CN105441541A - 一种肺癌检测质控品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肺癌检测质控品及其制备方法，属于临床检验学、病理学和生物技术领域。一种肺癌检测质控品，为肺癌细胞系H3122、肺癌细胞系H2228和肺癌细胞系H1299分别接种实验动物后生成的肿瘤组织的标本切片。本发明的创新点在于：本发明得到的肺癌异种瘤组织质控品可以长期保存在大多数的温度条件下，在室温和4℃环境保存两周后检测效果无变化，该质控品可以用于EQA和IQC，在将切片质控品作为EQA评估试验的质控品发放的时候，它可以在室温下无需冰袋进行邮寄并能长时间保存在-20℃或者-4℃条件下。

Description

一种肺癌检测质控品及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种肺癌检测质控品及其制备方法，尤指一种用于EML4-ALK融合基因临床常用方法检测的异种瘤组织福尔马林固定石蜡包埋的质控品及其制备方法，属于临床检验学、病理学和生物技术领域。
背景技术
非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80％，虽然不断有新的治疗药物上市，其预后仍然很差。随着分子靶向治疗的不断发展，已发现针对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的分子靶向药物能够有效的治疗具有EGFR外显子突变的非吸烟肺腺癌患者。2007年，日本学者在肺腺癌患者中发现的一个亚群对EGFR-TKI治疗和传统化疗不敏感，该类亚群存在人类棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)和人类间变性淋巴瘤激酶(ALK)重排形成的融合基因，即EML4-ALK融合基因，提示其可能对ALK抑制剂敏感。
EML4-ALK融合基因位于2号染色体短臂上，其5'端为EML4片段，3'端为ALK片段，编码一个由1059个氨基酸组成的蛋白质。目前发现至少14种EML4-ALK的变异体，均为EML4的人不同外显子与ALK的20外显子相融合。例如：变种1(v1)，为EML4的13外显子与ALK的20外显子相连；变种2(v2)，为EML4的20外显子和ALK的20外显子相连；变种3的两个亚种，v3a为EML4的第6外显子和ALK的20外显子相连，v3b为EML4的第6外显子加上一个33bp的小片段再和ALK的20外显子相连，等等总共14个变种。
目前，对于EML4-ALK融合基因的检测方法主要有三种：RT-PCR、免疫组化(IHC)和荧光原位杂交方法(FISH)，这三种方法都较常用在EML4-ALK融合基因的临床检测当中。其中，RT-PCR检测的是RNA水平，IHC方法检测的是EML4-ALK融合基因表达蛋白的水平，而FISH方法检测的是靶DNA分子的水平。除了上述方法，Westernblot、RACE-coupledPCR以及iAEP等方法也可用于EML4-ALK检测。随着检测技术的不断进展，很多医院都陆续开展了对于EML4-ALK融合基因的检测，各个临床实验室检测的方法各不相同，而对于EML4-ALK融合基因的标准化却鲜少提及。目前尚没有国内外文献报道关于EML4-ALK融合基因检测质量评价的文章，对于不同实验室检测性能情况的评价以及改善提高其检测的水平都迫在眉睫。
临床上对于EML4-ALK融合基因的检测包括FISH、RT-PCR和免疫组化三种常规方法，其中手工法免疫组化仅作为初筛手段，不能用作诊断，但对于其他方法可进行佐证。然而对于任意一种方法来说，一个好的质控品是保证检测准确度的关键。传统上的质控品倾向于使用肺癌患者的组织样本作为检测质控品，但是这种质控品来源局限，一致性较差，在应用的过程中存在较大的局限性。有机构曾经通过基因编辑方法利用细胞系制备了EML4-ALK融合基因的样本质控品，这种方法能够获得不同变种的EML4-ALK融合基因，但是制备过程中缺少组织结构间隙，不能完全类似与组织的情况。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种能用于异种瘤组织EML4-ALK融合基因临床常用方法检测的质控品。
本发明要解决的另一个技术问题是提供异种瘤组织EML4-ALK融合基因临床常用方法检测质控品的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种肺癌检测质控品，为肺癌细胞系H3122、肺癌细胞系H2228和肺癌细胞系H1299分别接种实验动物后生成的肿瘤组织的标本切片。
所述实验动物为免疫缺陷动物，优选小鼠，最优选BeigeSCID小鼠和裸小鼠。
所述标本切片采用以下方法制备：
1、培养肺癌细胞系；
2、建立肿瘤动物模型；
3、制备肺癌质控品。
一种肺癌检测质控品的制备方法，包括以下步骤：
1、培养肺癌细胞系；
2、建立肿瘤动物模型；
3、制备肺癌质控品。
本发明选择EML4-ALK融合基因阳性肺癌细胞系H3122(v1)、H2228(v3)和阴性肺癌细胞系H1299，采用异种移植的方法将细胞系在动物体内致瘤后，取产生的异种瘤进行质控品的制备。这种方法能够制备大量模拟正常组织样本的质控品。
所述步骤1培养肺癌细胞系是指：肺癌细胞系H3122、肺癌细胞系H2228、肺癌细胞系H1299，分别用含10％胎牛血清RPIM-1640培养液培养,培养基中含有10％胎牛血清,100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素；在37℃含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化进行细胞传代，将三种细胞系扩大培养至107-108并处于对数生长期。
所述步骤2建立肿瘤动物模型的步骤为：
(1)准备若干只BeigeSCID小鼠和裸小鼠，BeigeSCID小鼠用于H2228致瘤，裸小鼠用于H3122和H1299致瘤；
(2)细胞消化准备：倒掉旧培养基，向培养瓶中加入1xPBS2ml，清洗2～3次；加入2ml胰酶，放入37℃、5％CO2孵箱孵2min；待大部分细胞被消化下来，立即加入4ml培养基终止胰酶的消化作用；用一次性巴氏吸管将细胞吹打混匀，待在镜下观察细胞大部分成单个后转入50ml离心管中，离心，弃去上层培养基，加入2mlPBS，吹打混匀，离心，弃去上清液，加入1mlPBS，吹打混匀细胞，形成细胞悬液，转入2ml冻存管中；
(3)动物接种：将所得1.5ml细胞悬液吹打混匀，分别使用1ml注射器吸取0.2ml细胞悬液，皮下接种到裸小鼠两侧腋下每侧0.2ml，将三只接种的裸小鼠放回SPF隔离器中；每周观察一次，待瘤长至8至10cm时处死小鼠。
所述步骤3制备肺癌质控品的步骤为：
(1)收集肿瘤组织：处死小鼠，分别取出三种肿瘤组织，切成10mm×10mm×2mm，用PBS洗净血污；
(2)固定：每种肿瘤分别加入30ml10％中性甲醛固定细胞6-48小时后，加入1XPBS冲洗3次；
(3)乙醇梯度脱水：加入80％乙醇15ml，静置30min后，取出；加入90％乙醇15ml，静置30min后，取出；加入95％乙醇15ml，静置20min*2后，取出；加入无水乙醇15ml，静置20min*2后，取出；
(4)透明：加入无水乙醇和二甲苯的混合液1:115ml,静置30min，取出；加入二甲苯15ml静置30min，取出组织；
(5)浸蜡：放入56℃蜡盒中浸蜡三遍，第一道30min，第二道60min，第三道90min以上；
(6)包埋：70℃融化石蜡，将融化的500ul液体石蜡加入到组织块到包埋盒，再次灌蜡包埋；
(7)切片：5um/张切片，切片后于恒温30℃水箱内展片，用载玻片捞片，晾干，置于70℃温箱烤片1h；
(8)HE染色观察：①样本处理：染色前预热10min，二甲苯中脱蜡5分钟；换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5分钟；无水乙醇5分钟；90％乙醇2分钟；70％乙醇2分钟；蒸馏水2分钟；
②染色：苏木素染色液染色5-10分钟；HCL水溶液分化5s；浸自来水中反蓝，约5分钟；蒸馏水再洗涤一遍；95％乙醇5秒；伊红染色液染色30秒-2分钟；
③脱水透明封片：95％乙醇脱水2分钟；换用新鲜的95％乙醇再脱水2分钟；二甲苯透明5分钟；换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟；用中性树胶或其它封片剂封片。
本发明还对于使用的细胞系通过RT-PCR方法验证EML4-ALK融合基因；对于得到的切片标本通过雅培公司试剂盒进行FISH检测验证；对于得到的切片标本通过艾德公司试剂盒进行RT-PCR检测验证；对于得到的切片标本通过免疫组化的方法进行检测验证。
本发明选取了两种EML4-ALK融合基因阳性但型别不同的肺癌细胞系和一种EML4-ALK融合基因阴性的肺癌细胞系，将细胞培养达到一定数量，分别制备成细胞悬液接种至免疫缺陷小鼠体内，待其成瘤并长至一定大小后将瘤取出，并切成10mm×10mm×2mm，之后将得到的异种瘤组织通过中性甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制作瘤组织蜡块，对蜡块进行5μm切片，烤片，制作能用于EML4-ALK融合基因临床检验的质控品。这种通过细胞系制作的质控品重复性和一致性高，同时能够人为控制和选择所需的EML4-ALK融合基因型别的质控品，克服了传统质控品的不足。通过利用细胞系接种动物产生的异种瘤制作的质控品操作简便，试验周期短，能够大批量生产。本研究制作的质控品能够作为肺癌个体化检测的质控品，用于室内质量控制(IQC)和室间质量评价(EQA)，并且具用较好的重复性和一致性。
本发明的创新点在于：本发明得到的肺癌异种瘤组织质控品可以长期保存在大多数的温度条件下，在室温和4℃环境保存两周后检测效果无变化。因此，我们得到的切片质控品可以用于EQA和IQC，在将切片质控品作为EQA评估试验的质控品发放的时候，它可以在室温下无需冰袋进行邮寄并能长时间保存在-20℃或者-4℃条件下。我们的研究中得到的肺癌异种瘤组织制作的EML4-ALK融合基因临床检测切片质控品提供了一种可用于制造IQC或EQA的质控品的方法。这种利用肺癌异种瘤组织通过福尔马林固定石蜡包埋制作质控品的方法尚属首例。这种方法也能用于制造一系列的用于个体化检测的福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤标本质控品，例如PIK3CA突变检测和BRAF检测等。
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行说明，以使公众更好地理解本发明内容及应用，并不以任何方式造成对本发明的限定。凡依照本发明公开内容所做的任何等同替换，均属于本发明保护范围。
附图说明
图1为三种肿瘤组织制作切片的细胞分布示例情况，其中A1为H3122肿瘤组织切片10倍物镜下观察结果，B1为H3122肿瘤组织切片100倍物镜下观察结果；A2为H2228肿瘤组织切片10倍物镜下观察结果，B2为H2228肿瘤组织切片100倍物镜下观察结果；A3为H1299肿瘤组织切片10倍物镜下观察结果，B3为H1299肿瘤组织切片100倍物镜下观察结果。
图2为雅培公司试剂盒检测三种肿瘤组织切片标本的荧光示意图，其中A为100倍物镜下H1299肿瘤组织切片检测的FISH荧光图，B为100倍物镜下H2228肿瘤组织切片检测的FISH荧光图，C为100倍物镜下H3122肿瘤组织切片检测的FISH荧光图。
图3为三种肿瘤组织切片EML4-ALK目的基因和管家基因同时进行实时荧光定量PCR的曲线图，其中浅绿色线为H1299管家基因曲线，棕色线为G2228EML4-ALK1检测孔检测曲线，蓝色线为H3122管家基因曲线，红色线为H3122EML4-ALK1检测孔检测曲线，橙色线为H2228管家基因检测曲线。基线为绿色标记线。
图4为免疫组化检测三种肿瘤组织切片标本的结果图，其中A为阴性对照免疫组化结果图，B为H1299肿瘤组织切片免疫组化结果图，C为H2228肿瘤组织切片免疫组化结果图，D为H3122肿瘤组织切片免疫组化结果图。
具体实施方式
以下为实施例中涉及的主要材料和试剂：
肺癌细胞H1299，北京协和医科大学细胞库，中国
肺癌细胞H3122，南京科佰生物科技公司，中国
肺癌细胞H2228，厦门艾德生物医药科技有限公司，中国
QIAampDNAMiniKit，凯杰企业管理有限公司，中国
20×TaqManGeneExpressionAssay，ABI，美国
2×TaqManGeneExpressionMasterMix，ABI，美国
中性甲醛、无水乙醇、二甲苯，国药集团化学试剂北京有限公司，中国
苏木素伊红染色试剂，碧云天生物技术研究所，中国
上海雅培生物科技有限公司EML4-ALK融合基因检测试剂盒，上海雅培生物科技有限公司，中国
厦门艾德生物医药科技有限公司EML4-ALK融合基因检测试剂盒，厦门艾德生物医药科技有限公司，中国
免疫组化相关试剂盒及试剂，北京中杉金桥生物技术有限公司，中国
实施例1：异种瘤组织EML4-ALK融合基因临床检测质控品制备
一.方法
1.肺癌细胞系的培养
肺癌细胞H3122、H2228、H1299用含10％胎牛血清RPIM-1640培养液培养,培养基中含有10％胎牛血清,100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素。在37℃含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化进行细胞传代，将三种细胞系扩大培养至所需数量107-108并处于对数生长期。
2.通过PCR方法验证细胞系EML4-ALK基因融合情况
(1)RNA提取：①倒掉H1299、H2228和H3122旧培养基，PBS清洗两次，直接在培养瓶中加入2.5ml裂解液MZ裂解细胞，用取样器吹打几次。
②将样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
③4℃，12000rpm，离心5min，转移500ul到新的无RNase的离心管中。
④加入200ul氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置5min。
⑤4℃，12000离心15min，样品会分成3层，黄色的有机相，中间层和无色的有机相，RNA主要在水相中，水相的体积约为裂解液体积的50％，把水相转移到新管中。
⑥量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1.5倍的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转移到miRspincolumn中，室温12,000rpm离心30s，若以此不能将全部液体和混合物加入column，可分两次，离心后弃掉流出液，保留miRspincolumn。
⑦向miRspincolumn中加入500ul去蛋白液MRD，室温静置2min，室温12,000rpm离心30s，弃废液。向miRspincolumn中加入700ul漂洗液RW，室温静置2min，室温12,000rpm离心30s，弃废液。
⑧向miRspincolumn中加入700ul漂洗液RW，室温静置2min，室温12,000rpm离心30s，弃废液。
⑨将miRspincolumn放入2ml收集管中，室温12,000rpm离心1min，去除残余液体。
⑩离心后将miRspincolumn与室温放置片刻，以充分晾干，放置残余的酒精对后续的RT等步骤造成影响。
将miRspincolumn置于新的1.5ml离心管中，加入40ul无RNA酶的水，室温放置2min，室温12,000离心2min。
(2)逆转录PCR(RT-PCR)反应：
①将试剂盒试剂和样品混匀离心，置于冰上。
②配制如下体系：样本RNA5ul，引物1.7ul，水5.3ul；总计12ul。
混匀上述体系并稍微离心。
③向上述体系中继续加入试剂成为最终体系：
5×反应缓冲液4ul，RiboLockTMRNA酶抑制剂1ul，10mMdNTPMix2ul，RevertAidTMM-MuLV逆转录酶1ul；总计20ul。混匀体系，短暂离心。
④设置反转录程序进行反转录操作：温育42℃60min；热反应72℃5min。
⑤通过分光光度法检测cDNA浓度并将样品保存在-70℃。
(3)PCR反应检测细胞系EML4-ALK融合基因：
①离心cDNA样本、引物、Mix和RNase-freewater并置于冰上。
②配制反应体系：
表1
组分 每份包含的量(ul) 份数
RNase-free水 5 3
上游引物 0.2 3
下游引物 0.2 3
Mix 7.5 3
总量 12.9 3
③将上述混合体系混匀，并离心。
④加入样本每种2.1ul到每份混合体系的PCR管，最后一管作为空白孔不加入样本RNA。
⑤设置熔解曲线程序：
表2
⑥将PCR管放入PCR仪，启动PCR程序。
⑦将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳、成像，同时对扩增产物进行测序分析。
3.小鼠动物模型的建立
①准备若干只BeigeSCID小鼠和裸小鼠，BeigeSCID小鼠用于H2228致瘤，裸小鼠用于H3122和H1299致瘤。三种肺癌细胞用含10％胎牛血清RPIM-1640培养液培养,培养基中含有10％胎牛血清,100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素。在37℃含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养，用胰蛋白酶消化进行细胞传代，扩大培养至所需数量107～108并处于对数生长期。
②细胞消化准备：倒掉旧培养基，向培养瓶中加入1xPBS2ml，清洗2～3次；加入2ml胰酶，放入37℃、5％CO2孵箱孵2min；待大部分细胞被消化下来，立即加入4ml培养基终止胰酶的消化作用；用一次性巴氏吸管将细胞吹打混匀，待在镜下观察细胞大部分成单个后转入50ml离心管中，离心，弃去上层培养基，加入2mlPBS，吹打混匀，离心，弃去上清液，加入1mlPBS，吹打混匀细胞，形成细胞悬液，转入2ml冻存管中。
③动物接种：将所得1.5ml细胞悬液吹打混匀，分别使用1ml注射器吸取0.2ml细胞悬液，皮下接种到裸小鼠两侧腋下每侧0.2ml，将三只接种的裸小鼠放回SPF隔离器中。每周观察一次，待瘤长至8至10cm时处死小鼠取瘤。
4.切片质控品的制备
(1)收集肿瘤组织：颈椎脱臼法处死小鼠，分别取出三种肿瘤组织，切成10mm×10mm×2mm，用PBS洗净血污；
(2)固定：每种肿瘤分别加入30ml10％中性甲醛固定细胞6-48小时后，加入1XPBS冲洗3次；
(3)乙醇梯度脱水：加入80％乙醇15ml，静置30min后，取出；加入90％乙醇15ml，静置30min后，取出；加入95％乙醇15ml，静置20min*2后，取出；加入无水乙醇15ml，静置20min*2后，取出；
(4)透明：加入无水乙醇和二甲苯的混合液1:115ml,静置30min，取出；加入二甲苯15ml静置30min，取出组织；
(5)浸蜡：放入56℃蜡盒中浸蜡三遍，第一道30min，第二道60min，第三道90min以上；
(6)包埋：70℃融化石蜡，将融化的500ul液体石蜡加入到组织块到包埋盒(约500ul)，再次灌蜡包埋；
(7)切片：5um/张切片，切片后于恒温30℃水箱内展片，用载玻片捞片，晾干，置于70℃温箱烤片1h；
(8)HE染色观察：①样本处理：染色前预热10min，二甲苯中脱蜡5分钟；换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5分钟；无水乙醇5分钟；90％乙醇2分钟；70％乙醇2分钟；蒸馏水2分钟；
②染色：苏木素染色液染色5-10分钟；HCL水溶液分化5s；浸自来水中反蓝，约5分钟；蒸馏水再洗涤一遍(数秒钟)；95％乙醇5秒；伊红染色液染色30秒-2分钟；
③脱水透明封片：95％乙醇脱水2分钟；换用新鲜的95％乙醇再脱水2分钟；二甲苯透明5分钟；换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟；用中性树胶或其它封片剂封片；显微镜下观察。
二.结果
1.细胞系验证结果
(1)对细胞RNA进行RT-PCR后cDNA的浓度：检测cDNA浓度分别为：H3122：2848ng/mlH2228:3658ng/mlH1299：1697ng/ml。
(2)PCR验证结果显示，H3122细胞系存在EML413号外显子和ALK21号外显子的融合(EML4-ALKV1)；H2228细胞系测序结果也符合预期结果，与EML4-ALKV3a的序列相符合，初筛结果初步表明两种细胞系均符合预期结果。测序结果表明H2228细胞存在两种亚型，V3a和V3b，符合文献报道。H3122和H2228这两种细胞系测序结果序列见序列表，SEQIDNo.1所示的核苷酸序列为H3122测序结果，SEQIDNo.2所示的核苷酸序列为H2228反向测序结果，SEQIDNo.3所示的核苷酸序列为H2228正向测序结果。
2.制备切片细胞HE染色和分布情况
所制备的切片在光镜下细胞形态典型，符合肺癌细胞基本特征，肿瘤组织结构清晰。图1为三种切片的HE染色结果。
实施例2：采用市售FISH试剂盒对制备质控品EML4-ALK融合基因进行验证
一.方法：采用雅培公司EML4-ALK融合基因FISH试剂盒进行验证
1.将样本切片浸入装有二甲苯的考普林瓶中5分钟。重复该步骤共进行3次。
2.将样本切片放入无水乙醇中脱水1分钟。重复该步骤一次，之后拿出切片使之自然风干(2-5分钟)。
3.将切片置于预先预热到80±2℃的雅培前处理溶液中处理12±3分钟。之后将切片转入去离子水中浸泡3分钟。
4.从水中取出切片，擦去边缘多余水分，将切片置入预热37±1℃的蛋白酶溶液中消化20±2分钟。之后将切片转入去离子水中浸泡3分钟。
5.将切片分别置入70％、85％和100％的乙醇中脱水1分钟，空气中干燥切片(2-5分钟)，将混匀并离心的探针试剂加入切片样本区域10μL，迅速盖上盖玻片，避免出现气泡。用橡胶水泥对盖玻片一周进行封闭。
6.避光的情况下将切片置入原位杂交仪中，设置变性杂交的程序：变性：温度：73℃，时间：3分钟；杂交：温度：37℃，时间：14-24小时(过夜)。启动原位杂交仪进行变性杂交。
7.避光情况下取出杂交后的切片，撕去橡胶水泥，将玻片浸入常温雅培清洗缓冲液Ⅰ2-5分钟使盖玻片自然脱落。
8.将切片置入预热74±1℃的雅培清洗缓冲液Ⅱ，轻微晃动切片1-3秒，浸泡2分钟。避光情况下空气干燥玻片。
9.在样本区域滴加DAPI染液10μL，放置至少5分钟。
10.在合适的荧光显微镜下观察并计数细胞ALK断裂信号情况。
二.结果：
FISH试剂盒检测结果：计数细胞数为100个，具体三种切片的ALK断裂阳性细胞数表3：
表3：三种肿瘤组织切片的ALK断裂阳性细胞数以及结果判断
样本编号 定性(阴性/阳性) 计数总细胞数 计数ALK断裂阳性细胞数
H3122 阳性 100 60
H2228 阳性 100 76
H1299 阴性 100 3
我们使用国内常用试剂盒进行检测得到了三种肿瘤组织制作切片的结果，基本符合预期结果，检测效果较好。雅培公司试剂盒验证的EML4-ALK融合基因FISH荧光图见图2。
实施例3：用实时荧光RT-PCR方法对制备质控品EML4-ALK融合基因进行验证
一.方法：利用艾德公司EML4-ALK融合基因实时荧光RT-PCR试剂盒进行验证
1、RNA提取：(1)任取实施例1得到的三种EML4-ALK石蜡包埋样本切片各一，向管内加入1ml二甲苯溶液。涡流震荡10s后全速离心2min。
2)吸出并丢弃上清液，注意不要将下部沉淀吸出。
3)加入1ml无水乙醇到沉淀中，震荡混匀，全速离心2min。
4)吸去上清，注意不要吸出下部沉淀，换用新的吸头吸出参与的乙醇。
5)在室温下开盖孵育10min直至所有残余的乙醇都挥发干净。
6)加入150μLBufferPKD，震荡混匀。
7)加入10μL蛋白酶K溶液，轻柔地上下抽吸混匀。
8)在56℃环境温育15min，转导80℃环境温育15min。
9)在冰上孵育3min，然后13500rpm离心15min。
10)将上清液转移到一个新的EP管中，注意不要吸入沉淀物。
11)加入总样本体积十分之一的DNaseBoosterBuffer(约16μL)，之后加入10μLDNaseIstocksolution，颠倒混匀，短暂离心将管壁上液体离心至管底。
12)室温下孵育15min。
13)加入320μLBufferRBC来调整结合环境，将裂解液充分混匀。
14)向样本中加入120μL无水乙醇，通过抽吸混匀，不要进行离心，直接进行下一步。
15)将样本吸取700μL到携带了2ml收集管的RNeasyMinElutespincolumn中，轻轻盖上管盖，通过大于10000rpm离心15s，弃掉离心下来的液体。
16)重复上一步直至将所有的样本都转移到柱内。
17)向RNeasyMinElutespincolumn中加入500μLBufferRPE，轻轻盖上管盖，通过大于10000rpm离心15s，弃去离心下来的液体。
18)加入500μLBufferRPE到RNeasyMinElutespincolumn中，轻轻盖上管盖，通过大于10000rpm离心2min以清洗柱子膜，将下部收集管连同离心下来的液体一起弃去。
19)将RNeasyMinElutespincolumn放入一个新的2ml收集管中，打开柱子盖，全速离心5min，弃掉收集管连同离心下来的液体。
20)将RNeasyMinElutespincolunm放入一个新的1.5ml收集管中，直接加入20μLRNase-free水到柱子膜上，轻轻盖上管盖，全速离心1min洗脱下RNA。
21)分光光度计测量所提RNA浓度。
2.实时荧光RT-PCR过程：
1)取出三管EART反应过来，室温解冻后，快速离心15s。
2)取出EA逆转录酶快速离心15s，放置于冰架上。
3)移取0.5μLEA逆转录酶至EART反应管中。
4)加入6μL待测样品RNA，42℃保温1个小时，95℃保温5min后冰上冷却，得到cDNA溶液用于PCR扩增。
5)取出25μL阴性对照(RNase-free水)至单独的一个1.5ml离心管中。
6)取出EA混合酶，快速离心15s，放置于冰架上。
7)分别移取1.5μLEA混合酶至待测样本cDNA、25μL阴性对照中，震荡混匀后快速离心15s。
8)取出两条EAPCR8联管，快速离心15s，放置于PCR板架上。
9)轻轻揭开EAPCR8联管的管盖，分别移取5μL上述待测样品cDNA混合液和阴性对照混合液至EAPCR8联管中，小心盖上管盖，快速离心数秒。
加样顺序如下表4：
表4
管号 检测内容 1 2
1 EML4-ALK1 1299 3122
2 EML4-ALK2 1299 3122
3 EML4-ALK3 1299 3122
4 管家基因 1299 3122
5 EML4-ALK1 2228 阴性对照
6 EML4-ALK2 2228 阴性对照
7 EML4-ALK3 2228 阴性对照
8 管家基因 2228 阴性对照
10)将EAPCR8联管放入实时PCR仪器的样品槽中，打开设置窗口，按照下面说明的扩增程序进行设置。
第一阶段：95℃5min1个循环；
第二阶段：95℃25s64℃20s72℃20s15个循环；
第三阶段：93℃25s60℃35s72℃20s31个循环；
信号收集：第三阶段60℃时收集FAM信号，执行实时PCR，保存文件。(使用ABI仪器时探针模式设置：ReporterDYE：FAM；QuencherDye：TAMER；PassiveReference：NONE。)
二.结果
1.细胞提取RNA的浓度分别为：H1299:667.8μg/Ml；H2228：72.6μg/mL；H3122：251.2μg/mL。
2.实时荧光RT-PCR结果:三种肿瘤组织切片检测的Ct值结果如表5所示：
表5：三种肿瘤组织切片EML4-ALK融合基因和内参基因的Ct值
Ct值 EML4-ALK 管家基因 ΔCt
H3122 18.547 16.706 1.841
H2228 13.132 21.686 -8.554
H1299 无 4.498 -
根据试剂盒检测结果解释，检测结果有效，结果显示所有样品孔管家基因都有明显曲线升起，实验结果显示H1299肿瘤切片为EML4-ALK阴性，H2228和H3122肿瘤切片为EML4-ALK阳性，符合预期结果。具体PCR曲线见图3。
实施例4：通过免疫组化方法对制备质控品EML4-ALK融合基因进行验证
一.方法
1.常规脱蜡水化：将三张切片已在烤箱中干燥过的石蜡切片浸于二甲苯中1Omin，三次。取出切片置于100％无水乙醇中lOmin两次；依次置入95％、90％、85％、80％、70％各级酒精备5min。蒸馏水洗3min3次。
2.抗原修复：将切片浸入柠檬酸抗原修复液中，置于微波炉中，沸腾后持续20min，修复抗原。室温冷却后，蒸馏水冲洗2次，PBS冲洗2次×3min。
3.切片甩掉并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加50ul过氧化酶阻断溶液,以阻断内源性过氧化物酶的活性,室温下避光孵育1Omin。用PBS(pH7.4)冲洗3次,每次2min。
4.甩去PBS,切片滴加50ul的第一抗体,室温下孵育1-2h,建议按每种抗体说明书操作。PBS冲洗3次,每次2min。阴性对照以PBS缓冲液作为第一抗体。
5.甩去PBS液并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中,切片滴加50ul的第二抗体,室温下孵育10min。用PBS(pH7.4)冲洗3次,每次2min。
6.甩去PBS液并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中,切片滴加试剂1,37℃下避光孵育20min。用PBS(pH7.4)冲洗3次,每次2min。
7.甩去PBS液并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中,切片滴加试剂2,37℃下避光孵育20-30min。用PBS(pH7.4)冲洗3次,每次2min。
8.甩去PBS液并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中,切片滴加100ul新鲜配置的DAB溶液,显微镜下观察3-5min,阳性显色为棕黄色。
9.蒸馏水冲洗终止显色,苏木素复染,PBS冲洗返蓝"
10.梯度酒精脱水干燥每级10min，二甲苯透明两次10min，中性树胶封固。
二.结果
阴性对照(用PBS代替一抗)：可以看出为阴性结果，无着色；H1299肿瘤切片：为阴性结果，评分为0，无着色；H3122肿瘤切片：为阳性结果，结果判断为1+；H2228切片：强阳性结果，结果判读至少为3+。IHC结果满足预期结果，验证了我们制作的切片从检测蛋白表达的角度，也能证实FISH结果，与FISH结果相互佐证。具体免疫组化的结果如图4所示。

Claims (10)

1.一种肺癌检测质控品，其特征在于：为肺癌细胞系H3122、肺癌细胞系H2228和肺癌细胞系H1299分别接种实验动物后生成的肿瘤组织的标本切片。
2.根据权利要求1所述的肺癌检测质控品，其特征在于：所述实验动物为免疫缺陷动物，优选小鼠。
3.根据权利要求1或2所述的肺癌检测质控品，其特征在于：所述标本切片采用以下方法制备：
(1)培养肺癌细胞系；
(2)建立肿瘤动物模型；
(3)制备肺癌质控品。
4.根据权利要求3所述的肺癌检测质控品，其特征在于：所述步骤(1)培养肺癌细胞系是指：肺癌细胞系H3122、肺癌细胞系H2228、肺癌细胞系H1299，分别用含10％胎牛血清RPIM-1640培养液培养,培养基中含有10％胎牛血清,100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素；在37℃含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化进行细胞传代，将三种细胞系扩大培养至107-108并处于对数生长期。
5.根据权利要求3所述的肺癌检测质控品，其特征在于：所述步骤(2)建立肿瘤动物模型的步骤为：
(1)准备若干只BeigeSCID小鼠和裸小鼠，BeigeSCID小鼠用于H2228致瘤，裸小鼠用于H3122和H1299致瘤；
(2)细胞消化准备：倒掉旧培养基，向培养瓶中加入1xPBS2ml，清洗2-3次；加入2ml胰酶，放入37℃、5％CO2孵箱孵2min；待大部分细胞被消化下来，立即加入4ml培养基终止胰酶的消化作用；用一次性巴氏吸管将细胞吹打混匀，待在镜下观察细胞大部分成单个后转入50ml离心管中，离心，弃去上层培养基，加入2mlPBS，吹打混匀，离心，弃去上清液，加入1mlPBS，吹打混匀细胞，形成细胞悬液，转入2ml冻存管中；
(3)动物接种：将所得1.5ml细胞悬液吹打混匀，分别使用1ml注射器吸取0.2ml细胞悬液，皮下接种到裸小鼠两侧腋下每侧0.2ml，将三只接种的裸小鼠放回SPF隔离器中；每周观察一次，待瘤长至8至10cm时处死小鼠。
6.根据权利要求3所述的肺癌检测质控品，其特征在于：所述步骤(3)制备肺癌质控品的步骤为：
(1)收集肿瘤组织：处死小鼠，分别取出三种肿瘤组织，切成10mm×10mm×2mm，用PBS洗净血污；
(2)固定：每种肿瘤分别加入30ml10％中性甲醛固定细胞6-48小时后，加入1XPBS冲洗3次；
(3)乙醇梯度脱水：加入80％乙醇15ml，静置30min后，取出；加入90％乙醇15ml，静置30min后，取出；加入95％乙醇15ml，静置20min*2后，取出；加入无水乙醇15ml，静置20min*2后，取出；
(4)透明：加入无水乙醇和二甲苯的混合液1:115ml,静置30min，取出；加入二甲苯15ml静置30min，取出组织；
(5)浸蜡：放入56℃蜡盒中浸蜡三遍，第一道30min，第二道60min，第三道90min以上；
(6)包埋：70℃融化石蜡，将融化的500ul液体石蜡加入到组织块到包埋盒，再次灌蜡包埋；
(7)切片：5um/张切片，切片后于恒温30℃水箱内展片，用载玻片捞片，晾干，置于70℃温箱烤片1h；
(8)HE染色观察：①样本处理：染色前预热10min，二甲苯中脱蜡5分钟；换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5分钟；无水乙醇5分钟；90％乙醇2分钟；70％乙醇2分钟；蒸馏水2分钟；
②染色：苏木素染色液染色5-10分钟；HCL水溶液分化5s；浸自来水中反蓝，约5分钟；蒸馏水再洗涤一遍；95％乙醇5秒；伊红染色液染色30秒-2分钟；
③脱水透明封片：95％乙醇脱水2分钟；换用新鲜的95％乙醇再脱水2分钟；二甲苯透明5分钟；换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟；用中性树胶或其它封片剂封片。
7.一种肺癌检测质控品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)培养肺癌细胞系；
(2)建立肿瘤动物模型；
(3)制备肺癌质控品。
8.根据权利要求7所述的一种肺癌检测质控品的制备方法，其特征在于所述步骤(1)培养肺癌细胞系是指：肺癌细胞系H3122、肺癌细胞系H2228、肺癌细胞系H1299，分别用含10％胎牛血清RPIM-1640培养液培养,培养基中含有10％胎牛血清,100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素；在37℃含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化进行细胞传代，将三种细胞系扩大培养至107-108并处于对数生长期。
9.根据权利要求7所述的一种肺癌检测质控品的制备方法，其特征在于所述步骤(2)建立肿瘤动物模型的步骤为：
(1)准备若干只BeigeSCID小鼠和裸小鼠，BeigeSCID小鼠用于H2228致瘤，裸小鼠用于H3122和H1299致瘤；
(2)细胞消化准备：倒掉旧培养基，向培养瓶中加入1xPBS2ml，清洗2～3次；加入2ml胰酶，放入37℃、5％CO2孵箱孵2min；待大部分细胞被消化下来，立即加入4ml培养基终止胰酶的消化作用；用一次性巴氏吸管将细胞吹打混匀，待在镜下观察细胞大部分成单个后转入50ml离心管中，离心，弃去上层培养基，加入2mlPBS，吹打混匀，离心，弃去上清液，加入1mlPBS，吹打混匀细胞，形成细胞悬液，转入2ml冻存管中；
(3)动物接种：将所得1.5ml细胞悬液吹打混匀，分别使用1ml注射器吸取0.2ml细胞悬液，皮下接种到裸小鼠两侧腋下每侧0.2ml，将三只接种的裸小鼠放回SPF隔离器中；每周观察一次，待瘤长至8至10cm时处死小鼠。
10.根据权利要求7所述的一种肺癌检测质控品的制备方法，其特征在于所述步骤(3)制备肺癌质控品的步骤为：
(1)收集肿瘤组织：处死小鼠，分别取出三种肿瘤组织，切成10mm×10mm×2mm，用PBS洗净血污；
(2)固定：每种肿瘤分别加入30ml10％中性甲醛固定细胞6-48小时后，加入1XPBS冲洗3次；
(3)乙醇梯度脱水：加入80％乙醇15ml，静置30min后，取出；加入90％乙醇15ml，静置30min后，取出；加入95％乙醇15ml，静置20min*2后，取出；加入无水乙醇15ml，静置20min*2后，取出；
(4)透明：加入无水乙醇和二甲苯的混合液1:115ml,静置30min，取出；加入二甲苯15ml静置30min，取出组织；
(5)浸蜡：放入56℃蜡盒中浸蜡三遍，第一道30min，第二道60min，第三道90min以上；
(6)包埋：70℃融化石蜡，将融化的500ul液体石蜡加入到组织块到包埋盒，再次灌蜡包埋；
(7)切片：5um/张切片，切片后于恒温30℃水箱内展片，用载玻片捞片，晾干，置于70℃温箱烤片1h；
(8)HE染色观察：
①样本处理：染色前预热10min，二甲苯中脱蜡5分钟；换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5分钟；无水乙醇5分钟；90％乙醇2分钟；70％乙醇2分钟；蒸馏水2分钟；
②染色：苏木素染色液染色5-10分钟；HCL水溶液分化5s；浸自来水中反蓝，约5分钟；蒸馏水再洗涤一遍；95％乙醇5秒；伊红染色液染色30秒-2分钟；
③脱水透明封片：95％乙醇脱水2分钟；换用新鲜的95％乙醇再脱水2分钟；二甲苯透明5分钟；换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟；用中性树胶或其它封片剂封片。
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