CN111235231B - 一种基于石蜡切片的杨树根尖3d荧光原位杂交方法 - Google Patents

一种基于石蜡切片的杨树根尖3d荧光原位杂交方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于石蜡切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法，属于分子细胞遗传学领域。本方法主要包括：获取杨树幼嫩根尖，用卡诺固定液固定；正丁醇梯度溶液脱水、浸蜡、包埋；切片、展片、烤片及脱蜡；制片用果胶酶、纤维素酶、胃蛋白酶及RNA酶处理；制片及探针变性、杂交过夜；二抗孵育后检测杂交信号。本发明所提供的方法可以获得杨树根尖石蜡切片清晰的FISH信号，使用激光共聚焦显微镜捕获的3D图像可以准确反映靶序列在细胞中三维水平的空间分布。本发明的方法可用于杨树的染色体空间占位、基因表达及Hi‑C测序结果的分析等研究领域，具有广阔的应用前景。

Description

一种基于石蜡切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法
技术领域
本发明属于分子细胞遗传学领域，特别涉及一种基于石蜡切片的杨树根尖3D荧光原位杂交(FISH)方法，可以用于杨树的分子细胞遗传学及表观遗传学研究。
背景技术
荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)是20世纪80年代发展起来的一项分子细胞遗传学技术，是将荧光素直接或间接标记的核酸探针与待测样本中的核酸序列按照碱基互补配对的原则进行杂交后在荧光显微镜下观察，根据荧光信号对待测样本中的DNA或RNA进行定性，定量或定位分析。过去的20年间，植物的FISH技术已取得了长足发展，尤其在探针种类方面，已从常用的rDNA等重复序列为主的探针发展到现在的寡核苷酸(Oligo)序列探针，FISH技术已广泛应用于不同种类植物的核型分析、基因定位、纠正基因组序列组装错误等多个植物分子细胞遗传学研究领域。
石蜡切片是用石蜡作为组织支撑物，对组织进行切片，是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。该方法的主要优点是组织结构保存完好，能连续切片，且组织结构清晰，组织定位准确。因此，该方法不仅适用于观察一般植物组织的形态结构，也广泛应用于病理学和细胞化学等领域的研究。
伴随着植物基因组测序技术、基因组学、表观组学的迅猛发展，迫切需要从3D水平去认识染色体的结构及空间占位。然而，植物的FISH技术目前大多还停留在2D水平，不能分辨细胞内染色体的真实空间占位。这主要是因为植物FISH的制片方法主要是涂片，压片及滴片等，这些方法多是为了让中期染色体暴露出来，平铺在载玻片上，以便于显微观察及探针与靶序列的杂交复性，但这些制片方法改变了染色体在细胞中的原有空间位置，因而不能在三维水平上直观展示染色体的真实空间占位。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种基于石蜡切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法，使用该方法所得制片在激光共聚焦显微镜下可以在三维水平上直观展示染色体在细胞中的真实空间占位，以及准确定位靶序列在细胞中的空间分布。
一种基于石蜡切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法，包括如下步骤：
(1)截取幼嫩的杨树根尖浸入固定液固定1h以上，再用纯水洗2次，每次15min，再依次使用溶液I、II、III、IV、V和VI对根尖进行脱水；所述固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1的卡诺固定液，
所述溶液I为纯水∶酒精∶正丁醇＝5∶4∶1，
所述溶液II为纯水∶酒精∶正丁醇＝3∶5∶2，
所述溶液III为纯水∶酒精∶正丁醇＝3∶10∶7，
所述溶液IV为纯水∶酒精∶正丁醇＝1∶8∶11，
所述溶液V为酒精∶正丁醇＝1∶3，
所述溶液VI为正丁醇，
所述I、II、III、IV和V溶液中的各组分比例均为体积比；
(2)将经步骤(1)处理的根尖浸入正丁醇∶石蜡＝1∶1的溶液中，置于37℃培养箱过夜；然后转移到60℃烘箱的纯石蜡溶液中，58-60℃条件下保持液体状态，浸泡1h/次，共置换纯石蜡三次；最后在牛皮纸槽中将根尖浸没于液状石蜡，待石蜡表面凝固，立刻浸入冷水中，半小时后转移到4℃环境中保存；
(3)将包埋根尖的石蜡条修成石蜡小块，然后切片，并将切片在经多聚赖氨酸处理过的载玻片上展平，得到制片，并置于37℃培养箱过夜；
(4)将步骤(3)所得制片，浸入二甲苯溶液15min/次，两次；再浸入100％酒精15min/次，两次；最后用果胶酶、纤维素酶、胃蛋白酶及RNA酶处理对制片预处理，增强组织通透性；
(5)变性及杂交；
(6)抗体检测。
进一步地，步骤(1)中所述杨树幼嫩根尖的截取长度为3mm。
进一步地，步骤(1)中，所述使用溶液I进行脱水处理，具体为1次，时长30min；所述使用溶液II进行脱水处理，具体为1次，时长30min；所述使用溶液III进行脱水处理，具体为1次，时长30min；所述使用溶液IV进行脱水处理，具体为1次，时长30min；所述使用溶液V进行脱水处理，具体为1次，时长30min；所述使用溶液VI进行脱水处理，具体为2次，1h/次。
进一步地，步骤(3)中所述的切片是采用石蜡切片机Leica RM2235进行切片。
进一步地，步骤(3)中所述的切片的厚度为6-8μm。
进一步地，步骤(3)中所述的将切片在经多聚赖氨酸处理过的载玻片上展平，具体操作为：将蜡带光面朝下转移到经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，给载玻片上滴加适量纯水，小心将载玻片置于37℃热台上，使蜡带飘浮于水面之上，待石蜡切片充分舒展开后，用滤纸吸去多余水分。
进一步地，步骤(4)中所述用果胶酶、纤维素酶、胃蛋白酶及RNA酶处理对制片预处理具体包括如下步骤：
1)用4％纤维素酶和2％果胶酶的混合液处理制片，每张制片30μL，37℃酶解2h；
2)将制片浸入1×PBS溶液，5min/次，两次；
3)用100μg/mL的RNaseA溶液处理制片，每张制片100μL，37℃酶解1h；
4)将制片浸入2×SSC溶液，5min/次，三次；
5)将制片浸入0.01mol/L的HCl，2min；
6)用5μg/L的胃蛋白酶溶液处理切片，每张制片100μL，37℃酶解20min；
7)将制片浸入纯水清洗，2min；
8)将制片浸入2×SSC溶液，5min/次，两次；
9)将制片浸入70％、90％、100％乙醇溶液中脱水，每级3min；
10)制片气干。
进一步地，步骤(5)中变性及杂交具体包括如下步骤：
1)将预处理过的制片加100μL 70％DFA，放置在85℃变性15min；
2)将制片立即用70％，90％，100％的冰乙醇逐级脱水，每级5min；
3)晾干备用；
4)每张制片配制20μL杂交液，杂交液组成为：10μLDFA+2μL20×SSC+4μL 50％DS+4μL探针；
5)杂交液在98℃变性10min后立即在冰中冷却5min以上；
6)杂交液加到制片上，盖好盖玻片，放入湿盒，37℃杂交过夜。
进一步地，步骤(6)抗体检测具体包括如下步骤：
1)2×SSC泡掉盖玻片，并用2×SSC洗制片5min；
2)42℃的2×SSC洗制片20min；
3)1×TNT洗制片5min；
4)每张制片配制二抗孵育液102μL，37℃在湿盒中孵育1h，二抗孵育液组成为：100μL 1×TNB+1μLAnti-digoxigenin Rhodamine(Roche，11207750910)+1μLAlexaFluor，streptavidin 488(Invitrogen，S-11223)；
5)1×TNT洗制片三次，每次5min；
6)1×PBS洗制片5min；
7)纯水洗制片1min；
8)晾干后，每张制片加20μL含有DAPI的Vectashield(Vector Labs，H-1200)胶封片；
其中，从第4)步加入抗体开始避光操作。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的方法可以获得根尖完整的组织结构且FISH信号清晰，相比传统的压片、涂片或滴片等制片方法获得的2D FISH结果，本发明的技术方法可以原位获得特定组织或细胞中rDNA和整条染色体探针的FISH信号，使用激光共聚焦显微镜可以捕获3D图像，便可以在三维水平直观展示探针信号在细胞中的真实空间占位。本发明的技术方法可应用于杨树的染色体空间占位、基因表达及Hi-C测序结果的分析等研究领域，也可为其它植物的3D FISH及相关研究提供技术参考，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为间期核的激光共聚焦3D成像图，该图直观展示出45S rDNA(绿色信号)位于核仁组织区，19号染色体(红色信号)位于细胞核的周边，且两条19号同源染色体分别占据核的不同空间位置；
图2为中期细胞的激光共聚焦3D成像图，该图直观展示出8和14号拥有45S rDNA(绿色信号)的两对染色体及19号染色体(红色信号)在中期的空间占位。8、14和19号染色体的同源染色体在中期也分别占据不同空间位置。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。实施例中没有注明的温度均为室温，没有注明的试剂均为常规化学试剂。
实施例1：
1、根尖固定及脱水
截取长约3mm的杨树幼嫩根尖，立即浸入卡诺固定液(无水乙醇与冰乙酸体积比3∶1)固定1h以上。
将固定过的根尖用纯水洗2次，每次15min，以洗去卡诺固定液。然后用下表的正丁醇梯度溶液逐级脱水(各个梯度溶液的配比均为体积比)。
等级 I II III IV V VI
纯水(mL) 50 30 15 5 0 0
无水乙醇(mL) 40 50 50 40 25 0
正丁醇(mL) 10 20 35 55 75 100
脱水时间(min) 30 30 30 30 30 60(2次)
2、浸蜡和包埋
脱水后的根尖浸入正丁醇∶石蜡＝1∶1的溶液中，放置于37℃培养箱过夜，让石蜡逐渐浸透到根尖组织内部。再将根尖转移到60℃烘箱的纯石蜡溶液中浸泡1h/次，共置换纯石蜡三次，以便彻底置换出根尖组织内部的正丁醇。然后将石蜡溶液倒入牛皮纸槽中，再迅速将根尖放入槽内石蜡当中，待石蜡表面微微凝固之后，立刻浸入冷水之中，半小时后将样品转到4℃保存。
3、制作石蜡切片
从牛皮纸槽中取出包埋根尖的石蜡条，用单面刀片将其修成梯形石蜡小块，将小块粘附在切片机的样品头上，用德国徕卡半自动石蜡切片机(Leica RM2235)将根尖纵切成厚6-8μm的连续切片即蜡带。将蜡带光面朝下转移到经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，给载玻片上滴加适量纯水，小心将载玻片置于37℃热台上，使蜡带飘浮于水面之上，待石蜡切片充分舒展开后，用滤纸吸去多余水分，将制片放入37℃培养箱过夜，使制片彻底干燥并紧密粘附在载玻片上。
本实施例的切片厚度是影响后续FISH实验成功的重要因素，因为切片越厚，切片变性需要的时间越长，越容易导致组织细胞破损，探针抵达靶序列也越困难。但切片太薄，单个细胞会切成几个部分，导致切片上观察不到完整的细胞。因此，切片最佳厚度应该稍大于根尖分生细胞的直径，因为这样可以在切片中观察到完整的细胞。将根尖纵切成厚4、6、8、10μm的连续切片，可知杨树根尖分生组织细胞直径大约6μm，因此本实验选用6-8μm的切片厚度。
3、脱蜡及石蜡切片预处理
将制片放入盛有二甲苯溶液的染缸中脱蜡两次，每次15min，盛有二甲苯溶液的染缸置于通风橱中操作。接着用100％酒精将制片清洗两次，每次15min，气干备用。随后对石蜡切片预处理，步骤如下：
(1)用4％纤维素酶和2％果胶酶的混合液处理切片，每张片子30μL，37℃酶解2h；
(2)将切片浸入1×PBS溶液，5min/次，两次；
(3)用100μg/mL的RNase A溶液处理切片，每张片子100μL，37℃酶解1h；
(4)将切片浸入2×SSC溶液，5min/次，三次；
(5)将切片浸入0.01mol/L的HCl，2min；
(6)用5μg/L的胃蛋白酶溶液处理切片，每张片子100μL，37℃酶解20min；
(7)将切片浸入纯水清洗，2min；
(8)将切片浸入2×SSC溶液，5min/次，两次；
(9)将切片浸入70％、90％、100％乙醇溶液中脱水，每级3min；
(10)制片气干。
本实施例的酶解条件是影响后续FISH实验成功的重要因素。4％纤维素酶和2％果胶酶主要酶解细胞壁，可以增加组织通透性，分别酶解0.5、1、2、3h。RNase A和胃蛋白酶在植物2D FISH实验中较常用，可以去除其它蛋白质，使染色质暴露，从而使探针容易与靶序列结合。使用100μg/mL的RNase A溶液处理切片0.5、1、1.5、2h，用5μg/L的胃蛋白酶溶液处理切片10、15、20、30min。如果酶解时间短，会造成FISH没有信号，酶解时间长，会造成切片从载玻片上脱落。通过多次试验，优化的酶解条件是：4％纤维素酶和2％果胶酶的混合液酶解2h，100μg/mL的RNaseA酶解1h，5μg/L的胃蛋白酶酶解20min。
5、变性及杂交
(1)将预处理过的制片加100μL70％DFA，放置在85℃变性15min；
(2)将制片立即用70％，90％，100％的冰乙醇逐级脱水，每级5min；
(3)晾干备用；
(4)每张制片配制20μL杂交液，杂交液组成为：10μLDFA+2μL20×SSC+4μL50％DS+2μL45S rDNA+2μL19号染色体Oligo探针；
(5)杂交液在98℃变性10min后立即在冰中冷却5min以上；
(6)杂交液加到制片上，盖好盖玻片，放入湿盒，37℃杂交过夜。
本实施例的变性条件是影响FISH实验成功的关键因素。变性的目的是让DNA双链打开成单链，只有制片和探针的DNA呈单链，探针才能和靶序列复性并杂交成功。制片变性时间越短，组织结构保持越完整，DAPI染色效果越好，过度的变性会使组织结构破坏，且DAPI染色效果变差。将预处理过的制片用70％DFA在85℃分别变性5、10、15、20min。探针使用生物素标记的45S rDNA和地高辛标记的杨树19号染色体Oligo库，探针变性条件为98℃10min。结果表明：制片变性15min取得的试验效果最好。
6、抗体检测
将杂交过夜的制片按照如下步骤清洗、抗体孵育、DAPI套染，从第(5)步加入抗体开始需要避光操作。
(1)2×SSC泡掉盖玻片，并用2×SSC洗制片5min；
(2)42℃的2×SSC洗制片20min；
(3)1×TNT洗制片5min；
(4)每张制片配制二抗孵育液102μL，37℃在湿盒中孵育1h，二抗孵育液组成为：100μL1×TNB+1μLAnti-digoxigenin Rhodamine(Roche，11207750910)+1μLAlexaFluor488，streptavidin(Invitrogen，S-11223)；
(5)1×TNT洗制片三次，每次5min；
(6)1×PBS洗制片5min；
(7)纯水洗制片1min；
(8)晾干后，每张制片加20μL含有DAPI的Vectashield(Vector Labs，H-1200)胶封片。
7、3D图像捕获
完成FISH的制片先用荧光显微镜(Olympus BX51，Japan)初步观察，组织结构完整且杂交信号清晰的制片在蔡司激光共聚焦显微镜(Zeiss，Axio Imager Z2)下观察，使用ZEN 2011(Black version)软件捕获3D图像。
(1)双击桌面上的图标ZEN 2011启动软件，系统弹出软件启动窗口，点击StartSystem按钮，激活全部软件模块。
(2)将制片固定在载物台的样品夹上，点击软件左侧工具栏中的Locate按钮，点击Online按钮，激活软件对显微镜的控制。
(3)将待拍摄的细胞移动到视野中，点Acquisition按钮，设置扫描图像所需的各种参数。点击Smart Setup按钮，在Configure your experiment表格中选择待观察样品所使用的荧光物质及伪彩色，软件将自动完成光路配置，再勾选Z-Stack按钮，在Z-Stack操作界面进行Z轴方向拍摄区域的选择。
(4)设置完成后勾选所有的光路，点击左侧菜单栏中的Start Experiment按钮，开始拍摄。待系统运行结束后，3-D图像捕获完成。
图1为间期核的激光共聚焦3D成像图，该图直观展示出45S rDNA(绿色信号)位于核仁组织区，19号染色体(红色信号)位于细胞核的周边，且两条19号同源染色体分别占据核的不同空间位置。
图2为中期细胞的激光共聚焦3D成像图，该图直观展示出8和14号拥有45S rDNA(绿色信号)的两对染色体及19号染色体(红色信号)在中期的空间占位。8、14和19号染色体的同源染色体在中期也分别占据不同空间位置。

Claims (4)

1.一种基于石蜡切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)截取幼嫩的杨树根尖浸入固定液固定1h以上，再用纯水洗2次，每次15min，再依次使用溶液I、II、III、IV、V和VI对根尖进行脱水；
所述使用溶液I进行脱水处理，具体为1次，时长30min；所述使用溶液II进行脱水处理，具体为1次，时长30min；所述使用溶液III进行脱水处理，具体为1次，时长30min；所述使用溶液IV进行脱水处理，具体为1次，时长30min；所述使用溶液V进行脱水处理，具体为1次，时长30min；所述使用溶液VI进行脱水处理，具体为2次，1h/次；
所述固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1的卡诺固定液，
所述溶液I为纯水∶酒精∶正丁醇＝5∶4∶1，
所述溶液II为纯水∶酒精∶正丁醇＝3∶5∶2，
所述溶液III为纯水∶酒精∶正丁醇＝3∶10∶7，
所述溶液IV为纯水∶酒精∶正丁醇＝1∶8∶11，
所述溶液V为酒精∶正丁醇＝1∶3，
所述溶液VI为正丁醇，
所述I、II、III、IV和V溶液中的各组分比例均为体积比；
(2)将经步骤(1)处理的根尖浸入正丁醇∶石蜡＝1∶1的溶液中，置于37℃培养箱中浸蜡过夜；然后转移到60℃烘箱的纯石蜡溶液中，58-60℃条件下保持液体状态，浸泡1h/次，共置换纯石蜡三次；最后在牛皮纸槽中将根尖浸没于液状纯石蜡中，待石蜡表面凝固，立刻浸入冷水中，半小时后转移到4℃环境中保存；
(3)将包埋根尖的石蜡条修成梯形石蜡小块，然后切片，并将切片在经多聚赖氨酸处理过的载玻片上展平，得到制片，并置于37℃培养箱过夜，所述切片的厚度为6-8μm；
(4)将步骤(3)所得制片，浸入二甲苯溶液15min/次，两次；再浸入100％酒精15min/次，两次；最后用果胶酶、纤维素酶、胃蛋白酶及RNA酶处理对制片预处理，增强组织通透性，具体步骤为：
1)用4％纤维素酶和2％果胶酶的混合液处理制片，每张制片30μL，37℃酶解2h；
2)将制片浸入1×PBS溶液，5min/次，两次；
3)用100μg/mL的RNaseA溶液处理制片，每张制片100μL，37℃酶解1h；
4)将制片浸入2×SSC溶液，5min/次，三次；
5)将制片浸入0.01mol/L的HCl，2min；
6)用5μg/L的胃蛋白酶溶液处理切片，每张制片100μL，37℃酶解20min；
7)将制片浸入纯水清洗，2min；
8)将制片浸入2×SSC溶液，5min/次，两次；
9)将制片浸入70％、90％、100％乙醇溶液中脱水，每级3min；
10)制片气干；
(5)变性及杂交，具体包括如下步骤：
1)将预处理过的制片加100μL 70％DFA，放置在85℃变性15min；
2)将制片立即用70％，90％，100％的冰乙醇逐级脱水，每级5min；
3)晾干备用；
4)每张制片配制20μL杂交液，杂交液组成为：10μL DFA+2μL 20×SSC+4μL 50％DS+4μL探针；
5)杂交液在98℃变性10min后立即在冰中冷却5min以上；
6)杂交液加到制片上，盖好盖玻片，放入湿盒，37℃杂交过夜；
(6)抗体检测，具体包括如下步骤：
1)2×SSC泡掉盖玻片，并用2×SSC洗制片5min；
2)42℃的2×SSC洗制片20min；
3)1×TNT洗制片5min；
4)每张制片配制二抗孵育液102μL，37℃在湿盒中孵育1h，二抗孵育液组成为：100μL 1×TNB+1μL Ami-digoxigenin Rhodamine+1μL Alexa Fluor，streptavidin488；
5)1×TNT洗制片三次，每次5min；
6)1×PBS洗制片5min；
7)纯水洗制片1min；
8)晾干后，每张制片加20μL含有DAPI的Vectashield胶封片；
其中，从第4)步加入抗体开始避光操作。
2.根据权利要求1所述的基于石蜡切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤(1)中所述杨树幼嫩根尖的截取长度为3mm。
3.根据权利要求1所述的基于石蜡切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤(3)中所述的切片是采用石蜡切片机LeicaRM2235进行切片。
4.根据权利要求1所述的基于石蜡切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤(3)中所述的将切片在经多聚赖氨酸处理过的载玻片上展平，具体操作为：将蜡带光面朝下转移到经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，给载玻片上滴加适量纯水，小心将载玻片置于37℃热台上，使蜡带飘浮于水面之上，待石蜡切片充分舒展开后，用滤纸吸去多余水分。
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