JP2012039927A

JP2012039927A - 細胞画像解析装置及び方法

Info

Publication number: JP2012039927A
Application number: JP2010183503A
Authority: JP
Inventors: Toshiyuki Yoshida; 俊之吉田; Yutaka Nakano; 豊仲野; Masaya Oki; 昌也沖; Hiroyuki Uchida; 博之内田; Kyonobu Mano; 恭伸眞野; Akira Hatanaka; 彬良畑中
Original assignee: University of Fukui NUC
Current assignee: University of Fukui NUC
Priority date: 2010-08-18
Filing date: 2010-08-18
Publication date: 2012-03-01

Abstract

【課題】本発明は、蛍光タンパク質を用いた場合でも細胞の遺伝子の発現を複数世代にわたって正確に解析可能な細胞画像解析装置を提供する。
【解決手段】細胞画像解析装置１の処理部１０は、細胞観察装置２で培養された細胞を撮影した撮影画像のエッジ画像を生成し、エッジ画像により分割された画像領域のうち背景領域を特定して細胞領域を決定する画像処理部１０３、任意の撮影画像の細胞領域を直前の撮影画像の細胞領域と重ね合せて対応する細胞領域に同一の識別情報を付与するとともに細胞分裂と判定された場合にも対応する細胞領域に同一の識別情報を付与する識別処理部１０４、細胞に紫外線を照射して撮影された蛍光画像と撮影画像の細胞領域とを重ね合わせて各細胞領域の色の属性に対応して発現情報を付与する発現処理部１０５を備えている。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡等で撮影された酵母等の細胞画像を解析する細胞画像解析装置及び方法に関する。

近年細胞を用いた実験を行う場合に細胞を生きたままの状態で長期間にわたって顕微鏡により観察できる実験装置が実用化されてきている。こうした実験装置を使用することで、細胞の成長や分裂といった過程をリアルタイムで観察することができる。そして、こうした細胞の変化の過程を撮影して得られる細胞の画像データを時系列的に解析することで、細胞に生じる変化を詳細に分析することが可能となる。

生物学の分野では、生物の細胞内に存在する遺伝子の働きに着目して細胞の成長や分裂といった過程を解明する研究が行われている。こうした研究分野の中で、同一のＤＮＡを有する複数の細胞において細胞によって異なる性質を有する現象を解明するエピジェネティクスという領域に注目が集まっている。

エピジェネティクスに関する研究領域では、個体を構成する細胞は、同一の遺伝子を有しているにもかかわらず、発生・分化の過程において細胞の遺伝子の発現が異なることで、それぞれ異なる器官や組織を構成するようになると考えられている。そして、こうした細胞の遺伝子の発現は親子の間で引き継がれていくことが知られている。

本発明者である沖、眞野及び内田は、出芽酵母を用い、エピジェネティックな現象の１つとして知られているサイレンジング領域の形成及び維持に関して、分子レベルのメカニズム解明に向けて研究を行っており、出芽酵母のＨＭＲ−左側領域に存在するＴｙ５−ＬＴＲをＵＲＡ３遺伝子に置換すると、個々の細胞によって遺伝子の発現のオン・オフが切り替わる班入り位置効果（ＰＥＶ；Position Effect Variegation）の表現型がみられ、リポーター遺伝子としてＨ２Ｂ−ＥＧＦＰを用いてタイムラスプ実験を行ったところ、分裂を繰り返すと蛍光が消失する細胞が確認され、蛍光が消失した細胞では分裂を繰り返すと蛍光が回復することを報告している（非特許文献１参照）。

こうした細胞の遺伝子の発現に関して複数世代にわたって継続して実験を行うことは、長時間にわたって分裂していく細胞をリアルタイムで観察する必要があり、また細胞分裂により観察する細胞数が増加することから、観察者の負担が大きく、精度の高いデータを実験により十分に得ることが困難であった。

そのため、培養する細胞を自動的に検出して細胞の経時的な変化を追跡する装置が提案されている。例えば、特許文献１では、細胞を撮影した画像から細胞に対応する領域を検出し、検出した領域の特性を示す領域パラメータを算出して識別子を付与し、各時点において領域パラメータ及び識別子を対応させて特性情報を生成し、生成した特性情報を時系列に対応付けた履歴情報を生成する対象追跡装置が記載されている。また、特許文献２では、細胞に、発光タンパク質からなるレポーター遺伝子を導入するとともに細胞核を特異的に発現するマーカー遺伝子によって標識し、レポーター遺伝子及びマーカー遺伝子の発現に伴って発生するシグナルを検知し、マーカーシグナルに基づいて細胞の同定を行うとともにレポーターシグナルに基づいて遺伝子の発現を解析する方法が記載されている。

特開２００６−２０９６９８号公報特開２００９−６５８４８号公報

日本遺伝学会第８１回大会プログラム・予稿集，２００９年９月１６日，ｐ．１１４，２Ｅ−０５）

上述したように、細胞の遺伝子の発現に関して複数世代にわたって継続して実験を行う場合、個々の細胞を正確に識別するとともに親子関係を特定する必要がある。例えば、出芽酵母を用いて実験を行う場合、酵母から出芽する位置は不特定であるため、観察方向からみて隠れた位置で出芽すると親の酵母に子の酵母が隠れてしまい、正確な観察を行うことができない。特許文献１では、個々の細胞を識別して親子関係についても履歴情報として生成するようにしているものの、観察方向から細胞が重なった状態では正確な親子関係の情報を得にくく、隠れた細胞の遺伝子の発現の有無を正確に検知できないといった問題点がある。

また、特許文献２では、発光タンパク質を用いて細胞の同定を行い、遺伝子の発現を解析するようにしているが、発光タンパク質の場合光が微弱なため長時間にわたって正確な測定が難しいといった難点がある。また、特許文献２では、蛍光タンパク質を用いた場合も記載されているが、ＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質；Enhanced Green Fluorescent Protein）といった紫外線により発光する蛍光タンパク質の場合には、紫外線照射による細胞へのダメージが大きいためダメージの回復に必要な照射間隔（４０分程度）を取って実験を行う必要があり、そのため紫外線照射しない間の細胞の分裂を捉えることが困難になって親子関係の情報を正確に得ることができない問題点がある。

そこで、本発明は、蛍光タンパク質を用いた場合でも細胞の遺伝子の発現を複数世代にわたって正確に解析することができる細胞画像解析装置及び方法を提供することを目的とするものである。

本発明に係る細胞画像解析装置は、重複しないように面状配置されて増殖する細胞を所定時間毎に可視光により撮影して得られた複数の撮影画像の画像エッジ部分を補間及び／又は強調してエッジ画像を生成するエッジ処理手段と、前記エッジ画像により分割された画像領域のうち背景領域を特定して細胞領域を決定する領域処理手段と、任意の前記撮影画像の細胞領域を直前の前記撮影画像の細胞領域と重ね合せて対応する細胞領域に同一の識別情報を付与する追跡処理手段と、任意の撮影画像の複数の細胞領域が直前の前記撮影画像の１つの細胞領域と対応する場合であって直前の前記撮影画像の当該細胞領域の形状特性に基づいて分裂したと判定された場合に各細胞領域に同一の識別情報を付与する分裂処理手段と、前記撮影画像の撮影間隔よりも長い時間間隔で撮影された細胞の蛍光画像と当該蛍光画像に時間的に最も近い前記撮影画像の細胞領域とを重ね合わせて各細胞領域の蛍光特性に対応して発現情報を付与する発現処理手段とを備えていることを特徴とする。さらに、前記細胞領域の前記識別情報及び前記発現情報に基づいて同一の遺伝子を有する複数の細胞における遺伝子発現の時間的な変化を表示する表示処理手段を備えていることを特徴とする。

本発明に係る細胞画像解析方法は、プログラムされたコンピュータによって撮影された細胞画像を解析する細胞画像解析方法であって、重複しないように面状配置されて増殖する細胞を所定時間毎に可視光により撮影して得られた複数の撮影画像の画像エッジ部分を補間及び／又は強調してエッジ画像を生成するステップと、前記エッジ画像により分割された画像領域のうち背景領域を特定して細胞領域を決定するステップと、任意の前記撮影画像の細胞領域を直前の前記撮影画像の細胞領域と重ね合せて対応する細胞領域に同一の識別情報を付与するステップと、任意の撮影画像の複数の細胞領域が直前の前記撮影画像の１つの細胞領域と対応する場合であって直前の前記撮影画像の当該細胞領域の形状特性に基づいて分裂したと判定された場合に各細胞領域に同一の識別情報を付与するステップと、前記撮影画像の撮影間隔よりも長い時間間隔で撮影された細胞の蛍光画像と当該蛍光画像に時間的に最も近い前記撮影画像の細胞領域とを重ね合わせて各細胞領域の蛍光特性に対応して発現情報を付与するステップとを前記コンピュータに実行させることを特徴とする。さらに、前記細胞領域の前記識別情報及び前記発現情報に基づいて同一の遺伝子を有する複数の細胞における遺伝子発現の時間的な変化を表示することを特徴とする。

重複しないように面状配置されて増殖する細胞を観察する場合に、細胞の外周縁が乱反射により内部に比べて明るく見えることを利用すれば、各細胞を漏れなく観察することができ、細胞を撮影した撮影画像において明度が不連続となる画像エッジ部分を補間及び／又は強調して生成したエッジ画像により細胞の外周縁に対応した複数の画像領域に分割することができる。そして、分割された画像領域のうち背景画像を特定して細胞画像に対応する細胞領域を正確に決定することが可能となる。

各撮影画像について決定された細胞領域は、直前の撮影画像の細胞領域と重ね合わせることで対応する細胞領域に同一の識別情報を付与することで細胞領域を時系列で関連させることができる。また、直前の撮影画像の１つの細胞領域と複数個の細胞領域が対応する場合では、細胞分裂の可能性が考えられるので、直前の細胞領域の形状特性に基づいて分裂したか否か判定して、分裂したと判定された場合に対応関係にある細胞領域に同一の識別情報を付与して親子関係にあることを関連付けることができる。

そして、細胞の蛍光画像を時間的に最も近い撮影画像の細胞領域と重ね合わせることで、細胞領域に対応する蛍光画像の蛍光特性に応じて発現情報を付与して、細胞領域に付与された識別情報と発現情報とを関連付けることができる。そのため、ある細胞領域及びその細胞領域と親子関係にある細胞領域について時系列で発現状態を把握することが可能となり、細胞の複数世代にわたる遺伝子発現の切り替りを正確に解析することができる。

本発明に係る細胞画像解析装置に関する概略構成図である。培養プレートに関する模式図である。培養プレートの捕捉部における細胞の捕捉動作に関する説明図である。細胞画像の解析処理に関するフローである。撮影画像と蛍光画像との関係を示す説明図である。出芽酵母の撮影画像の一例である。図６に示す撮影画像の明度に基づく抽出画像である。電気回路シミュレーション方法に関する説明図である。画像エッジ部分を補間・強調した画像である。エッジ処理したエッジ画像である。分割された複数の画像領域を示す画像である。図１１に示す画像領域をＷａｔｅｒｓｈｅｄ処理した画像である。図１２に示す画像領域から細胞の境界部分を除去した画像である。図１３に示す画像領域から背景領域を除いた細胞領域を示す画像である。追跡処理を行う場合の直前の撮影画像の細胞領域を示す説明図である。追跡処理を行う場合の撮影画像の細胞領域を示す説明図である。細胞領域の円形度の頻度分布を示すグラフである。撮影画像を時系列で配列して細胞が増殖する過程を示す説明図である。細胞群の発現情報を表示する樹形図である。

以下、本発明に係る実施形態について詳しく説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明を実施するにあたって好ましい具体例であるから、技術的に種々の限定がなされているが、本発明は、以下の説明において特に本発明を限定する旨明記されていない限り、これらの形態に限定されるものではない。

図１は、本発明に係る細胞画像解析装置に関する概略構成図である。細胞画像解析装置１には、細胞観察装置２が接続されており、細胞観察装置２で撮影された撮影画像が細胞画像解析装置１に入力されるようになっている。細胞観察装置２の観察用ステージには、培養プレート３０が載置されており、供給制御装置３は、培養プレート３０に培養液及び細胞を供給する。そして、細胞画像解析装置１は、供給制御装置３に制御信号を送信して培養液の供給制御を行う。

細胞画像解析装置１は、処理部１０、記憶部１１、表示部１２及び入力部１３を備えている。こうしたブロック構成を備えた装置は、公知のコンピュータを用いて実現できる。例えば、処理部１０に対応するＣＰＵ及びメモリ、記憶部１１に対応するハードディスク、表示部１２に対応する液晶表示パネル等のディスプレイ、入力部１３に対応するキーボード及びマウス、といった公知のハードウェアをデータ伝送路により互いに接続したコンピュータを用いればよい。

細胞観察装置２は、公知の倒立顕微鏡と同じ構造を備えており、観察用ステージ（図示せず）に載置した培養プレート３０の上方に白色光を照射する光源２０が配置され、培養プレート３０の下方には対物レンズ２１、結像レンズ２２及び撮影ユニット２３を備えている。光源２０から照射された白色光は、培養プレート３０を透過して対物レンズ２１に入射し、結像レンズ２２を介して撮影ユニット２３の撮影面に細胞の像が結像するようになる。

撮影ユニット２３は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等の固体撮像素子を撮影面に配列しており、撮影面に結像した細胞の像は固体撮像素子の光電変換によって撮影画像として出力される。出力された撮影画像は、細胞画像解析装置１に送信される。

対物レンズ２１及び結像レンズ２２の間には、ダイクロイックミラー２５がセットされており、紫外線を照射する光源２４からの紫外線がダイクロイックミラー２５により反射して培養プレート３０に照射するように設定されている。そして、紫外線の照射により励起された細胞からの蛍光はダイクロイックミラー２５を透過して結像レンズ２２に入射するようになる。また、励起光ダイクロイックミラー２５は、蛍光画像を撮影する際に対物レンズ２１及び結像レンズ２２の間にセットされ、それ以外はセット位置から退避位置に移動するようになっている。

培養プレート３０は、出芽酵母等の細胞のサイズよりも狭い間隔に形成された一対の対向する捕捉面の間に細胞を捕捉して観察できるようになっている。図２は、培養プレート３０に関する模式図である。培養プレート３０は、基板３００の上面に、細胞の投入口３０１、培養液の供給口３０２及び排出口３０３が形成されており、投入口３０１から流路３０４を介して捕捉部３０６が設けられている。また、供給口３０２及び排出口３０３の間は流路３０５により連通しており、流路３０５は捕捉部３０６に隣接して形成されて捕捉部３０６に連通している。

図３は、図２のＡ−Ａ断面図で、捕捉部３０６における細胞の捕捉動作に関する説明図である。まず、投入口３０１から細胞Ｃが投入されると、細胞Ｃは流路３０４を通り、捕捉部３０６に到達する（図３（ａ））。捕捉部３０６は、ＰＤＭＳのような変形可能なエラストマーで形成されており、基板３００との間の間隔ｈは細胞Ｃのサイズよりも小さくなるように設定されている。そのため、捕捉部３０６に到達した細胞Ｃは、基板３００との間の隙間には入り込むことはない。次に、投入口３０１から所定の流体圧力を印加することで、圧力により捕捉部３０６を変形させて基板３００との間の間隔を拡げ、細胞Ｃのサイズよりも大きい間隔ｈ’に設定する（図３（ｂ））。間隔が拡げられることで、細胞Ｃが基板３００と捕捉部３０６との間に送り込まれるようになる。細胞Ｃが送り込まれた後、投入口３０１に印加した流体圧力を解除して捕捉部３０６を元の状態に戻すことで、間隔ｈに戻り、送り込まれた細胞Ｃは捕捉部３０６に捕捉された状態となる。なお、捕捉部３０６の間隔を拡げるために、捕捉部３０６の外部から加わる空気圧を変更するようにしてもよい。この場合には、捕捉部３０６へ加わる空気圧を投入口３０１からの流体圧力よりも低圧にすることで、図３（ｂ）に示すように、捕捉部３０６の間隔を拡げることができる。

流路３０５に流通する培養液は、捕捉部３０６に流入するが、捕捉部３０６を変形させる圧力よりは小さい流体圧力で流通するため、捕捉された細胞Ｃに常時培養液が供給されるようになり、細胞Ｃは捕捉された状態で増殖するようになる。そして、捕捉部３０６での間隔が細胞Ｃのサイズよりも小さいため、細胞Ｃから増殖する細胞は捕捉部３０６の捕捉面に沿って面状に拡がっていく。そのため、捕捉面と交差した方向から見た場合、分裂した子細胞が親細胞と重複することなく面状に配列されていくようになり、細胞を複数世代にわたって確実に観察することが可能となる。

供給制御装置３は、培養プレート３０の投入口、供給口及び排出口と連通する連通管で培養プレート３０と接続されており、弁及びポンプ等を駆動して培養液の供給動作及び流体圧力制御動作を行う。

処理部１０は、供給制御装置３に対して制御信号を送信して供給制御を行う供給制御部１０１を備えている。供給制御部１０１は、入力部１３から入力された設定データに基づいて供給制御装置３の弁及びポンプ等の作動部を駆動制御する制御信号を送信して捕捉部３０６に捕捉された細胞を安定した環境下で増殖できるように制御する。

また、処理部１０は、白色光を照射する光源２０及び紫外線を照射する光源２４に制御信号を送信して照射制御する照射制御部１０２を備えている。照射制御部１０２では、光源２０及び２４の光量調整や照射タイミングの制御を行う。例えば、光源２０による白色光が培養プレート３０の捕捉部３０６を透過して捕捉された細胞の像を撮影ユニット２３の撮影面に結像させて撮影画像を出力するとともに、光源２０からの光を遮光して光源２４からの紫外線を捕捉された細胞に照射して蛍光画像を出力する。

処理部１０では、撮影ユニット２３で撮影された撮影画像及び蛍光画像を撮影された時刻情報とともに記憶部１１に保存する。そして、処理部１０は、保存された撮影画像を処理して細胞領域を決定する画像処理部１０３、各撮影画像の細胞領域を対応付けて識別情報を付与する識別処理部１０４、保存された蛍光画像に基づいて遺伝子発現の有無に対応して細胞領域に発現情報を付与する発現処理部１０５、及び、細胞領域の識別情報及び発現情報に基づいて細胞の遺伝子発現の時間的な変化を表示する表示処理部１０６を備えている。

後述するように、画像処理部１０３は、複数の撮影画像の画像エッジ部分を補間及び／又は強調してエッジ画像を生成するエッジ処理手段及びエッジ画像により分割された画像領域のうち背景領域を特定して細胞領域を決定する領域処理手段として機能する。また、識別処理部１０４は、撮影画像の細胞領域を直前の撮影画像の細胞領域と重ね合せて対応する細胞領域に同一の識別情報を付与する追跡処理手段及び任意の撮影画像の複数の細胞領域が直前の撮影画像の１つの細胞領域と対応する場合であって直前の撮影画像の当該細胞領域の形状特性に基づいて分裂したと判定された場合に各細胞領域に同一の識別情報を付与する分裂処理手段として機能する。また、発現処理部１０５は、撮影画像の撮影間隔よりも長い時間間隔で撮影された細胞の蛍光画像と当該蛍光画像に時間的に最も近い撮影画像の細胞領域とを重ね合わせて各細胞領域の蛍光特性に対応して発現情報を付与する発現処理手段として機能する。

以上説明した処理部１０の各部における機能を実現するためのプログラムが記憶部１１に格納されており、処理部１０では、必要に応じてプログラムを読み出して各部の機能を実現するようになっている。

図４は、細胞画像の解析処理に関するフローである。まず、細胞観察装置２から細胞の撮影画像及び蛍光画像を取得する（Ｓ１００）。撮影画像は、所定時間（例；３０秒）毎に撮影ユニット２３で撮影し、蛍光画像は、撮影画像の撮影間隔より長い時間（例；４０分）毎に撮影ユニット２３で撮影する。蛍光画像の撮影には、細胞に対して紫外線を照射するので、細胞に紫外線によるダメージが生じるため、そのダメージが十分回復するだけの時間間隔を置いて蛍光画像を撮影するようにする。

図５は、撮影画像Ｐと蛍光画像Ｆとの関係を示す説明図である。撮影画像Ｐは、所定時間毎にＰ₁、Ｐ₂、・・・、Ｐ_k、・・・、Ｐ_2k、・・・と時系列で取得され、蛍光画像Ｆは、撮影画像Ｐ₁、Ｐ_k、Ｐ_2k・・・に同期して蛍光画像Ｆ₀、Ｆ₁、Ｆ₂・・・が取得される。したがって、撮影画像Ｐの所定枚数毎に蛍光画像Ｆが取得されるようになる。なお、蛍光画像Ｆの撮影タイミングは、撮影画像Ｐの撮影タイミングに正確に合わせる必要はなく、細胞の変化があまり生じない範囲内で両方の撮影タイミングを設定すればよい。

次に、取得された撮影画像についてエッジ処理を行い、複数の画像領域に分割する（Ｓ１０１）。例えば、図６に示すような、出芽酵母の撮影画像の場合、明度７０以上の領域を抽出する（図７参照）。酵母の外周縁は、乱反射により内部に比べて明るく見えるため、酵母の外周縁が抽出されるようになる。しかしながら、明度の差だけでは酵母の輪郭を明確に抽出することが困難で、どうしても途切れた部分が生じてしまう。そのため、酵母の外周縁を補間及び／又は強調するエッジ処理を行う。

まず、電気回路シミュレーションに基づく公知の補間・強調処理を行う（参考文献；吉田俊之外２名：「電気回路シミュレーションに基づく画像エッジの補間・強調処理とその画像セグメンテーションへの応用」，電子情報通信学会論文誌，VOL.J85-A，No.10，p.1079-1090）。図８は、この手法に関する説明図である。図８（ａ）に示すような、画像エッジを示す画像Ｓがある場合、エッジ強度の強い部分であるパスａや孤立点ｃを低抵抗部分とし、それ以外を高抵抗部分とする抵抗シートを想定する。そして、図８（ｂ）に示すように、画像Ｓから得られた仮想の抵抗シートの両側に電極を形成して電極に電源ｄを接続する。そして、図８（ｃ）に示すように、抵抗シートに電圧を加えた場合の電流の流れをシミュレーションする。この例では、パスａに電流が流れるようになり、パスａの途切れた部分ｂにも電流がある程度流れるようになる。これに対して、孤立点ｃは、高抵抗部分に囲まれているため電流がほとんど流れないので、仮想の抵抗シートの電流分布を画像エッジの強さに変換すれば、電流の流れる途切れた部分ｂを補間し、ノイズとなる孤立点ｃを除去して酵母の外周縁に相当する画像エッジ部分を強調することができる。

図９は、電気回路シミュレーション手法により画像エッジ部分を補間・強調した画像である。図７に示す抽出画像に比べて細胞の外周縁に相当する画像エッジ部分が途切れることなく連続するように補間されて強調されている。そして、図９に示す画像に対して明度４０以上の領域を抽出して細胞の外周縁である輪郭に対応するエッジ画像を得る（図１０参照）。

次に、エッジ処理により得られたエッジ画像に基づいて複数の画像領域に分割して細胞領域を決定する（Ｓ１０２）。図１０に示すエッジ画像の反転画像を生成して、反転された画像領域のうち、画像上での細胞の大きさに応じ、例えば１０画素以上１０００画素以下の画像領域を抽出して複数の分割された画像領域を得る（図１１参照）。得られた複数の画像領域に対応する図１０に示すエッジ画像で囲まれた領域に対して公知のＷａｔｅｒｓｈｅｄ処理を行い、線幅１の境界線で囲まれた複数の画像領域を設定する（図１２参照）。次に、細胞の境界部分（乱反射により明るい部分）を除いて細胞領域を決定するため、図７に示す抽出領域を境界部分とみなして図１２の画像領域から除去する（図１３参照）。

図１３に示す画像領域では、細胞領域の間に背景領域が見えている場合も含まれているため、背景領域を除く必要がある。まず、図１３に示す画像領域を含むすべての画像領域について撮影画像における明度のヒストグラムを作成する。次に、各画像領域を「背景」及び「細胞」の２つのグループに振り分ける。最初の振り分けでは、最も面積の大きい画像領域を「背景」グループに振り分け、残りすべてを「細胞」グループに振り分ける。そして、各グループ内の画像領域について各領域の明度のヒストグラムの平均値を求めて、平均値による各グループのヒストグラムを作成する。作成された各グループのヒストグラムを各画像領域のヒストグラムを比較して、ヒストグラムで設定したすべての明度での差を求めて合計し、合計値が少ないグループにその画像領域を振り分ける。

新たに振り分けられた「背景」グループ及び「細胞」グループに対して、再度各グループのヒストグラムを作成して各画像領域のヒストグラムと比較して画像領域の振り分けを繰り返していき、新たな画像領域の振り分けが行われなくなるまで処理を行う。こうして振り分けられた「背景」グループの画像領域を背景領域とし、「細胞」グループの画像領域を細胞領域とすることで、背景領域を正確に特定して細胞領域を決定することができる。図１４は、上述した処理により図１３に示す画像領域から背景領域を除いた細胞領域を抽出した画像を示している。

なお、背景領域の特定を行う場合には、背景となる壁面に予め模様等の表示を行い、その表示がある画像領域を背景領域と特定して除くようにしてもよい。

次に、各撮影画像において得られた細胞領域に対して直前の撮影画像の細胞領域との対応関係をみて細胞領域の追跡処理を行う（Ｓ１０３）。追跡処理では、各撮影画像について撮影タイミングが直前となる撮影画像との間で両者の細胞領域を重ね合わせて最も重なり合う細胞領域に同一の識別ラベルを付与する。

撮影画像の撮影間隔が短い場合（例；３０秒）、ほとんどの細胞領域は直前の細胞領域と重なり合うようになり、同一の識別ラベルが付与される。直前の撮影画像の細胞領域に対して複数の細胞領域が重なり合う場合には、最も面積の大きい細胞領域が重なり合うものとして直前の細胞領域と同一の識別ラベルを付与する。

図１５及び図１６は、時系列で隣接する２つの撮影画像から抽出した細胞領域を示しており、図１５に示す細胞領域が図１６に示す細胞領域の直前の撮影画像から抽出したものである。

図１５及び図１６に示す例では、直前の細胞領域における細胞領域Ｃ１に対して細胞領域Ｃ１’が重なり合うようになり、両方の細胞領域に同一の識別ラベルを付与する。また、この例では、細胞領域Ｃ２に対して細胞領域Ｃ２’及びＣ３’が重なり合うようになっている。細胞領域Ｃ２’及びＣ３’の重なり合う面積をみると、細胞領域Ｃ２’が細胞領域Ｃ２に重なり合う面積が最も大きいので、細胞領域Ｃ２及びＣ２’に同一の識別ラベルを付与する。

しかしながら、出芽酵母の細胞分裂が生じた場合にも直前の細胞領域に対して複数の細胞領域が重なり合うようになることから、細胞分裂を考慮して識別ラベルを付与する必要がある。そのため、細胞分裂により複数の細胞領域が重なり合うようになったか判定して細胞分裂の場合には重なり合う細胞領域に同一の識別ラベルを付与する分裂処理を行う（Ｓ１０４）。細胞分裂の判定は、細胞領域の形状特性に基づいて行う。細胞領域の形状特性を示すパラメータとしては、円形度、細胞領域を囲む境界線の曲率分布、フーリエ又はウェーブレット記述子等の変換領域における係数分布、凸包との面積差又は面積比といったものが挙げられる。そして、こうした形状パラメータを細胞領域の形状から算出して所定の閾値と比較して判定すればよい。ここでは、細胞分裂の判定を円形度に基づいて行う。円形度は以下の式により算出することができる。
円形度＝（４π×面積）／（周囲長）²
ここで、「面積」は細胞領域の画素数で、「周囲長」は、細胞領域の境界線に沿って縦横方向へ移動する場合は１を加算し、斜め方向に移動する場合は√２を加算するようにした境界線１周分の総和とする。

円形度は、真円の場合に最大値が１となり、真円から形が変化するに従い値が小さくなる。酵母のような細胞では通常楕円形であるため、円形度は０．９程度となるが、出芽した状態では細胞領域Ｃ２のようなヒョウタン形となるため、円形度は０．８程度に低下する。図１７は、実際に細胞分裂した多数の出芽酵母について細胞領域の円形度の頻度分布を示すグラフである。このグラフをみると、円形度を０．８５に設定することで、細胞分裂中の細胞であるか否か正確に判定することができる。

したがって、直前の細胞領域と複数の細胞領域が重なり合う場合には、直前の細胞領域の円形度を算出し、円形度が０．８５以下の場合には細胞分裂により複数の細胞領域が重なり合うようになったと判定して、重なり合う細胞領域に対してすべて同じ識別ラベルを付与する。

以上のように各撮影画像の細胞領域の間を対応付ける識別ラベルを付与し、同一識別ラベルの細胞領域を追跡することで、細胞領域の経時変化をみることができるとともに細胞分裂により親子関係にある細胞領域についても経時変化をみることができ、複数世代にわたって細胞の変化を追跡することができるようになる。

次に、蛍光画像に基づいて細胞領域に対応付けて発現情報を付与する発現処理を行う（Ｓ１０５）。まず、蛍光画像と同期して撮影した撮影画像の細胞領域（図１４参照）を読出して蛍光画像と重ね合わせる。そして、細胞領域の内部における蛍光画像の蛍光特性に応じた発現情報を付与する。

発現情報としては、例えば、色の属性（色相、彩度、明度）が挙げられる。１つの遺伝子の発現状態の指標としては明度が所定値以上であるか否かにより付与したり、所定の色の有無により付与すればよい。また、複数の遺伝子の発現状態の指標としてはそれぞれの発現状態に対応する複数色が所定値以上の明度であるか否かで付与すればよい。

色の属性以外にも、蛍光色に関するヒストグラム、ヒストグラムから抽出される平均値、モード値、分散等の統計量、蛍光色に関する空間分布といったデータに基づき所定の閾値と比較して発現情報を付与するようにしてもよい。

以上のような処理により、各撮影画像の細胞領域にそれぞれ識別ラベルが付与されて関連付けられ、蛍光画像と同期した撮影画像の細胞領域には発現情報が付与されるので、細胞領域の経時変化に対応して発現情報がどのように変化したのかを正確に把握することができるようになる。

次に、識別ラベル及び発現情報に基づいて遺伝子発現状態を表示する表示処理を行う（Ｓ１０６）。図１８は、撮影画像を時系列で配列して細胞が増殖する過程を示す説明図である。撮影画像には同一の識別ラベルを付与した細胞領域を黒色で表示して重ね合わせており、親子関係にある細胞群の時間的変化を表示している。また、黒色で表示した細胞領域の発現情報についても別のカラー表示で重ね合わせることで、親子関係にある同一の遺伝子を有する細胞群について遺伝子発現状態の経時的変化を表示することができる。

また、親子関係にある細胞群の発現情報を抽出して樹形図で表示することもできる。図１９は、細胞群の発現情報を複数世代にわたって系統的に表示する樹形図である。最上位の親細胞及び親細胞から細胞分裂により生まれた子細胞を○印で表示しており、子細胞は左側に枝分かれして示されている。そして、○印が灰色の丸印の場合には遺伝子が発現していることを示し、白丸の場合には遺伝子の発現が抑制されていることを示している。各細胞については上位から下位に行くに従い時間が経過しており、同じ細胞でも遺伝子の発現が切り替わること及び親子間で遺伝子の発現の切り替わりが生じていること等を明確に表示することができる。

このように、細胞領域に付与された識別ラベル及び発現情報を用いることで、細胞の遺伝子の発現状態を複数世代にわたって正確に表示することができ、また識別ラベル及び発現情報に基づいて同一の遺伝子を有する細胞の増殖過程における遺伝子の発現状態を定量的に分析することも可能となる。

なお、上述した例では、細胞画像解析装置１は、細胞観察装置２を制御して直接撮影画像及び蛍光画像を取得するように構成されているが、細胞画像解析装置１単体で構成してもよい。その場合には、記録媒体に別途格納された撮影画像及び蛍光画像を装置にセットして記憶部１１に画像データを保存するようにすればよく、またネットワークを介して外部装置から送信された撮影画像及び蛍光画像を取得するようにしてもよい。そして、処理部１０における供給制御部１０１及び照射制御部１０２を省略することができる。

１細胞画像解析装置
２観察装置
３供給制御装置
10 処理部
11 記憶部
12 表示部
13 入力部

Claims

重複しないように面状配置されて増殖する細胞を所定時間毎に可視光により撮影して得られた複数の撮影画像の画像エッジ部分を補間及び／又は強調してエッジ画像を生成するエッジ処理手段と、前記エッジ画像により分割された画像領域のうち背景領域を特定して細胞領域を決定する領域処理手段と、任意の前記撮影画像の細胞領域を直前の前記撮影画像の細胞領域と重ね合せて対応する細胞領域に同一の識別情報を付与する追跡処理手段と、任意の撮影画像の複数の細胞領域が直前の前記撮影画像の１つの細胞領域と対応する場合であって直前の前記撮影画像の当該細胞領域の形状特性に基づいて分裂したと判定された場合に各細胞領域に同一の識別情報を付与する分裂処理手段と、前記撮影画像の撮影間隔よりも長い時間間隔で撮影された細胞の蛍光画像と当該蛍光画像に時間的に最も近い前記撮影画像の細胞領域とを重ね合わせて各細胞領域の蛍光特性に対応して発現情報を付与する発現処理手段とを備えていることを特徴とする細胞画像解析装置。
前記細胞領域の前記識別情報及び前記発現情報に基づいて同一の遺伝子を有する複数の細胞における遺伝子発現の時間的な変化を表示する表示処理手段を備えていることを特徴とする請求項１に記載の細胞画像解析装置。
プログラムされたコンピュータによって撮影された細胞画像を解析する細胞画像解析方法であって、
重複しないように面状配置されて増殖する細胞を所定時間毎に可視光により撮影して得られた複数の撮影画像の画像エッジ部分を補間及び／又は強調してエッジ画像を生成するステップと、
前記エッジ画像により分割された画像領域のうち背景領域を特定して細胞領域を決定するステップと、
任意の前記撮影画像の細胞領域を直前の前記撮影画像の細胞領域と重ね合せて対応する細胞領域に同一の識別情報を付与するステップと、
任意の撮影画像の複数の細胞領域が直前の前記撮影画像の１つの細胞領域と対応する場合であって直前の前記撮影画像の当該細胞領域の形状特性に基づいて分裂したと判定された場合に各細胞領域に同一の識別情報を付与するステップと、
前記撮影画像の撮影間隔よりも長い時間間隔で撮影された細胞の蛍光画像と当該蛍光画像に時間的に最も近い前記撮影画像の細胞領域とを重ね合わせて各細胞領域の蛍光特性に対応して発現情報を付与するステップと
を前記コンピュータに実行させることを特徴とする細胞画像解析方法。
前記細胞領域の前記識別情報及び前記発現情報に基づいて同一の遺伝子を有する複数の細胞における遺伝子発現の時間的な変化を表示することを特徴とする請求項３に記載の細胞画像解析方法。