CN1470873A - Dna固相扩增与流式检测分析技术与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNA固相扩增与流式检测分析技术及试剂盒的制备方法，该技术灵敏快速、信息量大，制造简便、成本低。主要特征在于以流式细胞仪为主要检测分析手段，把多种不同的信息编码技术用于各种固相合成与扩增产物，亲合吸附层析等制备过程中的固相分离物、微载体表面附着的微生物体以及各种固相基质微粒表面结合、吸附或包被的生物、化学分子等表面活性分子结构与特性等信息的编码，并将此编码微粒用于核酸、蛋白、药物和化学分子等的大规模检测分析与筛选。本发明可广泛地用于环境检测、生物医药研究、疾病诊断以及基因组、蛋白质组学和分子文库等领域。

Description

DNA固相扩增与流式检测分析技术及试剂盒

本发明涉及一种高通量DNA固相扩增与流式检测分析技术及试剂盒的制备方法。该技术准确、灵敏、快速、信息量大，制备方法简便、成本低，能同时检测样品中多种不同的蛋白、核酸分子、生物化学分子、微生物或细胞等成分，可广泛地用于生物学、医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。

固相吸附、分离与合成技术在样品或样品溶液、生物体液(如血液、血清、血浆、脑脊液、尿液等，泪液、汗液、消化液和精液等分泌液，组织液、渗出液、呕吐物、粪便、组织/细胞匀浆液等)、微生物或细胞中的蛋白、核酸等生物、化学分子的检测、分析、分离、纯化以及蛋白多肽、寡核苷酸、先导化合物和药物的合成等方面已被广为应用。

生物固相技术主要是利用不溶的固相基质材料，通过表面吸附或结合以捕获液相被分析物和被纯化物中的靶分子或固定新合成的靶分子，借助重力、压力、离心、过滤、磁力、流体等，经过一步或多步操作很方便的将未结合的分子(液相、游离相或流动相)与结合分子(固相)分离，以便获得纯的目的分子，或将靶分子从复杂的样品混合物或悬液中分离出来，用于进一步的分析研究。

在样品的检测分析、分离纯化、合成等实验中，大部分情况下需要在同一个容器里、同时进行两项或多项实验，以便对样品中多种不同成分的有无、含量和来源等做出平行的比对以及定性、定量、定位等检测分析；或对单一种分子的多种不同特性(如单核苷酸多样性)进行平行检测与分析；或对多种物质同时进行分离纯化，或同时进行多种不同分子的合成。在此情况下，传统的固相吸附试验所存在的问题是：对超过3种以上的不同被检测物，被纯化物或合成物由于难以区分，很难同时进行。也就是说，用传统的固相技术或方法，在一个容器或试验中被检测物、合成物或分离物的数量受固相系统的限制或制约，更无法同时或连续进行合成、分离与检测等操作。

在现代基因组学、蛋白质组学、功能组学、组合化学的分析研究和生物医学诊断和新药研究开发中，需要同时对同一样品中大量的、多种不同生物、化学物质进行快速、灵敏的高通量合成、分离、纯化与检测，以分析生物、化学物资的种类、数量、组成、变异以及多态性、翻译后修饰、序列结构、不同生物分子间的相互作用，个体健康、感染状态与用药特性，个体免疫系统的功能状态、遗传差异等。传统解决办法是首先通过分离提取、纯化或人工合成等技术和工艺，分别进行大量制备，以获得各种不同的生物或化学分子(如核酸或寡核苷酸、蛋白与多肽、生长因子与受体、抗原与抗体等各种不同特性的生物分子)；然后，再分别将生物分子探针固相化在不同的固相基质(如载玻片、微孔板或层析基质)的表面，与样品中对应的抗原抗体或核酸等化学物质分别反应，分别进行检测分析。由于合成与制备、分离与纯化同检测与分析等各个操作环节彼此互无联系、相互脱节，因此如要检测十几种成分就需进行十几次不同的合成、分离纯化与检测分析实验，异常繁琐复杂。特别是在抗体、单克隆抗体、基因工程抗体、生物药等的大规模制备中，需要对大量的细胞、细菌、真菌、支原体、立克次氏体和病毒等微生物体，尤其是带有大量特定的重组基于、蛋白、酶类、抗体、抗原表位，展示肽等生物分子的基因工程菌、生物工程细胞、转化细菌、转染和感染的真菌和动植物细胞以及重组质粒或病毒等进行高通量筛选与分析。这些工程微生物体除带有与自身生物学特性相关的生物分子外还带有插入基因、感染或转染病毒等所赋予的特殊生物分子，是生物、医学检测和分析及基础研究的重要生物材料。而现有的技术方法只能通过免疫细胞化学等方法逐一培养、固定以及筛选与检测分析，操作异常复杂、繁琐。如在组合化学等分子文库的研究中，Kits Lam等提出的一珠一物法，虽然可以很便捷地进行高通量筛选，但因必须对筛选出的阳性微珠所吸附的多肽或寡核苷酸逐一进行测序分析，费时费力；此后他们又提出了在一个微珠上同时进行寡核苷酸与多肽合成的方法，用寡核苷酸序列对氨基酸序列进行编码，或用氨基酸序列对寡核苷酸序列进行编码。该方法不仅没有减少对后续测序分析等的操作，而且还增加了前期的合成制造的成本与复杂性，不便进行产业化。本发明的目的就是要通过几种简单有效的位序编码方法和DNA固相合成与扩增技术为多种不同物质成分、特别是核酸、蛋白分子以及药物及其前体等的合成、分离与纯化、检测和筛选等提供一种制造成本低，便于产业化，而技术和工艺更为简便灵敏、快速准确；同时又可将三者有机结合，贯通一起的新的高通量筛选与检测分析技术。

本发明的主要技术特征是，对固相自动合成、DNA固相扩增、以及固相分离纯化和微载体悬浮培养等所获得的保留在固相微粒表面的活性分子的结构、特性等运用不同的位序编码技术进行编码，配合高通量流式检测分析技术用于样品中的核酸、蛋白、多糖、脂类，多肽和寡核苷酸及其衍生物以及天然与仿生药物、药物前体与先导化合物等化学分子的大规模、高通量检测、分析与筛选。

本项发明同时还提供了基于本项技术发明制备试剂盒的方法，其主要技术特征在于：试剂盒由装有一定数量的、表面分别带有某种特定序列或结构的生物或化学分子的可编码固相微粒与各种相关的配套试剂共同或分别组成，以实现对同一样品或不同样品中同一成分或多种不同成分同时进行比对分析；同时利用试剂盒中所提供的试剂还可对各阳性微粒所捕获的样品成分，做分子克隆、分子结构、亲和力、分子量、等电点、序列测定等进一步分析。该试剂盒不仅大大简化了样品检测分析的操作步骤，缩短了操作时间，降低了工作强度，更增加了检测结果的精确性、灵敏度、重现性和可比性，而且还可同时对检测样品中不同的物质成分做各种进一步的分析，使用更方便，操作快捷，可广泛地应用于环境检测、疾病诊断、新药开发与筛选、疫苗研究、生物分子相互作用、基因组学、蛋白质组学和功能组学等技术、研究领域。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案其基本特征在于：DNA固相扩增与流式检测分析技术及试剂盒的制备方法，至少包括下述成分或步骤：

①一定数量的可编码固相微粒，由可编码装置、基质、连接分子层以及位于表面的活性分子组成；可编码装置分内置式和外置式；内置式可编码装置由基质包裹，位于可编码固相微粒的核心；基质表面为连接分子层，可将相同或不同的表面活性分子连接在固相颗粒的表面；表面活性分子可与样品中的生物、化学分子特异结合或杂交：在一个微粒表面通常只连接一种表面活性分子；

②封闭：为减少后续操作中可能存在的非特异性结合，用封闭液(如含添加剂的PBS、或HEPES等缓冲液)处理固相微粒，以封闭和去除其表面可能存在的非特异性结合位点；

③编码：根据可编码固相颗粒的数量、实验操作流程和位序等，按一定的方式将固相颗粒表面活性分子的结构、特性等生物、化学信息进行编码并存入可编码装置中；

④样品：固/液体标本、样品溶液、生物体液、微生物或细胞中的蛋白、核酸、各种组合化学库、分子库及展示系统中的蛋白多肽、寡核苷酸、先导化合物与合成药物分子库等的生物、化学分子，经过处理，如溶解、稀释、浓缩、裂解或匀浆、分离与纯化、去除颗粒和不溶成分、提取有效成分(如DNA，RNA，mRNA，蛋白和多肽、脂和脂类、糖和多糖等)，反转录以及延长或扩增与标记等；或不经处理直接与各固相微粒表面的各种相同或不同生物、化学分子相互作用，样品中的被检分子或靶分子与各固相分子特异性杂交或结合；

⑤标记：被检样品用标记分子，如荧光素、同位素、生物素或半抗原，胶体金、酶、稀土离子及其螯合物等物质或其衍生物(如Cy5-dCTP，³²P-dCTP等)直接标记；或用标记分子的不同标记物，如荧光抗体等标记被检样品；

⑥漂洗：借助重力、压力、离心、过滤、磁力、流体等，用不同特性的洗液，经过一步或多步操作，将未结合的分子(在液相、游离相或流动相中)与结合分子(固相)分离，去除固相微粒表面非特异性结合的或残留的样品、标记样品或标记物等；或用洗脱液经连续或不连续的梯度和非梯度洗脱，将特异性结合在固相微粒表面的样品成分解吸附；

⑦检测与分析：对固相基质表面保留的标记分子或标记物的有无、强弱以及含量用流式细胞仪、扫描仪等进行检测和分析；

⑧解码：识别可编码装置中存储的编码信号，将编码信号转换为反映固相微粒表面所结合的生物、化学分子结构等信息的可读数据；

本发明的特征还在于：可编码固相微粒是由可编码装置及包裹在其外表面的固相基质组成；固相基质为任何可加工成型、透光的、不透光的或反光的硬质或软质、单体或复合材料，如玻璃、塑料、葡聚糖、聚蔗糖、琼脂糖、高分子合成材料、纤维素、乳胶、硅胶、层析基质、陶瓷、磁性材料、金属或非金属或复合材料，经加工而成的，大小均一、具有不同外观形状的空心体、多孔或实心体；微粒经表面处理可获得具有不同活性基团的连接分子层，并通过活性基团进一步与不同的核酸或寡核苷酸、蛋白质、多肽等生物分子或化学分子连接，获得具有不同结合特性的表面活性分子。

本发明的特征还在于：可编码装置是可存储或记忆固相微粒所携带的表面活性分子的结构与特性等信息的，内置式微型元器件与结构或外置的微型结构或设备；可编码装置对固相微粒所携带的表面活性分子的结构与特性等信息的存储或记忆可用下述方法之一或组合予以实现：

①可编码装置由内置的微型能量转换器、存储器、信号发生器、信号放大器、发射装置等结构组成，通过光电、声电、电磁波、磁性介质等信息载体，存储、记忆和传递分子结构信息；实验前或实验中能量转换器接收编码器(外置)的控制信号，自启动，将分子结构等编码信息通过能量转换器存入存储器；分析检测时能量转换器接收解码器的控制信号，自启动，发射存储信息给解码器，实现对固相微粒表面活性分子的结构、特性等信息的编码、存储和识别；通过编码、存储编码信息、接收外来编码信号和控制信号，自启动，发射存储信息给解码器，实现对固相微粒表面活性分子结构信息的编码、存储和识别；

②可编码装置由内置的微型存储介质、条形码或数码、光斑、凹斑等组成，通过存储介质上的条形码、数码、光斑或凹斑等信息载体存储、记忆和传递分子信息；存储介质为任何可加工成型的，透光或不透光、反光或不反光、硬质或软质、金属或非金属、硅及其氧化物、导体或半导体、塑料、陶瓷、玻璃等，能记录条形码等的单体或复合基质材料；实验前或实验中通过光刻或蚀刻将分子结构与特性等信息以条形码等形式刻录在存储介质上；分析检测时由读码器读取并识别条形码或数码等，解读分子结构信息，以实现对分子结构与特性等信息的编码、存储和识别；

③位序编码装置由自动进样器和样品盘等结构组成，通过样品在样品盘中的位置和进样顺序实现对分子结构等信息的编码、存储与传递；

④可编码装置为具有微流路的微孔板，利用微孔在微孔板上的位置和排列顺序，对镶嵌在微孔中固相微粒的表面活性分子的结构与特性等信息进行编码、存储和识别；

本发明的特征还在于：连接分子层可分别由具有亲水、疏水、长臂、短臂，直链或支链等分子特性的连接分子所形成的单分子层结构组成；连接分子一端连接在固相基质分子上，其游离端具有活性基团可连接各种化学或生物分子；

本发明的特征还在于：表面活性分子是指通过连接分子层上的活性基团连接的不同的蛋白质、多肽、糖、多糖、脂和脂类、核酸或寡核苷酸及其衍生物、药物分子及其前体或先导化合物等大分子或小分子化合物，在固相微粒表面形成的具有一定结合特性的活性分子；在一个微粒表面通常只有一种表面活性分子，其种类和制备方法至少包括：

①通过多肽合成仪、DNA合成仪或其它固相合成技术，直接在固相微粒的基质表面合成各种多肽、糖、寡糖、酯、类脂、寡核苷酸分子及其衍生物、药物分子及其前体或先导化合物等活性分子，并保留在固相微粒表面；

②通过连接分子上的活性基团，连接各种不同的多肽、蛋白质、糖、寡糖、多糖、脂、类脂、核酸或寡核苷酸及其衍生物、药物分子及其前体或先导化合物等活性分子；

③以微粒表面的特异性寡核苷酸分子为固相化引物，与游离的寡核苷酸引物配对，以已知序列的核酸分子为模板，通过聚合酶链反应(PCR)延长寡核苷酸链并扩增获得表面活性分子；PCR循环反应包括a)加热变性使双链或环化的单链核酸分子解链；b)退火，引物与模板核酸分子杂交；c)在DNA聚合酶的作用下，引物沿5’→3’方向延长靶核苷酸链。

④以微粒表面的特异性寡核苷酸分子为固相化引物，与游离的寡核苷酸引物配对，以已知序列的核酸分子为模板，在微粒表面通过链接酶链反应(LCR)延长寡核苷酸链并扩增获得表面活性分子；LCR循环反应包括a)加热变性；b)退火，引物与模板核酸杂交；c)在DNA链接酶的催化下引物核酸分子连接；

⑤以微粒表面的特异性寡核苷酸分子为固相化引物，与游离的寡核苷酸分子引物配对，以已知序列的核酸分子为模板，在微粒表面通过铆接聚合酶链反应(RCR)延长寡核苷酸链并扩增获得表面活性分子；RCR循环反应包括a)加热变性；b)退火，引物与模板核酸杂交；c)DNA聚合酶延长靶核苷酸链序列；d)DNA链接酶连接。

⑥以亲合、吸附层析材料为固相基质，通过配基配体、抗原抗体等结合反应将生物分子吸附在固相微粒表面，为避免解吸附可用交联剂进一步交联；

⑦将微粒与细菌、细胞等微生物体共育或共培养，使微生物体附着在微粒表面；

本发明的特征还在于：样品核酸分子可用PCR反应，进行至少一个循环的延长或扩增以提高灵敏度；延长或扩增反应可通过下述方式进行：①反应在液相中进行，引物全部溶于液相中；②反应在固-液相界面上进行，其中有一条引物固相化在微粒的固相基质表面，用至少一个循环的PCR反应进行扩增或延长；③反应在固-液相界面上进行，其中有一条引物固相化在微粒的固相基质表面，用至少一个循环的LCR反应进行延长和扩增；④反应在固-液相界面上进行，其中有一条引物固相化在微粒的固相基质表面，用至少一个循环的RCR反应进行延长和扩增；

本发明的特征还在于：以荧光染料(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red等荧光素)、同位素(¹²⁵I，³²P，³⁵S，³H等)、生物素和半抗原，胶体金、酶(HRP，AP，半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，尿素梅和荧光素酶等)、稀土离子(如Eu，Sm，Tb和Dy等)及其螯合物(如Eu³⁺-DTPA)等标记分子或其衍生物(如Cy5-dCTP，³²P-dCTP等)通过掺入法、化学修饰、末端标记、缺口平移等标记方法直接标记被检样品；或用标记分子的不同标记产物，如荧光抗体、酶标抗体、生物素化抗体、生物素化酶、Eu³⁺-DTPA-抗体等能与样品中的被检物特异性结合的标记物标记被检样品(间接标记)。

本发明的特征还在于：固相化引物是指①DNA固相合成仪合成的，仍保留在固相基质上的合成产物；②由5’端与固相基质连接的寡核苷酸分子；③通过3’端第1-5位任意一个碱基上的侧链基团与固相基质连接，保留游离的3’末端碱基的寡核苷酸分子；④以表面带有游离的3’末端碱基的微粒为固相基质，该种固相基质由3’端第1-5位任意一个碱基上的侧链基团与固相基质连接，经固相合成延长获得的寡核苷酸分子产物；

本发明的特征还在于：试剂盒中至少有一管装有一定数量的可编码固相基质微粒，微粒表面可分别连接某种特定序列或结构的多肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸分子，糖、寡糖、多糖，酯或类脂等以及药物前体、前体化合物等表面活性分子，并与下述成分分别或共同组成不同的试剂盒：

①至少有一管为样品处理液；用于组织/细胞或微生物样品的裂解和DNA，RNA，mRNA或蛋白质、多糖等的提取；处理液可分别含有适量的去垢剂(如Triton X-100，NP40，Chaps等)、核酸酶抑制剂(如DNA酶和RNA酶抑制剂)、蛋白酶抑制剂，如PMSF，EDTA，TPCK，TLCK，aprotinin，leupeptin，antipain等，以保证颗粒样品充分裂解和溶解，同时保证DNA、RNA或蛋白分子等不被降解；

②至少有一管分别为dNTP(三磷酸脱氧核苷)，引物和热稳定DNA聚合酶、耐热或不耐热的DNA链接酶(Ligase)等用于样品的扩增或捕获的样品核酸成分的基因克隆；

③至少有一管分别为dNTP和反转录酶，用于互补DNA的合成；

④至少有一管为含标记分子及其衍生物(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red，地高辛和生物素、Cy5-dCTP，³²P-dCTP等)或标记物(如荧光抗体、酶标抗体等)用于对样品进行直接或间接标记的标记试剂；

⑤在标记分子或标记物为酶类时，至少有一种显色底物或发光底物，如OPD或DAB与过氧化氢/脲、鲁米诺，甲基伞形酮磷酸酯，ATP等；

⑥至少有一管洗涤液或其浓缩液，如含有适量BSA或小牛血清、鲑精DNA，脱脂奶粉、去垢剂等的缓冲液，用于漂洗或流洗，以去除反应中的各种非特异性结合物；

⑦至少有一管为蛋白质浓度检测分析试剂，如Folin-酚试剂，Bradford试剂等；

⑧至少有一管分别为核酸内切酶(如EcoRI等)、蛋白水解酶(如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，羧肽酶等)、磷酸酶(如细菌碱性磷酸酶，马铃薯磷酸酶等)和蛋白质糖基化试剂(如PNGaseF)，用于核酸或蛋白的消解，以便对被捕获分子进行质谱、核苷酸或氨基酸序列、蛋白质的糖基化或磷酸化等进行分析；

⑨至少有一管为染色液，如革兰氏染液、H-E染液、姬姆萨染液等，用于细菌或细胞等微生物体的染色或复染；

⑩至少有一管为电泳样品缓冲液，如含适量SDS或尿素等不同蛋白质变性剂的SDS-PAGE电泳样品缓冲液或含有尿素或Chaps等的IEF电泳样品缓冲液及核酸电泳样品缓冲液等用于电泳分析。

本发明的特征还在于：可以用试剂盒中的试剂通过下述不同的方法对可编码固相微粒表面所结合的样品成分分别做基因克隆、质谱分析、序列测定、蛋白质磷酸化、糖基化或电泳等进一步分析前的处理：

(1)在微孔板上感兴趣的阳性微孔中直接加入PCR、LCR、RCR试剂或核酸内切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液、蛋白质糖基化等分析试剂，对结合物在原位做进一步分析前的样品处理；

(2)将分选的阳性微粒在微量反应器中加入PCR、LCR、RCR试剂或核酸内切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液或蛋白质糖基化分析等试剂做进一步分析前的样品处理；

(3)将新鲜样品分别与感兴趣阳性微孔或微粒的复本微粒共育，以同样的条件重复微孔板的操作步骤，将样品中感兴趣的物质成分吸附在微粒上，充分漂洗去除非特异结合的样品混合物，分装并加入PCR、LCR、RCR试剂、核酸内切酶或蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液或蛋白质糖基化分析等试剂，对结合物做进一步分析前的样品处理。

本发明具有以下优点：1效率高、信息量大。固相微粒的大小可从毫米到纳米，目前各种商售的固相基质颗粒和细胞培养专用微载体一般均可在几十纳米到毫米之间，如以20微米颗粒计算，则每毫升中约有1亿枚左右。FACS的检测分析速度有数万枚/秒，因此只需数分钟就可完成近千万种不同生物或化学分子的检测分析与分选。2.易于制备、成本低。本发明所述的固相微粒易于加工更有各种商售产品可选用，如固相合成用多孔玻璃珠、聚苯乙烯珠、各种层析基质、硅胶和细胞培养微载体等；本发明将固相合成、固相分离纯化等技术与流式分析技术融为一体，省略了繁杂的生物分离纯化过程，大大简化了制造工艺；而简单灵活的编码方式，解决了高通量筛选后对固相微粒表面活性分子的序列等结构进行大量分析的问题，易于实现；3.自由组合，灵活易变。本发明提供的各种可编码装置其编码信息量大，而且还可以依照使用目的的不同，多种编码方式联合使用，可满足大库容的组合化学、抗体库、随机多肽库等分子文库的构建与筛选中对编码与解码过程要求灵活、简便、易行的需求；4.吸附容量大，灵敏度高。球形或多面体的固相微粒，与现有生物芯片技术相比，有更大的比表面积和比结合容量。为提高反应灵敏度，还可采用大孔微粒(如纳米级孔径)，使比表面积远远超过现有技术和方法，故更加灵敏；5.操作简便，节省样品与试剂。实施中所有固相微粒表面活性分子与样品的结合、漂洗、分离以及标记等反应均可在同一个容器中同时进行，改变了传统和现有技术分别反应、清洗或在较大的容器中反应和浸洗的操作方式，因此，不仅可大量节约试剂，并且易于实现全自动化操作；6.定量分析更准确。将成千上万种化学物质和生物分子的检测分析集中在同一个容器中同时进行，不仅可避免操作误差，同时又便于不同样品间和同一样品不同成份间的平行比对。此外，固相微粒表面活性分子的包被、连接或微生物体的附着等可同时在同一容器中一次性大量制备，因而可保证各微粒之间的检测结果的平行一致。采用微孔板编码方式时，通过增加复孔数配合微流路可实现对结合成分的精确定量分析，解决了定量分析的准确性、重复性和不同实验室及不同批次检测分析结果的可比对性问题；7.保留了传统和现有检测方法重复性好，准确性高、可靠性强等优特点。8.结果易于分析。由于微粒的编码和解码由不同的仪器设备分别进行，即编码可以在实验前、实验中或实验后进行；而在解码识别时可与检测同时并行，使得检测结果的分析可以完全自动化，并且简便易行。9.用途更广泛。本发明不仅可用于基因组学、蛋白质组学、功能组学等现代生命科学的研究；而且还可直接用于新药的研究开发和疾病的诊断；对感兴趣的阳性微粒还可直接进行基因克隆、核苷酸序列分析、结合物的分子量、等电点、结构、功能、亲和力、组织/细胞及亚微或超微结构定位等进一步分析，对结合物的不同解吸附条件的研究还可直接用于后续的靶分子的分离纯化。

下面结合附图作进一步的说明

图1.可编码固相微粒的结构示意图。

图中显示内置式可编码装置1、基质2，连接分子层3和表面活性分子4；图2.几种固相微粒的外观形状和结构示意图

图中显示内置式可编码装置1、基质2，连接分子层3；图中2A，2B，2C，2D，2E分别显示部分具有不同外观形状与结构的固相微粒。图3.固相微粒与连接分子及表面活性分子的结构关系示意图

图中显示基质2，连接分子层3和表面活性分子4；图中3A显示带有氰酸酯活性基团的连接分子层3；图中3B显示带有巯基活性基团的连接分子层3’；图中3C显示带有氨基活性基团的连接分子层3”；图中3D，3E，3F分别显示在固相颗粒表面经连接分子层3所带有的活性基团连接的表面活性分子，半抗原4*，蛋白分子4’和附着细胞4”。图4.内置式微型可编码装置组成结构示意图

图中显示内置式微型可编码装置1的能量转换器5、存储器6、信号发生器7、信号放大器8、发射装置9等组成结构和固相基质2、连接分子层3等结构；能量转换器5可将声、光、电、磁、电磁波等转换成电能(如能量转换器上的光敏电池接受编码器发出的激光，将光能转换为电能)为微型可编码装置提供电源；能量转换器5得到供电后自启动，接收并识别编码器的控制信号，将分子结构与特性等编码信息存入存储器6；在分析检测时能量转换器5上的光敏电池接受流式细胞仪或扫描仪发出的激光，将光能转换为电能自启动，同时接收并识别解码器的控制信号，将存储器6存储的分子结构与特性等信息给信号发生器7，由信号放大器8放大后，通过发射装置9将存储信息发送给解码器，实现对固相微粒表面活性分子结构与特性等信息的编码、存储和识别；存储器存储的信息可以是分子结构、合成方法、工艺操作流程、序列编号、材料来源、样品编号等。图5.内置式条形码微型可编码装置结构示意图

图中显示内置式微型条形码编码装置1’的存储介质10、条形码11、固相基质2、连接分子层3等结构；条形码10采用光刻或蚀刻技术在存储介质11上雕刻而成；分析检测时同时用读码器读取条形码信息，从而实现对分子结构信息的编码、存储与识别；图6.内置式条形码微型可编码装置与外置式位序编码装置组合使用原理示意图

图中显示带有内置式微型条形码编码装置的固相微粒12随机镶嵌入微孔板13的微孔14中，微孔间由微槽16将进液孔15和出液孔17连接形成微流路，并通过蠕动管18构成闭合环路；扫描仪检测各孔标记分子的信号并自动编码；加入不同的洗脱液，每次洗脱完成后，通过扫描仪检测各孔标记分子信号的变化并记录；检测结束后读码器读取固相微粒12的条形码信息，并将条形码转换为固相微粒在微孔板中的位序码，并自动给出可读的分子结构与特性、洗脱与解吸附以及亲和力等存储信息和分析结果。图7.DNA固相PCR扩增反应原理示意图

图中固相微粒2通过连接分子层3上的活性基团与寡核苷酸分子19的5’端连接；寡核苷酸19与模板20退火，在DNA聚合酶的催化下延长，获得与模板20碱基序列互补的核酸分子21(扩增产物22与寡核苷酸分子19的嵌合分子)；变性后再以21等为模板与游离的寡核苷酸引物23退火，在DNA聚合酶的催化下延长，获得与模板21碱基序列互补的核酸分子24(扩增产物与寡核苷酸分子23的嵌合分子)；通过几个循环的PCR扩增反应，最终在固相微粒表面获得足量的长链单股核酸分子21及其互补核酸分子24。如寡核苷酸分子23末端用荧光分子25标记，流式细胞仪检测标记分子25即可获得对模板20的检测分析结果。图8.DNA固相LCR扩增反应原理示意图

图中在固相微粒2表面经固相合成获得的寡核苷酸分子26和游离寡核苷酸分子27与模板20杂交；寡核苷酸分子26的游离端(为磷酸化5’末端)，在DNA链接酶的催化下与寡核苷酸分子27链接，获得与模板20碱基序列互补的长链核酸分子28(寡核苷酸分子26与27的嵌合分子)；再以28为模板，与寡核苷酸分子29和30退火，在DNA链接酶的催化下，寡核苷酸分子29与30(5’端磷酸化)链接，扩增，最终在固相微粒表面获得足量的长链核酸分子28与31。如寡核苷酸分子29末端用荧光分子25标记，流式细胞仪检测标记分子25即可获得对模板20的检测分析结果。图9.DNA固相RCR扩增反应原理示意图

图中在固相微粒2表面经固相合成获得的寡核苷酸分子26(5’末端磷酸化)和游离寡核苷酸分子27(引物)与模板20杂交；寡核苷酸引物27在DNA聚合酶的催化下，向3’端延长，获得与模板20碱基序列互补的长链核酸分子21(扩增产物与寡核苷酸引物27的嵌合分子)；在DNA链接酶的催化下，长链核酸分子21的3’末端与寡核苷酸分子26的磷酸化游离末端链接，获得与模板20碱基序列互补的长链核酸分子32(寡核苷酸分子26与核酸分子21的嵌合分子)；再以长链核酸分子32为模板与寡核苷酸引物分子33退火，通过聚合酶链反应，寡核苷酸分子33被延长获得长链核酸分子34；经过几轮循环最终在固相微粒表面获得足量的长链核酸分子32与34；如寡核苷酸引物分子33的末端用荧光分子25标记，用流式细胞仪检测标记分子25即可获得对模板20的检测分析结果。图10.DNA固相扩增流式检测分析技术工作原理示意图。

图10A，样品核酸分子35在试管中经标记分子25标记，与固相微粒2表面连接的核酸分子探针36杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记分子25获得检测分析结果。

图10B，样品核酸分子用5’端带有标记分子25的引物，在试管中进行PCR扩增，扩增后的样品37与微珠2表面连接的核酸分子36杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记分子25获得检测分析结果。

图10C，样品核酸分子35在试管中经标记分子25标记后，与固相微粒2表面连接的寡核苷酸分子38杂交，未杂交的样品核酸分子35经漂洗去除，检测标记分子25获得结果。

图10D，样品中的核酸分子用5’端带有标记分子25的引物，在试管中进行PCR扩增，扩增的样品37与微珠2表面的寡核苷酸分子38杂交，未杂交的样品核酸分子可经漂洗去除，检测标记分子25获得分析结果。

图10E，样品核酸分子35与固相微粒2表面的寡核苷酸分子38杂交；以样品核酸分子35为模板，微珠2表面的寡核苷酸分子38和5’端带有标记分子25的游离寡核苷酸39为引物，经PCR扩增后，扩增产物与微珠2表面连接的寡核苷酸分子38和游离的寡核苷酸引物39形成嵌合分子40和41，彻底漂洗后，检测标记分子25获得检测分析结果。

图10F和图10G中长链核酸分子43，是以微珠2表面的寡核苷酸分子42为引物，以已知序列的核酸分子为模板，经PCR延长、扩增获得的，被固定在固相微粒2表面的嵌合分子；样品核酸分子35经荧光分子25标记，与微珠2表面的长链核酸分子43杂交(图10F)；或样品核酸分子35的PCR扩增标记产物44与核酸分子43杂交(图10G)；经彻底漂洗后，检测标记分子25获得分析结果。图11酶标记法固相DNA流式检测分析技术工作原理示意图

图11A，样品核酸分子35经生物素分子46标记后，与固相微粒2表面的核酸分子45杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗可去除，加入过氧化物酶48标记的链亲合素47与生物素46结合，未结合的酶标记物经漂洗去除；在酶48的催化下，加入的底物49生成有色产物或发光产物50，检测有色产物或发光产物的有无及颜色的深浅或发光的强弱，获得分析结果；

图11B，长链核酸分子52和54，是以固相微粒2固相表面的寡核苷酸分子51和游离寡核苷酸分子53为引物，以样品核酸分子为模板，经PCR延长、扩增获得的、序列特异的，被固定在固相微粒2表面的序列互补的嵌合分子；经漂洗去除残留物和非特异结合寡核苷酸引物53，加入酶48标记的抗生物素抗体55与引物53的标记分子半抗原生物素46结合，未结合的酶标记物经漂洗去除；在酶48的催化下，加入的底物49生成有色产物或发光产物50，检测有色产物或发光产物的有无及颜色的深浅或发光的强弱，获得分析结果。图12核酸—蛋白质相互作用流式检测分析原理示意图

图12A，样品蛋白分子57经荧光素分子25标记后，与固相微粒2表面的核酸分子56结合，未结合的样品蛋白经漂洗去除，检测荧光素分子25的有无及强弱，获得分析结果。

图12B，样品蛋白分子57经生物素46标记后，与固相微粒2表面的核酸分子56结合，未结合的样品蛋白经漂洗去除，加入酶48标记的抗生物素抗体55与生物素46结合，未结合的酶标抗体经漂洗去除；在酶48的催化下，底物49生成有色产物或发光产物50，检测微粒或镶嵌微孔有色产物或发光产物的有无及颜色的深浅或发光的强弱，获得分析结果。图13蛋白质—蛋白质和蛋白质—药物半抗原相互作用流式检测分析原理示意图

图中为几种具有代表性的基本方法的实验原理，实施中可在此基础上衍生出许多不同的操作方法；图中2为固相微粒，3为连接分子层；图13A为直接法，用已知抗体58捕获未知的样品抗原59，检测标记分子荧光素60，根据荧光的有无和强弱判断样品抗原59的有无与含量。图13B为间接法，用已知抗原61捕获未知的样品抗体62，再用荧光素60标记的抗抗体63结合样品抗体62，检测标记分子荧光素60，根据荧光的有无和强弱判断样品抗体62的有无与含量。图13C为夹心法，用已知抗体58捕获未知的样品抗原59，再用荧光素60标记的抗体64(与抗体58结合同一抗原分子的不同或相同表位或决定簇)结合样品抗原59，检测标记分子荧光素60，根据荧光的有无和强弱判断样品抗原59的有无与含量。图13D为竞争法，未知的样品抗原59与荧光素60标记的已知抗原61，竞争结合固相的已知抗体58，检测被捕获的标记分子荧光素60，根据荧光的有无和强弱判断样品抗原59的有无与含量，荧光强提示未知的样品抗原59含量低，反之则含量高。图13E为双标记法，荧光素65标记的未知的样品抗原59与荧光素60标记的已知抗原61竞争结合固相的已知抗体58，分别检测被捕获抗原的标记分子荧光素60和65，根据荧光的有无和强弱判断样品抗原59的有无与含量，荧光素60的荧光强提示未知的样品抗原59含量低，反之则含量高；荧光素65的荧光强提示未知的样品抗原59含量高。图13F为桥联法(直接法)，亲合素68标记的药物靶蛋白67与固相化的半抗原药物分子66结合，加入标记分子荧光素25标记的生物素46，检测荧光素25，根据荧光的有无和强弱判断药物靶分子的有无与含量。实施中，用不同的洗脱液洗脱结合的药物靶分子，根据固相荧光素25的强弱变化，可以分析半抗原与药物靶分子的亲合力，为后续药物分子的分离纯化等提供依据。

本发明在实施中的基本操作步骤和方法如下：一.可编码固相微粒的制备：固相微粒的制备方法包括以下基本方法和步骤：1.编码。用编码器对固相颗粒进行编码，编码可在加工过程中进行，如用光刻或蚀刻法在编码介质上进行编码；或在加工完成后进行，如商售的微型无线电信号反射器(AVID公司和BioMedic Data System公司等)2.表面处理：固相微粒的表面处理因所选材料的不同而略有不同，每种材料其具体处理方法和条件都有多种，本发明在此将《生物分子固定化技术及应用》(蒋中华等，1998年，化学出版社)及中国专利号为01207812.3与申请号为00120798.9、02121325.9和02123775.1、的专利为主要参考文献。运用公知的各种生物大分子固相化技术，处理各种材料的固相微粒，使其表面带有特定的连接分子层，与核酸、蛋白以及药物等分子及其衍生物上的活性基团反应，而具有特定的吸附能力。如用2％丙氨基-三乙基硅烷无水丙酮溶液(APES，3-Aminopropyltriethoxysilane，Sigma公司，目录号A3648)处理的多孔玻璃微珠(Weetall，H.H.，Biochem.Biophys.Acta，1970；212：1)；商售的经表面处理的各种层析基质(如溴化氰活化的Sepharose-4B)，多肽与寡核苷酸固相合成用的聚苯乙烯珠或控孔玻璃珠(美国应用生物系统公司，Sigma公司)等。3.包被：将不同的核酸、蛋白与药物及其衍生物分子分别与固相微粒表面连接分子的活性基团连接，或在固相微粒表面进行原位固相合成以获得不同的表面活性分子层。表面活性分子的获得方法主要是①修饰连接。利用固相微粒表面连接分子上的活性基团通过化学键与表面活性分子连接使之在固相基质表面被固相化；②固相合成。运用固相化学合成技术，直接在微粒表面进行药物、多肽和寡核苷酸分子等的固相合成(Edge R.Wang等，1998，核酸探针的合成、标记及应用，科学出版社)；合成反应可以在试管中或装填于合成仪的专用柱体中进行；③生物合成。运用PCR，LCR和RCR等DNA扩增技术，以已知序列的核苷酸分子为模板，将其中一个引物连接在微珠上，或以固相合成的寡核苷酸分子为引物在固相颗粒表面进行的各种DNA扩增反应，扩增产物通过固相化的引物连接并固相化在微珠或微孔的表面；3封闭：用封闭液(如含添加剂的PBS、Tris-HC1或HEPES等缓冲液)与固相微粒共育，以封闭去除固相微粒表面可能残留的活性基团或非特异性结合位点，以减少检测中可能出现的非特异性结合。由此即获得能与化学分子、生物分子、抗体和/或抗原，酶、核酸或寡核苷酸分子，以及药物或其衍生物等特异性结合，并可用于对结合物进行检测的可编码固相微粒。常用的封闭液添加剂有：鲑精或酵母DNA聚蔗糖、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白(0.5-5％)、脱脂奶粉(0.1-6％)、酪蛋白(0.5-2％)、白明胶(0.1-0.5％)，正常动物血清(0.5-5％)和去垢剂等(如Tween 20，NP40，Triton X-100、SDS)等。二.样品的检测分析样品的检测分析一般包括以下基本步骤和方法：1.样品的制备：根据检测目的和被检物等的生物、化学性质的不同，生物样品在检测前将分别进行不同的处理。常见样品处理方法包括：①核酸提取物：用DNA或RNA抽提液处理各种生物样品、生物体液或标本以提取样品中的DNA或RNA等；②蛋白等生物成分提取物：用组织细胞裂解液配合匀浆或超声粉碎等处理组织细胞或细菌，使之裂解获得真性蛋白溶液或生物样品、生物体液或生物标本等的分离提取物；③人工合成产物：运用各种人工合成技术获得的药物前体、先导化合物以及多肽合成仪、核酸合成仪等的合成产物等；④反转录合成cDNA；⑤PCR、LCR或RT-PCR等的扩增产物。2.样品的标记：①直接标记。运用公知的生物分子标记技术，分别用生物素、酶、荧光素、胶体金、同位素或稀土离子及其螯合剂等物质或其衍生物等标记分子作为指示剂直接标记样品或生物标本；②采用间接标记。运用生物分子的相互作用，用标记分子的标记产物(如荧光抗体，生物素-HRP等标记物)标记样品；③掺入标记，运用各种合成技术，如固相合成技术、PCR扩增等将标记分子或标记物掺入被标记分子中。3.加待检样品：①将样品或处理样品与固相微粒共育，使之与各微粒表面已固相化的不同生物、化学或药物分子等杂交或结合；被检样品中互补或对应的生物分子被固相微粒捕获或特异结合，剩余的和未结合的部分经漂洗去除。②将微量的样品核酸与寡核苷酸引物、dNTP，可掺入标记物和耐热DNA聚合酶、链接酶以及固相微粒等一起进行加热变性、退火、延长扩增、连接等反应，并进行适当周期的PCR或RT-PCR等反应循环。4.漂洗：借助离心、微柱、检测板的微流路等用洗液漂洗，以去除固相微粒表面残留的被检样品(未结合物或称游离物)或标记物等。5.结果分析：根据标记分子的不同，目测或用流式细胞仪、扫描仪等仪器观察并记录各微粒表面反应的有无以及强弱(如生成产物颜色的深浅、胶体金沉积、荧光强度、放射强度等的强弱变化)。但是在标记物为蛋白酶时，操作中必须增加漂洗和添加底物等步骤才能观察检测结果，其检测结果为呈色反应或发光反应。6.解码。用解码器、读码器或显微镜等，借助计算机确定该样品中，被检测物的组成以及各组分的含量，结构、序列等。

本发明在实施中，上述操作步骤依据固相微粒表面活性分子、被检测物、标记物和结果显示方法等的不同，可有多种不同的组合方式。各步反应可在微量反应管、微孔板或微量反应柱(或微层析柱)中进行。各微粒的表面活性分子可以相同，用于筛选样品中的不同成分；也可以不同，用于对同一分子或同一样品中的不同成分进行高通量的筛选或平行检测分析。

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例：镶嵌式高通量基因芯片在核酸—蛋白质相互作用研究中的应用。

用核酸或寡核苷酸链文库进行DNA聚合酶、复制酶等核酸结合蛋白以及细胞生长因子、激素、小肽、抗体等生物活性分子筛选的潜在市场价值和广泛的应用前景，已经引起基础医学、临床诊断及药物筛选等方面的广泛关注。运用本发明所述的DNA固相扩增与流式检测分析技术，很容易构建序列长度和库容量足够大的核酸和寡核苷酸文库，而每个固相微粒表面的核酸序列可由解码或读码器非常快速地从可编码装置中提取，通过计算机检索获得。1.核酸固相微粒的制备：

按需要在固相合成专用基质微粒上，用多通道DNA合成仪合成特定序列的核苷酸链分子，建立固相微粒核苷酸链组合分子库，封闭液封闭非特异性结合位点。2.编码：

根据固相微粒表面的核苷酸序列对固相微粒进行编码。3.检测样品：

组织、细胞、细菌、病毒或噬菌体等经裂解液或匀浆处理的获得蛋白提取物，用荧光素标记，分子筛层析去除游离的荧光素小分子，取适量加入微量反应柱中，置翻转混合器与固相微粒核苷酸组合分子库孵育10-120分钟，连续流洗或离心以去除残留的或非特异性结合的杂质。4.观察结果：

流式细胞仪分析结果，比较不同来源或经不同处理的组织、细胞或细菌等的蛋白质结合谱，分析差异谱带与结构、功能、基因调控或与疾病等的关系，并分选出阳性固相微粒。5.将阳性微粒随机装填入高密度微孔板中，一孔一珠，封盖，扫描仪分析记录各微孔荧光强度；比较不同流洗条件以及竞争结合物或拮抗剂对各孔固相微粒与被检测物结合强度及结合量的影响，解码器或读码器给出各固相微粒核苷酸链的碱基序列。5.质谱分析：

对分析中感兴趣的反应孔，取适量复本固相微粒加入蛋白提取物，以完全一致的实验条件重复步骤3，彻底漂洗后加入适量胰蛋白酶(蛋白质水解酶)，室温或37℃反应2-6小时或过夜，取适量点样进行质谱分析，获得蛋白指纹图谱，通过计算机处理获得蛋白质的氨基酸序列。6.蛋白质磷酸化分析：

取适量胰蛋白酶水解液，加入适量体积的细菌碱性磷酸酶(溶于HEPES 20mmol/L，pH7.0，含NaCl 150mmol/L，0.1％Triton X-100，10％甘油)，30℃反应60分钟，取适量进行质谱分析；对照未经处理的分析结果，以测定和分析蛋白质有无磷酸化以及磷酸化的可能部位。7.蛋白质糖基化分析：

取出适量胰蛋白酶水解液，加入PNGase试剂(溶于Tris-HCl缓冲液中，20mmol/L，pH7.2，含50mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)适量，37℃反应60-120分钟，取适量进行质谱或色谱分析，对照未经处理的分析结果，以测定和分析蛋白质有无糖基化以及糖基化的程度与部位。8.蛋白质等电点和分子量测定

取适量复本固相微粒与蛋白提取物反应，充分漂洗并分装于不同的微量试管中，分别加入专用等电聚焦和SDS-PAGE电泳样品缓冲液，取出适量分别电泳，以测定等电点和分子量，并与质谱分析结果对比。9.基因克隆

以该寡核苷酸分子为特异性引物，应用PCR技术进行上下游核酸片段的扩增，以克隆全长或长链核酸分子片段。

本发明把固相合成与分离技术同信息编码与高通量的流式细胞检测分析与分选技术相结合，集数种技术的优点于一身，具有定量准确、信息量大、灵敏度高、制造成本低，方便快捷、用途广等突出优点，是一种新的可广泛用于生物学、医学、药物学，环境科学等领域的高通量筛选与检测分析技术。

Claims (10)

1.一种可同时检测、分析和筛选样品中的核酸、蛋白与化学分子及药物分子的DNA固相扩增与流式检测分析技术及试剂盒的制备方法，该技术和试剂盒至少包括下述成分或步骤：

①一定数量的可编码固相微粒，由可编码装置、基质、连接分子层以及表面活性分子组成；可编码装置分内置式和外置式；内置式可编码装置由基质包裹，位于可编码固相微粒的核心；基质表面为连接分子层，可将相同或不同的表面活性分子连接在固相颗粒的表面；表面活性分子可与样品中的生物、化学或药物等分子特异结合或杂交；在一个微粒表面通常只连接一种表面活性分子；

②封闭：为去除非特异性结合位点，用封闭液处理固相微粒表面；

③编码：将表面活性分子的结构、特性等生物、化学信息进行编码并存入可编码装置中；

④样品：经过处理或不经处理直接与各固相微粒表面连接的各种相同或不同的生物、化学分子相互作用，并与之特异性杂交或结合的被检物；

⑤标记：被检样品用指示性标记分子及其衍生物或标记物等进行标记；

⑥漂洗：用洗液或洗脱液洗脱与固相微粒表面活性分子结合或非特异结合的各种分子；

⑦检测与分析：对固相基质表面保留的标记分子或标记物的有无、强弱以及含量进行检测和分析；

⑧解码：识别可编码装置中存储的编码信号，将编码信号转换为固相微粒表面所结合的生物、化学分子的结构、特性等信息的可读数据；

2.根据权利要求1所述的可编码固相微粒，由包裹在外表面的固相基质和位于核心的内置式微型可编码装置组成；固相基质为任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的硬质或软质、金属或非金属、导体或半导体、绝缘体、单体或复合材料，经加工而成的，大小均一、具有不同外观形状的空心体、多孔或实心体；微粒经表面处理可获得具有不同活性基团的连接分子层，借助其活性基团可进一步与不同的核酸或寡核苷酸、蛋白与多肽等生物或化学分子连接，获得具有不同结合特性的表面活性分子。

3.根据权利要求1和权利要求2所述的可编码装置，是可存储或记忆固相微粒所携带的表面活性分子的结构与特性等信息的，内置式微型元器件与结构或外置的微型结构或设备；可编码装置对固相微粒所携带的表面活性分子的结构与特性等信息的存储或记忆可用下述方法之一或组合予以实现：

①可编码装置由内置的微型能量转换器、存储器、信号发生器、信号放大器、发射装置等结构组成，通过光电、声电、电磁波、磁性介质等信息载体，存储、记忆和传递分子结构信息；通过编码、存储编码信息、接收外来编码信号和控制信号，自启动，发射存储信息给解码器，实现对固相微粒表面活性分子结构信息的编码、存储和识别；

②可编码装置由内置的微型存储介质、条形码、数码、光斑或凹斑等组成，通过条形码、数码、光斑或凹斑等信息载体存储、记忆和传递分子信息；存储介质可为任何经光刻或蚀刻能记录条形码、数码、光斑或凹斑的、任何可加工成型的、透光的、不透光的、反光的、硬质或软质、金属或非金属、导体或半导体、塑料、陶瓷、玻璃等单体或复合材料做基质制备的；检测分析时读码器读取并识别条形码、数码、光斑或凹斑，以实现对分子结构与特性等信息的编码、存储和识别；

③位序编码装置由自动进样器和样品盘等结构组成，通过样品在样品盘中的位置和进样顺序实现对分子结构等信息的编码、存储与传递；

④可编码装置为具有微流路的微孔板，利用微孔在微孔板上的位置和排列顺序，对镶嵌在微孔中固相微粒的表面活性分子的结构与特性等信息进行编码、存储和识别；

4.根据权利要求1和权利要求2所述的连接分子层，可分别由具有亲水、疏水、长臂、短臂，直链或支链等分子特性的连接分子所形成的单分子层组成；连接分子一端连接在固相基质上，其游离端具有活性基团可连接各种化学或生物分子；

5.根据权利要求1、权利要求2和权利要求3所述的表面活性分子，是指通过固相微粒连接分子层上的活性基团，分别连接的具有不同序列和长度的多肽、蛋白质、核酸或寡核苷酸及其衍生物、药物分子及其前体或先导化合物等大分子或小分子化合物，在微粒表面形成的具有一定结合特性的活性分子；一个微粒表面通常只有一种表面活性分子；各种固相微粒表面活性分子的制备与包被方法至少包括：

①通过多肽合成仪、DNA合成仪或其它固相合成技术，直接在微粒的固相基质表面合成，并保留在固相微粒表面：

②通过连接分子上的活性基团连接或吸附；

③以微粒表面的特异性寡核苷酸分子为固相化引物，与游离的寡核苷酸分子引物配对，以已知序列的核酸分子为模板，在微粒表面通过至少一个循环的聚合酶链反应(PCR)延长寡核苷酸链并进一步扩增，获得由长链核酸分子组成的表面活性分子；PCR循环反应包括a)加热变性；b)退火；c)DNA聚合酶延长核苷酸链序列。

④以微粒表面的特异性寡核苷酸分子为固相化引物，与游离的寡核苷酸分子引物配对，以已知序列的核酸分子为模板，在微粒表面通过链接酶链反应(LCR)延长寡核苷酸链并扩增，获得由长链核酸组成的表面活性分子；LCR循环反应包括a)加热变性；b)退火；c)DNA链接酶连接；

⑤以微粒表面的特异性寡核苷酸分子为固相化铆接引物，与游离的寡核苷酸分子引物配对，以已知序列的特异性核酸分子为模板，在微粒表面通过铆接聚合酶链反应(RCR)延长寡核苷酸链并进一步扩增，获得由长链核酸组成的表面活性分子；RCR循环反应包括a)加热变性；b)退火；c)DNA聚合酶延长靶核苷酸链序列；d)DNA链接酶连接。

⑥以亲合层析、吸附层析材料为固相基质，通过配基配体、抗原抗体、疏水结合以及交换反应将生物分子吸附在固相微粒表面；

⑦将微粒与细菌、细胞等微生物体共育或共培养，使微生物体附着在微粒表面；

6.根据权利要求1和权利要求5所述的样品，其核酸分子可用PCR反应，进行至少一个循环的扩增或延长；样品核酸分子的延长或扩增可通过下述方式进行：①反应在液相中进行，引物全部溶于液相中；②在固-液相界面上进行，其中有一个为固相化引物，用至少一个循环的PCR反应进行扩增或延长；③在固-液相界面上进行，其中有一个为固相化引物，用至少一个循环的LCR反应进行延长和扩增；④在固-液相界面上进行，其中有一个为固相化铆接物，用至少一个循环的RCR反应进行延长和扩增；

7.根据权利要求1所述的标记，是指用荧光染料、酶类、生物素、半抗原、胶体金、同位素、稀土离子及其螯合剂等标记分子或其衍生物直接标记样品；或用能与样品中被检物特异性结合的标记物标记样品；

8.根据权利要求5和权利要求6所述的固相化引物，是指①DNA固相合成仪合成的，仍连接在固相基质上的合成产物；②5’端与固相基质连接的寡核苷酸分子；③通过3’端第1-5位任意一个碱基上的侧链基团与固相基质连接，保留游离的3’末端碱基的寡核苷酸；④以带有游离的3’末端碱基的微粒为固相基质，该固相基质由3’端第1-5位任意一个碱基上的侧链基团与固相基质连接，再经固相合成获得寡核苷酸产物；

9.根据权利要求1所述的试剂盒，至少有一管装有一定数量的可编码固相微粒，微粒表面分别有某种特定序列或结构的多肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸分子，寡糖、多糖，酯或类脂等以及药物前体、前体化合物等表面活性分子，并与下述成分分别或共同组成不同的试剂盒：

①至少有一管为样品处理液；

②至少有一管分别为dNTP、引物和用于PCR扩增的热稳定的DNA聚合酶和/或耐热DNA链接酶；

③至少有一管分别为dNTP和反转录酶；

④至少有一管为含标记分子或标记物的标记试剂；

⑤在标记物为酶类时，至少有一种显色底物或发光底物；

⑥至少有一管为洗涤液或其浓缩液；

⑦至少有一管为蛋白质浓度检测分析试剂；

⑧至少有一管为核酸内切酶、蛋白水解酶、蛋白质糖基化或蛋白质磷酸化分析试剂；；

⑨至少有一管为组织细胞染色液；

⑩至少有一管为电泳样品缓冲液；

10.根据权利要求1和权利要求9所述的检测方法和试剂盒，可以用试剂盒中的试剂通过下述不同的方法对可编码固相微粒表面所结合的样品成分分别做基因克隆、质谱分析、序列测定、蛋白质磷酸化、糖基化或电泳等进一步分析前的处理：

(1)用微孔板编码时，可直接在感兴趣的阳性微孔中加入PCR、LCR、RCR试剂或核酸内切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液、蛋白质糖基化等分析试剂，对结合物在原位做进一步分析前的样品处理；

(2)分选阳性固相微粒，在微量反应器中加入PCR、LCR、RCR试剂或核酸内切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液或蛋白质糖基化分析等试剂做进一步分析前的样品处理；

(3)将样品分别与感兴趣阳性微孔或微粒的复本微粒共育，以同样的条件重复微孔板的操作步骤，将样品中感兴趣的物质成分吸附在微粒上，充分漂洗去除未结合的样品混合物，加入PCR、LCR、RCR试剂、核酸内切酶或蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液或蛋白质糖基化分析等试剂，对结合物做进一步分析前的样品处理。

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