CN103555568A - 一种用于核酸单分子检测的样本小皿及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于核酸单分子检测的样本小皿及其制备方法。该样本小皿包括底板和玻璃盖板，底板与盖板之间连接并形成一个以上的腔室，每个腔室靠近底板的一面开有与外界连通的进口与出口，内腔的玻璃盖板表面上非特异性吸附有生物素化的牛血清蛋白，生物素化的牛血清蛋白上特异性结合有亲和素，亲和素上特异性结合在生物素化的寡核苷酸的一端，生物素化的寡核苷酸的另一端上标记有Cy5荧光分子。使用这种样本小皿，结合荧光倒置显微镜，可以实现对核酸单分子的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种样本小皿，特别是涉及一种用于核酸单分子检测的样本小皿。
背景技术
基因芯片Microarray技术将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列。但是传统的基因芯片技术无法定量检测，也无法观察单个核酸分子的构象变化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的缺点，提供一种用于核酸单分子检测的样本小皿及其制备方法。该样本小皿包括底板和玻璃盖板，底板与盖板之间连接并形成一个以上的腔室，每个腔室靠近底板的一面开有与外界连通的进口与出口。该样本小皿的制备方法为：取实验室常用的载玻片作为底板，在载玻片上钻两个小孔作为进口和出口，并清洗干净，取两段双面胶粘贴于载玻片上，双面胶间留有狭缝，进口和出口位于狭缝之间，再将实验室常用的干净的盖玻片作为盖板贴于双面胶另一面，形成一个通道，用环氧基树脂将通道的两端封口，从而形成样本小皿。
本发明进一步限定的技术方案是：
前述的用于核酸单分子检测的样本小皿，其腔室的形状为长方形，进口与出口设置在长方形相互远离的两端。
前述的用于核酸单分子检测的样本小皿，其长方形腔室的宽为4至6毫米，长方形腔室的高为0.1至0.2毫米，长方形腔室的长为10至30毫米。
前述的用于核酸单分子检测的样本小皿，内腔的玻璃盖板表面上非特异性吸附有生物素化的牛血清蛋白，生物素化的牛血清蛋白上特异性结合有亲和素，亲和素上特异性结合在生物素化的寡核苷酸的一端，生物素化的寡核苷酸的另一端上标记有Cy5荧光分子。
进一步的，前述的样本小皿的制备方法，包括以下制备步骤：
步骤1：将溶解于缓冲液T50的生物素化的牛血清蛋白注入小皿的内腔中，静置4至6分钟；
步骤2：往内腔中注入缓冲液T50，将没有非特异性吸附于内腔中的生物素化的牛血清蛋白洗脱；
步骤3：将溶于缓冲液T50的亲和素注入内腔中，静置1分钟；
步骤4：往内腔中注入缓冲液T50，将没有特异性结合于生物素化的牛血清蛋白上的亲和素洗脱；
步骤5：注入一端标记有Cy5荧光分子的生物素化的的寡核苷酸到内腔中，使其与亲和素特异性结合。
本发明的有益效果是：(1)本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿具备多个腔室，一个样本小皿支持多组实验；(2)本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿容易制备，利用实验室环境资源即可制得；(3)本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿可以结合荧光倒置显微镜，实现对核酸分子的定量检测。
附图说明
图1为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿的宏观结构爆炸图
图2为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿的宏观结装配炸图
图3为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿内腔玻璃表面微观结构图a
图4为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿内腔玻璃表面微观结构图b
图5为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿内腔玻璃表面微观结构图c
图6为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿内腔玻璃表面微观结构图d
载玻片1，盖玻片2，内腔3，进口4，出口5，小管6，双面胶7，生物素化的牛血清蛋白8，亲和素9，生物素化的寡核苷酸10，Cy5荧光分子11，寡核苷酸12，Cy3染料分子13，待测样本核苷酸14
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种在实验室环境下易于制作的用于核酸单分子检测的样本小皿及其制备方法。结合图1和图2，首先在载玻片1上钻两个直径在0.6至1毫米的孔，作为样本小皿的进口4和出口5，溶液最终都是通过进口4和出口5流进和流出的。进口4和出口5是相对的，取决于从哪个孔注入液体。
接着对载玻片1和盖玻片2进行清洗。一种优选的清洗方案为：先于10％的Alconox清洗剂中超声清洗20min，再于水中超声清洗5min，再于丙酮中超声清洗15min，然后于1mol/L的KOH中超声清洗20min，最后用去离子水漂洗载玻片1。清洗完毕后还可选择性的使用丙烷喷枪燃烧成像面，目的是为了去除残余的荧光有机分子。
接着对载玻片1和盖玻片2进行组装，取两段双面胶7粘贴于干净的载玻片1上，双面胶7间留有4至6毫米的狭缝，进口4和出口5位于狭缝之间，再将干净的盖玻片2贴于双面胶7另一面，形成一个通道，用环氧基树脂将通道的两端封口，从而形成样本小皿的内腔。载玻片1的出口5上还可以用环氧基树脂粘合一个小管6，小管6的作用是便于内腔3中的液体导出。
接着要在内腔中形成被生物素化的牛血清蛋白8包被的表面。结合图3至图5，一种优选的方案为：首先制备1mg/ml的溶解于缓冲液T50中的生物素化的牛血清蛋白8，并注入小皿的内腔中，放置4-6min，生物素化的牛血清蛋白8会非特异性的吸附于内腔表面；接着往内腔中流入100μl缓冲液T50，将没有非特异性吸附于内腔中的生物素化的牛血清蛋白8洗脱；接着将0.2mg/ml的溶于缓冲液T50中的亲和素9注入内腔中，静置1分钟；接着往内腔中流入100μl缓冲液T50，将没有特异性结合于生物素化的牛血清蛋白8上的亲和素9洗脱；最后将30μl被Cy5荧光分子11标记的生物素化的寡核苷酸10注入到内腔中，生物素化的寡核苷酸10会与亲和素9特异性结合。
使用时，用全内反射显微镜对样本小皿进行观察，并用532nm的激光激发成像面。此时Cy5荧光分子11并不会被激发发光。再从进口4中注入溶于缓冲液T50的被Cy3荧光分子标记的寡核苷酸和待测样本核苷酸。被Cy5荧光分子11标记的生物素化的寡核苷酸10、被Cy3荧光分子13标记的寡核苷酸12和待测样本核苷酸三者之间的关系为：Cy5荧光分子11标记的生物素化的寡核苷酸10与被Cy3荧光分子13标记的寡核苷酸12都与待测样本核苷酸14互补，如图6所示。所以当三者相结合后，Cy3荧光分子13会被532nm激光激发发光，所发射的荧光会进一步激发Cy5荧光分子11发光，从而实现对寡核苷酸的检测。
这种样本小皿实验室可以现做现用，使用以后将其放入瓶装水中一段时间即可移走双面胶7和环氧树脂，从而可以重复使用。
Claims (6)
1.一种用于核酸单分子检测的样本小皿，其特征在于：包括底板和玻璃盖板，底板与盖板之间连接并形成一个以上的腔室，每个腔室靠近底板的一面开有与外界连通的进口与出口。
2.根据权利要求1所述的用于核酸单分子检测的样本小皿，其特征在于：腔室的形状为长方形，进口与出口设置在长方形相互远离的两端。
3.根据权利要求2所述的用于核酸单分子检测的样本小皿，其特征在于：长方形的宽为4至6毫米，长方形的高为0.1至0.2毫米，长方形的长为10至30毫米。
4.根据权利要求1-3中任一所述的用于核酸单分子检测的样本小皿，其特征在于：内腔的玻璃盖板表面上非特异性吸附有生物素化的牛血清蛋白，生物素化的牛血清蛋白上特异性结合有亲和素，亲和素上特异性结合在生物素化的寡核苷酸的一端，生物素化的寡核苷酸的另一端上标记有Cy5荧光分子。
5.一种样本小皿的制备方法，其特征在于：取实验室常用的载玻片作为底板，在载玻片上钻两个小孔作为进口和出口，并清洗干净，取两段双面胶粘贴于载玻片上，双面胶间留有狭缝，进口和出口位于狭缝之间，再将实验室常用的干净的盖玻片作为盖板贴于双面胶另一面，形成一个通道，用环氧基树脂将通道的两端封口，从而形成样本小皿。
6.根据权利要求5所述的样本小皿的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：将溶解于缓冲液T50的生物素化的牛血清蛋白注入小皿的内腔中，静置4至6分钟；
步骤2：往内腔中注入缓冲液T50，将没有非特异性吸附于内腔中的生物素化的牛血清蛋白洗脱；
步骤3：将溶于缓冲液T50的亲和素注入内腔中，静置1分钟；
步骤4：往内腔中注入缓冲液T50，将没有特异性结合于生物素化的牛血清蛋白上的亲和素洗脱；
步骤5：注入一端标记有Cy5荧光分子的生物素化的的寡核苷酸到内腔中，使其与亲和素特异性结合。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140205 |