、連結細胞から分裂した細胞に付与された識別コードを示す付加データを記録する。これにより、分裂前後の細胞のデータが相互に関連付けされてグループ化する。

また、新規生成テーブルにおいて、既登録テーブルで複数の細胞の存在した位置の近傍に新たに細胞のコロニーが発生している場合、ＣＰＵ４３は、既登録テーブルで存在した周辺の細胞が新規生成テーブルで結合したものと推定する。このとき、ＣＰＵ４３は、新規生成テーブルにおける連結細胞の属性データに、結合した細胞に付与された識別コードを示す付加データを記録する。これにより、結合前後の細胞のデータが相互に関連付けされてグループ化する。

なお、検索時には付加データの識別コードを参照することで、ＣＰＵ４３は注目する細胞から分裂した細胞などについても細胞解析テーブルの培養情報を検索できるようになる。そのため、付加データの生成によって、データベースとしての利便性がより向上する。

ステップＳ２０９：ＣＰＵ４３は、上記の同一性判定（Ｓ２０７）およびグループ判定（Ｓ２０８）の結果に基づいて、既登録テーブルと新規生成テーブルとの間で同一の細胞に付与された識別コードを共通化する。これにより、記憶部４４にある複数の細胞解析テーブルは、同じ細胞の情報が共通の識別コードで管理されたデータベースとして機能する。そのため、任意の識別コードをキーとして観察時点の異なる複数の細胞解析テーブルから各種のデータを抽出すれば、着目する細胞について時間軸方向に連続性をもつ観察データが取得できる。

ステップＳ２１０：ＣＰＵ４３は、既登録テーブルと新規生成テーブルとの間で細胞の位置を対比して、各細胞ごとに細胞の移動量をそれぞれ求める。さらに、ＣＰＵ４３は、上記の細胞の移動量をタイムラプス観察の撮影間隔で除して、細胞の移動速度も求める。そして、ＣＰＵ４３は、細胞の移動量および移動速度のデータを新規生成テーブルに対応付けして記憶部４４に記録する。

なお、Ｓ２１０の終了後に、ＣＰＵ４３はサブルーチンの処理を終了し、Ｓ１０６の処理に復帰する。以上で、図５の流れ図の説明を終了する。

（培養情報の検索処理の説明）
次に、図７の流れ図を参照しつつ、本実施形態の培養装置１１を用いた培養情報の検索処理の一例を説明する。なお、図７の例では、予め細胞解析テーブルがデータベース化された状態で記憶部４４に記憶されていることを前提に説明を行う。

ここで、図７に示す培養情報の検索処理は、培養装置１１の制御装置４１によって実行される。また、ユーザーは、制御装置４１に接続された端末装置４６から、制御装置４１に対して各種の操作を実行する。

ステップＳ３０１：制御装置４１のＣＰＵ４３は、端末装置４６からのユーザーの操作に応じて検索処理のシーケンスプログラムを立ち上げる。

一例として、ユーザーが培養履歴画面から検索処理を行う場合を説明する。図８は、端末装置４６のモニタで培養履歴画面を表示している状態を示す図である。培養履歴画面では、特定の培養容器１９についての観察日時が一覧表示されている。この培養履歴画面では、同じ観察日時に撮像された全体観察画像および４つの位相差画像（４倍、１０倍、２０倍、４０倍）と、培養容器内の撮像ポイントを示すアイコンとが観察日時に対応付けされて表示されている。

ユーザーがいずれかの位相差画像を指定した状態でＧＵＩ形式の「ラベリング」ボタンをクリックすると、制御装置４１は、識別コードおよび細胞を囲む矩形枠が重畳された位相差画像のデータを端末装置４６に対して出力する。そして、端末装置４６のモニタには、識別コードおよび矩形枠が重畳された位相差画像が表示されることとなる（図９参照）。

そして、ユーザーは、培養情報を参照しようとする細胞の指定を端末装置４６から行う。具体的には、位相差画像上の識別コードまたは矩形枠の表示を端末装置４６のポインタ等でユーザー直接指定することによって、端末装置４６から制御装置４１に対して識別コードの入力が行われることとなる。

本実施形態では、ユーザーは位相差画像から培養情報を参照する細胞を個別に指定入力できるので、検索処理時の操作性をより向上させることができる。なお、ユーザーは、Ｓ３０１において、端末装置４６で複数の細胞を一度に指定することも可能である。

ステップＳ３０２：ＣＰＵ４３は、入力された識別コード（Ｓ３０１）をキーとして、ユーザーの指定する細胞の培養情報を記憶部４４の複数の細胞解析テーブルからそれぞれ抽出する。

ステップＳ３０３：ＣＰＵ４３は、観察時点の異なる複数の細胞解析テーブルから抽出された細胞の培養情報を端末装置４６に対して出力する。これにより、ユーザーは、端末装置４６のモニタにおいて時間軸方向に連続した細胞の培養情報を取得できる。

ここで、ＣＰＵ４３は、ユーザーの選択に応じて、上記の細胞の培養情報を以下の（１）から（３）のいずれかの表示形式で端末装置４６のモニタに表示させることができる。

（１）ＣＰＵ４３は、各観察時点における細胞形態データ、蛍光データおよび属性データを、識別コード別に一覧表示できる形式で端末装置４６のモニタに表示させる。

図１０に、各観察時点における細胞形態データ等の一覧表示画面の一例を示す。この表示画面では、観察時点ｔ₀〜ｔ_nまでの細胞形態データ、蛍光データ、属性データの各内容が表示される。

具体的には、細胞形態データに関連する項目としては、「細胞の重心位置」、「細胞の移動量および移動速度」、「矩形枠のサイズ」、「矩形枠内の細胞の面積比」がモニタに表形式で表示される。また、各観察時点での細胞のトリミング画像も画面上に表示される。

蛍光データに関連する項目としては、「細胞内の蛍光領域の数（発光点数）」、「細胞内での蛍光の輝度平均値および輝度面積」がモニタに表形式で表示される。また、上記の画面では、個々の発光点について「蛍光領域の重心位置」、「輝度平均」、「輝度面積」もそれぞれモニタに表示される。なお、所定の観察時点において細胞に蛍光領域がない旨のデータが記録されている場合には、図１０の表では「−」が表示される。

また、属性データの項目としては、「細胞の属性（単独、連結など）」、「付加データとして記録された識別コード（細胞番号）」、「細胞状態」がモニタに表形式で表示される。

図１０の一覧表示画面では、ユーザーが特定の細胞に着目して、細胞の状態の経時的な変化を把握することが可能となる。例えば、ユーザーは、観察時点ｔ₀〜ｔ_nでの細胞形態の変化および細胞分裂等の有無や、各観察時点ｔ₀〜ｔ_nでのそれぞれの蛍光検出の有無および蛍光の強弱などの情報を得ることができる。

そのため、ユーザーは特定の細胞について、細胞分裂、細胞老化、細胞死などの細胞挙動を把握した上で細胞の蛍光情報を取得できる。さらに、ユーザーは、特定の細胞について時間軸方向に連続性をもつ細胞の情報を解析することで、一連の細胞周期の中で蛍光情報を評価することが可能となる。

（２）ＣＰＵ４３は、任意の細胞を基点として細胞の分裂状態を示す樹形図と、分裂した各細胞の発光時期とを同時に示す画面を端末装置４６のモニタに表示させる。

図１１に、樹形図とともに細胞の発光時期を表示した画面の一例を示す。ここで、図１１の例では、横軸に時間をとって標記している。また、図１１では、祖先となる細胞が培養容器１９に定着し、その後に３回の細胞分裂が行われている例を示している。

図１１の画面を表示する場合、ＣＰＵ４３はＳ３０２で抽出したデータ群に含まれる付加データを参照して、指定された識別コードの細胞を含んだ細胞分裂の樹形図を生成する。次に、ＣＰＵ４３は、樹形図に含まれる各分裂細胞の蛍光データをそれぞれ参照し、各細胞の発光期間を求める。そして、ＣＰＵ４３は、上記の樹形図の上に各細胞の発光期間をそれぞれ重畳表示した画面を端末装置４６のモニタに表示させる。

図１１の表示形式によると、細胞周期および発光時期の相関が可視化されるので、細胞内の遺伝子の発現の観察や医薬品のスクリーニングの判定などが容易となる。例えば、図１１は、細胞周期においてＤＮＡ複製期間（合成期）にあるときのみに蛍光を発するように処置したがん細胞を培養し、所定の時点Ａに抗がん剤を投与したケースを示す。一般的に、細胞の合成期の持続時間は、その細胞種に固有の値をとる。しかし、図１１のケースでは抗がん剤を投与したＡの時点より後で細胞が蛍光を発する期間（合成期の持続時間）が変化している。細胞周期が遅延する理由は様々であるが、図１１の例では、投与した抗がん剤が細胞の合成期に作用してＤＮＡの複製を阻害する機能を発揮していると推察できる。

（３）なお、ＣＰＵ４３は、複数の細胞の発光時期を統計的に処理した結果を示す画面を端末装置４６のモニタに表示させてもよい。一例として、ＣＰＵ４３は、発光時期の長さと細胞の数との相関を示すヒストグラムや、観察対象の細胞の一般的な細胞周期と観察した各細胞の発光期間とのズレの大きさを示すグラフなどを端末装置４６のモニタに表示させる。特に観察対象の細胞が膨大な数となる場合には、かかる表示によれば培養している細胞の傾向を概略的に把握できるので、装置の利便性をより向上させることが可能となる（なお、Ｓ３０３での（３）の場合の表示画面の図示はいずれも省略する）。

ステップＳ３０４：ＣＰＵ４３は、ユーザーから再検索を行う旨の入力を受け付けたか否かを判定する。上記入力を受け付けた場合（ＹＥＳ側）には、ＣＰＵ４３はＳ３０１に戻って上記動作を繰り返す。一方、上記入力がない場合（ＮＯ側）にはＳ３０５に移行する。

ステップＳ３０５：ＣＰＵ４３は、検索処理の終了操作を受け付けたか否かを判定する。上記入力を受け付けた場合（ＹＥＳ側）には、ＣＰＵ４３は検索処理のシーケンスプログラムを終了して待機状態に移行する。一方、上記入力がない場合（ＮＯ側）にはＣＰＵ４３はＳ３０４に戻って上記動作を繰り返す。以上で図７の流れ図の説明を終了する。

本実施形態の培養装置１１の制御装置４１は、同一視野を連続的に撮像して得た位相差画像と蛍光画像とを用いて細胞解析テーブルを生成する。そして、制御装置４１は、細胞解析テーブル間での細胞の位置や形態に基づいてテーブル間で各細胞を対応付けし、観察時点の異なる複数の細胞解析テーブルを共通性のある細胞に着目して時間軸方向に検索できるようにする。

そのため、ユーザーは特定の細胞をトラッキングして、時間軸方向に連続性をもつ細胞の培養状態の情報を取得することが可能となり、細胞の形態、状態と細胞周期との因果関係を解明するための有効な手段を得ることができる。

（実施形態の補足事項）
（１）上記実施形態では、培養装置１１の制御装置４１がプログラムを実行することで細胞解析テーブルをデータベース化する例を説明した。しかし、上記実施形態において、画像入力処理、透過観察画像解析処理、蛍光画像解析処理、発光判定処理、テーブル生成処理、同一性判定処理、データベース生成処理を含むプログラムを端末装置４６に実行させるようにしてもよい。

（２）上記実施形態では、培養容器の定点をタイムラプス観察して、細胞の位相差画像および蛍光画像を同一視野で撮像する例を説明した。しかし、上記実施形態において、注目する細胞の移動に伴って撮像装置３３ａの視野を移動させて細胞をトラッキングし、細胞の位相差画像および蛍光画像を同一視野で撮像するようにしてもよい。

（３）上記実施形態において、観察ユニット２２は位相差画像に代えて微分干渉観察による画像を撮像するようにしてもよい。また、上記実施形態における流れ図の処理はあくまで一例であって、各々の処理工程を適宜修正してもかまわない。例えば、蛍光画像と位相差画像の撮影順を変更してもよい。また、Ｓ１０５での細胞解析テーブル生成処理を制御装置４１がバッチ処理するように変更してもよい。

なお、本発明は、その精神またはその主要な特徴から逸脱することなく他の様々な形で実施することができる。そのため、上述した実施形態はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。本発明は、特許請求の範囲によって示されるものであって、本発明は明細書本文にはなんら拘束されない。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する変形や変更は、全て本発明の範囲内である。

Claims (9)

1. 所定の環境条件で細胞を培養する恒温室と、前記恒温室内で前記細胞の顕微観察画像を撮像する撮像装置とを備えた培養装置を用いて前記細胞の培養状態を解析するコンピュータに対して、
   前記撮像装置が同一視野を連続的に撮像して生成された透過観察画像のデータおよび蛍光画像のデータを前記コンピュータに読み込ませる画像入力処理と、
   前記透過観察画像のデータを用いて、各々の前記細胞に対応する識別データと各々の前記細胞の位置および形態を示す細胞形態データとを生成する透過観察画像解析処理と、
   前記蛍光画像のデータを用いて、前記視野内での蛍光検出状態を示す蛍光データを生成する蛍光画像解析処理と、
   前記細胞形態データの示す前記細胞の位置と前記蛍光データの示す発光位置とを写像して、各々の前記細胞の発光状態を求める発光判定処理と、
   前記細胞形態データおよび前記発光状態のデータを前記識別データにそれぞれ対応付けして、タイムラプス観察における各観察時期での各々の前記細胞の状態を示す細胞解析テーブルを生成するテーブル生成処理と、
   前記細胞形態データを用いて前記細胞の同一性を判定し、前記観察時期の異なる複数の前記細胞解析テーブル間での前記識別データの対応関係を求める同一性判定処理と、
   前記同一性判定処理で求めた前記識別データの対応関係に基づいて、前記観察時期の異なる複数の前記細胞解析テーブルを、共通性のある前記細胞ごとに時間軸方向へ検索可能にデータベース化して記憶媒体に記録するデータベース生成処理と、
   を前記コンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
2. 請求項１に記載のプログラムにおいて、
   前記コンピュータは、透過観察画像のデータを前記記憶媒体にさらに記録し、
   前記透過観察画像を表示装置に対して出力する画像表示処理と、
   前記透過観察画像に含まれる前記細胞のうちから検索対象の指定を受け付ける指定処理と、
   前記検索対象の前記細胞に対応する前記細胞解析テーブルの項目を前記表示装置に対して出力する結果表示処理と、
   を前記コンピュータにさらに実行させることを特徴とするプログラム。
3. 請求項１または請求項２に記載のプログラムにおいて、
   前記細胞の形態に基づき、前記細胞の分裂または結合を検出するグループ判定処理と、
   前記細胞の分裂または結合を検出したときに、分裂または結合した前記細胞に対応する前記識別データを相互に関連付ける付加データを生成する付加データ生成処理と、
   を前記コンピュータにさらに実行させることを特徴とするプログラム。
4. 請求項１に記載のプログラムにおいて、
   検索対象となる細胞の指定を受け付ける指定処理と、
   複数の前記細胞解析テーブルのうちから前記検索対象に関する前記発光状態のデータをそれぞれ抽出し、タイムラプス観察における前記検索対象の前記細胞の発光時期を示す画面を表示装置に対して出力する結果表示処理と、
   を前記コンピュータにさらに実行させることを特徴とするプログラム。
5. 請求項４に記載のプログラムにおいて、
   前記コンピュータは、分裂した前記細胞に対応する前記識別データを相互に関連付ける付加データを前記記憶媒体にさらに記録し、
   前記結果表示処理にて、前記付加データに基づいて、前記検索対象を含む前記細胞の分裂状態を示す樹形図と、分裂した各細胞の発光時期とを同時に示す画面を前記表示装置に対して出力することを特徴とするプログラム。
6. 請求項４に記載のプログラムにおいて、
   前記結果表示処理にて、複数の前記細胞についての前記発光時期のデータを統計的に処理した結果を前記表示装置に対して出力することを特徴とするプログラム。
7. 請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のプログラムの各処理を実行するコンピュータ。
8. 所定の環境条件で細胞を培養する恒温室と、前記恒温室内で前記細胞の顕微観察画像を撮像する撮像装置とを備えた培養装置からデータを取得するコンピュータを用いた培養状態解析方法であって、
   前記撮像装置が同一視野を連続的に撮像して生成された透過観察画像のデータおよび蛍光画像のデータを前記コンピュータに読み込ませる画像入力処理と、
   前記透過観察画像のデータを用いて、各々の前記細胞に対応する識別データと各々の前記細胞の位置および形態を示す細胞形態データとを前記コンピュータが生成する透過観察画像解析処理と、
   前記蛍光画像のデータを用いて、前記視野内での蛍光検出状態を示す蛍光データを前記コンピュータが生成する蛍光画像解析処理と、
   前記細胞形態データの示す前記細胞の位置と前記蛍光データの示す発光位置とを写像して、各々の前記細胞の発光状態を前記コンピュータが求める発光判定処理と、
   前記細胞形態データおよび前記発光状態のデータを前記識別データにそれぞれ対応付けして、タイムラプス観察における各観察時期での各々の前記細胞の状態を示す細胞解析テーブルを前記コンピュータが生成するテーブル生成処理と、
   前記細胞形態データを用いて前記細胞の同一性を判定し、前記観察時期の異なる複数の前記細胞解析テーブル間での前記識別データの対応関係を前記コンピュータが求める同一性判定処理と、
   前記同一性判定処理で求めた前記識別データの対応関係に基づいて、前記観察時期の異なる複数の前記細胞解析テーブルを、共通性のある前記細胞ごとに時間軸方向へ検索可能にコンピュータがデータベース化して記憶媒体に記録するデータベース生成処理と、
   を備えることを特徴とする培養状態解析方法。
9. 請求項８に記載の培養状態解析方法において、
   検索対象となる細胞の指定を前記コンピュータが受け付ける指定処理と、
   複数の前記細胞解析テーブルのうちから前記検索対象に関する前記発光状態のデータをそれぞれ抽出し、タイムラプス観察における前記検索対象の前記細胞の発光時期を示す画面を前記コンピュータが表示装置に対して出力する結果表示処理と、
   をさらに備えることを特徴とする培養状態解析方法。
   

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