CN114182048A - 用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针、探针组以及试剂盒 - Google Patents

用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针、探针组以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针、探针组以及试剂盒，属于生物医药技术领域。本发明的用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针的核苷酸序列的长度为30‑50bp，并且能够与巨细胞病毒早期基因转录产物CMV Beta 2.7lncRNA的部分序列互补。采用本发明的寡核苷酸探针，可以将免疫组化的显色反应与原位杂交技术相结合，在检测巨细胞病毒时不需要核酸提取，通过探针杂交，即可直观观察到待检核酸的存在以及存在的细胞类型和细胞内分布状态，通过在组织中原位检测特异性核酸片段，就可以明确病原体部位、同时显示基因状态与组织形态学。

Description

用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针、探针组以及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针、探针组以及试剂盒，属于生物医药技术领域。
背景技术
巨细胞病毒(CMV)感染在我国极其普遍，一般人群感染率86％～96％。感染者可长期或间隙地经口腔、生殖道、胎盘、输血或器官移植等多途径，由唾液、乳汁、血液、尿液、精液、子宫分泌物等多种介质携带排出病毒进行传播。巨细胞病毒一旦侵入机体，将长期或终身存在于人体内。对于绝大多数免疫功能正常的个体，常表现为没有临床症状的潜伏感染，但当机体免疫功能低下，如妊娠、多次输血、器官移植或获得性免疫缺陷等时，病毒可被激活而发生显性感染。病毒可侵入肺、肝、肾、唾液腺等腺体，以及多核白细胞和淋巴细胞，侵袭多个器官和系统引起严重终末器官疾病(白细胞减少、肝炎、肾炎、间质性肺炎、胃肠道疾病、器官移植失败等)。因此，准确、快速和特异性地监测CMV活动性感染，对早期治疗非常重要。
目前临床上检测巨细胞病毒感染的检测方法主要有：病毒分离培养、PP65抗原检测(免疫组化)、血清CMV-IgG/CMV-IgM检测、核酸检测等。其中病毒分离培养需要1个月以上才能得到培养结果，不适用于临床应用；免疫抑制剂的使用和“窗口期”的问题使血清学检测缺乏敏感性；病毒抗原检测样本要求有足量的粒细胞且较易受到内源性酶的影响而影响结果判断；依赖扩增PCR或以PCR为基础的检测易造成实验室环境污染，且无法定位。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针，可以实现在组织原位检测巨细胞病毒，并且有助于提高巨细胞病毒检测的及时性和准确程度。
本发明还提供了一种用于检测巨细胞病毒的探针组和试剂盒。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针的核苷酸序列的长度为30-50bp，并且能够与巨细胞病毒早期基因转录产物CMV Beta 2.7lncRNA的部分序列互补。
本发明的用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针，靶向巨细胞病毒早期基因转录产物CMV Beta 2.7lncRNA。由于CMV Beta 2.7lncRNA是巨细胞病毒活动性感染阶段丰度最高的早期基因转录产物CMV Beta 2.7lncRNA，采用本发明的寡核苷酸探针，可以将免疫组化的显色反应与原位杂交技术相结合，在检测巨细胞病毒时不需要核酸提取，通过探针杂交，即可直观观察到待检核酸的存在以及存在的细胞类型和细胞内分布状态，通过在组织中原位检测特异性核酸片段，就可以明确病原体部位、同时显示基因状态与组织形态学，并可将形态研究与功能研究有机结合。
进一步地，所述寡核苷酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:15中任意一种所示。
进一步地，所述寡核苷酸探针的3’末端标记有可检测标记物。所述可检测标记物优选为地高辛、生物素、异硫氰酸荧光素(FITC)中的任意一种，进一步优选为地高辛。
本发明的用于检测巨细胞病毒的探针组所采用的技术方案为：
一种用于检测巨细胞病毒的探针组，包括两种以上不同核苷酸序列的上述寡核苷酸探针。本发明的用于检测巨细胞病毒的探针组，能够实现在组织样本原位上检测巨细胞病毒活动性感染的基础上，提高检测的灵敏度。
进一步地，本发明的用于检测巨细胞病毒的探针组，包括核苷酸序列分别如SEQID NO:1～SEQ ID NO:15所示的寡核苷酸探针。
进一步地，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:15所示的寡核苷酸探针的3’末端均标记有可检测标记物。更进一步地，所述可检测标记物为地高辛、生物素、异硫氰酸荧光素中任意一种。
本发明的用于检测巨细胞病毒的试剂盒所采用的技术方案为：
一种采用上述任意的寡核苷酸探针或任意的探针组的用于检测巨细胞病毒的试剂盒。本发明的用于检测巨细胞病毒的试剂盒，能够将免疫组化的显色反应与原位杂交技术相结合，不需要核酸提取，通过探针杂交，即可直观观察到待检核酸的存在以及存在的细胞类型和细胞内分布状态，通过在组织中原位检测特异性核酸片段，就可以明确病原体部位、同时显示基因状态与组织形态学。
进一步地，用于检测巨细胞病毒的试剂盒包括CMV检测探针溶液，所述CMV检测探针溶液包括上述的用于检测巨细胞病毒的探针组。更进一步地，所述CMV检测探针溶液采用包括以下步骤的方法制得：获取各寡核苷酸探针的核苷酸序列片段的混合物，然后采用TDT末端转移酶在混合物中各核苷酸序列片段的3’末端标记地高辛，然后采用杂交缓冲液稀释，即得。在寡核苷酸片段的3’末端标记可检测标记物时，采用的标记体系为ReactionBuffer(5x)2μL，寡核苷酸片段2μL，Digoxigen-11-dUTP 0.5μL，TDT 0.5μL,ddH2O5μL。标记程序为：37℃25min；70℃5min。所述杂交缓冲液可以为本领域常用核酸分子杂交缓冲液。进一步地，所述杂交缓冲液由水和甲酰胺、硫酸葡聚糖、氯化钠、柠檬酸和十二烷基硫酸钠(SDS)组成，其中，甲酰胺的体积百分含量为50％，硫酸葡聚糖的质量百分含量为10％，氯化钠的浓度为8.75g/L，柠檬酸的浓度为4.4g/L，SDS的质量百分含量为0.05％。
进一步地，所述的用于检测巨细胞病毒的试剂盒，还包括清洗液。所述清洗液是由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、表面活性剂和水组成的混合溶液；混合溶液中，氯化钠的浓度为8g/L、氯化钾的浓度为0.2g/L、磷酸氢二钠浓度为1.44g/L、磷酸二氢钾的浓度为0.24g/L、Tween20的质量分数为0.05％。
进一步地，所述的用于检测巨细胞病毒的试剂盒，还包括蛋白酶溶液、鼠抗地高辛抗体试剂、兔抗鼠抗体试剂、多聚HRP羊抗兔抗体试剂、显色底物、显色缓冲液、显色剂。
进一步地，所述蛋白酶溶液为胃蛋白酶溶液。所述胃蛋白酶溶液的浓度为2mg/mL胃蛋白酶反应液。所述显色底物为DAB底物。所述显色缓冲液为DAB缓冲液。所述显色剂为苏木素。
附图说明
图1为实验例中采用实施例3的试剂盒对切片组织中的CMV Beta 2.7lncRNA检测的结果图；
图2为实验例中免疫组化法对切片组织中PP65抗原检测的结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1
本实施例的用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14或SEQ ID NO:15所示，寡核苷酸探针的3’末端标记有地高辛。
实施例2
本实施例的用于检测巨细胞病毒的探针组，包括核苷酸序列分别如NO:1～SEQ IDNO:15所示的寡核苷酸探针，各寡核苷酸探针的3’末端均标记有地高辛。也就是说，本实施例的探针组包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的寡核苷酸探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的寡核苷酸探针；各寡核苷酸探针的3’末端均标记有地高辛。
以下实施例3中CMV探针溶液在制备时采用的Reaction Buffer(5x)、TdT末端转移酶购自beyotime，Digoxigen-11-dUTP购自Roche。杂交缓冲液由水和甲酰胺、硫酸葡聚糖、氯化钠、柠檬酸和十二烷基硫酸钠(SDS)组成，其中，甲酰胺的体积百分含量为50％，硫酸葡聚糖的质量百分含量为10％，氯化钠的终浓度为8.75g/L，柠檬酸的终浓度为4.4g/L，SDS的质量百分含量为0.05％。
实施例3
本实施例的用于检测巨细胞病毒的试剂盒，包括CMV检测探针溶液、胃蛋白酶溶液、清洗液、鼠抗地高辛抗体试剂、兔抗鼠抗体试剂、多聚HRP羊抗兔抗体试剂、DAB底物、DAB缓冲液、苏木素。
其中，胃蛋白酶溶液为2mg/mL胃蛋白酶反应液。
清洗液是由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、表面活性剂和水组成的混合溶液；混合溶液中，氯化钠的浓度为8g/L、氯化钾的浓度为0.2g/L、磷酸氢二钠浓度为1.44g/L、磷酸二氢钾的浓度为0.24g/L、Tween20的质量分数为0.05％。
CMV检测探针溶液包括实施例2中的用于检测巨细胞病毒的探针组，具体地，CMV检测探针溶液采用包括以下步骤的方法制得：
1)从NCBIGenbank数据库下载CMV Beta 2.7RNA的基因组全长序列(Humanherpesvirus 5Long non-coding RNAbeta 2.7RNA，GenBank:HG975384.1。)。
2)将步骤1)获得的CMV Beta 2.7RNA的基因组全长序列，用Oligominer软件设计长度为30-50bp的寡核苷酸探针。
3)将步骤2)获得的寡核苷酸探针逐一进行BLAST特异性分析，筛选出15条特异性探针序列，具体见表1。
表1 15条特异性探针序列
序号 Probe# Sequence(5’-3’)
1 CMV Beta 2.7-1 AAAACGCAGGGGTTTAGCAGCTTCCCCAGATCGCTGCTGC
2 CMV Beta 2.7-2 GAGAAGACGGAGGAGCCGAGATGACAACAGCAGTCGTGGA
3 CMV Beta 2.7-3 CGCCAAGCCCCGGTCCTTCTCTTCTGTCTGGTCGAATCTT
4 CMV Beta 2.7-4 TTTTATGTGAGTTTCTCTTCCGCGTCTCCCGGCCGTACCA
5 CMV Beta 2.7-5 CCATGCAGCATGCACGCGTGTATGTATGCATCGCCTCTCC
6 CMV Beta 2.7-6 GGGGAACGGGTCGGCGGCCGGTCGGCTTCTGTTTTATTAT
7 CMV Beta 2.7-7 GCGATCCTCATGGCGAGGACCGCGATCTCCGTATAGGTAG
8 CMV Beta 2.7-8 TGCACATCCTGACGCGTCGGTCAGCAGCCAAACAATCATA
9 CMV Beta 2.7-9 AGCAACACCAACAACAACCGCATCGCAACATCTTCATCCG
10 CMV Beta 2.7-10 TGAAAGACGACGATGATTCCTTACCGCTCCTGCCACCCGG
11 CMV Beta 2.7-11 AAGAGAGAAAACGGTGAATCCAAGATCCCCGGGTCGGCGT
12 CMV Beta 2.7-12 AAAAGAAAAGAGAAAGAGACCACCTTCCCGGCGGCGGACA
13 CMV Beta 2.7-13 CAGCGTTGCAGTAGTCGACTCCCTGGACACGAAGGAGTCA
14 CMV Beta 2.7-14 TCTGCACTGAAAACACACTCTCCTGTCACGACACCGCGCC
15 CMV Beta 2.7-15 AGAGGCGTACGCGTGACTTCATCGCAACGATCCATCGTGA
4)将步骤3)所得15条特异性探针序列让生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，每条探针浓度10pmol/L。
5)取步骤4)得到的每条探针各2μL进行混合，得到混合探针；将混合探针采用TdT末端转移酶标记地高辛；采用TdT末端转移酶标记的反应体系如下：
Figure BDA0003451675120000051
标记反应程序如下：37℃25min；70℃5min。
6)将步骤5)得到的标记产物按照标记产物:杂交缓冲液＝1:200的体积比例进行配制，即得到CMV检测探针溶液。
实验例
采用本发明的试剂盒进行显色原位杂交检测方法如下：
1.组织切片预处理
1.1 60～65℃烤片固定约2h。
1.2二甲苯中室温脱蜡3次，10min/次。
1.3无水乙醇中浸泡2次，5min/次。
1.4室温晾干组织切片5～10min。
1.5将切片放置于37℃环境并滴加胃蛋白酶溶液完全覆盖样本组织，消化10～15min。(注：根据不同的组织类型及切片厚度，消化时间有所不同，若组织类型及切片厚度与该说明书中样本要求不一致，使用前应确认消化时间。)
1.6去离子水浸泡2min。
1.7组织切片依次过70％，85％，无水乙醇，各2min后室温晾干。
2.样本杂交
2.1将CMV探针溶液从冰箱取出，瞬时离心，用移液器分别取10μl滴加至组织区域。
2.2样本盖上盖玻片，避免气泡；用橡胶水泥密封盖玻片四周。
2.3将切片放入杂交仪70℃变性8min后37℃过夜杂交。
3.杂交后洗涤
3.1小心除去橡胶水泥，室温条件下将玻片浸入清洗液中至盖玻片自然滑落。
3.2清洗液中浸泡3次，2min/次。
4.抗体孵育及显色
4.1滴加70～100μL鼠抗地高辛抗体试剂。
4.2室温孵育40～60min。
4.3清洗液浸泡3次，2min/次。
4.4滴加70～100μL兔抗鼠抗体试剂，室温孵育20min。
4.5清洗液浸泡3次，2min/次。
4.6滴加70～100μL多聚HRP羊抗兔抗体试剂，室温孵育20min。
4.7清洗液浸泡3次，2min/次。
4.8去离子水浸泡1次，2min/次。
注：为确保充分洗脱，浸泡期间可多次提拉玻片。
5.显色复染
5.1根据组织大小，滴加70～100μL新鲜配制的DAB显色液。
5.2室温孵育3～5min。
5.3自来水冲洗。
5.4清洗液浸泡1min。
5.5待测组织区域加100μL苏木素，孵育10～20s。(注意：依据作用的苏木素染色液的强度和孵育时间的长短，对比染色结果导致细胞质呈现淡蓝色到深蓝色的反应，而过染或是染色不足都有可能危及正确结果的判断。)
5.6清洗液浸泡1min返蓝。
5.7梯度乙醇(70％、85％、无水)脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
5.8阅片。
实验例：按照实验例的上述显色原位杂交检测方法采用实施例3的试剂盒对某PP65抗原阳性样本进行检测，得到的检测结果如图1所示，采用免疫组化法进行检测的结果如图2所示。
比较图1和图2可知，采用本发明的用于巨细胞病毒检测的试剂盒进行寡核苷酸探针的原位杂交检测方法，灵敏度及特异性均优于使用CMV抗体的免疫组化检测。
<110> 河南赛诺特生物技术有限公司
<120> 用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针、探针组以及试剂盒
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> CMV Beta 2.7 -1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgccaagccc cggtccttct cttctgtctg gtcgaatctt 40
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<221> CMV Beta 2.7 -15
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agaggcgtac gcgtgacttc atcgcaacga tccatcgtga 40

Claims (10)

1.用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针的核苷酸序列的长度为30-50bp，并且能够与巨细胞病毒早期基因转录产物CMV Beta 2.7lncRNA的部分序列互补。
2.根据权利要求1所述的用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:15中任意一种所示。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测巨细胞病毒的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针的3’末端标记有可检测标记物；所述可检测标记物为地高辛、生物素、异硫氰酸荧光素中的任意一种。
4.用于检测巨细胞病毒的探针组，其特征在于：包括两种以上不同核苷酸序列的如权利要求1～3中任意一项所述的寡核苷酸探针。
5.用于检测巨细胞病毒的探针组，其特征在于：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:15所示的寡核苷酸探针。
6.根据权利要求5中任意一项所述的用于检测巨细胞病毒的探针组，其特征在于：核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:15所示的寡核苷酸探针的3’末端均标记有可检测标记物；所述可检测标记物为地高辛、生物素、异硫氰酸荧光素中任意一种。
7.采用如权利要求1～3中任意一项所述的寡核苷酸探针或如权利要求4～6中任意一项所述的探针组的用于检测巨细胞病毒的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的用于检测巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：包括CMV检测探针溶液；所述CMV检测探针溶液包括所述用于检测巨细胞病毒的探针组，所述CMV检测探针溶液采用包括以下步骤的方法制得：获取各寡核苷酸探针的核苷酸序列片段的混合物，然后采用TDT末端转移酶在在混合物中各核苷酸序列片段的3’末端标记地高辛，然后采用杂交缓冲液稀释，即得。
9.根据权利要求8所述的用于检测巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：还包括清洗液；所述清洗液是由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、表面活性剂和水组成的混合溶液；混合溶液中，氯化钠的浓度为8g/L、氯化钾的浓度为0.2g/L、磷酸氢二钠浓度为1.44g/L、磷酸二氢钾的浓度为0.24g/L、Tween20的质量分数为0.05％；所述杂交缓冲液由水和甲酰胺、硫酸葡聚糖、氯化钠、柠檬酸和十二烷基硫酸钠组成，甲酰胺的体积百分含量为50％，硫酸葡聚糖的质量百分含量为10％，氯化钠的浓度为8.75g/L，柠檬酸的浓度为4.4g/L，十二烷基硫酸钠的质量百分含量为0.05％。
10.根据权利要求7或8或9所述的用于检测巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：还包括蛋白酶溶液、鼠抗地高辛抗体试剂、兔抗鼠抗体试剂、多聚HRP羊抗兔抗体试剂、显色底物、显色缓冲液、显色剂。
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