WO2021027866A1 - 用于黄瓜幼苗基因定位研究的rna原位杂交优化方法 - Google Patents

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张文娜
胡茜
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Definitions

  • the second hybridization incubation method sequentially includes the following steps: DIG-AP antibody hybridization incubation ⁇ remove the cover slip in Buffer 4 solution and place on a clean staining rack ⁇ shake in Buffer 4 solution Bed 15min ⁇ Buffer 4 solution shaker 15min ⁇ Buffer 4 solution shaker 15min ⁇ Buffer 4 solution shaker 15min ⁇ Buffer 5 solution shaker 5min ⁇ Buffer 5 solution shaker 5min.
  • step 6 after the second hybridization incubation, it further includes the step of mounting RNA hybridization solution;
  • the method for mounting the RNA hybridization solution includes the following steps: using a pipette to suck the antibody-containing RNA hybridization solution Drop it on the left end of the hybridized section sample, then lightly press the left end of the cover glass and hold it with your left hand to make the cover glass fit the RNA hybridization solution containing antibody, hold the other end of the cover glass with your right hand and slowly put it down, the RNA containing antibody hybridizes The liquid is slowly pushed away with the cover glass, and the moving speed of the cover glass is slower than that of the RNA hybridization liquid containing the antibody; the RNA hybridization liquid containing the antibody is composed of a primary antibody hybridization liquid and a secondary antibody hybridization liquid; The dosage of the primary antibody hybridization mixture is 135 ⁇ l/tablet, and the dosage of the secondary antibody hybridization mixture is 100 ⁇ l/tablet.
  • the DIG-AP antibody solution Dilute the DIG-AP antibody (Roche, #11093274901) 1250 times with Buffer 4 solution, that is, add 8 ⁇ l DIG-AP antibody to 10ml Buffer 4 solution, according to the dosage of 200 ⁇ l DIG-AP antibody solution per sheet Calculate the total amount of configuration required.
  • the stems of cucumber seedlings with a length of 3 to 4 cm and root fragments containing lateral roots with a length of 3 to 4 cm were respectively cut from cucumber seedlings on ice as tissue samples, as shown in FIG. 2.
  • microtome Turn on the microtome, return the sample head to its original position, and set the slice thickness to 10 ⁇ m; then load the sample that is successfully trimmed, adjust the position of the blade to form a section with the sample; then turn the microtome and use a brush to assist in pushing away the paraffin sections formed into strips , To prevent the samples from sticking together into a group.
  • Buffer 3 solution Prepared with 1 ⁇ TBS buffer solution preheated to 60°C, add 1g skimmed milk powder (Roche, #11096176001) to 100ml 1 ⁇ TBS buffer solution, and continue heating at 60°C on a magnetic stirrer to ensure that the skimmed milk powder is fully dissolved.
  • DIG-AP antibody hybridization incubation is as follows: each slide is washed with 100 ⁇ l DIG-AP antibody solution, then mounted with 100 ⁇ l DIG-AP antibody solution, and finally put into the immunohistochemistry with Buffer 4 solution Incubate for 2h at room temperature in a humid box.
  • the CsNPF7.2 fluorescent quantitative PCR CQ value of the target gene CsNPF7.2 of the cucumber roots cultivated for 15 days is 30.49 (the CQ value of the internal reference gene ACTIN fluorescent quantitative PCR is 14.38), it is the target gene with general expression abundance, so after the color reaction 10h The first microscopic examination was performed, and the second microscopic examination was performed 8 hours later.

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Abstract

本发明提供了一种用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法，其中首先根据黄瓜幼苗植株材料特性，改进植物培养、取样和固定的方法，从而获得含目标组织的完整植物结构；其次，针对性优化切片准备、杂交预处理、杂交孵育封片和显色反应镜检等操作手法，从而提高基因定位结果的可靠性、准确性和特异性；最后，针对性设计适合黄瓜幼苗成熟组织的显色反应终止后的处理方案，以便排除细胞内含物的干扰，直接观察杂交信号的分布。

Description

[根据细则37.2由ISA制定的发明名称]　用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法 技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)是我国的主要蔬菜作物，也是重要的经济作物。根据世界粮农组织(FAO)统计数据显示1961年中国黄瓜年产量就占全世界黄瓜年产量的48.3％，而在2017年这一比例已经达到了77.5％，中国是世界上最主要的黄瓜栽培地。因此，研究黄瓜生理栽培机制与基因功能特征对现代化农业的建设，栽培管理模式的进步以及优质新品种的选育具有重要意义。随着基因组学、生物信息学的进步，黄瓜的全基因组信息终于在2009年得到破译(Huang,Sanwen et al.2009.“The Genome of the Cucumber,Cucumis Sativus L.”Nature genetics41(12):1275.)，然而这些被破译的核苷酸序列，大部分都是注释信息缺失的新基因。一方面，公开的全基因组信息为黄瓜的分子机理研究提供了极大的便利；另一方面，由于黄瓜遗传转化率低，从众多候选基因中快速筛选出关键性基因也变成新的挑战。
基因的功能与定位密切相关。黄瓜属于多细胞类型的生物，由不同分化类型的细胞构成多种组织、器官，不同的组织部位承担着不同的生理功能，相同的组织内表达的基因之间很有可能承担着相似或有联系的功能。例如，植物根毛的表皮细胞，主要负责从土壤中吸收水分和矿质营养；植物维管束组织，负责运输植物生长发育所需的营养物质和代谢物质。因此，研究基因定位对基因功能研究以及筛选关键性基因具有指导意义。
目前主流的植物组织水平基因定位研究方法包括原位杂交法、GUS组织化学定位法和GFP荧光标记定位法。然而，黄瓜的遗传转化效率尚低，三种方法中只有原位杂交法不需要构建黄瓜转基因干扰株系，因此更适用现阶段黄瓜组织水平的基因定位研究。原位杂交技术起源于上世纪中叶，而应用于植物组织基因定位的RNA原位杂交方法主要基于Dave Jackson和Cox Kathleen H的报道(JACKSON and DAVID.1991.“In Situ Hybridization in Plants.”In Molecular Plant Pathology:A Practical Approach,Oxford University Press.；Meyerowitz and Elliot M.1987.“In Situ Hybridization to RNA in Plant Tissue.”Plant Molecular Biology Reporter 5(1):242–50.)。该套体系的基本原理是使用与mRNA互补的DIG(地高辛)-反义探针杂交，然后添加可与DIG偶联的AP(碱性磷酸酶)作为二抗，AP会与两种显色底物NBT(四唑氮蓝)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐)发生显色反应出现紫红色。不同的植物材料具有不同的特性，特别是植物成熟组织与分生组织的植物材料在原位杂交技术的应用方面，差异较大。Dave Jackson和Cox Kathleen H的试验方法更适用于植物 分生组织的研究。近年来，也有一些针对植物优化的原位杂交体系(“In Situ Hybridization Protocol(for Plant Roots)–Benfey Lab.”2019.https://sites.duke.edu/benfey/protocols/in-situ-hybridization-protocol-for-plant-roots/(June 5,2019).；程珂,陈炯炯,鄢文豪,欧阳亦聃.2018.“RNA原位杂交.”Bio-protocol:e1010119.https://doi.org/10.21769/BioProtoc.1010119.)，但这些原位杂交体系均不能直接适用于黄瓜幼苗成熟组织的基因定位研究。
目前已有的应用于植物的原位杂交技术体系，适用于植物的分生组织(例如，叶芽发育、雌雄蕊分化、胚胎或胚珠发育等)，同时适用于大部分植物的成熟组织(例如苹果幼苗的根)，这些植物材料都较为粗壮，它们或者遇到固定液之后变硬，或者本身木质化程度较高。黄瓜幼苗的根茎等部位过于幼嫩，成熟组织的杂交分子信号与分生组织不同，直接应用现有体系时出现以下问题：
(1)植物材料培养：传统草炭蛭石和珍珠岩配方的基质栽培黄瓜幼苗根系，会粘附许多难以清除的基质杂质，然而暴力冲洗不仅无法完全除掉杂质，还会破坏黄瓜根系的组织结构；
(2)基因探针制备：传统体系用目标基因cDNA的片段连接pGEMT或pGEMTeasy，然后通过回收酶切线性载体产物获取体外转录模版，然而这样的方法不仅增加经济成本，而且模版的产率直接受到连接效率与酶切效率的影响；
(3)植物材料取样与固定：黄瓜幼苗的茎和根系非常幼嫩，密度较低，抽真空难以沉淀。传统的切样模式、固定液配方、梯度乙醇脱水体系和石蜡包埋方式并不适用，导致组织皱缩、破损，结构不完整(如图1A所示)；
(4)杂交切片的准备：传统体系并未针对此步骤进行优化，而此步骤对于后期黄瓜幼苗成熟组织的原位杂交结果具有重要影响；
(5)杂交预处理：传统体系对此步骤处理过的样本保存未进行优化，并且此阶段多种试剂溶液多次使用、消耗较大；
(6)杂交孵育封片：传统体系并未针对此步骤进行优化，而此步骤的技术手法对于黄瓜幼苗成熟组织的基因定位结果的准确性具有直接的影响；
(7)显色反应镜检：传统体系并未针对此步骤进行优化，而此步骤对于基因在黄瓜幼苗成熟组织定位的特异性具有直接影响；
(8)反应终止后处理：传统体系要求TE缓冲液终止显色反应，然后用二甲苯和乙醇梯度漂洗，或者清水终止反应后直接拍照，而黄瓜幼苗成熟组织的杂交分子信号成“点”分布，与分生组织成“面”分布的杂交分子信号不同，因此杂交信号即会受到大量细胞内含物的干扰而看不清(黄瓜幼苗成熟组织的细胞中含有丰富的内含物杂质，它们几乎不溶于水、乙醇、二甲苯，显微镜下像黑色的杂质严重干扰了杂交信号)，同时也会容易被乙醇或二甲苯漂洗直接脱色(如图1C所示)。
基于以上问题，亟需一套新的适用于黄瓜幼苗成熟组织的原位杂交优化方 案，解决现有体系应用时黄瓜幼苗材料来源、取样、固定、探针制备、杂交过程与杂交显色终止后处理等步骤中存在的技术不足。
发明公开
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法。
本发明提供的用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法包括如下步骤：
步骤1、试验材料的培养
采用组培、水培、沙培或土培的方式将黄瓜种子培养得到黄瓜幼苗；所述土培为采用细土培养；
步骤2、试验材料的取样与固定
从所述黄瓜幼苗上取部分组织作为植物样品；然后将所述植物样品进行包埋，得到包埋样品；
步骤3、目标基因探针的制备
根据目标基因的mRNA序列长度，选取GG起始且GC含量为40％～70％的目标基因片段作为转录模版；将含有启动子的转录模版进行体外转录，得到目标基因反义探针；所述目标基因反义探针与目标基因的mRNA序列互补且带有标记物；
步骤4、杂交切片的准备
将所述包埋样品制成石蜡切片，并对所述石蜡切片依次进行筛选、摊片、烘片，得到杂交切片；
步骤5、杂交预处理
对所述杂交切片进行脱蜡、脱色，对包裹靶分子的蛋白质进行处理，使靶分子充分暴露出来，得到杂交预处理后切片；
步骤6、杂交孵育封片
对所述杂交预处理后切片先使用一抗进行第一次杂交孵育，然后使用二抗进行第二次杂交孵育，最后使用含抗体的RNA杂交液进行封片，得到杂交孵育后切片；所述一抗是所述目标基因反义探针，所述二抗是可特异性结合所述目标基因反义探针带有的标记物的物质与碱性磷酸酶(AP)的偶联物；
步骤7、显色反应与镜检
将所述杂交孵育后切片进行显色反应与镜检；
所述镜检时尽量避光，将对粘的载玻片置于NBT/BCIP显色底物缓冲液中分开，用NBT/BCIP显色底物缓冲液制作临时装片，然后置于显微镜下检查杂交信号，若观察到清晰的杂交信号分子，终止显色反应；否则，用NBT/BCIP显色底物缓冲液重新冲洗样品，然后将两片载玻片重新对粘并放回容器(考普林杯)中继续反应；
步骤8、显色反应终止与封片
对于观察到杂交信号的组织样本，先用清水终止显色反应，然后置于室温晾干后用中性树脂和二甲苯的混合液进行封片。
上述方法中，步骤1中，所述黄瓜幼苗的地上部组织材料对培养条件无特殊要求，地下部组织材料的培养方式可为组培、水培、沙培或土培。
在本发明的一个具体实施例中，所述培养方式为组培。所述组培的具体步骤如下：选择大小、形态和重量一致的黄瓜种子，首先用蒸馏水(55℃～60℃)浸泡30min；然后将浸泡后的种子用小镊子剥去黄瓜种皮(尽量避免镊子接触种子的生长点)；再依次用75％酒精消毒30s，灭菌水清洗3次，2.5％次氯酸钠消毒10min，灭菌水清洗3次，得到处理后种子；最后将处理后的种子放在MS固体培养基上转入培养箱进行培养，培养条件如下：第一阶段28℃暗培养24h。第二阶段光周期12h、白天28℃/晚上18℃培养13天。
上述方法中，步骤2中，所述部分组织来源于黄瓜幼苗的成熟组织和/或分生组织，如黄瓜幼苗的根和/或茎。
进一步的，所述部分组织的长度优选为3～4cm。
更进一步的，所述部分组织为3～4cm的黄瓜幼苗的茎或3～4cm的包含侧根的根系片段。
上述方法中，步骤2中，所述包埋的方法包括如下步骤：
1)植物样品固定
将所述植物样品放入预冷的FAA固定液，真空泵抽真空18～20min，然后缓慢进气至恢复大气压，更换新的FAA固定液并于4℃水平摇床摇晃过夜；
2)乙醇梯度脱水
在4℃水平摇床中，将步骤1)得到的植物样品依次在浓度梯度为50％、70％、85％、95％、100％、100％、100％的乙醇溶液中进行脱水，每个梯度的乙醇溶液都添加1-2耳匙的曙红染色剂，直到植物样品被染成粉红色，每个溶液的脱水时间为35min，最后一个100％乙醇溶液过夜；
3)二甲苯置换乙醇
在常温水平摇床中，将步骤2)得到的植物样品依次在100％乙醇、50％乙醇+50％二甲苯(50％乙醇和50％二甲苯体积比为1:1)、100％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯溶液中进行置换，每个溶液的置换时间为30min，最后一个100％二甲苯溶液过夜；
4)石蜡置换二甲苯
在60℃的恒温箱中，用融化干净的石蜡置换步骤3)得到的植物样品中的二甲苯，重复4天，每天1次；
5)石蜡包埋
在RNA酶清除剂处理过的超净台中，首先将包埋盒(普通无酶的方形塑料培养皿)置于冰上，添加1cm厚度的石蜡融液，然后迅速摆放步骤4)得到的植物样品于其中，再用火焰灼热的金属镊子赶走植物样品周围的气泡，使石蜡与 植物样品充分接触，融为一体，最后石蜡凝固后得到包埋样品。
进一步的，步骤1)中，所述FAA固定液由无水乙醇、37％甲醛、冰醋酸和RNase-free水组成。
更进一步的，所述无水乙醇、所述37％甲醛、所述冰醋酸和所述RNase-free水的体积比为6:2:1:11。
上述方法中，步骤2中，所述包埋后还包括对所述包埋样品进行修块切分的步骤；所述修块切分为将所述包埋样品切成体积尺寸为0.5mm×0.5mm×0.5mm的包含植物样品的蜡块。
上述方法中，步骤3中，所述转录模版可直接合成或利用含启动子序列的引物和高保真PCR酶扩增获得。
进一步的，所述目标基因探针还包括目标基因正义探针(阴性对照)。所述目标基因正义探针与目标基因的mRNA序列相同且带有标记物。
再进一步的，所述启动子可为T7启动子或Sp6启动子；所述标记物可为同位素标记物或非同位素标记物；所述非同位素标记物可为地高辛、生物素或荧光素。
更进一步的，所述目标基因为CsNPF7.2基因。所述标记物为地高辛。
所述转录模版为以试验材料的cDNA为模板利用含启动子序列的引物和高保真PCR酶扩增获得。其中，目标基因正义探针连接的启动子为T7启动子，目标基因反义探针连接的启动子为Sp6启动子。所述目标基因正义探针和所述目标基因反义探针与启动子的连接方向相反。
上述方法中，步骤3中，所述目标基因探针还包括纯化的步骤。
进一步的，所述纯化的方法可为醇沉淀法；所述醇沉淀时间至少为3h。
更进一步的，所述纯化的方法包括如下步骤：首先向反应完成的体外转录产物中依次加入75μl RNase-free水，1μl 100mg/ml tRNA，1μl DNaseⅠ，37℃保温30min，用于去除DNA；然后用无水乙醇沉淀法回收RNA产物，依次加入等体积预冷的4M NH 4Ac和2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，放置于-20℃冰箱3～6h；4℃、14000rpm离心10min，弃上清，得到沉淀；沉淀用600μl70％乙醇漂洗，4℃、14000rpm离心7min，弃上清，再瞬离吸取上清后等待沉淀晾干；加入100μl RNase-free水重悬沉淀，再加入碳酸盐缓冲液，60℃保温50min进行水解，水解完成后，再次使用无水乙醇沉淀法回收RNA产物；最后加入40μl50％甲酰胺溶解沉淀，得到纯化后的探针溶液。
上述方法中，步骤4中，所述石蜡切片的厚度为10～12μm，具体可为10μm。
上述方法中，步骤4中，将所述包埋样品制成石蜡切片的过程中还包括及时检查并清理刀片上的蜡渍，避免划痕导致的样品碎裂的步骤。
上述方法中，步骤4中，所述将所述包埋样品制成石蜡切片的过程中还包括用毛笔辅助推开形成条的石蜡切片，防止样品粘在一起成团的步骤。
上述方法中，步骤4中，所述筛选、摊片、烘片的方法包括如下步骤：用 显微镜从石蜡切片中初步筛选组织完整、无破损且含有目标组织结构的切片，然后平放于37℃RNase-free水浴中进行摊片，待石蜡切片软化后完全摊开，颜色由白变为近乎透明，再用毛笔轻轻拖起摊在载玻片上，并用毛笔轻压样品赶走气泡，最后用吸水纸轻压吸去水分后进行烘片(42℃过夜)，得到杂交切片。
上述方法中，步骤5中，所述杂交预处理的方法依次包括如下步骤：将所述杂交切片依次置于如下溶液中进行杂交预处理：二甲苯溶液中浸泡10min→二甲苯溶液中浸泡10min→50％二甲苯溶液+50％乙醇溶液(50％二甲苯溶液和50％乙醇溶液体积比为1:1)中浸泡5min→100％乙醇溶液中浸泡1min→100％乙醇溶液中浸泡1min→95％乙醇溶液中浸泡30s→85％乙醇溶液中浸泡30s→70％乙醇溶液中浸泡30s→50％乙醇溶液中浸泡30s→0.85％NaCl溶液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→蛋白酶K溶液中37℃反应30min→0.2％甘氨酸溶液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→4％甲醛溶液中浸泡10min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→乙酸酐溶液中浸泡10min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→0.85％NaCl溶液中浸泡2min→50％乙醇溶液中浸泡30s→70％乙醇溶液中浸泡30s→85％乙醇溶液中浸泡30s→95％乙醇溶液中浸泡30s→100％乙醇溶液中浸泡1min→100％乙醇溶液中浸泡1min，杂交预处理结束。
所述蛋白酶K溶液：由RNase-free水配置，三种溶液底物工作浓度分别为100mM Tris(pH8.0)、50mM EDTA、1μg/ml proteinaseK(Sigma，#p2308)。根据购买的相关母液计算稀释比例依次添加，提前一晚37℃预热，用时再加proteinaseK。
所述0.2％甘氨酸溶液：由RNase-free PBS缓冲液(由RNase-free水配置的PBS缓冲液)配置，100ml PBS缓冲液添加0.2g甘氨酸。
所述4％甲醛溶液：由RNase-free水、高浓度PBS缓冲液和37％甲醛配置，稀释后溶液底物工作浓度分别为4％甲醛，1×PBS。
所述乙酸酐溶液：由RNase-free水配置，溶液底物工作浓度分别为0.1M三乙醇胺、0.5％NaCl、48mM HCl(浓盐酸配置)、0.025％乙酸酐，临用前再加乙酸酐，充分搅拌混合。
上述方法中，步骤5还包括将得到的杂交切片样品置于底部添加少量无水乙醇的封口膜密封的染色缸内的染色架上的步骤。
上述方法中，步骤6中，所述第一次杂交孵育包括如下步骤：首先将杂交切片样品(从染色架移至玻片板上)于室温晾干5-10min，至杂交切片样品呈纯白色，同时将稀释后探针溶液80℃变性2min，立即置于冰上2-3min，瞬离30s；然后按照120μl/片的用量加入RNA杂交液，混匀(用枪头吸打)，在免疫组化湿盒中加入2×SSC/50％甲酰胺溶液覆盖整个湿盒底；再在每张载玻片上加入杂交混合液135μl，待液体完全覆盖样品后盖上盖玻片，并放入免疫组化湿盒中； 最后，待所有载玻片全部放入免疫组化湿盒后，将免疫组化湿盒密封(用胶带)，置于50～55℃保温箱过夜；
所述杂交混合液是由稀释后探针溶液和RNA杂交液混匀得到的；所述稀释后探针溶液和所述RNA杂交液的体积比为1:4。
所述稀释后探针溶液由目标基因探针溶液(即上文中的纯化后的探针溶液)和50％甲酰胺溶液组成；所述目标基因探针溶液与所述50％甲酰胺溶液的体积比为1:14。
所述RNA杂交液：1ml RNA杂交液添加的底物用量分别为500μl 100％甲酰胺、200μl 50％硫酸葡聚糖、170μl RNase-free水、100μl 10×Salts、20μl 50×denhardt's、10μl 100mg/ml tRNA。其中，硫酸葡聚糖粘稠，移液枪吸用速度不宜过快，并且充分吹打混匀。
所述2×SSC/50％甲酰胺：由RNase-free水、20×SSC缓冲液和100％甲酰胺配置，稀释后溶液底物工作浓度分别为2×SSC，50％甲酰胺。
上述方法中，步骤6中，在使用一抗进行杂交孵育后，使用二抗进行杂交孵育前还包括如下步骤：将使用一抗进行杂交孵育后的样品在55℃预热的Buffer 1溶液中去掉盖玻片，然后依次在如下溶液中进行处理：Buffer 1溶液中55℃反应1h→Buffer 1溶液中55℃反应1h→Buffer 2溶液中37℃反应5min→Buffer 2溶液中37℃反应5min→含有RNaseA的Buffer 2溶液(由100mg RNaseA和500ml Buffer 2溶液组成)中37℃反应30min→Buffer 2溶液中37℃反应5min→Buffer 2溶液中37℃反应5min→Buffer 1溶液中55℃反应1h→TBS缓冲液中摇床5min→Buffer 3溶液中摇床1h→Buffer 4溶液中摇床45min。
上述方法中，步骤6中，所述二抗(可特异性结合所述目标基因反义探针带有的标记物的物质与碱性磷酸酶的偶联物)为DIG-AP抗体(连接有碱性磷酸酶的地高辛抗体)。
上述方法中，步骤6中，所述第二次杂交孵育的方法依次包括如下步骤：DIG-AP抗体杂交孵育→在Buffer 4溶液中去盖玻片后放置干净染色架上→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer 5溶液中摇床5min→Buffer 5溶液中摇床5min。
进一步的，所述DIG-AP抗体杂交孵育的方法包括如下步骤：每张载玻片先用100μl DIG-AP抗体溶液进行冲洗，然后用100μl DIG-AP抗体溶液进行封片，最后放入加入Buffer 4溶液的免疫组化湿盒中室温孵育2h。
上述方法中，步骤6中，所述第二次杂交孵育后还包括RNA杂交液封片的步骤；所述RNA杂交液封片的方法包括如下步骤：使用移液枪吸取含抗体的RNA杂交液滴于杂交切片样品的左端，然后轻压盖玻片左端并用左手按住，使盖玻片贴合含抗体的RNA杂交液，右手握住盖玻片另一端缓缓放下，含抗体的RNA 杂交液随着盖玻片被缓缓推开，盖玻片移动速度要缓于含抗体的RNA杂交液；所述含抗体的RNA杂交液由一抗杂交混合液和二抗杂交混合液组成；所述一抗杂交混合液的用量为135μl/片，二抗杂交混合液的用量为100μl/片。
所述Buffer 1溶液：0.2×SSC缓冲液(由蒸馏水稀释20×SSC缓冲液得到)。
所述Buffer 2溶液：由蒸馏水配置，三种溶液底物工作浓度分别为0.5mM NaCl、10mM Tris·HCl(pH7.5)、1mM EDTA，
所述Buffer 3溶液：由预热至60℃的1×TBS缓冲液配置，100ml 1×TBS缓冲液添加1g脱脂奶粉(Roche，#11096176001)，在磁力搅拌器上60℃持续加热保证脱脂奶粉充分溶解。
所述Buffer 4溶液：由TBS缓冲液和蒸馏水配置，溶液底物工作浓度分别为1×TBS、1％BSA(Sigma，#sre0096)、0.3％Triton X-100(Sigma，#t8787)，根据需求配置适当用量，在磁力搅拌器上常温搅拌使之充分混匀。
所述Buffer 5溶液：由蒸馏水配置，溶液底物工作浓度分别为0.1M Tris·HCl(pH9.5)、100mM NaCl、50mM MgCl 2，根据需求配置用量，充分混匀。
所述DIG-AP抗体溶液：用Buffer 4溶液稀释DIG-AP抗体(Roche，#11093274901)1250倍，即10ml Buffer 4溶液添加8μl DIG-AP抗体，根据每张片子200μl DIG-AP抗体溶液的用量计算所需配置总量。
所述一抗杂交混合液：由20μl的稀释后探针溶液(一抗)和80μl RNA杂交液配置而成。
所述二抗杂交混合液：由8μl的DIG-AP抗体溶液(二抗)和10ml的RNA杂交液配置而成。
上述方法中，步骤7中，所述将杂交孵育后切片进行显色反应的方法包括如下步骤：在避光环境中，用120μl NBT/BCIP显色底物溶液冲洗所述杂交孵育后切片(封片后的杂交切片样品)并将载玻片两两之间对贴在一起，转入底部加有1～2ml NBT/BCIP显色底物溶液的容器(考普林杯)中，密封(用锡箔纸包裹)后放置于黑暗环境中，室温下进行显色反应。
进一步的，所述NBT/BCIP显色底物缓冲液由Buffer 5溶液配置，两种显色底物工作浓度分别为：225μg/ml NBT、175μg/ml BCIP。
上述方法中，步骤7中，对于特殊时期相对表达丰度较高的目标基因(如目标基因的荧光定量PCR的CQ值为15≤CQ＜25，内参基因CQ值为15。此处仅为参考值，用于预判镜检开始时间，实际情况可根据此参考值进一步预估)，优选在显色反应开始6h内进行一次镜检查看杂交信号；对于相对表达丰度一般的目标基因(如目标基因的荧光定量PCR的CQ值为25≤CQ≤30，内参基因CQ值为15。此处仅为参考值，用于预判镜检开始时间，实际情况可根据此参考值进一步预估)，优选在第二天开始，每天上午、下午或晚上各进行一天2次的镜检。目标基因的CQ值越小，越早进行第一次镜检。镜检次数与时间间隔根据实验显色情况而定。在本发明的一个具体实施例中，所述目标基因CsNPF7.2荧 光定量PCR的CQ值为30.49，内参基因ACTIN荧光定量PCR的CQ值为14.38，显色反应10h后第一次镜检，8h后第二次镜检。
上述方法中，步骤8中，所述中性树脂和二甲苯的混合液为中性树脂和二甲苯按照体积比为1:1的比例混匀后得到的溶液。每张载玻片用90μl所述中性树脂和二甲苯的混合液进行封片。
上述任一所述方法中，所述箭头“→”前后溶液的处理方法表示用箭头“→”前溶液处理后更换为箭头“→”后溶液进行处理。
为了实现上述目的，本发明还提供了用于黄瓜幼苗基因定位的成套试剂。
本发明提供的用于黄瓜幼苗基因定位的成套试剂包括上述FAA固定液。
进一步的，所述成套试剂还包括不同浓度的乙醇溶液、二甲苯溶液、石蜡、目标基因探针溶液、0.85％NaCl溶液、PBS缓冲液、蛋白酶K溶液、0.2％甘氨酸溶液、4％甲醛溶液、乙酸酐溶液、2×SSC/50％甲酰胺溶液、50％甲酰胺溶液、RNA杂交液、Buffer 1溶液、Buffer 2溶液、Buffer 3溶液、Buffer 4溶液、Buffer 5溶液、DIG-AP抗体溶液、NBT/BCIP显色底物溶液。
更进一步的，所述不同浓度的乙醇溶液为如下浓度：50％、70％、85％、95％、100％的乙醇溶液。
所述目标基因探针溶液包括目标基因正义探针溶液和目标基因反义探针溶液。
上述方法或成套试剂在研究黄瓜幼苗基因功能中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述方法或成套试剂或应用中，所述黄瓜的品种为‘新泰密刺’黄瓜。
本发明优化后的原位杂交技术的有益效果：
1、本发明优化后的原位杂交技术提高了实验结果的灵敏性和准确性：实验过程中多次物理伤害情况下仍然获得了具有完整组织结构的实验材料切片，并且大幅度降低了成熟细胞内含物等杂信号干扰，获得了较为干净的背景，基因定位清晰(图1和图8)。
2、本发明优化后的原位杂交技术通过提高药品利用率、减少实验用品消耗、增加反应产物产率、节省劳动成本等方法降低了实验体系的经济成本：优化后的实验步骤，使部分药品重复利用，通过显微镜提前检查初步筛掉一些非目标的组织结构，增加每载玻片上组织切片数量，优化的摊片及后期杂交液封片方法及取样方法等使复杂的原位杂交体系建立起按照实验先后顺序的系列质量控制，提高结果准确率的同时也减少了无意义的实验重复，并降低了实验成本损耗。
附图说明
图1为现有原位杂交技术体系与本发明技术体系对比。其中，A为现有原位杂交技术体系固定黄瓜幼苗根系组织皱缩，结果不完整；B为本发明原位杂交技 术体系应用于黄瓜幼苗根系组织结构完整，细胞轮廓清晰；C为现有原位杂交技术体系细胞内含物干扰杂交信号；D为本发明原位杂交技术体系应用于黄瓜幼苗成熟组织，杂交信号清晰可见(白色三角形指向杂交信号)。现有原位杂交技术体系可参考文献“Goodrich,Justin.(2002).Arabidopsis:A Laboratory Manual.D.WEIGEL&J.GLAZEBROOK.Genetics Research-GENET RES.80.10.1017/S0016672302215852.”和“Wu MF.,Wagner D.(2012)RNA In Situ Hybridization in Arabidopsis.In:Jin H.,Gassmann W.(eds)RNA Abundance Analysis.Methods in Molecular Biology(Methods and Protocols),vol 883.Humana Press,Totowa,NJ”中的方法。
图2为本发明黄瓜幼苗根系组织取样示意图。
图3为本发明目标基因探针设计原理图。
图4为本发明摊片技术要点示意图。
图5为本发明原位杂交技术体系杂交预处理示意图。
图6为本发明杂交孵育封片技术要点示意图。
图7为本发明原位杂交技术体系杂交后处理示意图。
图8为CsNPF7.2基因在黄瓜幼茎中的定位结果示意图。
实施发明的最佳方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法及其应用
一、用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法
1、试验材料的培养
试验材料与黄瓜幼苗地上部组织材料的培养条件无特殊要求，与地下部组织材料的质量和培养方式相关，组培、水培、沙培和土培(细土)都不会使幼苗根系表皮黏附难以清除的杂质，是优选的培养方法。
2、试验材料的取样与固定
1)试验材料的取样
黄瓜幼苗的茎木质化程度低，根细小、柔软，组织取样优选切取长度为3～4cm的成熟组织和/或分生组织。
2)试验材料的包埋
固定液浸泡：取下的植物材料迅速放入预冷的FAA固定液(改进配方：30ml无水乙醇，10ml 37％甲醛，5ml冰醋酸，55ml RNase-free水)，真空泵抽真空18～20min，然后缓慢进气至恢复大气压，更换新的FAA固定液并于4℃水平摇床摇晃过夜，样品可在4℃短期保存1周。
乙醇梯度脱水：在4℃水平摇床中，依次用低浓度到高浓度的乙醇溶液进行脱水，乙醇浓度梯度为50％、70％、85％、95％、100％、100％、100％(由RNase-free 水配制而成)，每个梯度都添加少量的曙红染色剂(用来在切片时区分石蜡与样品)，直到植物样品被染成粉红色，每个梯度的脱水时间改进为35min，最后一个100％乙醇梯度过夜。
二甲苯置换乙醇：在常温水平摇床中，依次为100％乙醇、50％乙醇/50％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯，每个溶液的置换时间为30min，最后一个100％二甲苯过夜。
石蜡置换二甲苯：在60℃的恒温箱中，直接用提前融化干净的石蜡置换二甲苯，重复4天，每天1次。
样品包埋：在RNA酶清除剂处理过的超净台中，将普通无酶的方形塑料培养皿用作包埋盒置于冰上，添加约1cm厚度干净的石蜡融液，然后迅速摆放样品于其中，再用火焰灼热的金属镊子赶走样品周围的气泡，使石蜡与样品充分接触，融为一体，最后石蜡凝固后，得到包埋样品，置于-20℃冰箱保存。
3、目标基因的探针制备
如图3所示，探针的转录模版由模版片段和T7/Sp6启动子序列两部分组成，正义探针和反义探针与启动子连接方向相反，正义探针是目标基因的阴性对照，反义探针是目标基因mRNA序列的互补序列，与靶基因结合显示目标基因的位置，它们是带目标基因的转录模版体外转录产物。根据目标基因的mRNA序列长度和荧光定量qPCR结果，选取GG起始，GC含量为40％～70％的目标基因片段做模版片段，mRNA序列长度越长，荧光定量ΔCQ值越高，模版片段越长。2000bp左右mRNA的模版片段长度一般为500bp～1500bp。
转录模版制备既可以由公司直接合成DNA片段，也可以利用含T7/Sp6启动子序列的引物，用高保真性PCR酶扩增所得(图3)。
体外转录体系不必要求模版DNA总量大于1μg，体外转录产物纯化阶段会损失部分RNA产物，增加-20℃下乙醇或异丙醇沉淀的时间到3h以上(可以过夜)，可以增加探针的产率。150ng左右的转录模版起始量，反应2h可回收转录产物达约100μg。
4、杂交切片的准备过程
成熟组织的杂交信号与分生组织不同，信号分子零散分布在单个细胞内，样品的组织切片不宜过薄，否则会减少固定在组织上的靶分子数量。10～12μm厚黄瓜幼苗的成熟组织切片适用于原位杂交实验。
在切片前先对包埋样品进行修块，然后通过切片机制得的石蜡切片，并对石蜡切片进行筛选，筛选方法如下：用刀片将连成一条的石蜡切片分割成适合载玻片放置的长度，轻轻平放在载玻片上，置于显微镜下简单镜检筛选需要的组织切片，将组织碎裂、空洞、刀片划痕等结构不完整的切片丢弃。切片过程中，及时检查并清理刀片上的蜡渍，避免划痕导致的样品碎裂。
经过筛选后的切片，轻轻平放于37℃RNase-free水中进行摊片，如图4所示，带石蜡切片软化后完全摊开，颜色由白变为近乎透明，再用毛笔轻轻拖 起摊在载玻片上，毛笔轻压赶走气泡，再用吸水纸轻压吸去水分，以此减少烘片的时间并提升烘片的效果，避免后期样品与载玻片分离。
5、杂交预处理
杂交预处理对石蜡包裹的组织样品进行脱蜡、脱色，对包裹靶分子的蛋白质进行处理，使靶分子充分暴露出来，因此所有用具都应该使用RNA酶清除剂处理，所有试剂用RNase-free水配置。
此过程多次用到PBS缓冲液，梯度乙醇等，对此流程进行优化如图5所示，最终样品应保存在4℃冰箱，置于底部添加少量无水乙醇的封口膜密封的染色缸内的染色架上。
6、杂交孵育封片
原位杂交体系中一抗和二抗分别进行杂交孵育，使用含抗体(一抗是DIG-11-UTP探针，二抗是DIG-AP)的RNA杂交液淋洗组织样品，然后使用RNA杂交液封片以进行孵育，因此RNA杂交液封样的程度直接决定了杂交的效果。RNA杂交液封片，即封样，要求组织样本必须完全浸润在RNA杂交液中，一旦产生气泡，会导致该位置样品未接触到抗体，从而影响基因定位结果的准确性。
优化的封片技术如图6所示，移液枪吸取适量含抗体的RNA杂交液(一抗～135μl，二抗～100μl)滴于图6所示位置，然后在该侧轻压下盖玻片一侧并用左手按住，使盖玻片贴合RNA杂交液，右手握住盖玻片另一层缓缓放下，RNA杂交液随着盖玻片被缓缓推开，切记盖玻片移动速度一定要缓于RNA杂交液。
7、显色反应镜检
黄瓜幼苗成熟组织的原位杂交体系不适用显色反应三天后直接终止，为了尽量减少背景噪音的同时提高目标基因定位的特异性，杂交信号分子应该尽早被发现，越早出现的信号是噪音的可能性就越小。
对于特殊时期相对表达丰度较高的目标基因(即荧光定量PCR的CQ值为15≤CQ＜25，内参基因CQ值为15的基因。此处仅为参考值，用于预判镜检开始时间，实际情况可根据此参考值进一步预估)，适宜在显色反应开始6h内进行一次镜检查看杂交信号；对于表达丰度一般的目标基因(即荧光定量PCR的CQ值为25≤CQ≤30，内参基因CQ值为15的基因。此处仅为参考值，用于预判镜检开始时间，实际情况可根据此参考值进一步预估)，第二天开始，每天上午、下午或晚上各进行一天2次的镜检。
镜检时尽量避光，将封片后的杂交切片样品置于显色底物缓冲液(Buffer 5)中分开，用缓冲液制作临时装片，然后置于显微镜下检查杂交信号，若观察到清晰的杂交信号(紫红色)分子，即可终止显色反应；否则，用显色反应溶液重新冲洗样品，然后对粘放回考普林杯中继续反应。
8、反应终止后处理
对于观察到杂交信号的组织样本，用清水终止显色反应，然后置于室温晾干，最后每张载玻片直接用90μl中性树脂和二甲苯的混合液(中性树脂和二甲 苯按照体积比为1:1的比例混匀后得到的溶液)进行封片。封片后的样本几乎不受到内含物杂质的影响，杂交信号也清晰，实验结果永久保存。
二、CsNPF7.2基因在黄瓜幼茎原位杂交
1、试验材料的培养
组织培养：选择大小、形态和重量一致的‘新泰密刺’黄瓜种子，首先用55℃～60℃的蒸馏水浸泡约30min。然后将浸泡后的种子用小镊子剥去黄瓜种皮(尽量避免镊子接触种子的生长点)。再依次用75％酒精消毒30s，灭菌水清洗3次，2.5％次氯酸钠消毒10min，灭菌水清洗3次，得到处理后种子。最后将处理后的种子放在MS固体培养基上转入培养箱(江南仪器厂植物培养箱)进行培养，培养条件如下：第一阶段28℃暗培养24h。第二阶段光周期12h、白天28℃/晚上18℃培养13天。
2、试验材料的取样与固定
从步骤1中获得的黄瓜幼苗上取样，将取得的组织样品先用FAA固定液浸泡抽过真空的黄瓜幼茎，然后分别进行乙醇梯度脱水、二甲苯置换乙醇、石蜡置换二甲苯，再用石蜡包埋样品，最后存放于-20℃。具体步骤如下：
1)试验材料的取样
在冰上从黄瓜幼苗上分别切取长度为3～4cm的黄瓜幼苗的茎和长度为3～4cm的包含侧根的根系片段作为组织样品，如图2所示。
2)试验材料的包埋
2-1)试验材料的固定：取下的组织样品迅速放入预冷的FAA固定液(改进配方：30ml无水乙醇，10ml 37％甲醛，5ml冰醋酸，55ml RNase-free水)，真空泵抽真空18～20min，然后缓慢进气至恢复大气压，更换新的FAA固定液并于4℃水平摇床摇晃过夜。
2-2)乙醇梯度脱水：在4℃水平摇床中，依次用低浓度到高浓度的乙醇溶液进行脱水，乙醇浓度梯度为50％、70％、85％、95％、100％、100％、100％(由RNase-free水配制而成)，每个梯度都添加少量的曙红染色剂(用来在切片时区分石蜡与样品)，直到植物样品被染成粉红色，每个梯度的脱水时间改进为35min，最后一个100％乙醇梯度过夜。
2-3)二甲苯置换乙醇：在常温水平摇床中，依次用100％乙醇、50％乙醇/50％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯进行置换，每个溶液的置换时间为30min，最后一个100％二甲苯过夜。
2-4)石蜡置换二甲苯：在60℃的恒温箱中，直接用提前融化干净的石蜡置换二甲苯，重复4天，每天1次。
2-5)样品包埋：在RNA酶清除剂处理过的超净台，首先将普通无酶的方形塑料培养皿用作包埋盒置于冰上，添加约1cm厚度干净的石蜡融液，然后迅速摆放样品于其中，再用火焰灼热的金属镊子赶走样品周围的气泡，使石蜡与样品充分接触，融为一体，最后石蜡凝固后得到包埋样品，置于-20℃冰箱保存。
2-6)样品修块：点燃酒精灯，取一张干净的报纸垫在桌上，放2ml离心管架及2ml离心管；然后取出包埋成功的样品，用手术刀片围着样品切成体积尺寸大约为0.5mm×0.5mm×0.5mm的包含样品的蜡块(切去多余的石蜡，边缘越接近样品越好)；放一小块碎石蜡在离心管盖上，用酒精火焰灼烧过的刀片烫融石蜡，然后迅速放上刚切好的蜡块，随着石蜡凝固，蜡块会固定在离心管上；用签字笔在离心管上标注样品名称。
3、目标基因探针的制备
1)目标基因的探针制备
1-1)利用SnapGene 4.1.8软件设计CsNPF7.2的转录模版扩增引物如表1所示，以试验植株材料的cDNA为模板采用胶回收高保真性PCR酶PrimeSTAR(TaKaRa)进行PCR扩增，得到扩增产物。
1-2)以步骤1-1)获得的扩增产物作为转录模版，根据T7/Sp6体外转录试剂盒(Roche)中的T7/Sp6体外转录说明书指导，配置含有Digoxigenin-11-UTP(地高辛标记的尿嘧啶核苷酸)体外转录反应体系，37℃反应2h，得到体外转录产物。
表1、CsNPF7.2基因原位杂交探针引物表
Figure PCTCN2020108828-appb-000001
注：正义探针连接T7启动子，反义探针连接Sp6启动子，表格中划横线的序列为启动子序列。
2)目标基因的探针纯化
2-1)向反应完成的体外转录产物中依次加入75μl RNase-free水，1μl 100mg/ml tRNA(Sigma，#10109517001)，1μl DNase Ⅰ(TaKaRa)，37℃保温30min，去除DNA。
2-2)用无水乙醇沉淀法回收RNA产物。具体步骤如下：依次加入等体积预冷的4M NH 4Ac，2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，放置于-20℃冰箱3～6h；4℃、14000rpm离心10min，弃上清；沉淀用600μl 70％乙醇漂洗，4℃、14000rpm离心7min，弃上清，再瞬离吸取上清后等待沉淀晾干。
2-3)加入100μl RNase-free水重悬沉淀，然后加入100μl碳酸盐缓冲液(pH9.2-10.8，80mM碳酸钠、120mM碳酸氢钠)，60℃保温50min进行水解，水解完成后，再次使用醇沉法回收RNA产物。
2-4)加入40μl 50％甲酰胺溶解沉淀，得到纯化后的探针溶液，放于-80℃冰箱保存原位杂交探针。在探针放入超低温冰箱前，可以利用Nanodrop或Qubit3.0测量RNA探针的浓度。
4、杂交切片的准备
1)切片
打开切片机，将上样头退回原处，设置切片厚度为10μm；然后上修块成功的样品，调整刀片位置正好与样品形成切面；再转动切片机，用毛笔辅助推开形成条的石蜡切片，防止样品粘在一起成团。
2)筛选与摊片
用细毛笔勾下一段样品放在干净的A4纸上，用刀片切成小片段，然后放在载玻片上，用显微镜初步筛选出组织完整，无破损，并且含有目标组织结构的小片段(图1B)；再将选中的小片段小心放入37℃RNase-free水浴中进行摊片，将样品小心的展平；最后待石蜡切片软化后完全摊开，颜色由白变为近乎透明，用毛笔轻轻拖起摊在载玻片上，使之粘在载玻片上，用吸水纸小心从样品周围吸取多余的水分，并用毛笔轻推样品，赶走气泡。
3)烘片
将摊片成功的载玻片放在42℃的烘片机上过夜，使样品完全粘贴在载玻片上，下一步脱蜡组织不会跟着脱落。
5、杂交预处理
1)杂交预处理相关试剂的配置
本阶段需要试剂均为RNase-free水配置，除了常用试剂二甲苯、梯度乙醇(100％-95％-85％-70％-50％)、0.85％NaCl、EDTA和PBS缓冲液(pH7.2-7.4)外，在试验开始前，根据实验需求用量现配蛋白酶K溶液、0.2％甘氨酸溶液、4％甲醛溶液、乙酸酐溶液，具体配方分别如下：
蛋白酶K溶液：由RNase-free水配置，三种溶液底物工作浓度分别为100mM Tris(pH8.0)、50mM EDTA、1μg/ml proteinaseK(Sigma，#p2308)。根据购买的相关母液计算稀释比例依次添加，提前一晚37℃预热，用时再加proteinaseK。
0.2％甘氨酸溶液：由RNase-free PBS缓冲液(RNase-free水配置的PBS缓冲液)配置，100ml PBS缓冲液添加0.2g甘氨酸。
4％甲醛溶液：由RNase-free水、高浓度PBS缓冲液和37％甲醛配置，稀释后溶液底物工作浓度分别为4％甲醛，1×PBS。
乙酸酐溶液：由RNase-free水配置，溶液底物工作浓度分别为0.1M三乙醇胺、0.5％NaCl、48mM HCl(浓盐酸配置)、0.025％乙酸酐，临用前再加乙酸酐，充分搅拌混合。
2)杂交预处理过程
对杂交切片进行脱蜡、脱色，对包裹靶分子的蛋白质进行处理，使靶分子充分暴露出来。具体步骤如下：将步骤4获得的烘干后切片依次置于如下溶液中进行处理(箭头前后溶液的处理方法表示用箭头“→”前溶液处理后更换箭头“→”后溶液进行处理)：二甲苯溶液中浸泡10min→二甲苯溶液中浸泡10min→50％二甲苯溶液和50％乙醇溶液中浸泡5min→100％乙醇溶液中浸泡1min→100％ 乙醇溶液中浸泡1min→95％乙醇溶液中浸泡30s→85％乙醇溶液中浸泡30s→70％乙醇溶液中浸泡30s→50％乙醇溶液中浸泡30s→0.85％NaCl溶液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→蛋白酶K溶液中37℃反应30min→0.2％甘氨酸溶液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→4％甲醛中浸泡溶液10min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→乙酸酐溶液中浸泡10min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→0.85％NaCl溶液中浸泡2min→50％乙醇溶液中浸泡30s→70％乙醇溶液中浸泡30s→85％乙醇溶液中浸泡30s→95％乙醇溶液中浸泡30s→100％乙醇溶液中浸泡1min→100％乙醇溶液中浸泡1min，杂交预处理结束。将最终得到的杂交切片样品保存在4℃冰箱，置于底部添加少量无水乙醇的封口膜密封的染色缸内的染色架上。
6、第一次杂交孵育
1)第一次杂交相关试剂的配置
1-1)探针的稀释
按照每张切片30μl稀释后探针的用量计算，分别稀释正义探针和反义探针，得到稀释后探针。30μl稀释后探针由2μl正义探针或反义探针(上文中纯化后的探针溶液)和28μl 50％甲酰胺溶液组成。
1-2)其它试剂的配置
本阶段需要试剂均为RNase-free水配置，常用试剂甲酰胺(Sigma)、tRNA(Sigma)、SSC缓冲液(Coolaber)和50×denhardt's(ThermoFisher)直接购买获得。在试验开始前，需要现配10×Salts、50％硫酸葡聚糖、RNA杂交液、2×SSC/50％甲酰胺溶液和杂交混合液，具体配方如下：
10×Salts溶液：由RNase-free水配置，溶液底物工作浓度分别为磷酸盐缓冲液(pH6.8，49mM Na 2HPO 4、51mM NaH 2PO 4)、3M NaCl、50mM EDTA、Tris·HCl(pH8.0)，可在-20℃长期保存。
50％硫酸葡聚糖：由60℃加热的RNase-free水配置，10ml RNase-free水加入0.5g硫酸葡聚糖，充分混匀溶解后可在-20℃长期保存。
RNA杂交液：由RNase-free水配置，每张片子的RNA杂交液用量为120μl，1ml RNA杂交液添加的底物用量为500μl 100％甲酰胺、200μl 50％硫酸葡聚糖、170μl RNase-free水、100μl 10×Salts、20μl 50×denhardt's、10μl 100mg/ml tRNA，根据杂交切片的数目配置相应的用量，其中硫酸葡聚糖粘稠，移液枪吸用速度不宜过快，并且充分吹打混匀。
2×SSC/50％甲酰胺：RNase-free水、20×SSC缓冲液和100％甲酰胺配置，稀释后溶液底物工作浓度为2×SSC，50％甲酰胺。
杂交混合液：由30μl稀释后探针和120μl RNA杂交液配置而成。
2)第一次杂交孵育
2-1)将载玻片从染色架移至玻片板上于室温晾干5-10min，至组织样品呈 纯白色；同时，将稀释后探针溶液80℃变性2min，立即置于冰上2-3min，瞬离30s。
2-2)按照120μl/片计算后加入RNA杂交液，用剪过的枪头吸打混匀；接着，在免疫组化湿盒中加入2×SSC/50％甲酰胺溶液覆盖整个湿盒底。
2-3)每张载玻片加入杂交混合液135μl，待液体完全覆盖样品后盖上盖玻片，随即放入免疫组化湿盒中，待所有载玻片全部放入免疫组化湿盒后，将免疫组化湿盒用胶带密封，置于50～55℃保温箱过夜。
7、第二次杂交孵育
1)第二次杂交相关试剂的配置
本阶段需要试剂除常用试剂外还需要提前购买10×TBS缓冲液(Coolaber)、RNaseA(Takara)、BSA(牛血清蛋白)(Sigma)、脱脂奶粉(Roche)、Triton X-100(Sigma)、DIG-AP(Roche)和显色底物NBT/BCIP(Roche)，试验开始前需要提前配置五种缓冲液Buffer 1(0.2×SSC)、Buffer 2(NTE)、Buffer 3、Buffer 4、Buffer 5和两种反应溶液DIG-AP抗体溶液、NBT/BCIP显示底物溶液，此阶段溶液由普通蒸馏水配置即可，具体配方如下：
Buffer 1溶液：0.2×SSC(由蒸馏水稀释20×SSC得到)。
Buffer 2溶液：由蒸馏水配置，三种溶液底物工作浓度分别为0.5mM NaCl、10mM Tris·HCl(pH7.5)、1mM EDTA。
Buffer 3溶液：由预热至60℃的1×TBS缓冲液配置，100ml 1×TBS缓冲液添加1g脱脂奶粉(Roche，#11096176001)，在磁力搅拌器上60℃持续加热保证脱脂奶粉充分溶解。
Buffer 4溶液：由TBS缓冲液和蒸馏水配置，溶液底物工作浓度分别为1×TBS、1％BSA(Sigma，#sre0096)、0.3％Triton X-100(Sigma，#t8787)，根据需求配置适当用量，在磁力搅拌器上常温搅拌使之充分混匀。
Buffer 5溶液：由蒸馏水配置，溶液底物工作浓度分别为0.1M Tris·HCl(pH9.5)、100mM NaCl、50mM MgCl 2，根据需求配置用量，充分混匀。
DIG-AP抗体溶液：用Buffer 4稀释DIG-AP抗体(Roche，#11093274901)1250倍，即10ml Buffer 4溶液添加8μl DIG-AP抗体，根据每张片子200μl AP抗体溶液的用量计算所需配置总量。
NBT/BCIP显示底物溶液：由Buffer 5溶液配置，两种显色底物工作浓度分别为：225μg/ml NBT(Roche，#11383213001)、175μg/ml BCIP(Roche，#11383221001)，根据实验所需配置用量。
一抗杂交混合液：由20μl的稀释后探针溶液(一抗)和80μl RNA杂交液配置而成。
二抗杂交混合液：由8μl的DIG-AP抗体溶液(二抗)和10ml的RNA杂交液配置而成。
2)第二次杂交孵育
第二次杂交孵育前先对样品进行处理(图7中1-11)；然后每张载玻片用100μl DIG-AP抗体溶液进行冲洗，再用100μl DIG-AP抗体溶液进行封片，放入加入Buffer 4溶液的湿盒中室温孵育2h(图7中12)；孵育结束后，洗掉盖玻片，先用Buffer 4溶液清洗4次，每次15min，然后用Buffer 5溶液清洗2次，每次5min(图7中13-18)；最后使用含抗体的RNA杂交液封片。具体步骤如下：
2-1)一抗杂交后样品的处理
将使用一抗进行杂交孵育后的样品置于在55℃预热的Buffer 1溶液中去掉盖玻片，然后依次在如下溶液中进行处理(箭头前后溶液的处理方法表示用箭头“→”前溶液处理后更换箭头“→”后溶液进行处理)：Buffer 1溶液中55℃反应1h→Buffer 1溶液中55℃反应1h→Buffer 2溶液中37℃反应5min→Buffer 2溶液中37℃反应5min→含有RNaseA的Buffer 2溶液(由100mg RNaseA和500ml Buffer 2溶液组成)中37℃反应30min→Buffer 2溶液中37℃反应5min→Buffer 2溶液中37℃反应5min→Buffer 1溶液中55℃反应1h→TBS缓冲液中摇床5min→Buffer 3溶液中摇床1h→Buffer 4溶液中摇床45min。
2-2)第二次杂交孵育及孵育后处理
使用DIG-AP抗体溶液依次按照如下步骤进行第二次杂交孵育及孵育后处理(箭头前后溶液的处理方法表示用箭头“→”前溶液处理后更换箭头“→”后溶液进行处理)：DIG-AP抗体杂交孵育→在Buffer 4溶液中去盖玻片后放置干净染色架上→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer4溶液中摇床15min→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer 5溶液中摇床5min→Buffer 5溶液中摇床5min。DIG-AP抗体杂交孵育的方法具体如下：每张载玻片先用100μl DIG-AP抗体溶液进行冲洗，然后用100μl DIG-AP抗体溶液进行封片，最后放入加入Buffer 4溶液的免疫组化湿盒中室温孵育2h。
2-3)RNA杂交液封片(封样)
使用含抗体的RNA杂交液淋洗孵育处理后的杂交切片样品，然后使用含抗体的RNA杂交液封片。封片的方法具体如下：使用移液枪吸取含抗体的RNA杂交液(由一抗杂交混合液和二抗杂交混合液组成)滴于杂交切片样品的左端，然后轻压盖玻片左端并用左手按住，使盖玻片贴合含抗体的RNA杂交液，右手握住盖玻片另一端缓缓放下，含抗体的RNA杂交液随着盖玻片被缓缓推开，盖玻片移动速度一定要缓于含抗体的RNA杂交液。一抗杂交混合液的用量为135μl/片，二抗杂交混合液的用量为100μl/片。
8、显色反应与镜检
在避光环境中，用120μl NBT/BCIP显色底物溶液冲洗一次封片后的杂交切片样品并将载玻片两两之间对贴在一起，转入底部加有1～2ml NBT/BCIP显色底物溶液的考普林杯，用锡箔纸包裹密封，放置于黑暗环境中，室温下进行显色反应(图7中的19)。
NBT/BCIP显色底物缓冲液由Buffer 5溶液配置，两种显色底物工作浓度分别为：225μg/ml NBT(Roche，#11383213001)、175μg/ml BCIP(Roche，#11383221001)。
镜检时尽量避光，将对粘的载玻片置于NBT/BCIP显色底物缓冲液中分开，用NBT/BCIP显色底物缓冲液制作临时装片，然后置于显微镜下检查杂交信号，若观察到清晰的杂交信号(紫红色)分子，即可终止显色反应；否则，用NBT/BCIP显色底物缓冲液重新冲洗样品，然后对粘放回考普林杯中继续反应。
由于培养15天的黄瓜根部目标基因CsNPF7.2荧光定量PCR的CQ值为30.49(内参基因ACTIN荧光定量PCR的CQ值为14.38)，为表达丰度一般的目标基因，所以于显色反应10h后进行第一次镜检，8h后进行第二次镜检。
9、显色反应终止与封片
对于观察到杂交信号的组织样本，用清水终止显色反应，然后置于室温晾干，每张载玻片直接用90μl中性树脂和二甲苯的混合液(中性树脂和二甲苯按照体积比为1:1的比例混匀后得到的溶液)进行封片(图1D表示封片方法效果)。
CsNPF7.2在黄瓜根系中的定位结果如图1B和图1D所示，杂交信号如白色三角形指向所示；CsNPF7.2在黄瓜幼茎中的定位结果如图8所示，杂交信号如黑色三角形指向所示。从图中可以看出：杂交信号清晰可见。
工业应用
本发明提供的原位杂交优化方法是针对黄瓜幼苗成熟组织的基因定位研究，对现有原位杂交体系应用不足的优化。首先，根据黄瓜幼苗植株材料特性，改进植物培养、取样和固定的方法，从而获得含目标组织的完整植物结构，这是整个原位杂交体系的基础；其次，针对性优化切片准备、杂交预处理、杂交孵育封片和显色反应镜检等操作手法，从而提高基因定位结果的可靠性、准确性和特异性；最后，针对性设计适合黄瓜幼苗成熟组织的显色反应终止后的处理方案，以便排除细胞内含物的干扰，并且直接观察杂交信号的分布。基于以上三点，本发明构建了一套完整的应用于黄瓜幼苗成熟组织的原位杂交体系，实验技术的优化不仅提高了实验结果的灵敏性和准确性，也在一定程度上通过提高药品利用率、减少实验用品消耗、增加反应产物产率、节省劳动成本等方法降低了实验体系的经济成本，因此本发明是一套兼顾科学性、创新性和实用性的科学研究方法。

Claims (30)

  1. 一种用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交方法，包括如下步骤：
    步骤1、试验材料的培养
    采用组培、水培、沙培或土培的方式将黄瓜种子培养得到黄瓜幼苗；所述土培为采用细土培养；
    步骤2、试验材料的取样与固定
    从所述黄瓜幼苗上取部分组织作为植物样品；然后将所述植物样品进行包埋，得到包埋样品；
    步骤3、目标基因探针的制备
    根据目标基因的mRNA序列长度，选取GG起始且GC含量为40％～70％的目标基因片段作为转录模版；将含有启动子的转录模版进行体外转录，得到目标基因反义探针；所述目标基因反义探针与目标基因的mRNA序列互补且带有标记物；
    步骤4、杂交切片的准备
    将所述包埋样品制成石蜡切片，并对所述石蜡切片依次进行筛选、摊片、烘片，得到杂交切片；
    步骤5、杂交预处理
    对所述杂交切片进行脱蜡、脱色，对包裹靶分子的蛋白质进行处理，使靶分子充分暴露出来，得到杂交预处理后切片；
    步骤6、杂交孵育封片
    对所述杂交预处理后切片先使用一抗进行第一次杂交孵育，然后使用二抗进行第二次杂交孵育，最后使用含抗体的RNA杂交液进行封片，得到杂交孵育后切片；所述一抗是所述目标基因反义探针，所述二抗是特异性结合所述目标基因反义探针带有的标记物的物质与碱性磷酸酶的偶联物；
    步骤7、显色反应与镜检
    将所述杂交孵育后切片进行显色反应与镜检；
    所述镜检时将对粘的载玻片置于NBT/BCIP显色底物缓冲液中分开，用NBT/BCIP显色底物缓冲液制作临时装片，然后置于显微镜下检查杂交信号，若观察到清晰的杂交信号分子，终止显色反应；否则，用NBT/BCIP显色底物缓冲液重新冲洗样品，然后将两片载玻片重新对粘并放回容器中继续反应；
    步骤8、显色反应终止与封片
    对于观察到杂交信号的组织样本，先用清水终止显色反应，然后置于室温晾干后用中性树脂和二甲苯的混合液进行封片。
  2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，所述部分组织来源于黄瓜幼苗成熟组织和/或分生组织。
  3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述部分组织的长度为3～ 4cm。
  4. 如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述部分组织为3～4cm的黄瓜幼苗的茎或3～4cm的包含侧根的根系片段。
  5. 如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述包埋的方法包括如下步骤：
    1)植物样品固定
    将所述植物样品放入预冷的FAA固定液，真空泵抽真空18～20min，然后缓慢进气至恢复大气压，更换新的FAA固定液并于4℃水平摇床摇晃过夜；
    2)乙醇梯度脱水
    在4℃水平摇床中，将步骤1)得到的植物样品依次在浓度梯度为50％、70％、85％、95％、100％、100％、100％的乙醇溶液中进行脱水，每个梯度的乙醇溶液都添加1-2耳匙的曙红染色剂，直到植物样品被染成粉红色，每个溶液的脱水时间为35min，最后一个100％乙醇溶液过夜；
    3)二甲苯置换乙醇
    在常温水平摇床中，将步骤2)得到的植物样品依次在100％乙醇、50％乙醇+50％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯、100％二甲苯溶液中进行置换，每个溶液的置换时间为30min，最后一个100％二甲苯溶液过夜；
    4)石蜡置换二甲苯
    在60℃的恒温箱中，用融化干净的石蜡置换步骤3)得到的植物样品中的二甲苯，重复4天，每天1次；
    5)石蜡包埋
    在RNA酶清除剂处理过的超净台中，首先将包埋盒置于冰上，添加1cm厚度的石蜡融液，然后迅速摆放步骤4)得到的植物样品于其中，再用火焰灼热的金属镊子赶走植物样品周围的气泡，使石蜡与植物样品充分接触，融为一体，最后石蜡凝固后得到包埋样品。
  6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述FAA固定液由无水乙醇、37％甲醛、冰醋酸和RNase-free水组成。
  7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述无水乙醇、所述37％甲醛、所述冰醋酸和所述RNase-free水的体积比为6:2:1:11。
  8. 如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述包埋后还包括对所述包埋样品进行修块切分的步骤；所述修块切分为将所述包埋样品切成体积尺寸为0.5mm×0.5mm×0.5mm的包含样品的蜡块。
  9. 如权利要求1-8所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述目标基因探针还包括目标基因正义探针；所述目标基因正义探针与目标基因的mRNA序列相同且带有标记物。
  10. 如权利要求1-9所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述转录模版可直接合成或利用含启动子序列的引物和高保真PCR酶扩增获得。
  11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述启动子为T7启动子或Sp6启动子。
  12. 如权利要求1-11所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述标记物可为同位素标记物或非同位素标记物。
  13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述非同位素标记物为地高辛、生物素或荧光素。
  14. 如权利要求1-13任一所述的方法，其特征在于，步骤4中，所述石蜡切片的厚度为10～12μm。
  15. 如权利要求1-14任一所述的方法，其特征在于，步骤4中，将所述包埋样品制成石蜡切片的过程中还包括及时检查并清理刀片上的蜡渍，避免划痕导致的样品碎裂的步骤。
  16. 如权利要求1-15任一所述的方法，其特征在于，步骤4中，，将所述包埋样品制成石蜡切片的过程中还包括用毛笔辅助推开形成条的石蜡切片，防止样品粘在一起成团的步骤。
  17. 如权利要求1-16任一所述的方法，其特征在于，步骤4中，所述筛选、摊片、烘片的方法包括如下步骤：从石蜡切片中筛选组织完整、无破损且含有目标组织结构的切片，然后平放于37℃RNase-free水浴中进行摊片，待石蜡切片软化后完全摊开，颜色由白变为近乎透明，再用毛笔轻轻拖起摊在载玻片上，并用毛笔轻压样品赶走气泡，最后用吸水纸轻压吸去水分后进行烘片，得到杂交切片。
  18. 如权利要求1-17任一所述的方法，其特征在于，步骤5中，所述杂交预处理的方法依次包括如下步骤：将所述杂交切片依次置于如下溶液中进行杂交预处理：二甲苯溶液中浸泡10min→二甲苯溶液中浸泡10min→50％二甲苯溶液+50％乙醇溶液中浸泡5min→100％乙醇溶液中浸泡1min→100％乙醇溶液中浸泡1min→95％乙醇溶液中浸泡30s→85％乙醇溶液中浸泡30s→70％乙醇溶液中浸泡30s→50％乙醇溶液中浸泡30s→0.85％NaCl溶液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→蛋白酶K溶液中37℃反应30min→0.2％甘氨酸溶液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→4％甲醛溶液中浸泡10min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→乙酸酐溶液中浸泡10min→PBS缓冲液中浸泡2min→PBS缓冲液中浸泡2min→0.85％NaCl溶液中浸泡2min→50％乙醇溶液中浸泡30s→70％乙醇溶液中浸泡30s→85％乙醇溶液中浸泡30s→95％乙醇溶液中浸泡30s→100％乙醇溶液中浸泡1min→100％乙醇溶液中浸泡1min，杂交预处理结束。
  19. 如权利要求1-18任一所述的方法，其特征在于，步骤5还包括将得到的杂交切片样品置于底部添加少量无水乙醇的封口膜密封的染色缸内的染色架上的步骤。
  20. 如权利要求1-19任一所述的方法，其特征在于，步骤6中，所述第一 次杂交孵育包括如下步骤：首先将杂交切片样品于室温晾干5-10min，至杂交切片样品呈纯白色，同时将稀释后探针溶液80℃变性2min，立即置于冰上2-3min，瞬离30s；然后按照120μl/片的用量加入RNA杂交液，混匀，在免疫组化湿盒中加入2×SSC/50％甲酰胺溶液覆盖整个湿盒底；再在每张载玻片上加入杂交混合液135μl，待液体完全覆盖样品后盖上盖玻片，并放入免疫组化湿盒中；最后，待所有载玻片全部放入免疫组化湿盒后，将免疫组化湿盒密封，置于50～55℃保温箱过夜。
  21. 如权利要求1-20任一所述的方法，其特征在于，步骤6中，在使用一抗进行杂交孵育后，使用二抗进行杂交孵育前还包括如下步骤：将使用一抗进行杂交孵育后的样品在55℃预热的Buffer 1溶液中去掉盖玻片，然后依次在如下溶液中进行处理：Buffer 1溶液中55℃反应1h→Buffer 1溶液中55℃反应1h→Buffer 2溶液中37℃反应5min→Buffer 2溶液中37℃反应5min→含有RNaseA的Buffer 2溶液中37℃反应30min→Buffer 2溶液中37℃反应5min→Buffer 2溶液中37℃反应5min→Buffer 1溶液中55℃反应1h→TBS缓冲液中摇床5min→Buffer 3溶液中摇床1h→Buffer 4溶液中摇床45min。
  22. 如权利要求1-21任一所述的方法，其特征在于，所述第二次杂交孵育的方法依次包括如下步骤：DIG-AP抗体杂交孵育→在Buffer 4溶液中去盖玻片后放置干净染色架上→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer 4溶液中摇床15min→Buffer 5溶液中摇床5min→Buffer 5溶液中摇床5min。
  23. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述DIG-AP抗体杂交孵育的方法包括如下步骤：每张载玻片用100μl DIG-AP抗体溶液进行冲洗，然后再用100μl DIG-AP抗体溶液进行封片，最后放入加入Buffer 4溶液的免疫组化湿盒中室温孵育2h。
  24. 如权利要求1-23任一所述的方法，其特征在于，步骤6中，所述第二次杂交孵育后还包括如下步骤：使用移液枪吸取含抗体的RNA杂交液滴于杂交切片样品的左端，然后轻压盖玻片左端并用左手按住，使盖玻片贴合含抗体的RNA杂交液，右手握住盖玻片另一端缓缓放下，含抗体的RNA杂交液随着盖玻片被缓缓推开，盖玻片移动速度要缓于含抗体的RNA杂交液；所述含抗体的RNA杂交液由一抗杂交混合液和二抗杂交混合液组成；所述一抗杂交混合液的用量为135μl/片，所述二抗杂交混合液的用量为100μl/片。
  25. 如权利要求1-24任一所述的方法，其特征在于，步骤7中，所述将所述杂交孵育后切片进行显色反应的方法包括如下步骤：在避光环境中，用120μl NBT/BCIP显色底物溶液冲洗所述杂交孵育后切片并将载玻片两两之间对贴在一起，转入底部加有1～2ml NBT/BCIP显色底物溶液的容器中，密封后放置于黑暗环境中，室温下进行显色反应。
  26. 如权利要求1-25任一所述的方法，其特征在于，步骤7中，所述NBT/BCIP 显色底物缓冲液中两种显色底物工作浓度分别为：225μg/ml NBT、175μg/ml BCIP。
  27. 用于黄瓜幼苗基因定位的成套试剂，其包括权利要求6或7中所述的FAA固定液。
  28. 如权利要求27所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还包括不同浓度的乙醇溶液、二甲苯溶液、石蜡、目标基因探针溶液、0.85％NaCl溶液、PBS缓冲液、蛋白酶K溶液、0.2％甘氨酸溶液、4％甲醛溶液、乙酸酐溶液、2×SSC/50％甲酰胺溶液、50％甲酰胺溶液、RNA杂交液、Buffer 1溶液、Buffer 2溶液、Buffer 3溶液、Buffer 4溶液、Buffer 5溶液、DIG-AP抗体溶液、NBT/BCIP显色底物溶液。
  29. 如权利要求28所述的成套试剂，其特征在于：所述目标基因探针溶液包括目标基因正义探针溶液和目标基因反义探针溶液。
  30. 权利要求1-26任一所述的方法或权利要求27-29任一所述的成套试剂在研究黄瓜幼苗基因功能中的应用。
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LI, HONG-YING , SU YAN-HUA: "Optimization of the RNA in Situ Hybridization System in Rice", JOURNAL OF NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY, vol. 35, no. 2, 30 April 2012 (2012-04-30), pages 15 - 20, XP055780768, ISSN: 1000－2030 *

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