ITTO20070771A1 - Metodo e apparato per la identificazione e manipolazione di particelle - Google Patents

Description

D E S C R I Z I O N E

Campo della tecnica

La presente invenzione riguarda metodi e dispositivi miniaturizzati per la manipolazione di particelle. In particolare, l'invenzione è relativa a metodi e dispositivi per la selezione ottimizzata e l'isolamento, all'interno di una popolazione più o meno numerosa, di elementi di interesse e/o utilità per una serie di operazioni successive.

L'invenzione trova applicazione principalmente nell'implementazione di protocolli biologici su campioni di cellule in un volume ridotto di un mezzo di sospensione, che richiedono il controllo accurato di singole cellule o particelle per effettuarne la manipolazione.

Stato dell'arte

Esistono numerosi protocolli sperimentali che richiedono una accurata ed attenta selezione di particelle che presentano specifiche caratteristiche all'interno di una popolazione, che costituisce il campione. La possibilità di individuare, sulla base dei valori assunti da almeno un parametro di interesse, le particelle della popolazione che soddisfano determinati criteri e che sono, pertanto, adatte ad essere sottoposte con successo alle fasi successive del protocollo sperimentale è cruciale non solo perché consente di ridurre i tempi e quindi, generalmente, i costi correlati alla campagna sperimentale, ma anche e soprattutto nel caso in cui le cellule di interesse siano rare all'interno della popolazione.

Sono noti, tra gli altri, protocolli sperimentali a carattere diagnostico basati sulla manipolazione di cellule (o, più in generale, particelle) la cui concentrazione, all'interno del campione di provenienza, è particolarmente bassa e nei quali, pertanto, occorre, identificare ed isolare le cellule di interesse sulla base di loro caratteristiche distintive con una sensitività estremamente elevata, allo scopo di non correre il rischio di perdere cellule/particelle di interesse.

Per esempio, EP0500727 (Bianchi) descrive un protocollo sperimentale per la diagnosi prenatale di anomalie cromosomiche basata sull'ottenimento, a partire da un campione dì sangue materno periferico, di una popolazione arricchita di cellule fetali nucleate (eritroblasti) da sottoporre, successivamente, a una serie di procedure diagnostiche di tipo genetico (per esempio FISH, QF-PCR, eccetera).

W02006018849 [MonaLiza Medical] descrive la possibilità di sottoporre ad analoghe procedure diagnostiche a carattere genetico trofoblasti fetali ricavati mediante opportuno arricchimento di un campione transcervicale (TCC) materno.

In entrambi i casi, secondo il protocollo sperimentale noto, è necessario individuare quali cellule siano nucleate, al fine di potere successivamente procedere-ad un'analisi del patrimonio cromosomico. Inoltre, è indispensabile discriminare tra cellule fetali e cellule di provenienza materna, al fine di evitare falsi positivi/negativi. Può peraltro risultare necessario effettuare ulteriori controlli, finalizzati ad escludere la possibilità di falsi positivi.

In generale, pertanto, viene stabilito, per uno o più parametri caratteristici delle cellule/particelle di interesse rilevabili per mezzo dì uno o più corrispondenti sensori, un valore di soglia sulla base del quale si effettua la selezione.

Per esempio US20060139638 divulga un metodo per individuare e selezionare tramite dielettroforesi cellule vive e di interesse all'interno di una popolazione cellulare comprendente anche cellule morte o aggregati cellulari. La selezione viene effettuata a seguito di una elaborazione della distribuzione della luminosità all'interno di una cellula che permette di ricavare alcuni parametri caratteristici della stessa quali ad esempio la dimensione. Vengono selezionate in quanto ritenute di interesse solo le cellule che presentano una dimensione al di sotto di un valore determinato. Procedendo in questo modo, tuttavia, dal momento che il valore del parametro dimensione viene stabilito prima dell'esame delle particelle di interesse, accade spesso che soltanto una frazione molto piccola delle cellule/particelle della popolazione venga di fatto isolata. Addirittura, è possibile che nessuna delle cellule di interesse venga selezionata per le fasi successive del protocollo (cosiddetto "no call"). Non sempre, però, questo implica che nessuna delle cellule della popolazione fosse di fatto utilizzabile. Data la sensibile variabilità della distribuzione delle caratteristiche di interesse nella popolazione cellulare da un soggetto ad un altro, da un prelievo ad un altro, o anche più semplicemente a causa di possibili alterazioni delle condizioni sperimentali e strumentali, può verificarsi che il valore di soglia prefissato sia elevato al punto che la procedura di selezione porta ad isolare un numero di cellule utili troppo ridotto per portare a termine con successo le analisi successive. Per contro, se il valore di soglia prefissato è troppo basso, o se, per esempio, la distribuzione dei valori del parametro di interesse all'interno della popolazione cellulare è multimodale, la procedura di selezione può non avere una precisione adeguata (ovvero vengono selezionate anche cellule di fatto non utili), oppure può privilegiare una porzione del campione non realmente rappresentativa della intera popolazione cellulare.

La figura 11 rappresenta la selezione di particelle determinate all'interno di una popolazione di particelle come da arte nota ovvero utilizzando un valore di soglia determinato a priori cioè prima dell'esame dell'intero campione.

Nel caso in cui il valore di soglia prefissato è troppo basso come da Figura 11 (A) vengono selezionate anche cellule di fatto non utili ovvero si ha contaminazione delle particelle selezionate. Per contro, se il valore di soglia prefissato è elevato come rappresentato in Figura 11 (B), la procedura di selezione porta ad isolare un numero di cellule utili ridotto.

Di conseguenza, accade frequentemente che le prove debbano essere ripetute, che debbano essere prelevati nuovi campioni, o che, più semplicemente, venga sprecata parte di un campione utile, con conseguente perdita di informazioni.

In alcuni casi viene eseguita una valutazione a priori delle proprietà del campione esaminandone una porzione. Sulla base delle informazioni raccolte in questa fase vengono stabiliti valori di soglia per i parametri di interesse e, di seguito, viene eseguita la selezione vera e propria su ciò che resta del campione. Questo modo di procedere è svantaggioso perché comporta, in ogni caso, il sacrificio di una parte di campione per la valutazione preliminare e, in secondo luogo, perché i valori di soglia prefissati non possono comunque più essere adattati nel caso in cui la porzione di campione sottoposta all'esame a priori si rivelasse poi non validamente rappresentativa delle caratteristiche dell'intero campione.

E' altresì noto che esistono varie tecniche di manipolazione di particelle all'interno di dispositivi microfluidici.

Un metodo prevede l'utilizzo di gabbie di potenziale di dielettroforesi mentre altri metodi prevedono l'utilizzo di laser (Laser microdissection), l'utilizzo di trappole ottiche (Optical-tweezers).

La manipolazione tramite Laser microdissection ha lo svantaggio di manipolare parti di interesse (singole cellule o agglomerati, etc.) sezionando il campione insieme al supporto al quale esso è adeso. Inoltre, la fase di microdissezione laser non si può applicare a cellule o particelle immerse in un fluido.

Un'altra metodologia nota è quella di posizionare corpi all'interno di fluidi e manipolarli con mezzi ottici. Con i cosiddetti laser-tweezers è possibile mantenere particelle in soluzione con grande accuratezza e movimentarle in modo predeterminato.

Questo tipo di manipolazione presenta però degli svantaggi, perché la particella all'interno del raggio laser che la intrappola è sottoposta a collisioni termiche e pertanto la sua posizione può venire accidentalmente modificata in maniera casuale. Inoltre, solo una particella alla volta può essere movimentata e non si può realizzare il controllo della posizione di ciascuna particella di una popolazione .

Obiettivo della presente invenzione è pertanto quello di fornire un metodo ed un dispositivo per la identificazione e manipolazione, (con conseguente selezione e/o isolamento) di particelle rare all'interno di una popolazione di interesse superando gli inconvenienti precedentemente descritti.

In particolare, è uno scopo dell'invenzione quello di fornire un metodo per identificare e selezionare particelle rare in tempi rapidi e con alta sensitività, limitando pertanto costi e tempi di analisi ed evitando gli sprechi di campione utile o la perdita di informazioni.

Secondo un aspetto della presente invenzione, viene dunque fornito un metodo secondo la rivendicazione 1.

Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, viene inoltre fornito un apparato secondo la rivendicazione 15. Ulteriori vantaggi e caratteristiche della presente invenzione risulteranno evidenti dalla descrizione seguente di una sua forma di realizzazione preferita, fornita a puro titolo di esempio non limitativo e con riferimento alle figure dei disegni annessi, in cui:

Figura 1 è una rappresentazione schematica di un sistema che realizza il metodo per la selezione ottimizzata di particelle secondo l'invenzione;

Figura 2 è un diagramma di flusso delle fasi del metodo dell'invenzione;

Figura 3 è una riproduzione di una schermata dell'interfaccia di un software per 1'implementazione del metodo per la selezione ottimizzata di particelle secondo l'invenzione, in cui è riportato un elenco di particelle osservate e selezionate, per ciascuna delle quali sono visualizzabili rispettivi valori misurati di una pluralità di parametri sperimentali e le immagini acquisite mediante scansione del campione in uno o più canali luminosi a differenti lunghezze d'onda;

Figura 4 è una ulteriore riproduzione della schermata del software di Figura 3, in cui sono visualizzabili per ciascuna delle particelle osservate dell'elenco rispettivi valori misurati di una ulteriore pluralità di parametri sperimentali e ancora le relative immagini acquisite mediante scansione del campione;

Figura 5 è una riproduzione di una ulteriore schermata dell'interfaccia di un software per 1'implementazione del metodo per la selezione ottimizzata di particelle secondo l'invenzione, in cui sono visualizzabili per una particella osservata selezionabile una molteplicità di istogrammi rappresentativi dell'andamento di uno o più parametri sperimentali misurati per la particella;

Figura 6 è una riproduzione di una ulteriore schermata dell'interfaccia di un software per 1'implementazione del metodo per la selezione ottimizzata di particelle secondo l'invenzione, in cui sono visualizzabili simultaneamente tutte le particelle osservate in modo da riprodurre la loro effettiva disposizione nel campione sottoposto a scansione;

Figura 7 è una riproduzione di una ulteriore schermata dell'interfaccia di un software per 1'implementazione del metodo per la selezione ottimizzata di particelle secondo l'invenzione, in cui sono visualizzabili le sole particelle selezionate secondo il metodo in modo da riprodurre la loro effettiva disposizione all'interno del campione sottoposto a scansione;

Figura 8 è una riproduzione di una ulteriore schermata dell'interfaccia di un software per 1'implementazione del metodo per la selezione ottimizzata di particelle secondo l'invenzione, in cui i valori relativi a due parametri sperimentali misurati per la popolazione di particelle sono riportati in un diagramma a dispersione;

Figura 9 è una immagine che mostra un dispositivo ibrido o chip silicio/plastica per la manipolazione di particelle secondo il metodo dell'invenzione;

Figura 10 è una rappresentazione schematica di una porzione del dispositivo di Figura 9 che mostra una possibile realizzazione di una fase di scarto/recupero delle particelle selezionate secondo il metodo dell'invenzione.

La figura 11 rappresenta la selezione di particelle determinate all'interno di una popolazione di particelle come da arte nota, utilizzando un valore di soglia determinato a priori ovvero prima dell'esame dell'intero campione.

Il sistema 1 per la selezione ottimizzata di particelle illustrato in Figura 1 si basa sull'impiego di tecnologia commerciale e comprende un microscopio diritto 2 (Olympus, upright microscope) ad epifluorescenza comprendente un telaio (non illustrato) che sostiene un piano orizzontale 3 (o anche stage) motorizzato ed un sistema ottico 4 posto al di sopra del piano orizzontale 3.

Il piano orizzontale 3 è equipaggiato con motori nano-stepper ad estrema precisione di posizionamento (~± 3 mm) nel piano X-Y ed è sorretto da un supporto (non illustrato), equipaggiato con motori nano-stepper ad estrema precisione di posizionamento (~± 0.01mm), montato scorrevole su di una slitta verticale collegata al telaio del microscopio per consentire una esatta definizione del fuoco in corrispondenza dell'asse Z. Il sistema ottico 4 comprende un illuminatore (non illustrato), un insieme di filtri a fluorescenza (non illustrato) ed un gruppo ottico 5 mobile il quale comprende una telecamera 6 CCD (Orca ER Hamamatsu) da 1600X1200 mega-pixel di risoluzione ed una torretta 7 (revolver) dotata di diversi obiettivi a diverso potere di ingrandimento la quale è in grado di ruotare per posizionare l'obiettivo prescelto al di sopra del piano 3 motorizzato.

L'illuminatore ed il sistema di filtri definente il sistema ad epifluorescenza comprendono una sorgente luminosa bianca ad ampio spettro, un primo blocco filtri (blocco FITC) con un filtro di eccitazione 460-495 nm (blu), filtro di emisssione 515-550 nm (verde) e specchio dicroico a 505nm, ed un secondo blocco filtri per illuminazione in campo chiaro (bright-field) e sono fissati al telaio del microscopio 2.

In Figura 9 è illustrato un dispositivo ibrido microfluidico 8 (o anche chip) silicio/plastica per la manipolazione di particelle in sospensione in un liquido come descritto in Lab Chip 2006, 6, 121-126. Il chip 8 comprende una camera 9 per la manipolazione di particelle di dimensioni 16mm X 16mm la quale è definita da una parete di base, da una parete superiore, sostanzialmente parallela alla parete di base, e da un elemento spaziatore, il quale è disposto tra le pareti di base e superiore per mantenere le pareti di base e superiore ad una distanza determinata equivalente ad una propria altezza. La camera di manipolazione presenta una camera interna la quale è delimitata superiormente ed inferiormente dalla parete superiore 13 e, rispettivamente, dalla parete di base e lateralmente dall'elemento spaziatore. La camera interna presenta una forma sostanzialmente parallelepipeda a base quadrata e comprende un setto 10 di separazione disposto parallelo ad una parete laterale della camera interna il quale definisce due camere 11,12 di forma sostanzialmente parallelepipeda a base rettangolare limitate lateralmente dal setto di separazione 10, delle quali la prima 11 costituisce una camera di caricamento (circa 2,9 μl) del campione e la seconda 12 una camera di recupero (circa 0,6 μl) del campione. Il setto di separazione 10 presenta una interruzione 18 di ampiezza 300 pm in prossimità di una parete laterale della camera interna la quale costituisce il canale 18 di comunicazione tra la camera 11 di caricamento e la camera 12 di recupero del campione.

La parete superiore 13 della camera di manipolazione, di forma sostanzialmente parallelepipeda a base quadrata, è trasparente, è costituita da policarbonato e presenta quattro aperture 14,15,16,17, disposte due 14,15 in corrispondenza della camera di caricamento e due 16,17 in corrispondenza della camera di recupero, le quali sono atte a mettere in comunicazione la camera interna con l'ambiente esterno.

La parete di base della camera interna presenta una matrice o griglia di elettrodi di dielettroforesi, che costituiscono la superficie del chip 8, ciascuno controllabile singolarmente per creare gabbie di dielettroforesi in grado di manipolare singole particelle all'interno della griglia. Secondo un aspetto del metodo secondo l'invenzione, le particelle vengono dunque manipolate essendo state catturate ciascuna in corrispondenza di uno specifico sito di una pluralità di siti resi disponibili mediante l'attivazione degli elettrodi che costituiscono la superficie del chip 8. In analogia con la struttura fisica del chip 8, i siti in corrispondenza dei quali vengono catturate le particelle sono anch'essi disposti all'interno del dispositivo di manipolazione secondo una schiera.

Si noti che il chip 8 è dotato di due camere diverse (11,12) tra loro distinte, collegate idraulicamente e delimitate su almeno una faccia dalla parete di base del chip stesso. In alternativa è possibile prevedere chip separati, collegati idraulicamente tra loro.

II chip 8 comprende inoltre un circuito stampato a cui la camera di manipolazione è saldata tramite colla, in cui sono definiti i circuiti elettronici per comandare separatamente i singoli elettrodi della matrice ed un insieme di contatti a cui i circuiti elettronici afferiscono.

Il chip 8 costituisce un dispositivo microfluidico per la manipolazione di particelle, o preferibilmente cellule, il guale può vantaggiosamente essere utilizzato in modalità usa e getta.

In uso, quando una delle aperture 14 (16) della camera di caricamento 11 viene utilizzata da un operatore per inserire un campione (in fase sostanzialmente liquida) nella camera interna, l'altra apertura 16 (14) della camera di caricamento 11 funge da sfiato. In considerazione della dimensione ridotta del canale di comunicazione tra la camera di caricamento 11 e la camera di recupero 12, si forma un menisco aria/acqua in corrispondenza del canale stesso, che impedisce al campione di penetrare nel canale di recupero. Successivamente la camera di recupero 12 viene riempita con una soluzione tampone che impedisce alle particelle presenti nella soluzione campione di penetrare nella camera di recupero 12.

Effettuato il caricamento del campione nel chip 8, il dispositivo viene disposto al di sopra del piano motorizzato 3 e posizionato tramite viti (non illustrate) in un opportuno alloggiamento 19 ricavato nel piano motorizzato stesso.

Tale alloggiamento 19 comprende i connettori (non illustrati) a cui è collegato il sistema di controllo degli elettrodi di dielettroforesi e in uso l'accoppiamento tra i contatti del chip 8 di manipolazione ed i connettori presenti nel piano orizzontale 3 motorizzato consente il controllo di ciascun elettrodo di dielettroforesi.

Al fine di recuperare le cellule di interesse presenti nella soluzione campione, viene definito un percorso P nella parete di base della camera interna del chip 8, costituito da un insieme determinato di elettrodi di dielettroforesi. Tale percorso definisce un convogliatore di uscita che si estende attraverso il canale 18 di comunicazione per trasportare cellule di interesse da un punto PI iniziale della camera 11 di caricamento ad un punto P2 finale della camera 12 di recupero. Attivando in successione gli elettrodi di dìelettroforesi presenti nel percorso P in direzione della camera 12 di recupero, le cellule di interesse vengono spostate dalla soluzione campione alla soluzione tampone, immerse nella quale vengono infine recuperate.

Secondo quanto illustrato in figura 1, il sistema 1 per la selezione ottimizzata di particelle comprende inoltre una unità di controllo 20 esterna collegata al microscopio 2 mediante dei cavi elettrici (non illustrati), la quale è alloggiata in una o più centraline esterne (non illustrate) alcune delle quali possono anche essere meccanicamente supportate dal telaio del microscopio 2. In particolare, l'unità di controllo 20 comprende un primo dispositivo 21 di controllo per la gestione dello stage 3 motorizzato, un secondo dispositivo 22 per la gestione del gruppo ottico e l'acquisizione delle immagini dalla telecamera ed un terzo dispositivo 23 per la gestione dei segnali di controllo degli elettrodi di dielettroforesi.

Si noti che l'unità di controllo 20 esterna può comprendere un computer industriale di tipo noto collegato tramite una rete Ethernet (preferibilmente operante secondo il protocollo TCP/IP) alle centraline esterne o in alternativa comprendere una o più centraline esterne realizzate mediante elettronica dedicata, collegate tra loro tramite rete Ethernet (preferibilmente operante secondo il protocollo TCP/IP).

Inoltre, il sistema 1 per la selezione ottimizzata di particelle comprende uno o più dispositivi 24 di interfaccia utente (dei quali solo uno è mostrato nella figura) denominati anche dispositivi "HMI" (Human Machine Interface). Ciascun dispositivo 24 HMI comprende un computer di tipo noto provvisto di uno schermo (non illustrato nella figura 1) per la visualizzazione dei dati ed un dispositivo di digitazione (non illustrato nella figura 1), il quale è normalmente definito da una tastiera e/o da un dispositivo di puntamento e può anche essere integrato nello schermo mediante la funzione denominata touchscreen. Ciascun dispositivo 24 HMI permette ad un operatore di interagire con l'unità di controllo 20 del microscopio 2 e consente ad esempio di inviare configurazioni relative alla telecamera 6; di selezionare e successivamente posizionare i filtri o gli obiettivi prescelti del revolver 7; di muovere in una posizione determinata lo stage 3 motorizzato in modo da visualizzare le cellule presenti in una posizione determinata sulla superficie del chip 8 di manipolazione a seguito del caricamento di un campione.

Al dispositivo 24 HMI possono essere collegati tramite una rete Ethernet (preferibilmente operante secondo il protocollo TCP/IP) ulteriori computer 30, 31, 32, i quali possono essere disposti in locale oppure in remoto. Ad esempio un computer 30 è un computer industriale o da ufficio, disposto in laboratorio o comunque in uno spazio riservato alle analisi di laboratorio, un computer 31 è un computer da ufficio ed è disposto nello stesso edificio del laboratorio, un computer 32 è un computer da ufficio ed è disposto a notevole distanza dal laboratorio. I computer 30 e 31 sono collegati al dispositivo 24 HMI unicamente mediante una rete di tipo Ethernet/Intranet, mentre i computer 32 sono collegati al dispositivo 24 HMI mediante la rete Internet. Si noti che i computer disposti a notevole distanza dal laboratorio sono in grado di visualizzare gli stessi dati del computer disposto in laboratorio.

Il dispositivo 24 HMI comprende un primo dispositivo 25 di comunicazione che dialoga (cioè scambia dei dati in modo bidirezionale) con l'unità di controllo del sistema per la selezione ottimizzata di particelle, un dispositivo 26 di memorizzazione che implementa anche un database (ad esempio SQL, SQL Light etc), ed un secondo dispositivo di comunicazione 27 che dialoga (cioè scambia dei dati in modo bidirezionale) con l'utente. Il primo dispositivo 25 di comunicazione realizza il protocollo di accesso ai dati della unità di controllo ed implementa i comandi di controllo di ogni diverso dispositivo periferico presente quale ad esempio stage 3 motorizzato, gruppo ottico 5 mobile, telecamera 6.

Il secondo dispositivo di comunicazione 27 realizza l'interfaccia utente grafica vera e propria.

I due dispositivi di comunicazione dialogano prevalentemente tra di loro solo indirettamente, ovvero dialogano tra di loro attraverso il dispositivo di memorizzazione 26; in altre parole, salvo comandi specifici con cui l'utente controlla dispositivi specifici, il primo dispositivo 25 di comunicazione legge/scrive dei dati nel dispositivo 26 di memorizzazione e nello stesso tempo il secondo dispositivo 27 di comunicazione legge/scrive dei dati nel dispositivo 26 di memorizzazione essenzialmente in modalità casuale (cioè quando l'operatore decide di utilizzare l'interfaccia utente).

Il primo dispositivo 25 di comunicazione, il secondo dispositivo 27 di comunicazione ed il dispositivo 26 di memorizzazione vengono usualmente realizzati tramite rispettivi programmi (Software) che costituiscono nell'insieme un programma (Software) di manipolazione di particelle. In particolare, il programma (software) che realizza il secondo dispositivo 27 di comunicazione costituisce l'interfaccia utente grafica e realizza mezzi di elaborazione di immagine tramite i quali vengono estratti i parametri pi pn caratteristici di ciascuna particella. Analogamente, il programma (software) che realizza il secondo dispositivo 27 di comunicazione realizza più genericamente mezzi di elaborazione di almeno una funzione dei parametri rilevati. Inoltre, sempre il medesimo programma (software) che realizza il secondo dispositivo 27 costituisce mezzi di selezione di particelle e mezzi per stabilire un criterio di selezione da utilizzare come parametro di riferimento per operare tale selezione.

Tali programmi sono usualmente residenti nel computer facente parte del dispositivo 24 HMI ma possono alternativamente essere residenti in altri computer disposti in locale oppure in remoto e scambiare dati via rete Intranet e/o Internet.

In uso, l'intera superficie del chip viene sottoposta a scansione e vengono acquisite e memorizzate in un'area 28 del dispositivo di memorizzazione un numero di immagini (15 immagini per ogni riga parzialmente sovrapposte per un totale di 20 righe) che consentono di valutare con esattezza il contenuto del chip con un adeguato grado di definizione. Le immagini memorizzate sono elaborate mediante un processo di elaborazione grafica che consente di individuare le cellule presenti e, per ciascuna cellula individuata, memorizzare nel dispositivo di memorizzazione in un'area 29 che implementa un database SQL i dati caratteristici di ciascuna cellula ovvero i parametri pi. pn.

Occorre notare che in alternativa o in parallelo alla scansione della intera superficie del chip tramite un sensore esterno quale la telecamera, è possibile utilizzare sensori (non illustrati) interni al chip stesso per rilevare i dati caratteristici di ciascuna cellula. Come descritto in W02007/049103, il cui contenuto si intende qui incorporato per le parti necessarie per semplice riferimento, è possibile ad esempio avere la superficie del chip 8 comprendente sia elettrodi di dielettroforesi che sensori di tipo ottico (o impedenziometrico) in grado di rilevare i parametri pi. pn caratteristici di ciascuna cellula.

Inoltre è opportuno notare che la manipolazione di ciascuna cellula può essere eseguita con successo tramite tecniche di manipolazione alternative alla dielettroforesi (ad esempio trappole di Optoforesi, Electrowetting on Dielectric - EWOD), a condizione che le cellule vengano manipolate in dispositivi microfluidici essendo state catturate ciascuna in corrispondenza di un generico sito di una pluralità di siti controllabili singolarmente.

A titolo di esempio non limitativo, verrà ora descritta una realizzazione preferenziale del metodo secondo la presente invenzione, seguendo il diagramma di flusso mostrato in Figura 2.

Per cominciare (blocco 100), viene identificato l'esperimento che si sta per svolgere raccogliendo informazioni relative all'operatore ed al campione che sta per essere analizzato. Quindi, il sistema esegue in automatico (blocco 110) una serie di operazioni volte a verificare la corretta connessione e/o configurazione e/o calibrazione della unità 20 di controllo in relazione ai dispositivi costituenti il microscopio 2, così da garantirne il corretto funzionamento nel corso dell'esperimento. Viene generalmente previsto (blocco 120) un controllo preliminare volto a verificare che non siano presenti contaminanti sulla superficie del chip 8, e più particolarmente lungo il percorso P del convogliatore di uscita. Se questo controllo porta ad individuare la presenza di contaminanti, l'esperimento viene interrotto (blocco 130). Se invece l'esito è negativo, si procede caricando il campione (blocco 140). La verifica dell'assenza di contaminanti viene a questo punto ripetuta (blocco 150) per escludere la possibilità che insieme al campione da analizzare siano state introdotte altre sostanze non desiderate sulla superficie del chip. Nel caso di contaminazione, chiaramente, all'operatore è data la possibilità di recuperare il campione precedentemente caricato per poterlo riutilizzare in un altro esperimento.

Ultimata questa verifica, è possibile avviare la fase di analisi vera e propria. L'intera superficie del chip viene sottoposta a scansione (blocco 160) in modo automatico e mediante un opportuno processo di elaborazione grafica, vengono rilevati e quindi memorizzati nel database (o anche mezzi di memorizzazione) una serie di dati caratteristici di ciascuna particella ovveri i parametri pi. pn.

Acquisite le immagini dell'intera superficie del chip, e memorizzati i parametri caratteristici di ciascuna particella, l'operatore può stabilire un criterio per la selezione delle sole particelle di interesse dopo avere acquisito informazioni sull'intero campione (blocco 170) (il criterio di selezione può ad esempio essere la scelta di particelle di morfologia determinata, la scelta delle particelle più luminose, la scelta di particelle rare con caratteristiche determinate). In particolare, il criterio di selezione viene stabilito sulla base del risultato di una elaborazione dei dati acquisiti per ciascuna particella.

A livello pratico, l'interfaccia grafica mostra all'operatore una schermata (Figure 3 e 4) nella quale viene riportato l'elenco delle particelle, cellule nel caso specifico, osservate mediante scansione ottica dell'intero campione. Per ciascuna di esse sono visualizzabili i valori di una molteplicità di parametri sperimentali misurati nel corso della scansione, quali parametri ottici (trasparenza, opacità, uniformità di intensità luminosa), parametri morfologici (fattore di area o anche misura indiretta del raggio in pixel, fattore di forma, fattore di rotondità o anche sfericità etc...), corretto posizionamento all'interno di una cella (sito) della griglia del chip 8, luminosità misurata in canali luminosi corrispondenti a differenti lunghezze d'onda etc. In linea del tutto generale, i parametri misurati per le particelle possono riferirsi anche alle proprietà bio-elettriche e/o bio-chimiche (ad esempio è possibile stabilire se una cellula sia viva o morta studiando nel tempo il decadimento della fluorescenza di cellule marcate con calceina oppure ancora, analizzando immagini prese ad un certo intervallo di tempo, misurare l'assorbimento di un colorante ecc), meccaniche (ad esempio di può determinare l'elasticità di una particella sottoponendola ad un impulso di dielettroforesi in grado di deformarla; osservando il tempo necessario affinché la particella torni alla forma originaria si può dedurre un fattore si elasticità della particella stessa), dielettriche (se la particella osservata si posiziona all'interno di una cella della griglia del chip 8 allora siamo in presenza di particelle manipolabili tramite NDEP, se la particella si posiziona tra celle contigue della griglia del chip 8 allora siamo in presenza di celle manipolabili tramite PDEP), o ancora - nel caso si tratti di cellule - l'espressione di antigeni di superficie o intra-citoplasmatici, o di una loro opportuna combinazione. L'acquisizione dei dati viene realizzata mediante l'utilizzo di una pluralità di sensori, che possono essere interni o esterni al dispositivo ibrido 8.

A tale scopo, il metodo secondo l'invenzione può comprendere anche una fase di marcare le particelle (più propriamente, nella fattispecie, cellule) in sospensione con almeno un marcatore che sia rilevabile mediante uno di tali sensori interni e/o esterni al chip. Per ciascuna delle cellule vengono inoltre memorizzate e riportate le coordinate che ne definiscono la disposizione rispetto alla superficie del chip 8.

Mediante una ulteriore schermata (Figura 5) all'operatore vengono mostrati dei diagrammi che riportano la distribuzione, rispetto alla popolazione di cellule, del valore dei parametri pi, p2, ... pn sperimentali misurati nel corso della scansione e memorizzati , e/o il valore di una o più funzioni di almeno uno di tali parametri opportunamente elaborato dal sistema. Definendo opportunamente un criterio di selezione, l'operatore può utilizzare l'interfaccia per selezionare un sottoinsieme di particelle della popolazione in esame: modificando all'interno degli istogrammi di Figura 5 la posizione dei cursori 34, l'operatore può imporre valori di soglia inferiore e/o superiore ai parametri misurati e/o a rispettive funzioni degli stessi.

Tali valori di soglia, inferiore o superiore, e/o tali intervalli di interesse (per esempio corrispondenti, cioè, ad un tratto di interesse della funzione dei parametri pi elaborata ed associata al criterio di selezione, ovvero ad un tratto della distribuzione del valore di tale funzione all'interno della popolazione di particelle, e dunque compresi tra un valore di soglia inferiore ed un valore di soglia superiore) costituiscono un "criterio di soglia" con il quale il valore della funzione dei parametri pi viene comparato al fine di realizzare la selezione delle particelle di interesse.

Tali valori di soglia possono essere scelti dall'operatore stesso dopo aver valutato le proprietà del campione di cellule nella sua totalità, in particolare sulla base del valore elaborato dal sistema delle funzioni dei parametri memeorizzati, oppure può essere implementata in automatico una procedura che individua le particelle che rispondono ad un determinato criterio di selezione, variabile comunque da esperimento ad esperimento, sulla base dei dati raccolti per l'intera popolazione oggetto della prova. Si noti inoltre che, in quest'ultimo caso, l'operatore può scegliere se affidare la selezione definitiva alla procedura di selezione automatica o in alternativa controllare la proposta di selezione automatica, perfezionandola mediante un controllo manuale dei risultati.

E' importante sottolineare che non vengono cioè fissati a priori valori di soglia delle grandezze di interesse nell'esperimento, ma, sulla base delle informazioni relative all'intero campione appena ricavate mediante la scansione, il criterio di selezione e, conseguentemente, i relativi valori di soglia, vengono scelti in modo adattativo, così da individuare e manipolare le cellule che soddisfano dati requisiti. Pertanto, secondo il metodo dell'invenzione, risulta possibile selezionare le cellule aventi le caratteristiche complessivamente migliori in vista di un determinato impiego successivo, ovvero quelle per le quali il valore di una opportuna funzione di merito definita di volta in volta risulta ottimizzato.

In questo modo l'interfaccia utente 27 costituisce mezzi di selezione dì particelle e, inoltre, mezzi per stabilire un criterio di soglia da impiegare come parametro di riferimento per la selezione stessa.

A seconda della destinazione successiva delle cellule -per esempio l'impiego in ulteriori determinazioni sperimentali - il criterio di selezione può essere modulato nell'ottica di avere a disposizione un numero sufficiente di cellule che soddisfano determinati requisiti che le rendono idonee al passo sperimentale seguente.

D finendo le soglie di interesse mediante l'interfaccia di Figura 5 (blocco 170), l'operatore effettua dunque contestualmente una selezione all'interno della popolazione di particelle, individuando quelle per le quali sono stati misurati quei valori dei parametri pi, p2,..., pn e computati quei valori delle funzioni che rientrano negli intervalli di interesse definiti dalle soglie imposte graficamente con i cursori 34.

L'operatore è eventualmente aiutato nel posizionamento dei cursori 34 negli istogrammi di Figura 5 in quanto, se richiesto, l'interfaccia mostra, in corrispondenza di ogni barra costituente 1'istogramma, una ulteriore schermata (non illustrata) con le immagini delle particelle associate a tale barra.

A titolo di esempio non limitativo, in Figura 5 compaiono, in una prima colonna, istogrammi relativi alla distribuzione nella popolazione oggetto della prova di caratteristiche morfologiche delle particelle, quali dimensione, fattore di rotondità, correttezza del posizionamento in corrispondenza di una delle celle del dispositivo utilizzato per la manipolazione. In una seconda colonna alla destra della precedente compaiono invece istogrammi che mostrano l'andamento di funzioni complesse basate su una opportuna combinazione e /o elaborazione di differenti parametri misurati utilizzabili come indici di proprietà non direttamente misurabili. Come esempio di combinazione, possono essere combinati i risultati relativi a misure di luminosità eseguite a diverse lunghezze d'onda, ciascuna corrispondente ad un marcatore specifico associato alla presenza/assenza di una determinata caratteristica (per esempio del nucleo cellulare, di un antigene specifico, di una fluorescenza spontanea della particella, eccetera). Come esempio di elaborazione, possono essere elaborati i risultati relativi a misure di luminosità, per tenere in considerazione ed eventualmente compensare la diversa illuminazione in zone diverse del chip 8 ad opera dell'illuminatore.

Dopo avere effettuato la selezione all'interno della popolazione di particelle mediante l'interfaccia di Figura 5, l'utente può successivamente perfezionare la selezione già effettuata (blocco 180 - Raffinamento Selezione). L'utente può infatti controllare, solo per le particelle che soddisfano i criteri di soglia stabiliti tramite le schermate di Figura 5 (blocco 190), le particelle selezionate poiché, mediante le schermate di Figura 3 e 4, l'utente visualizza per ciascuna particella sia i parametri caratteristici della stessa che le immagini acquisite durante la scansione del campione. Tali immagini, visualizzate in uno o più canali luminosi a differenti lunghezze d'onda(a titolo di esempio non limitativo in figura 3 e 4 sono riportate le immagini di cellule nei canali DAPI, FITC, TRITC), offrono all'operatore la possibilità di decidere se selezionare definitivamente o meno una particella inizialmente prescelta e pertanto le schermate di Figura 3 e 4 costituiscono dei mezzi di controllo per perfezionare la selezione già effettuata. Può infatti accadere che, nonostante la particella sia stata inizialmente prescelta, essa risulti essere una impurità e pertanto non sia utile ai fini dei protocolli sperimentali successivi.

L'interfaccia utente 27 grafica offre all'operatore anche un ulteriore mezzo di controllo per perfezionare la selezione già effettuata, il quale è costituito dalla possibilità di vedere attraverso gli oculari del microscopio ciascuna particella selezionata. Mediante la attivazione di un bottone di comando (non illustrato), la particella selezionata si posizione esattamente in modo automatico al di sotto dell'obiettivo del microscopio e ciò consente all'operatore, tramite oculari, la visione reale della particella stessa.

Si noti che il posizionamento automatico della particella selezionata al di sotto dell'obiettivo del microscopio si realizza in quanto, attivando il bottone di comando, l'interfaccia utente 27 grafica comunica alla unità 20 di controllo le coordinate della particella di interesse all'interno della griglia del chip 8 e l'unità 20 di controllo sposta con precisione nel piano X-Y lo stage memorizzato al fine di allineare tra loro particella (posizione all'interno della griglia del chip 8) e obiettivo del microscopio. Qualora sia necessario, l'unità 20 di controllo movimenta automaticamente lo stage motorizzato lungo l'asse Z per mettere a fuoco la particella prescelta Al termine di tale ulteriore fase di controllo, l'operatore ha la possibilità di decidere se la particella sia di interesse o se sia invece da considerare una impurità.

In questo modo l'interfaccia utente grafica 27 costituisce mezzi di selezione di particelle e, inoltre, mezzi di controllo per perfezionare la selezione delle particelle di interesse. Nel caso in cui il sensore sia esterno al dispositivo microfluidico e sia costituito da una telecamera o anche nel caso in cui il sensore sia interno al dispositivo microfluidico e sia costituito da un sensore ottico, i mezzi di controllo comprendono mezzi di visualizzazione delle immagini di ciascuna particella.

L'interfaccia offre ulteriori possibilità all'operatore: è possibile osservare la disposizione sulla superficie del chip di tutte le particelle del campione (Figura 6) oppure delle sole particelle effettivamente selezionate (Figura 7) fissando in modo adattativo i valori di soglia come appena discusso. Occorre notare come le coordinate delle particelle mostrate nella schermata dell'interfaccia di Figura 6 corrispondano a quelle effettive del campione nel chip 8, e pertanto presentino una distribuzione che risente della relativa struttura fisica. In particolare, è possibile individuare nella porzione inferiore della schermata di Figura 6 una fascia orizzontale nella quale non sono presenti particelle, che corrisponde alla camera 12 di recupero delle particelle selezionate. Analogamente, nella porzione superiore non compaiono particelle perché quella porzione della camera 11 di caricamento viene utilizzata per ospitare le particelle eventualmente scartate.

In Figura 8 è mostrata una ulteriore schermata dell'interfaccia con cui l'operatore può visualizzare, sotto forma di diagramma a dispersione, la distribuzione nella popolazione di particelle di due parametri o funzioni di interesse. A titolo di esempio non limitativo, in Figura 8 sono riportati i valori di luminosità misurati a due differenti lunghezze d'onda, ciascuna corrispondente ad uno specifico marcatore. Mediante l'utilizzo di opportuni comandi, all'operatore è data la possibilità di visualizzare su un analogo diagramma a dispersione i valori relativi ad altri parametri e/o funzioni. Anche mediante questa forma di visualizzazione, l'operatore può imporre valori di soglia in maniera da definire un opportuno criterio di selezione e contestualmente selezionare le particelle che rispondono a tali requisiti, in maniera del tutto analoga a quanto discusso precedentemente con riferimento alla rappresentazione mediante istogrammi.

Terminata questa fase, avendo definito un criterio di selezione e avendo, sostanzialmente, effettuato una prima selezione delle particelle che soddisfano tale criterio, la procedura prevede (blocco 190) di controllare (eventualmente anche ad una ad una) le particelle selezionate al passo precedente, raffinando se necessario la selezione appena eseguita.

L'operatore può quindi confermare la selezione delle particelle eseguita nella fase precedente avendo analizzato in maniera complessiva l'intera popolazione contenuta dal chip, verificando la correttezza della sua scelta potendo analizzare nel dettaglio le caratteristiche specifiche di ogni singola cellula. Tra le opportunità offerte dall'interfaccia c'è, ancora, quella di ordinare le particelle secondo il valore di uno qualsiasi dei campi disponibili, per esempio secondo l'intensità luminosa nel campo DAPI crescente nel caso di cellule, se si intendono selezionare le 'migliori' cellule per una serie di esperimenti successivi, oppure se si desidera selezionare cellule che presentano valori di intensità luminosa in uno specifico canale simili tra loro.

Se l'utente non è soddisfatto della scelta già realizzata, può ritornare (blocco 180) alla fase precedente in modo da raffinare ulteriormente la selezione, variando eventualmente il criterio di selezione precedentemente stabilito. Se invece il risultato della selezione è quantitativamente e qualitativamente soddisfacente, il metodo prevede di procedere ad una prima fase di trasferimento o routing (blocco 200), ovvero ad una manipolazione automatizzata delle particelle che ha per obiettivo il trasferimento delle particelle selezionate dalla posizione originariamente occupata sulla superficie del chip ad una determinata posizione, anch'essa memorizzata dal sistema, all'interno del convogliatore di uscita destinato al trasporto delle particelle stesse verso la camera 12 di recupero. Questo costituisce la prima parte del tragitto che devono percorrere le particelle selezionate per pervenire alla camera di recupero. A seconda della geometria specifica del dispositivo di manipolazione di volta in volta impiegato, può essere previsto un unico convogliatore di uscita centrale, oppure il dispositivo può comprendere più convogliatori di uscita in parallelo al fine di accelerare e agevolare l'operazione di routing. Tale operazione di fatto realizza la separazione delle particelle di interesse precedentemente selezionate, operando all'interno del campione una loro manipolazione esclusiva.

A questo punto, il metodo prevede un ulteriore passo di controllo (blocco 220) del convogliatore di uscita per realizzare il quale occorre effettuare una nuova scansione (blocco 210) per acquisire le immagini del convogliatore e delle particelle da esso ospitate. Sulla base delle informazioni rese disponibili da queste immagini, l'utente deciderà fra tutte le particelle selezionate nella prima fase di trasferimento se e quali particelle cellule scartare e quali invece destinare all'estrazione vera e propria dal chip verso la camera 12 di recupero.

Tale fase di controllo ulteriore viene eseguita confrontando per ciascuna particella la fotografia della particella disposta in posizione originale e disposta in posizione nel convogliatore di uscita al fine di verificare che la prima fase di trasferimento abbia effettivamente manipolato la particella prescelta, che potrebbe non arrivare correttamente alla sua destinazione nel convogliatore di uscita.

Come illustrato in Fig.10, si noti che è possibile individuare lungo il percorso P del convogliatore di uscita una stazione 33 di scarto che comprende una matrice 34 di elettrodi di selezione in corrispondenza dei quali per ciascuna particella viene verificato se tale particella sia da scartare o recuperare, in funzione del risultato del controllo del convogliatore di uscita (blocco 220). Se la particella è selezionata, viene fatta passare alla camera di recupero; se, altrimenti, è scartata, viene portata ad un convogliatore di scarto definito in una porzione della camera 11 di caricamento. Tale fase di recupero delle particelle selezionate viene realizzata manipolando in maniera esclusiva le stesse.

Successivamente, si procede alla seconda fase di trasferimento o fase di route-out, scopo della quale è quello di portare tutte le particelle selezionate e confermate fino a quel momento alla camera di recupero. Da tale camera, le particelle possono quindi essere recuperate ed eventualmente utilizzate per ulteriori fasi di analisi, su dispositivi esterni o anche in situ.

Il sistema impiegato per realizzare la selezione ottimizzata delle particelle di interesse, terminata la procedura, emette (blocco 260) un report contenente le informazioni relative all'analisi appena effettuata.

ESEMPIO 1 - Eliminazione dei clusters Il metodo secondo la presente invenzione si può utilizzare, tra le numerose potenziali applicazioni, al fine di eliminare da una popolazione di particelle quelle raggruppate a formare aggregati (clusters) nel caso in cui la loro presenza non sia desiderabile, per esempio in vista di un successivo utilizzo di sole singole particelle. Questo si verifica, per esempio, nel caso della separazione di cellule viventi, qualora si desideri operare una successiva analisi su singole cellule per cui la presenza di clusters nel campione potrebbe alterare l'acquisizione dei dati o il risultato della prova stessa.

In tale caso, l'operatore può osservare (Figura 3), mediante l'interfaccia che realizza il metodo secondo l'invenzione, le particelle ed aggregati di particelle che costituiscono il campione, e per ciascuno di essi rilevare una pluralità di parametri. In particolare, in questo caso, verranno misurati il raggio della particella o aggregato, in associazione con le corrispondenti coordinate rispetto alla superficie del dispositivo di manipolazione, e sarà altresì valutato un fattore di rotondità della particella. Si verificherà per finire che la particella si trovi effettivamente in corrispondenza di un sito corrispondente in uso a una delle celle di dielettroforesi utilizzate per la manipolazione. A supporto della selezione verranno anche elaborate le immagini delle particelle o aggregati ottenute nel corso della scansione integrale del campione effettuata a monte dell'avvio delle operazioni di selezione.

Utilizzando in maniera opportuna i cursori relativi ad una successiva schermata dell'interfaccia (Figura 5), l'operatore seleziona un valore di soglia superiore per la dimensione (raggio) delle particelle e/o per la rotondità, andando dunque a selezionare (per poi poterle allontanare dal dispositivo) quelle per cui il dato misurato risulti in eccesso. Si noti che l'indice di probabilità che si tratti di un cluster è una funzione di più parametri caratteristici della cellula come ad esempio dimensione e rotondità. E' infatti elevata la probabilità che un raggio misurato elevato corrisponda non ad una particella singola di dimensioni maggiori, ma a un cluster e che una forma allungata si riferisca non ad una singola particella, ma a più particelle raggruppate lungo una direzione principale ovvero ad un cluster. Se inoltre le particelle si trovano effettivamente in corrispondenza di gabbie di manipolazione del dispositivo, si può affermare che il dato misurato è relativo a particelle e non ad impurezze presenti per errore sulla superficie del dispositivo.

Avendo definito opportunamente valori di soglia ed intervalli di utilità per le grandezze prese in esame, l'operatore seleziona di fatto i clusters presenti nel campione, verifica eventualmente a posteriori la bontà della sua selezione ed infine è in grado di allontanare dal campione i clusters, conservando selettivamente all'interno del dispositivo di manipolazione le particelle singole, su cui può in un secondo momento effettuare l'analisi sempre all'interno dello stesso dispositivo.

ESEMPIO 2 - Diagnosi prenatale

Per una varietà di protocolli di diagnosi prenatale è necessario realizzare una concentrazione di un campione di sangue materno andando a selezionare al suo interno gli eritrociti fetali per sottoporli successivamente ad analisi di tipo genetico. A tale scopo, è sostanzialmente necessario individuare le cellule dotate di nucleo, che abbiano provenienza fetale e non materna. Questo tipo di determinazione può essere effettuata marcando le cellule con uno o più marcatori fluorescenti, per esempio un primo marcatore (DAPI) che si lega al nucleo di una cellula ed un secondo marcatore (FITC) che si lega selettivamente ad antigeni di origine fetale e non materna. Rilevando l'intensità di fluorescenza per i due marcatori, a due rispettive lunghezze d'onda separate, è possibile individuare le cellule per le quali entrambi i marcatori sono presenti. Poiché una rilevazione di fluorescenza potrebbe essere affetta da errore nel caso in cui cellule presentassero fenomeni di autofluorescenza non specifica - ovvero rilevabile a qualunque lunghezza d'onda - è preferibile effettuare una terza rilevazione di fluorescenza a una terza lunghezza d'onda (TRITC), in modo da determinare quali cellule presentino tale fenomeno e siano pertanto da escludere, in quanto la rilevazione di fluorescenza nei canali DAPI e FITC non garantirebbe da sé che si tratti effettivamente di cellule nucleate fetali. In questo senso, secondo il metodo dell'invenzione viene stabilito un criterio di selezione di cellule nucleate fetali - imponendo rispettivi valori o intervalli di soglia definiti sulla base dell' elaborazione di una funzione dei parametri misurati e memorizzati - che di fatto minimizza la possibilità di realizzare selezioni erronee, ovvero di selezionare cosiddetti falsi positivi.

Utilizzando l'interfaccia che realizza il metodo secondo l'invenzione, l'operatore assocerà alle coordinate delle particelle sulla superficie del dispositivo di manipolazione il valore di una pluralità di parametri rilevati nel corso della scansione, oltre alle immagini ottenute alle diverse lunghezze d'onda considerate, e il valore di una o più funzioni di merito calcolate sulla base dei parametri rilevati. In particolare (Figura 3, 4 e 5), l'operatore valuterà la distribuzione all'interno della popolazione cellulare del valore di più funzioni.

Una prima funzione è indice della probabilità che si tratti di una cellula nucleata fetale (indicata con "fetal" in Figura 5) ed è un indice della intensità di fluorescenza nel canale FITC elaborata per compensare la diversa illuminazione in zone diverse del chip 8 ad opera dell'illuminatore; una seconda funzione (indicata con Dapi in Figura 5) è indice della intensità di fluorescenza nel canale DAPI ed è una funzione elaborata dell'intensità di fluorescenza ; una terza funzione è indice della probabilità che la rilevazione di fluorescenza nei canali DAPI e FITC sia in realtà fuorviante, in quanto la particella in oggetto presenta fenomeni di autofluorescenza (istogramma non nominato in Figura 5).

L'operatore è pertanto in grado di fissare, sulla base dell'osservazione dell'intero campione e in modo adattativo, intervalli di valori utili della funzione "fetal" e delle altre precedentemente descritte in modo da realizzare la selezione delle sole cellule per cui sono verificati i criteri precedentemente discussi.

Claims (35)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per l'identificazione e la manipolazione di particelle di interesse all'interno di una popolazione di particelle, comprendente le fasi di: a) rilevare, per ciascuna di dette particelle di detta popolazione di particelle, almeno uno di una pluralità di parametri p1, p2, ... pncaratteristici di dette particelle di interesse; b) selezionare tra dette particelle le particelle di interesse comparando per ciascuna di dette particelle detto almeno un parametro con un rispettivo parametro di riferimento; caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre le fasi di c) memorizzare, per ciascuna di dette particelle, detto almeno uno parametro p1, p2, ...pnprecedentemente rilevato; d) elaborare il valore di almeno una funzione di detto almeno un parametro memorizzato associando la detta funzione ad un criterio di selezione delle dette particelle di interesse detto criterio di selezione essendo scelto in un gruppo di possibili criteri di selezione; e) stabilire per ciascuna di dette particelle un criterio di soglia da utilizzare come detto parametro di riferimento; detto criterio di soglia venendo di volta in volta stabilito in base al risultato di detta elaborazione.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre la fase di f) separare dette particelle di interesse precedentemente selezionate tra dette particelle manipolando esclusivamente le stesse.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che dette particelle sono mantenute in sospensione in un liquido in un dispositivo microfluidico.
4. 4. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre la fase g) di memorizzare la collocazione di partenza di dette particelle.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre la fase h) di spostare le particelle selezionate dalla loro detta collocazione di partenza ad una rispettiva collocazione di trasferimento, la cui posizione viene anch'essa memorizzata per una successiva fase i) di recupero di ciascuna particella in essa situata.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che detta fase i) di recupero delle dette particelle selezionate e spostate alla rispettiva collocazione di trasferimento viene effettuata manipolando esclusivamente le stesse.
7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 5 0 6, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre la fase 1) di verificare che le particelle di interesse selezionate siano state correttamente spostate dalla loro detta collocazione di partenza alla detta collocazione di trasferimento.
8. 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che dette fasi vengono condotte manipolando dette particelle avendo catturato le stesse, ciascuna in corrispondenza di uno specifico sito di una pluralità di siti del dispositivo 8 microfluidico.
9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detti siti sono disposti all'interno del detto dispositivo 8 microfluidico secondo una schiera.
10. 10. Metodo secondo una delle rivendicazioni 8 o 9, caratterizzato dal fatto che detto dispositivo microfluidico 8 è munito di una pluralità di camere diverse (11,12), tra loro distinte e collegate idraulicamente, delimitate su almeno una faccia da una parete di base di un unico chip 8 o da una pluralità di chip separati.
11. 11. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 3 a 10, caratterizzato dal fatto che detti parametri pi, p2, ... pndi detta pluralità di parametri sono rilevabili mediante almeno un sensore interno o esterno a detto dispositivo microfluidico.
12. 12. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto dì comprendere una ulteriore fase di perfezionamento della selezione di dette particelle di interesse; detta ulteriore fase di perfezionamento interessando tutte le dette particelle e/o solo le particelle precedentemente selezionate.
13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 12 in cui la detta fase di perfezionamento comprende una fase di controllo di ciascuna particella selezionata
14. 14. Metodo secondo la rivendicazione 13 in cui la detta fase di controllo comprende una fase di visualizzazione della pluralità di parametri pi, p2, ... pnrilevabili per ciascuna particella mediante almeno un sensore interno e/o esterno a detto dispositivo microfluidico.
15. 15. Metodo secondo la rivendicazione 13 o 14 in cui almeno uno dei parametri della pluralità di parametri Ρ1,P2, ... Pnè rilevabile mediante un sensore esterno costituito da una telecamera e la detta fase di controllo comprende la visualizzazione delle immagini di ciascuna particella.
16. 16. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di comprendere una ulteriore fase di elaborazione in cui si sceglie in detto gruppo di possibili criteri di selezione per dette particelle di interesse un criterio che riduce al minimo la possibilità di selezioni erronee; detta ulteriore fase di elaborazione interessando tutte le dette particelle e/o solo le particelle precedentemente selezionate.
17. 17. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto di comprendere la fase di marcare dette particelle di detta popolazione di particelle in sospensione con almeno un marcatore specifico per dette particelle di interesse, detto marcatore essendo rilevabile mediante almeno un sensore interno esterno ad un dispositivo microfluidico in cui detta popolazione di particelle è stata disposta in sospensione in detto liquido.
18. 18. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detti parametri p1, p2, ... pndi detta pluralità di parametri sono selezionati nel gruppo consistente in: a. morfologia; b. proprietà ottiche c. proprietà bio-elettriche; d. proprietà bio-chimiche; e. proprietà meccaniche; f. espressione di antigeni di superficie; g. espressione di antigeni intra-citoplasmatici; h. proprietà dielettriche; o combinazioni delle medesime.
19. 19. Apparato per la l'identificazione e la manipolazione di particelle di interesse all'interno di una popolazione di particelle, comprendente: a) mezzi di rilevazione per ciascuna di dette particelle di almeno uno di una pluralità parametri p1, P2, - Pncaratteristici di dette particelle di interesse; b) mezzi per selezionare tra dette particelle le particelle di interesse comparando per ciascuna di dette particelle detto almeno un parametro con un rispettivo criterio di soglia; caratterizzato dal fatto di comprendere c) mezzi di memorizzazione, per ciascuna di dette particelle, di detto almeno un parametro p1, p2, ... pnprecedentemente rilevato; d) mezzi di elaborazione del valore di almeno una funzione di detto almeno un parametro memorizzato e di associazione di detta funzione ad un criterio di selezione delle dette particelle di interesse, detto criterio di selezione essendo scelto in un gruppo di possibili criteri di selezione; e) mezzi per stabilire per ciascuna di dette particelle il detto criterio di soglia; detto criterio di soglia venendo di volta in volta stabilito in base al risultato di detta elaborazione.
20. 20. Apparato secondo la rivendicazione 19, caratterizzato dal fatto che detti mezzi di selezione comprendono mezzi di controllo per perfezionare la selezione di dette particelle
21. 21. Apparato secondo la rivendicazione 19 o 20, caratterizzato dal fatto che detti mezzi di rilevazione comprendono un microscopio equipaggiato con telecamera ed un piano orizzontale mobile posto al di sotto di detta telecamera.
22. 22. Apparato secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che detto piano orizzontale mobile comprende un alloggiamento disegnato per ospitare un dispositivo microfluidico che contiene, in uso, le dette particelle in sospensione in un liquido.
23. 23. Apparato secondo la rivendicazione 22, caratterizzato dal fatto che detto piano orizzontale è mobile in un piano XY sostanzialmente orizzontale e verticalmente lungo l'asse Z per consentire l'acquisizione, mediante detti mezzi di rilevazione, di immagini dell'intera superficie del detto dispositivo microfluidico contenente la popolazione di particelle
24. 24. Apparato secondo la rivendicazione 23, caratterizzato dal fatto che sulla base delle di dette immagini dell'intero dispositivo microfluidico acquisite vengono memorizzate, mediante detti mezzi di memorizzazione, le immagini di ciascuna particella rilevata.
25. 25. Apparato secondo la rivendicazione 24, caratterizzato dal fatto che dette immagini delle particelle acquisite vengono memorizzate in mezzi di memorizzazione costituiti da un database.
26. 26. Apparato secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che detto database memorizza le immagini di ciascuna particella rispettivamente acquisite in canali separati relativi a distinte lunghezze d'onda.
27. 27. Apparato secondo una delle rivendicazioni da 24 a 26, in cui i mezzi di rilevazione sono costituiti da una telecamera ed i mezzi di controllo comprendono mezzi di visualizzazione delle immagini di ciascuna particella memorizzata.
28. 28. Apparato secondo una delle rivendicazioni da 19 a 27, caratterizzato dal fatto che detti mezzi di elaborazione comprendono un computer ed un programma di elaborazione.
29. 29. Apparato secondo una delle rivendicazioni da 19 a 28, caratterizzato dal fatto che detti mezzi per stabilire il detto criterio di soglia comprendono un computer ed un primo programma di selezione.
30. 30. Apparato secondo una delle rivendicazioni da 19 a 29, caratterizzato dal fatto che detti mezzi di selezione comprendono una unità di controllo del detto dispositivo microfluidico ed un secondo programma di selezione.
31. 31. Apparato secondo una delle rivendicazioni da 28 a 30, caratterizzato dal fatto che detto programma di elaborazione è configurato per classificare le dette particelle sulla base di dimensione e di una pluralità di parametri morfologici di ciascuna particella.
32. 32. Apparato secondo una delle rivendicazioni da 28 a 31, caratterizzato dal fatto che detto programma di elaborazione è configurato per classificare le dette particelle sulla base della misura della intensità luminosa di fluorescenza all'interno del perimetro di ciascuna particella.
33. 33. Apparato secondo una delle rivendicazioni da 19 a 32, caratterizzato dal fatto che detti mezzi di rilevazione comprendono sensori interni e/o esterni al detto dispositivo microfluidico, detti mezzi essendo atti a rilevare almeno un parametro pi di dette particelle selezionato nel gruppo consistente in: a. Morfologia; b. proprietà ottiche c. proprietà bio-elettriche; d. proprietà bio-chimiche; e. proprietà meccaniche; f. espressione di antigeni di superficie; g. espressione di antigeni intra-citoplasmatici; h. proprietà dielettriche; o combinazioni delle medesime.
34. 34. Apparato secondo una delle rivendicazioni da 19 a 33, caratterizzato dal fatto che detti mezzi di rilevazione sono configurati per rilevare almeno un detto parametro dì una pluralità di parametri p1, p2, ... pnper ciascuna delle dette particelle in sospensione entro il detto dispositivo microfluidico oppure, selettivamente, soltanto per un sottoinsieme di particelle selezionate e spostate alla loro detta collocazione dì trasferimento.
35. 35. Apparato secondo la rivendicazione 34, caratterizzato dal fatto che detti mezzi di elaborazione sono configurati per comparare i parametri rilevati e memorizzati per le particelle di detto sottoinsieme in corrispondenza della loro collocazione di partenza con rispettivi parametri rilevati e memorizzati per le stesse particelle di detto sottoinsieme in corrispondenza della loro collocazione di trasferimento.