CN101918809B - 识别和处理微粒的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及相应群体内感兴趣成分的优化选择和分离，和/或一系列后续操作的应用。本发明涉及一种方法，包括步骤：a)针对每个微粒，识别多个特性参数中的至少一个；b)选择感兴趣微粒，将针对这些感兴趣微粒中的每一个的至少一个参数与相应参考参数进行比较。所述方法还包括步骤：c)针对所述微粒中的每一个，存储识别的至少一个参数；d)对所述存储参数的函数的值进行处理，将所述函数与感兴趣微粒的选择标准相关联，所述选择标准是从一组可能选择标准中选择的；e)针对每个微粒建立要用作所述参考参数的阈值标准。每次基于以上处理的结果建立所述阈值标准。

Description

识别和处理微粒的方法和设备
技术领域
本发明涉及用于处理细胞的小型化方法和器件。具体地，本发明涉及用于大量群体内感兴趣成分的优化选择和分离的方法和器件、和/或用于一系列后续操作的应用。
本发明主要应用在与缩减体积的悬浮介质中的细胞样本有关的生物方案的实现方式中，需要精确控制单独细胞或微粒，以便于执行对所述细胞或微粒的处理。
背景技术
现有的许多实验方案需要精确和仔细选择组成样本的群体内具有特定特性的微粒。基于至少一个感兴趣参数所采取的值来识别群体的微粒的可能性是关键的，这些微粒满足特定标准并因此适合于成功经历实验方案的后续步骤，这不仅在高速化(从而通常降低实验活动的成本)方面，而且在群体内的感兴趣细胞很稀少的情况下以及上述所有情况下都是关键的。
基于细胞(或者，更一般地，微粒)处理的诊断实验方案是公知的，样本内细胞的浓度特别低，并因此必须基于感兴趣细胞具有极高敏感性的区别性特性来对感兴趣细胞进行识别和分离，以便于不会有丢失感兴趣细胞/微粒的危险。
例如，EP0500727(Bianchi)描述了一种用于染色体异常的产前检查的实验方案，该实现方案基于从周围母体血液的样本获得胎儿具核细胞(成红血细胞)的浓缩群体，该群体然后经历一系列基因类型诊断过程(例如，FISH、QF-PCR、等)。
WO2006018849(Monaliza医疗)描述了，对通过母体宫颈样本(TCC)的适当浓缩而获得的胎儿滋养细胞执行类似基因类型诊断过程的可能性。
在这两种情况下，根据已知的实验方案，需要识别哪些细胞是具核的，以便能够继续进行染色体遗传的分析。此外，区分胎儿细胞与母体细胞是必要的，以免错误肯定/否定。还需要执行以排除错误肯定的可能性为目标的其他控制。
因此，通常，对于通过一个或多个相应传感器可检测到的感兴趣细胞/微粒的一个或多个特性参数而言，基于进行哪种选择来建立阈值。
例如，US20060139638公开了一种用于通过介电电泳(dielectrophoresis)识别和选择细胞群体(也包括死细胞或细胞群集)内感兴趣的活细胞的方法。在处理细胞内发光度分布之后，进行这种选择，以允许获得细胞的一些特性参数，例如，尺寸。仅选择尺寸小于特定值的细胞，这是由于将这些细胞视为感兴趣细胞。然而，以这种方式，由于在检验感兴趣微粒之前建立尺寸参数的值，通常实际上仅分离群体中极小部分的细胞/微粒。对于方案的后续步骤，甚至可能选择不出感兴趣细胞(没有响应)。然而，这并不始终暗示着，群体中没有细胞是实际可用的。假定细胞群体中感兴趣特性的分布随实验对象的不同、随样本的不同而显著变化，或者甚至更简单地，由于实验和仪器条件的可能改变而显著变化，预建立的阈值可能太高，使得选择过程导致分离太少的有用细胞，以致于不能成功完成后续分析。另一方面，如果阈值太低，或者例如如果细胞群体内感兴趣参数的值的分布多峰，则选择过程可能不够精确(即，还会选择出无用的细胞)，或者挑选出不代表整个细胞群体的一部分样本。
图11示出了现有技术中使用先验(即，在整个样本检验之前)确定的阈值在微粒群体内确定的微粒选择。
如图11(A)所示，如果预置阈值太低，则也会选择出无用的细胞，即，选择的微粒是被污染的。另一方面，如图11(B)所示，如果预建立的阈值太高，则选择过程导致分离出的有用细胞的数目减少。
因此，必须频繁地重复测试，必须采用新样本，或者更简单地，浪费一部分有用样本，从而丢失信息。
在一些情况下，执行对样本属性的先验评估，检查样本属性的一部分。基于在该步骤所收集的信息，为感兴趣参数建立阈值，并且随后，对于剩下的样本执行实际选择。该方法的缺点是：首先，该方法涉及牺牲用于初步评估的样本的一部分，其次，在证明先验检验的样本的一部分不代表整个样本的特性的情况下，不再能够改变预先建立的阈值。
如已知，还存在用于在微流(microfluidic)器件中处理微粒的各种技术。
一种方法使用介电电泳势能笼，而其他方法涉及使用激光器显微切割或光学镊子。
通过激光器显微切割进行处理的缺点在于，通过将样本与样本所附着的支架一起进行切割来处理感兴趣部分(单个细胞或细胞集群等)。此外，激光器显微切割步骤不能适用于流体中浸没的细胞或微粒。
另一种已知的方法是将主体放在流体中，并通过光学装置对它们进行处理。利用激光器镊子，能够很精确地将微粒保持在溶液中，并以预定方式移动这些微粒。
然而，这种类型的处理的缺陷是：由于激光束内被该激光束俘获的微粒受到热碰撞，并从而该微粒的位置可能被意外地随机修改。此外，一次只能移动一个微粒，并且不能控制群体中每个微粒的位置。
发明内容
因此，本发明的目的是，提供一种用于识别和处理(以及随后选择和/或分离)感兴趣群体内稀少微粒的方法和器件，以克服先前描述的缺陷。
具体地，本发明的一个目的是，提供一种用于快速识别和选择稀少微粒并具有高灵敏度的方法，从而限制了分析成本和时间，并且避免有用样本的浪费，或信息丢失。
根据本发明的一个方面，提供了一种根据权利要求1所述的方法。
根据本发明的另一方面，提供了一种根据权利要求15所述的设备。
附图说明
参照附图，仅作为非限制示例，根据优选实施例的以下描述，本发明的其他优点和特性将变得显而易见，在附图中：
图1是提供根据本发明的用于微粒的优化选择的方法的系统的图示；
图2是本发明的方法步骤的流程图；
图3是用于实现根据本发明的优化微粒选择方法的程序界面的屏幕截图的再现，包含：所观察和选择的微粒的列表；对于这些微粒中的每一个，示出了多个实验参数的相应测量值以及通过以不同波长在一个或多个光学通道中扫描样本而获取的图像；
图4是图3的程序的屏幕截图的另一再现，对于列表中观察到的微粒中的每一个，示出了另外多个实验参数的相应测量值以及通过扫描样本而获取的相关图像；
图5是用于实现根据本发明的优化微粒选择方法的程序界面的另一屏幕截图的再现，对于可选的观察微粒，示出了代表针对该微粒而测量的一个或多个实验参数的趋势的多个直方图；
图6是用于实现根据本发明的优化微粒选择方法的程序界面的另一屏幕截图的再现，同时示出了所有观察到的微粒，以便在扫描的样本中再现它们的实际排列；
图7是用于实现根据本发明的优化微粒选择方法的程序界面的另一屏幕截图的再现，仅示出了根据该方法选择的微粒，以便在扫描的样本内再现它们的实际排列；
图8是用于实现根据本发明的优化微粒选择方法的程序界面的另一屏幕截图的再现，其中，在分散图中示出了与针对微粒群体而测量的两个实验参数有关的值；
图9是示出了根据本发明方法的用于处理微粒的混合器件或硅/塑料芯片的图；
图10是图9的器件的一部分的图示，示出了根据本发明方法选择的微粒的丢弃/回收步骤的可能实施例；
图11示出了现有技术中使用先验(即，在整个样本检验之前)确定的阈值在微粒群体内确定的微粒选择。
具体实施方式
图1所示用于优化微粒选择的系统1基于商业技术的使用，并且系统1包括：立式落射荧光显微镜(Olympus)2，包括支撑电动水平表面3(或者镜台)的框架(未示出)；以及位于该水平表面3上的光学系统4。
水平表面3在X-Y平面上配备具有极高定位精度(～±3mm)的毫微步进电机，并且由支架(未示出)支撑，该支架配备具有极高定位精度(～±0.01mm)的毫微步进电机，该步进电机以滑动的方式被安装在与显微镜框架连接的垂直载玻片上，以允许精确限定Z轴上的聚焦。
光学系统4包括：照明器(未示出)、一组荧光滤镜(未示出)、以及可移动光学单元5，光学单元5包括：具有1600×1200百万像素分辨率的CCD照相机(Orca ER Hamamatsu)6、以及配备具有不同放大率的若干透镜的旋转台7，该旋转台7能够旋转以定位电动表面3之上的选择的透镜。
限定落射荧光系统的照明器和滤镜系统包括：宽光谱白光源、第一滤镜模块(FITC模块)、以及第二滤镜模块，第一滤镜模块具有激发滤镜460-495nm(蓝)、发射滤镜515-550nm(绿)以及505nm的分色镜，第二滤镜模块用于明视场照明并固定至显微镜2的框架。
图9示出了如Lab Chip2006，6，121-126中描述的用于处理液体中悬浮的微粒的硅/塑料混合微流器件8(或也被称作芯片)。芯片8包括微粒处理室9，该微粒处理室9大小为16mm×16mm，并且由底壁、实质上平行于底壁的顶壁、以及隔离元件限定，该隔离元件位于底壁与顶壁之间，以将底壁和顶壁保持在等于其高度的特定距离。处理室具有内室，该内室由顶壁13和底壁分别在顶部和底部、以及由间隔元件横向定界。内室是具有实质上的平行六面体形状以及方形底，并且包括与内室侧壁平行布置的分离壁10，分离壁10限定两个室11、12，这两个室11、12受分离壁10横向限制，并具有实质上平行六面体形状以及矩形底，第一室11构成样本装载室(大约2.9μl)，第二室12是样本回收室(大约0.6μl)。分离壁10在内室的侧壁附近具有宽度为300μm的断裂18，该断裂18构成样本装载室11与样本回收室12之间的传送通道18。
具有实质上平行六面体形状以及方形底的处理室的顶壁13是透明的，由聚碳酸酯制成，并且具有四个孔14、15、16、17，其中的两个孔14、15位于装载室中，另外两个孔16、17位于回收室中，适合于将内室与外部相连接。
内室的侧壁配备介电电泳电极阵列或网格，该阵列或网格构成芯片8的表面，可以单独控制其中的每个电极，以创建能够处理网格中各个单独微粒的介电电泳笼。根据本发明方法的一个方面，当已经在通过激活构成芯片8的表面的电极可获得的多个位置中的特定位置中捕获每个微粒之后，对这些微粒进行处理。类似于芯片8的物理结构，还可以根据阵列将捕获微粒的位置布置在处理器件中。
应当注意，芯片8具备：两个不同且有区别的室(11、12)，这两个室在芯片的底壁的至少一个面上被液压式连接和限定。备选地，能够提供彼此液压式连接的分离芯片。
芯片8还包括与处理室粘合的印刷电路板，其中，电路用于分别控制阵列的各个单独电极，并且限定朝向电路的一组触点。
芯片8构成用于处理微粒或优选地细胞的微流器件，有利地可以用作不可回收器件。
在使用中，当操作员使用装载室11的孔之一14(16)将样本沉积(以实质上液相的方式)在内室中时，装载室11的另一个孔16(14)用作排放孔。由于装载室11与回收室12之间的传送通道尺寸较小，在该通道中形成空气/水弯月面，以防止样本穿过回收通道。随后，回收室12充满缓冲溶液，以防止存在于样本溶液中的微粒穿过回收室12。
一旦已经在芯片8中沉积了样本，将器件放置在电动表面3上，并且通过螺钉(未示出)将其置于存在于电动表面中的适合的外壳(housing)19中。
所述外壳19包括与介电电泳电极的控制系统连接的连接器(未示出)；在使用期间，处理芯片8的触点与存在于水平电动表面3中的连接器之间的耦合允许控制每个介电电泳电极。
为了回收存在于样本溶液中的感兴趣细胞，在芯片8的内室的底壁中限定路径P，该路径P由一组介电电泳电极组成。所述路径限定通过传送通道18延伸的排放路径，以将感兴趣细胞从装载室11的起点P1传送至回收室12的终点P2。通过沿着回收室12的方向连续激活存在于路径P中的介电电泳电极，将感兴趣细胞从样本溶液移动至缓冲溶液，将这些感兴趣细胞浸没在缓冲溶液中，然后回收。
如图1所示，用于优化微粒选择的系统1还包括通过电缆(未示出)与显微镜2连接的外部控制单元20，外部控制单元20置于一个或多个外部单元(未示出)中，一些外部单元也可以由显微镜2的框架以机械方式支撑。具体地，控制单元20包括：用于管理电动镜台3的第一控制器件21、用于管理光学单元并从照相机获取图像的第二器件22、以及用于管理介电电泳电极的控制信号的第三器件23。
应当注意，外部控制单元20可以包括通过以太网(优选地，根据TCP/IP协议进行操作)连接至外部单元的已知类型的工业计算机，或者备选地可以包括由专用电子装置提供、通过以太网(优选地，根据TCP/IP协议进行操作)彼此连接的一个或多个外部单元。
此外，用于优化微粒选择的系统1包括一个或多个用户界面设备24(在图中仅示出了其中的一个界面)，也被称作“HMI”(人机界面)设备。每个HMI设备24包括配备用于显示数据的屏幕(图1中未示出)和键入设备(图1中未示出)的已知类型的计算机，键入设备通常由键盘和/或点选设备限定，并且还可以通过触摸屏功能被集成在屏幕中。每个HMI设备24允许操作员与显微镜2的控制单元20交互，例如，允许所述操作员发送与照相机6有关的配置信息，选择并随后定位旋转台7的选择的滤镜或透镜，或者将电动镜台3移动至给定位置，以便装载样本之后显示出现在处理芯片8的表面上的特定位置中的细胞。
可以将按照本地或远程配置而布置的其他计算机30、31、32经由以太网(优选地，根据TCP/IP协议进行操作)连接至HMI设备24。例如，计算机30是位于实验室或在任何情况下位于用于实验室分析的场所中的工业或办公计算机，计算机31是办公计算机，并且位于与实验室相同的建筑物中，计算机32是办公计算机，并且位于与实验室距离非常远的位置处。计算机30和31仅经由以太网/内联网类型的网络单独连接至HMI设备24，而计算机32经由因特网连接至HMI设备24。应当注意，位于与实验室距离非常远位置处的计算机能够显示与位于实验室中的计算机所显示的数据相同的数据。
HMI设备24包括：与用于优化微粒选择的系统的控制单元进行对话(即，以双向方式交换数据)的第一通信设备25、还实现了数据库(例如，SQL、SQL Light等)的存储设备26、以及与用户进行对话(即，以双向方式交换数据)的第二通信设备27。第一通信设备25提供对控制单元的数据的访问协议，并实现存在的每个不同外部设备(例如，电动镜台3、可移动光学单元5、照相机6)的控制命令。
第二通信设备27提供实际图形用户界面。
两个通信设备主要仅彼此间接进行对话，即，它们经由存储设备26彼此进行对话；换言之，除了用户控制特定设备所使用的特定命令以外，第一通信设备25在存储设备26中读取/写入数据，并且同时第二通信设备27以基本上随机的方式(即，当操作员决定使用用户界面时)在存储设备26中读取/写入数据。
第一通信设备25、第二通信设备27以及存储设备26通常由相应程序(软件)提供，该相应程序整体上构成微粒处理程序(软件)。具体地，提供第二通信设备27的程序(软件)构成图形用户界面，并且提供图像处理装置，通过该图像处理装置提取出每个微粒的参数p1......pn特性。类似地，提供第二通信设备27的程序(软件)提供用于处理检测到的参数的至少一个函数的更一般的装置。此外，提供第二设备27的相同的程序(软件)构成用于选择微粒的装置，以及用于建立要用作参考参数以进行所述选择的选择标准的装置。
所述程序通常驻留在HMI设备24的计算机形成部分中，但是备选地，所述程序可以驻留在本地或远程放置的其他计算机中，并且经由内联网和/或互联网网络交换数据。
在使用中，对芯片的整个表面进行扫描，并且获取一些图像，并将这些图像存储在存储设备的区域28(对于总共20个线中的每一个线，有15个部分重叠的图像)中，实现了具有适当清晰度的芯片内容的精确评估。通过图形编辑对所存储的图像进行处理，图形编辑允许识别存在的细胞，并且对于所识别的每个细胞，将每个细胞的特性数据(即，参数p1......pn)存储在存储设备中的区域29中，区域29实现了数据库SQL。
应当注意，与通过诸如照相机等外部传感器对芯片的整个表面的扫描交替或并行地，能够使用芯片内的传感器(未示出)来检测每个细胞的特性数据。如WO2007/049103中所描述的，其内容应理解为通过简单引用合并于此，例如，芯片8的表面能够包括介电电泳电极以及能够检测每个细胞的参数p1......pn特性的光学(或阻抗生物(impedenziometric))传感器。
还应当注意，可以通过介电电泳的备选处理技术(例如，光电泳诱捕，介电电湿润-EWOD)来成功执行对每个细胞的处理，只要是在微流器件中处理细胞，并且每个细胞都已被俘获于可被单独控制的多个位置之一。。
作为非限制示例，现在根据图2所示的流程图描述根据本发明的方法的优选实施例。
开始(方框100)，通过收集与操作员以及要进行分析的样本有关的信息，来识别要执行的实验。系统然后在自动模式下执行(方框110)一系列操作，以验证与构成显微镜2的设备有关的控制单元20的正确连接和/或配置和/或校准，从而保证实验期间的正确操作。通常安排初步检查(方框120)，以便确保在芯片8的表面上(更具体地，沿着排放路径P)不存在污染物。如果该检查识别出存在污染物，则实验中断(方框130)，而如果结果为否定，则沉积(方框140)样本。在这一点(方框150)处重复对污染物存在的验证，以排除连同要分析的样本一起在芯片的表面上引入其他不期望的物质的可能性。在存在污染物的情况下，操作员显然可以回收先前沉积的样本，使得可以在其他实验中重新使用该样本。
完成该检查之后，开始实际分析步骤。在自动模式下对芯片的整个表面进行扫描(方框160)，并且通过适当的图形编辑过程，识别出每个微粒的特性数据集合(即，参数p1......pn)，并将该集合存储在数据库中(或者也可以存储在存储装置中)。
获得芯片的整个表面的图像以及存储每个微粒的特性参数之后，操作员可以建立标准，以在获取与整个样本有关的信息之后选择感兴趣微粒(方框170)(例如，选择标准可以是利用特定形态学特性的微粒选择，最亮微粒选择，或者具有特定特性的稀少微粒选择)。具体地，可以基于针对每个微粒获取的数据的处理结果，来建立选择标准。
在操作级别，图形界面向操作员示出了，包含在这种特定情况下通过对整个样本的光学扫描观察到的微粒、细胞的列表的屏幕截图(图3和图4)，对于每一个微粒，可以示出在扫描期间测量到的许多实验参数的值，例如，光学参数(透明度、不透明度、发光强度的均匀度)、形态学参数(面积因子或者像素束的间接测量、形态因子、球形或球状因子等...)、芯片8的网格的单元(位置)内的正确定位、在与不同波长相对应的光通道中测量的发光度等。一般而言，针对微粒而测量的参数还可以指：生物电学和/或生物化学属性(例如，能够通过研究以钙元素标记的细胞的荧光随时间的衰减，或者通过分析以特定时间间隔拍摄的图像，测量染料的吸收等，来确定细胞是活的还是死的)、或医学属性(例如，可以通过使微粒经受能够使其变型的介电电泳脉冲；通过观察微粒恢复到其原始形态所需的时间，来确定微粒的弹性，可以缩减微粒的弹性的因子)、或介电属性(如果观察到的微粒在芯片8的网格的单元中，则处理能够通过NDEP进行操作的微粒，而如果微粒位于芯片8的网格的相邻单元之间，则处理能够通过PDEP进行操作的微粒)，或者，在细胞的情况下，表面或胞质内抗原的表示、或上述的适当组合。可以通过使用多个传感器来获取数据，这些传感器可以在混合器件8的内部或外部。
为此，根据本发明的方法还可以包括：标记步骤，用能够通过芯片之内和/或之外的所述传感器之一检测到的至少一个标记，来标记悬浮微粒(或者在这种情况下，标记细胞)。对于每个细胞，还存储并示出了相对于芯片8的表面定义它们的排列的坐标。
通过另一屏幕截图(图5)向操作员示出了，示意了相对于细胞群体的以下值的分布图：扫描和存储期间测量的实验参数p1......pn的值，和/或由系统适当处理的至少一个所述参数的一个或多个函数的值。通过适当定义选择标准，操作员可以使用界面来选择所考虑的群体中的微粒子集：通过修改图5的直方图中游标34的位置，操作员可以设置小于和/或大于所测量的参数的阈值，和/或设置小于和/或大于相述参数的相应函数的阈值。
所述下阈值或上阈值和/或所述感兴趣区间(例如，与利用选择标准处理的、与选择标准相关联的参数pi的函数的感兴趣部分相对应，或者与微粒群体内所述函数的值的分布的一部分相对应，并从而在较低阈值和较高阈值之间)构成“阈值标准”，将该“阈值标准”与参数pi的函数的值进行比较，以便执行感兴趣微粒的选择。
具体地，基于由所存储的参数的函数的系统处理的值，在对作为整体的细胞样本的属性进行评估之后，操作员可以选择所述阈值，或者可以响应于特定选择标准自动实现对微粒进行识别的过程，基于针对测试的整个群体而收集的数据，该过程随着实验的不同而变化。
还应当注意，在后一种情况下，操作员可以选择，实现针对最后选择的自动选择过程，还是备选地，控制自动选择建议，经由结果的手动检查来细化该自动选择建议。
重点强调的是，并不先验地在实验中建立感兴趣数量的阈值；基于与通过扫描而获得的整个样本有关的信息，以自适应方式来选择选择标准并因此选择相关阈值，以便识别和处理满足给定要求的细胞。
因此，根据本发明的方法，能够针对设想的后续使用选择具有总体最佳特性的细胞，即，其基于每次使用而定义的的适当有价值函数的值是优化的那些细胞。
这样，用户界面27构成用于选择微粒的装置，并且还构成用于建立要用作参考参数以进行选择的阈值标准的装置。
根据细胞的后续目的地(例如，在其他实验中使用)，可以对选择标准进行修改，以便获得满足给定要求的足够数目的细胞，使这些细胞适合于以下实验步骤。
经由图5的界面定义感兴趣阈值(方框170)，与此同时，操作员在微粒群体内执行选择，识别已经测量了其参数p1、p2、...、pn的值的那些细胞，以及已经计算了其函数的值的那些细胞，该函数落在利用游标34以图形方式设置的阈值所定义的感兴趣区间内。
如果需要，则帮助操作员定位图5的直方图中的游标34：在被请求时，该界面针对每个直方图条示出了与该条相关联的微粒图像的另一屏幕截图(未示出)。
作为非限制示例，图5中，在第一栏中示出了，与测试的群体中微粒的形态学特性(例如，尺寸、球形因子，以及在器件中用于处理的单元之一中的定位的正确性)的分布有关的直方图。在前一栏的右侧的第二栏中，是示出了基于所测量的不同参数的适当组合和/或处理的复杂函数的趋势的直方图，该趋势可以用作不可直接测量的属性的索引。作为组合示例，可以组合与以不同波长执行的发光度测量有关的结果，每一个结果对应于与特定特性(例如，细胞核、特定抗原、微粒的自发荧光等的特定特性)的存在/不存在相关联的特定标记。作为处理示例，可以考虑对与发光度测量有关的结果进行处理，以及如果需要，结果可以补偿芯片8的不同区域中发光体的不同照度。
在通过图5的界面执行微粒群体内的选择之后，用户随后可以细化已经进行的选择(方框180-选择细化)。对于满足经由图5的屏幕截图建立的阈值标准的微粒(方框190)，用户可以检查选择的微粒，因为经由图3和4的屏幕截图，用户可以查看每个微粒的特性参数以及样本的扫描期间获取的图像。以不同波长在一个或多个光通道中显示的图像(作为非限制示例，在图3和4中，示出了DAPI、FITC以及TRITC通道中的细胞图像)允许操作员判定是否最后选择初始预选择的微粒，并且因此，图3和4的屏幕截图构成用于细化已经进行的选择的控制装置。事实上，尽管已经初始预选择了微粒，但是该微粒可能是杂质，并因此不能用于后续实验方案的目的。
图形用户界面27还向操作员提供用于细化已经进行的选择的另一控制装置，该装置能够通过显微镜目镜查看选择的每个微粒。通过激活控制按钮(未示出)，自动将选择的微粒刚好定位在显微镜透镜下方，这允许操作员经由目镜查看微粒。
应当注意，自动将所选择的微粒定位在显微镜透镜之下，这是由于当激活控制按钮时，图形用户界面27向控制单元20传送芯片8的网格中感兴趣微粒的坐标，并且控制单元20精确移动存放在平面X-Y上的镜台，以便将微粒(芯片8的网格中的位置)与显微镜透镜对准。如果需要，控制单元20沿着Z轴自动移动电动镜台，以聚焦所选择的微粒。
在所述另一控制步骤结束时，操作员可以判定该微粒是否是感兴趣微粒，或者是否应将该微粒视为杂质。
这样，图像用户界面27构成用于选择微粒的装置，并且还构成用于细化感兴趣微粒的选择的控制装置。如果传感器在微流器件的外部，并且包括照相机，或者即使该传感器在微流器件内部，并且包括光学传感器，控制装置包括用于显示每个微粒的图像的装置。
界面向操作员提供其他可能：能够观察到芯片的表面上样本的所有微粒(图6)或者仅实际选择的微粒(图7)的排列，如上所述以自适应方式建立阈值。应当注意，在图6界面的屏幕截图中所示的微粒的坐标与芯片8中的样本的那些坐标相对应，并因此具有反映相关物理结构的分布。具体地，能够识别图6的屏幕截图的下部中的水平带，在该水平带中不存在微粒，该水平带与针对所选择的微粒的回收室12相对应。类似地，在上部中没有出现微粒，这是由于装载室11的一部分用于容纳任何丢弃的微粒。
图8示出了界面的另一屏幕截图，其中，采用分离图的形式，操作员可以查看微粒群体中感兴趣的两个参数或函数的分布。作为非限制示例，图8示出了以两个不同波长测量的发光度值，每个发光度值与特定标记相对应。通过使用适当命令，操作员可以在类似的分离图中查看与其他参数和/或函数有关的值。同样经由这种形式的显示，如先前参照直方图的表现所讨论的，操作员可以设置阈值，以便定义适当的选择标准，并且同时选择符合所述要求的微粒。
在完成该步骤、定义选择标准以及随后执行满足所述标准的微粒选择之后，过程中的下个步骤(方框190)涉及控制先前步骤中选择的的微粒(如果需要甚至逐一控制选择的微粒)，如果需要则细化所述选择。
然后，操作员可以确认在先前步骤中进行的微粒选择已经整体分析了芯片所包含的整个群体，由于操作员可以详细分析每个单独细胞的特定特性，因此可以验证他的选择的正确性。界面所提供的可能性包括：根据可用场中的任一个的值，对微粒进行排序，例如，在细胞的情况下，如果用户希望选择用于一系列后续实验的“最佳”细胞，或者如果用户期望在特定通道中选择彼此具有类似光强值的细胞，则根据DAPI场中增加的光强进行排序。
如果用户对已经进行的选择不满意，则用户可以返回(方框180)先前步骤，以便进一步细化选择，如果需要则改变先前建立的选择标准。另一方面，如果选择的结果在数量以及质量上是令人满意的，则方法中的下个步骤是继续第一传送或传递步骤(方框200)，即，以在排放路径中将选择的微粒从芯片表面上最初占据的位置传送至同样由系统存储的位置为目的，来自动处理微粒，该排放路径用于向着回收室12传送微粒。这构成向着回收室方向传输选择的微粒的第一部分。根据每次使用的处理器件的特定几何形状，可以提供一个单个中央排放路径，或者该器件可以包括平行的若干排放路径，以便加速并便于传递操作。所述操作将先前选择的感兴趣微粒进行分离，仅对样本内的这些微粒进行处理。
在这一点上，该方法在通过执行新扫描(方框210)而获得的排放路径上安排另一控制步骤(方框220)，以获取排放路径的图像以及该排放路径中包含的微粒。基于从这些图像中获得的信息，用户根据第一传送步骤中选择的所有微粒，来判定丢弃哪些微粒/细胞，以及从芯片中提取并向回收室12传送哪些微粒/细胞。
所述另一控制步骤由以下操作来执行：对于每个微粒，将微粒在其原始位置时的照片与该微粒在排放路径中的位置时的照片进行比较，以便确保第一传送步骤已经实际处理了选择的微粒，该选择的微粒可能没有正确到达其在排放路径中的目的地。
如图10所示，沿着排放路径的路径P，可以识别丢弃站33，丢弃站33包括选择电极的阵列34，针对每个微粒，选择电极根据排放路径控制的结果(方框220)验证丢弃还是回收所述微粒。如果选择微粒，则微粒去往回收室，而如果丢弃该微粒，则将该微粒传送至装载室11的一部分中限定的丢弃排放路径。通过仅对所述微粒进行处理，来执行选择的微粒的所述回收步骤。
其后是第二传送步骤或传递出步骤，该步骤的目的是将所有选择的或确认的微粒传送至回收室，直到某时刻为止。然后从所述回收室中回收微粒，并且如果需要，该微粒用于外部设备上或还在原处的其他分析步骤。
一旦已经完成了上述过程，用于执行优化感兴趣微粒选择的系统就发出(方框260)报告，该报告包含与刚刚执行的分析有关的信息。
示例1-群集的排除
根据本发明的方法的许多可能应用之一在于，从微粒群体中排除被分组以形成群集的微粒，如果群集的存在是不期望的，例如，在后续仅使用单个微粒的情况下，进行上述排除。例如，在分离活细胞的情况下，会发生：如果操作员期望对单个细胞执行后续分析，则样本中群集的存在可能改变测试的数据获取甚至测试的结果。
在这种情况下，操作员可以经由实现根据本发明的方法的界面(图3)观察到构成样本的微粒和微粒群集，并且识别每个微粒和微粒群集的多个参数。具体地，在这种情况下，结合相对于处理器件表面的相应坐标，对微粒或群集的半径进行测量，还可以对微粒的球形因子进行评估。最后，可以确定微粒实际上位于使用中与用于处理的介电电泳单元之一相对应的位置中。为了支持选择，还可以对样本的完整扫描期间获得的微粒或群集的图像进行处理，样本的完整扫描在选择操作开始之前执行。
以适当的方式使用与后续的界面屏幕截图(图5)有关的游标，操作员选择用于微粒的尺寸(半径)和/或球形度的上阈值，因此选择测量数据超过所述阈值的那些微粒(然后从器件中移除那些微粒)。应当注意，群集概率的索引是细胞的若干特性参数(例如，尺寸和球形度)的函数。事实上，测量的较大半径极不可能与具有较大尺寸的单个微粒相对应，而是与群集相对应，并且较长形状极不可能指单个微粒，而是指沿着主要方向聚集的若干微粒，即群集。此外，如果微粒位于器件的处理笼级别处，则肯定测量到的数据与微粒有关，而不与器件表面上不应该存在的杂质有关。
适当定义阈值并检验针对数量的应用区间之后，操作员选择存在于样本中的群集，如果需要则后验检查其选择的正确性，并且然后可以从样本中移除群集，有选择地将单个微粒保持在处理器件中，操作员可以在后续步骤在所述器件中对单个微粒执行分析。
示例2-产前诊断
对于各种产前诊断方案，需要提供母体血液样本的浓缩液，在该样本中选择胎儿红细胞，然后对这些胎儿红细胞执行基因分析。为此，实质上需要识别胎儿的具核细胞，而不是母体源。这种类型的确定可以通过用一个或多个荧光标记对细胞进行标记来执行，例如，绑定至细胞的细胞核的第一标记(DAPI)，以及选择性地绑定至胎儿的抗原而不是母体源的第二标记(FITC)。通过以两个分离的相应波长检测两个标记的荧光强度，能够识别两个标记都存在的细胞。由于如果细胞出现非特定自发荧光(即，可以任何波长可检测到的)现象，荧光检测就会出错，因此，优选地执行以第三波长的第三荧光检测(TRITC)，以便确定哪些细胞存在所述现象，并从而必须排除所述细胞，这是由于DAPI和FITC通道中的荧光检测本身不能保证，细胞是胎儿具核细胞。在这种情况下，根据本发明的方法，为胎儿具核细胞建立选择标准(设置基于对所测量和存储的参数的函数的处理而定义的相应值或阈值区间)，该选择标准实际上最小化不正确选择(即，错误肯定的选择)的可能性。
使用实现根据本发明的方法的界面，操作员将处理器件表面上的微粒坐标与扫描期间识别的多个参数的值、以各种所考虑的波长获得的图像、以及基于识别的参数计算的一个或多个有价值函数的值相关联。具体地(图3、4和5)，操作员对细胞群体内若干函数的值的分布进行评估。
第一函数是作为胎儿具核细胞(图5中指示为“胎儿”)的细胞的概率的索引，并且是FITC通道中荧光强度的索引，该荧光强度用于补偿芯片8的不同区域中照明器的不同照度；第二函数(图5中Dapi所指)是DAPI通道中荧光强度的索引，并且是处理后的荧光强度函数；第三函数是实际上使人迷惑的DAPI和FITC通道中荧光检测的概率的索引，这是由于所考虑的微粒出现自发荧光现象(图5中未命名的直方图)。
因此，操作员能够基于对整个样本的观察以及以自适应方式，来建立胎儿函数的有用值的区间以及先前描述的其他值的区间，以便仅选择先前讨论的标准已经被确定的细胞。

Claims (35)

1.一种用于识别和处理微粒群体内的感兴趣微粒的方法，包括步骤：
a)针对所述微粒群体的微粒中的每一个，识别作为所述感兴趣微粒的特性的多个参数p1、p2、...、pn中的至少一个参数；
b)从所述微粒中选择所述感兴趣微粒，包括针对所述微粒中的每一个，将所述至少一个参数与相应参考参数进行比较；
其中，通过以下步骤来建立所述参考参数：
c)针对所述微粒中的每一个，存储先前识别的所述多个参数p1、p2、...、pn中的所述至少一个参数；
c’)确定针对所述微粒群体存储的所述至少一个参数的至少一个函数的值；
d)对存储的所述至少一个参数的所述至少一个函数的值进行处理，将所述函数与所述感兴趣微粒的选择标准进行组合，所述选择标准是从一组可能选择标准中选择的；
e)针对所述微粒中的每一个，建立要用作参考参数的阈值标准，每次基于所述处理的结果来建立所述阈值标准。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：
f)将先前从所述微粒之中选择的所述感兴趣微粒分离出来，仅对所述感兴趣微粒进行处理。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将所述微粒保持悬浮在微流器件中的液体中。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：
g)存储所述微粒的开始排列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：
h)将选择的微粒从它们的所述开始排列移动至相应传送排列，将所述相应传送排列的位置进行存储，以用于后续步骤i)对位于所述位置中的每一个微粒的回收。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，通过仅对所选择的微粒进行处理来执行用于所选择的并移动至相应传送排列的微粒的回收的所述步骤i)。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：
1)验证已经将选择的感兴趣微粒正确地从它们的所述开始排列移动至所述传送排列。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，在微流器件(8)的多个位置的特定位置中捕获到所述微粒中的每一个之后，通过对所述微粒进行处理来进行所述方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，按照阵列将所述位置排列在所述微流器件(8)之内。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述微流器件(8)配备多个不同室(11、12)，所述多个不同室(11、12)彼此有区别并液压式相连接，通过单个芯片(8)的底壁或者通过多个分离芯片在至少一个面上定界。
11.根据权利要求3所述的方法，其中，由所述微流器件内部或外部的至少一个传感器对所述多个参数p1、p2、...、pn中的所述至少一个参数进行检测。
12.根据前述权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法包括进一步的步骤：细化对所述感兴趣微粒的选择，所述细化步骤涉及所有所述微粒或仅涉及先前选择的微粒。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述细化步骤包括：对每一个选择的微粒的控制步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，将所述微粒保持悬浮在微流器件中的液体中，所述控制步骤包括：所述多个参数p1、p2、...、pn的显示步骤，所述多个参数p1、p2、...、pn是通过所述微流器件内部和/或外部的至少一个传感器针对每个微粒而识别的。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述多个参数p1、p2、...、pn中的至少一个参数由包括照相机的外部传感器来检测，所述控制步骤包括每个微粒的图像的显示。
16.根据前述权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法包括另一处理步骤：在针对所述感兴趣微粒的可能选择标准的组中，选择使错误选择的概率最小化的标准，所述另一处理步骤涉及所有微粒或仅涉及先前选择的微粒。
17.根据前述权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法包括步骤：采用针对所述感兴趣微粒的至少一个特定标记，对悬浮的所述微粒群体的所述微粒进行标记，所述标记能够通过微流器件内部或外部的至少一个传感器来检测，在所述微流器件中，所述微粒群体已经悬浮在液体中。
18.根据前述权利要求1或2所述的方法，其中，所述多个参数p1、p2、...、pn是在包括以下项目在内的组中选择的：
a.形态学特性；
b.光学特性；
c.生物电特性；
d.生物化学特性；
e.机械特性；
f.表面抗原表达；
g.胞质内抗原表达；
h.介电特性；
或上述项目的组合。
19.一种用于识别和处理微粒群体内的感兴趣微粒的设备，包括：
a)识别装置，用于针对所述微粒群体的微粒中的每一个，识别作为所述感兴趣微粒的特性的多个参数p1、p2、...、pn中的至少一个参数；
b)选择装置，用于从所述微粒中选择所述感兴趣微粒，该选择装置针对所述微粒中的每一个，将所述至少一个参数与相应阈值标准进行比较；
其中，所述设备的特征在于还包括：
c)存储装置，用于针对所述微粒中的每一个，存储先前识别的所述多个参数p1、p2、...、pn中的所述至少一个参数；
c’)确定装置，用于确定针对所述微粒群体存储的所述至少一个参数的至少一个函数的值；
d)处理装置，用于对存储的所述至少一个参数的所述至少一个函数的值进行处理、并且将所述函数与所述感兴趣微粒的选择标准进行组合，所述选择标准是从一组可能选择标准中选择的；
e)用于针对所述微粒中的每一个建立所述阈值标准的装置，每次基于所述处理的结果来建立所述阈值标准。
20.根据权利要求19所述的设备，其中，所述选择装置包括：用于细化对所述微粒的选择的控制装置。
21.根据权利要求19或20所述的设备，其中，所述识别装置包括显微镜，所述显微镜包括照相机和位于所述照相机之下的可移动水平表面。
22.根据权利要求21所述的设备，其中，所述可移动水平表面包括：被设计为容纳微流器件的外壳，所述微流器件在使用中容纳在液体中悬浮的所述微粒。
23.根据权利要求22所述的设备，其中，所述水平表面能够在实质上水平的表面XY上移动，并且沿着Z轴垂直移动，以实现经由所述识别装置获取容纳微粒群体的所述微流器件的整个表面的图像。
24.根据权利要求23所述的设备，其中，基于所获取的整个微流器件的图像，利用所述存储装置存储识别到的每个微粒的图像。
25.根据权利要求24所述的设备，其中，将所获取的所述微粒的图像存储在包括数据库的存储装置中。
26.根据权利要求25所述的设备，其中，所述数据库存储分别在与不同波长有关的分离通道中获取的每个微粒的图像。
27.根据权利要求24所述的设备，其中，识别装置包括照相机，控制装置包括用于显示存储的每个微粒的图像的装置。
28.根据权利要求19或20所述的设备，其中，所述处理装置包括计算机和处理程序。
29.根据权利要求19或20所述的设备，其中，用于建立所述阈值标准的所述装置包括：计算机和第一选择程序。
30.根据权利要求19或20所述的设备，其中，所述选择装置包括：针对微流器件的控制单元，以及第二选择程序，所述微粒保持悬浮在微流器件中的液体中。
31.根据权利要求28所述的设备，其中，所述处理程序被配置为，基于每个微粒的尺寸和多个形态学参数来对所述微粒进行分类。
32.根据权利要求28所述的设备，其中，所述处理程序被配置为，根据每个微粒周围的荧光强度的测量，来对所述微粒进行分类。
33.根据权利要求19或20所述的设备，其中，所述识别装置包括在微流器件内部和/或外部的传感器，所述识别装置适合于识别在包括以下项目在内的组中选择的所述微粒的至少一个参数：
a.形态学特性；
b.光学特性；
c.生物电特性；
d.生物化学特性；
e.机械特性；
f.表面抗原表达；
g.胞质内抗原表达；
h.介电特性；
或上述项目的组合，
其中，所述微粒保持悬浮在微流器件中的液体中。
34.根据权利要求19或20所述的设备，其中，所述识别装置被配置为，针对微流器件中悬浮的所述微粒中的每一个，或者选择性地，仅针对所选择的并移动至其传送排列的微粒子集，识别多个参数p1、p2、...、pn中的至少一个所述参数，其中所述微粒保持悬浮在微流器件中的液体中。
35.根据权利要求34所述的设备，其中，所述处理装置被配置为，将针对在其开始排列中的所述子集中的微粒而识别和存储的参数与针对在其传送排列中的所述子集中的相同微粒而识别和存储的相应参数进行比较。
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