CN107541569A - 一种肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属分子生物学和医学领域，涉及一种检测肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交试剂盒，尤其是一种在慢性乙型肝炎患者肝活检组织切片中HBV DNA与cccDNA (共价闭合环状DNA)的原位杂交检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括靶向HBV负链DNA与cccDNA特异性区域互补探针及半抗原偶联的信号扩增寡核苷酸，其中，在与酶偶联的半抗原结合蛋白共孵育后，通过化学显色方法获得HBV DNA，cccDNA的组织内定位。本发明的检测试剂盒适用于慢性乙型肝炎患者肝内病毒学水平的评价与抗病毒疗效的评价；有助于临床医师获得对慢乙肝患者肝脏组织学与病毒学更完整的信息，并为慢乙肝个体化治疗提供数据支持。

Description

一种肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交检测试剂盒

技术领域

本发明属分子生物学和医学领域，涉及一种检测肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交试剂盒，尤其是一种在慢性乙型肝炎患者肝活检组织切片中HBV DNA与cccDNA (共价闭合环状DNA)的原位杂交检测试剂盒及检测方法，本发明的检测方法涉及在肝组织切片原位检测HBV DNA以及cccDNA的方法，该方法使得在显微镜下观察HBV DNA或cccDNA的组织内分布定位与强度成为可能。

背景技术

现有技术公开了慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个严重的全球健康问题，全球有2.4亿人感染。研究显示，HBV感染能引起慢性肝脏疾病并显著增加罹患肝细胞癌的风险；虽然已广泛使用乙肝表面抗原重组抗原疫苗预防感染，但实践显示，对于已经罹患慢性HBV感染者仍然缺乏完全治愈的方法。临床干预方案中，干扰素α与核苷类似物，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡维、替比夫定等仍是HBV感染的主要治疗药物。有研究报道，目前使用的抗病毒疗效虽然能有效抑制病毒的复制，压制血液中病毒载量，但对肝内共价闭合环状DNA(cccDNA)以及随之造成的乙肝表面抗原血症无能为力。目前学术界一致认为,cccDNA是乙肝难以治愈的分子基础，从而也是新一代抗病毒疗法的分子靶标。

尽管cccDNA在慢乙肝持续感染中的作用日益受到重视，然而对cccDNA的临床检测却长期受制于方法学。经典的cccDNA检测方法依赖于Southern blot杂交技术，该技术操作步骤复杂，且大多需要使用同位素标记探针，很难在临床研究中应用。此外，有研究者还开发了cccDNA特异性定量PCR技术，该方法随可较简便地对肝组织cccDNA进行定量，但该方法仍无法提供cccDNA在组织中的定位信息。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种检测肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交试剂盒，尤其是一种在慢性乙型肝炎患者肝活检组织切片中HBV DNA与cccDNA (共价闭合环状DNA)的原位杂交检测试剂盒及检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种简便易行的HBV cccDNA和总DNA的原位杂交试剂盒及检测方法，该方法可在普通临床病理学实验室开展，并获得满意的结果。

具体的，本发明基于原位杂交技术，提供了一种检测肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交试剂盒，尤其是一种在慢性乙型肝炎患者肝活检组织切片中HBV DNA与cccDNA(共价闭合环状DNA)的原位杂交检测试剂盒及检测方法；所述原位杂交技术是一种结合核酸特异性杂交原理与组织学技术的分子病理学方法，该方法使得在组织切片原位显示某种核酸的定位与相对丰度成为可能。

本发明提供了一种检测肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交试剂盒，该试剂盒含有针对HBV DNA负链序列和cccDNA 特异性序列的特异性核苷酸探针，和针对探针3’末端接头序列的半抗原偶联的互补寡核苷酸，以及针对半抗原的酶标记抗体和含有该酶的化学显色底物。

本发明中，所述的特异性核苷酸探针序列如 SEQ ID NO 1-20所示。

本发明中，所述的针对探针3’末端接头序列的半抗原偶联的互补寡核苷酸序列如SEQ ID NO 21所示。

序列表

Sequence number	full seq
		SEQ NO1	ctctaagagacagtcatcctaatcaaggacttattcgaggac
SEQ NO2	aatcggcagtcaggaagacaaatcaaggacttattcgaggac
		SEQ NO3	atattgacaacagtgccagcaatcaaggacttattcgaggac
SEQ NO4	caccacacggcagtcttttgaatcaaggacttattcgaggac
		SEQ NO5	aacaaggatcactggccagaaatcaaggacttattcgaggac
SEQ NO6	atccagattgggacttcaacaatcaaggacttattcgaggac
		SEQ NO7	gcattcggagccaactcaaaaatcaaggacttattcgaggac
SEQ NO8	caatcctctgggattctttcaatcaaggacttattcgaggac
		SEQ NO9	atggggacgaatctttctgtaatcaaggacttattcgaggac
SEQ NO10	tgggaacaagagctacagcaaatcaaggacttattcgaggac
		SEQ NO11	cttgagcaggaatcgtgcagaatcaaggacttattcgaggac
SEQ NO12	ttccgtccgaaggttttgaaaatcaaggacttattcgaggac
		SEQ NO13	gggatgggaatacaagtgcaaatcaaggacttattcgaggac
SEQ NO14	cccataggaatcttgcgaaaaatcaaggacttattcgaggac
		SEQ NO15	ccctacgaaccactgaacaaaatcaaggacttattcgaggac
SEQ NO16	ctgaaagccaaacagtggggaatcaaggacttattcgaggac
		SEQ NO17	ccaataccacatcatccataaatcaaggacttattcgaggac
SEQ NO18	agatgttgtacagacttggcaatcaaggacttattcgaggac
		SEQ NO19	ggtaacagcggtaaaaagggaatcaaggacttattcgaggac
SEQ NO20	cccaacgctttgttttattgaatcaaggacttattcgaggac
		SEQ NO21	GTCCTCGAATAAGTCCTTGA-Digoxigenin

本发明还提供了在慢性乙型肝炎患者肝活检组织切片中HBV DNA与cccDNA (共价闭合环状DNA)的原位杂交检测方法，其包括步骤：

1)将取得的待检肝组织固定，石蜡包埋，切片；

2)将上述切片进行二甲苯脱蜡、乙醇浸泡、逐步复水（rehydration）；

3)在抗原修复液中高温煮沸，并用蛋白酶进行有限消化；

4)使用核酸酶消化（cccDNA检测需要）；

5)使用特异性核苷酸探针混合物稀释于杂交缓冲液与肝组织切片进行杂交，

6)切片充分洗涤后，与含有针对探针3’末端接头序列的半抗原偶联的互补寡核苷酸杂交；

7)切片充分洗涤后，与针对半抗原的酶标记蛋白孵育；

8)切片充分洗涤后，通过化学显色方法获得HBV DNA与cccDNA的组织内定位；

9)切片洗涤，脱水与封片。

本发明检测方法的整个过程均在载有肝组织切片的玻璃载玻片上完成。

本发明检测方法中，所述的肝组织固定方法为： 将肝组织用10% 中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片；

本发明检测方法中，所述的肝组织切片脱蜡方法为： 将切片放置于100%二甲苯液体中，再放入梯度乙醇液体中复水，放入蒸馏水中；

本发明检测方法中，所述的抗原修复过程为：将切片浸泡于10mM柠檬酸钠缓冲液pH6.0中，将溶液加热至95℃ 20分钟；

本发明检测方法中，所述的蛋白酶消化方法为： 将蛋白酶K（20mg/ml）稀释1000倍于PBS中，将蛋白酶稀释液加到切片上，室温消化10分钟；

本发明检测方法中，所述的核酸酶消化方法为：将RNase A, RNase H 与plasmid safeDNase混合稀释于消化缓冲液中， 将酶稀释液加到切片上， 37℃处理1小时；

本发明检测方法中，所述的半抗原偶联的互补寡核苷酸可以是地高辛标记，也可以是生物素或二硝基酚标记；

本发明检测方法中，所述的针对半抗原的酶标记蛋白可以是针对地高辛的抗体，也可以是针对生物素的亲和素或链亲和素，或者抗二硝基酚抗体；所述酶标记可以是碱性磷酸酶也可以是辣根过氧化物酶。

本发明检测方法中，使用两步探针杂交方法，第一步使用一系列与特异区域核酸序列互补的寡核苷酸，该些寡核苷酸除了5‘端与特定区域有20个左右的互补序列外，在期3’端具有20个接头序列，用于与第二步探针结合；第二步使用与第一步3’末端互补的寡核苷酸序列，该序列在3‘末端标记有半抗原，如地高辛（Digoxingenin），生物素 (biotin)或二硝基酚(Dinitrophenol)。

本发明检测方法中，针对HBV DNA负链序列，或与cccDNA独有的，rcDNA不具有的缺口区正链DNA序列各设计了10条第一步探针，该些探针5“端有20个与靶序列互补的寡核苷酸序列，在其3‘端带有20个碱基的接头序列。

本发明对慢性乙型肝炎患者肝活检组织切片中HBV DNA与cccDNA (共价闭合环状DNA)的原位杂交进行了检测，该方法使得在组织切片原位显示某种核酸的定位与相对丰度成为可能，本发明试剂盒中的靶向HBV负链DNA与cccDNA特异性区域互补探针及半抗原偶联的信号扩增寡核苷酸，在与酶偶联的半抗原结合蛋白共孵育后，通过化学显色方法能获得HBV DNA，cccDNA的组织内定位，该检测试剂盒尤其适用于慢性乙型肝炎患者肝内病毒学水平的评价与抗病毒疗效的评价；有助于临床医师获得对慢乙肝患者肝脏组织学与病毒学更完整的信息，并为慢乙肝个体化治疗提供数据支持。

附图说明

图1.慢乙肝患者肝组织切片中HBV DNA原位杂交结果。

图2.慢乙肝患者肝组织切片中HBV cccDNA原位杂交结果。

图3.丙型肝炎，自身免疫性肝炎以及药物性肝炎患者肝组织切片使用HBV DNA或cccDNA探针原位杂交结果，其中，A,B 为丙型肝炎患者肝组织切片，C-D为自身免疫性肝炎患者肝组织切片， E,F为药物性肝炎患者肝组织切片， A，C，E使用HBV DNA探针杂交，B,D,F使用cccDNA探针杂交。

具体实施方式

实施例1：慢乙肝患者肝组织中HBV DNA 和cccDNA的原位杂交方法

检测对象为上海市公共卫生临床中心2014年4月-2015年3月期间90例慢性乙肝患者；入组病人中81.9%为e抗原阳性，平均病毒载量为7.05 log₁₀ 拷贝/毫升；所有病人均检测HBV表面抗原， e抗原 （雅培 AXSYM HBsAg (正常值: 0–2S/N) and HBe 2.0 MEIA Kit(正常值: 0–1.0S/CO)， 病毒载量通过定量PCR检测（凯杰生物）；

实验方法：

1）肝组织预处理

将源自慢性乙肝患者的肝组织放入10%甲醛的中性PBS缓冲液中固定2小时，梯度乙醇溶液脱水，从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水，各级乙醇中放置1小时，透明：通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯两次，各浸泡1小时；透腊： 使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理，纯石蜡处理2次，透蜡的时间15～30min，包埋框包埋；切片： 将石蜡包埋的肝组织用切片机切成4微米的薄片， 贴于APES硅化处理的载玻片上，60℃烘烤2小时；

2）切片的脱蜡、抗原修复与蛋白酶消化

将制得的肝组织切片常规脱蜡至水洗，浸泡于10mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中，将溶液加热至95℃ 20分钟抗原修复；修复完成后，将切片放入蒸馏水中洗涤一次，蛋白酶酶消化；将蛋白酶K（20mg/ml）稀释1000倍于PBS中，将蛋白酶稀释液加到切片上，室温消化10分钟，完成后将切片放入蒸馏水中洗涤两次，并用4%中性甲醛灭活5分钟；

3）切片的核酸酶消化（仅cccDNA检测需要此步骤）

将RNase A (20mg/ml), RNase H (5U/ul), plasmid safe DNase （10U/ul）各稀释100倍于plasmid safe DNase反应缓冲液中，将酶稀释液加与切片上，37℃消化1小时；消化完成后将切片放入蒸馏水中洗涤两次，并用4%中性甲醛灭活5分钟；

4）切片的第一步杂交

将HBV DNA负链DNA特异性探针SEQ ID NO 1-10， cccDNA特异性探针SEQ ID NO 11-20按相等的摩尔比例混合，将其稀释于杂交溶液（2X SSC, 10% dextran sulfate, 0.01%sheared salmon sperm DNA,0.02% SDS, 25% formamide）中,探针总体终浓度为5pmol/ml， 将杂交液加于切片上， 放上盖玻片，95℃变性10分钟后，降温到37℃杂交过夜；

5）切片的第二步杂交

将切片浸泡于洗涤液（2X SSC +0.1% Tween-20）中，彻底洗涤，每次30分钟，共三次；将第二步地高辛标记探针（SEQ NO 21）稀释于杂交溶液（2X SSC, 10% dextran sulfate,0.01% sheared salmon sperm DNA,0.02% SDS, 25% formamide）中,探针总体终浓度为5pmol/ml，将杂交液加于切片上，37℃杂交 2小时；

6）酶标记结合蛋白孵育

将切片浸泡于洗涤液（2X SSC +0.1% Tween-20）中，彻底洗涤，每次30分钟，共三次；将切片用封闭液（0.1M马来酸, 0.15M NaCl， pH 7.0 0.1% Tween-20， 5% FBS） 室温封闭1小时； 将碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体稀释与马来酸缓冲液（0.1M马来酸, 0.15MNaCl， pH 7.0 0.1% Tween-20）中，将稀释液加于切片上，室温孵育一小时，用马来酸缓冲液洗涤，每次20分钟，共三次；

7）显色，脱水封片。

将NBT-BCIP底物混合液（Roche）稀释100倍于显色缓冲液中（100mM Tris-HCl,100mM NaCl, 50mM MgCl₂ pH 9.5），定时观察显色情况，并适时终止反应，将切片用蒸馏水洗涤，使用核固红染液染色1分钟，用蒸馏水洗涤，常规方法脱水，封片。

实验结果显示，靶向HBV负链DNA与cccDNA特异性区域互补探针及半抗原偶联的信号扩增寡核苷酸，在与酶偶联的半抗原结合蛋白共孵育后，通过化学显色方法能获得HBVDNA，cccDNA的组织内定位。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市公共卫生临床中心

<120> 一种肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交检测试剂盒

<130> 20160623

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列 SEQ NO1

<400> 1

ctctaagaga cagtcatcct aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO2

<400> 2

aatcggcagt caggaagaca aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO3

<400> 3

atattgacaa cagtgccagc aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO4

<400> 4

caccacacgg cagtcttttg aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO5

<400> 5

aacaaggatc actggccaga aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO6

<400> 6

atccagattg ggacttcaac aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO7

<400> 7

gcattcggag ccaactcaaa aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO8

<400> 8

caatcctctg ggattctttc aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO9

<400> 9

atggggacga atctttctgt aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO10

<400> 10

tgggaacaag agctacagca aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO11

<400> 11

cttgagcagg aatcgtgcag aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO12

<400> 12

ttccgtccga aggttttgaa aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO13

<400> 13

gggatgggaa tacaagtgca aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO14

<400> 14

cccataggaa tcttgcgaaa aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO15

<400> 15

ccctacgaac cactgaacaa aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO16

<400> 16

ctgaaagcca aacagtgggg aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO17

<400> 17

ccaataccac atcatccata aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO18

<400> 18

agatgttgta cagacttggc aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO19

<400> 19

ggtaacagcg gtaaaaaggg aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 特异性核苷酸探针序列SEQ NO20

<400> 20

cccaacgctt tgttttattg aatcaaggac ttattcgagg ac 42

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 半抗原偶联的互补寡核苷酸序列SEQ NO21

<400> 21

gtcctcgaat aagtccttga 20

Claims (9)

1.一种检测肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有针对HBV DNA负链序列和cccDNA 特异性序列的特异性核苷酸探针，和针对探针3’末端接头序列的半抗原偶联的互补寡核苷酸，以及针对半抗原的酶标记抗体和含有该酶的化学显色底物。

2.按权利要求1所述的检测肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交试剂盒，其特征在于，所述的特异性核苷酸探针序列如 SEQ ID NO 1-20所示。

3.按权利要求1所述的检测肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交试剂盒，其特征在于，所述的针对探针3’末端接头序列的半抗原偶联的互补寡核苷酸序列如 SEQ ID NO 21所示。

4.一种检测肝组织中HBV DNA与cccDNA的原位杂交的方法，其特征在于，其包括步骤：

1)将取得的待检肝组织固定，石蜡包埋，切片；

2)将上述切片进行二甲苯脱蜡、乙醇浸泡、逐步复水（rehydration）；

3)在抗原修复液中高温煮沸，并用蛋白酶进行有限消化；

4)使用核酸酶消化；

5)使用特异性核苷酸探针混合物稀释于杂交缓冲液与肝组织切片进行杂交，

6)切片充分洗涤后，与含有针对探针3’末端接头序列的半抗原偶联的互补寡核苷酸杂交；

7)切片充分洗涤后，与针对半抗原的酶标记蛋白孵育；

8)切片充分洗涤后，通过化学显色方法获得HBV DNA与cccDNA的组织内定位；

9)切片洗涤，脱水与封片。

5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的核酸酶消化方法为：将RNase A,RNase H 与plasmid safe DNase混合稀释于消化缓冲液中， 将酶稀释液加到切片上， 37℃处理1小时。

6.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的半抗原偶联的互补寡核苷酸是地高辛标记，或是生物素或二硝基酚标记。

7.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的针对半抗原的酶标记蛋白是针对地高辛的抗体，或是针对生物素的亲和素或链亲和素，或者抗二硝基酚抗体；所述酶标记是碱性磷酸酶或是辣根过氧化物酶。

8.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法中，使用两步探针杂交方法，第一步使用一系列与特异区域核酸序列互补的寡核苷酸，该些寡核苷酸除了5‘端与特定区域有20个左右的互补序列外，在期3’端具有20个接头序列，用于与第二步探针结合；第二步使用与第一步3’末端互补的寡核苷酸序列，该序列在3‘末端标记有半抗原。

9.按权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法中，针对HBV DNA负链序列，或与cccDNA独有的，rcDNA不具有的缺口区正链DNA序列各设计10条第一步探针，该些探针5“端有20个与靶序列互补的寡核苷酸序列，在其3‘端带有20个碱基的接头序列。