CN116042782A - 特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法 - Google Patents

特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法 Download PDF

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CN116042782A CN202310214526.9A CN202310214526A CN116042782A CN 116042782 A CN116042782 A CN 116042782A CN 202310214526 A CN202310214526 A CN 202310214526A CN 116042782 A CN116042782 A CN 116042782A
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Abstract

本发明公开了特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法，具体涉及生物学检测领域，具体检测步骤如下：S1、组织样本准备；S2、免疫组织化学染色；S3、多重免疫组织化学染色；S4、X/Y染色体荧光原位杂交；S5、后期软件制作。本发明在多重免疫组化过程中，无需荧光显微镜，本实验方法仅仅通过可见光普通显微镜即可对结果进行多重染色成像；相对于传统的多重免疫组化，本发明可以在多重免疫组化的基础上再进行一次荧光原位杂交，这是过去相关技术无法做到的。

Description

特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法
技术领域
本发明涉及生物学检测技术领域，更具体地说，本发明涉及特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法。
背景技术
免疫组织化学(immunoh i stochemi stry,IHC)是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织和细胞中的某些化学物质的一门技术，它是免疫学和传统组织化学相结合而形成的。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
1.传统的免疫组化方法(IHC)，无法在一张组织切片上完成多种不同的蛋白质抗原的标记，无法准确的展现出不同的抗原表达区域的相互关系(无法展现出共表达，非共表达，表达区域空间定位的准确的相互关系)。
2.传统的免疫组化方法(IHC)，无法在免疫组化实验的基础上再进行一次荧光原位杂交实验，既无法在同一张组织切片上同时完成免疫组化实验和荧光原位杂交实验。
3.传统的多重免疫组化实验必须利用不同荧光二抗与不同的一抗进行结合，通知需要利用荧光显微镜对不同抗原进行成像，会很容易出现串色，荧光背景值过高，假阳性的出现等现象，这些问题很难避免。
4.传统多重免疫组化，无法在原本多重免疫组化实验完成后的切片组织上再进行一次荧光原位杂交实验，既不可以在同一张玻片上同时完成多个蛋白质抗原的标记的基础上，再完成一次可视化特定DNA序列的荧光原位杂交实验。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法，以解决背景技术中提及的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法，具体检测步骤如下：
S1、组织样本准备：
S1.1：新鲜胎盘组织用PBS缓冲液洗涤三次；
S1.2：将步骤S1.1处理后的样本放置在包埋盒中,用4％多聚甲醛固定过夜；
S1.3：在脱水器中使用各类脱水剂进行梯度过夜脱水；
S1.4：将步骤S1.3中脱水后的样本利用石蜡包埋机对组织进行包埋；
S1.5、切片：将步骤S1.4中包埋处理后的样本切片处理，处理成4μm的组织切片放在硅烷化的玻片上，并在60℃下烘烤过夜后备用；
S2、免疫组织化学染色；
S2.1、脱蜡：组织切片在二甲苯中脱蜡；
S2.2、抗原修复：将玻片置于预先加热到95℃的抗原修复液中，高压锅蒸煮玻片10分钟，自然冷却至室温；
S2.3：用3％的H2O2孵育10分钟以抑制内源性过氧化物酶活性；
S2.4：用PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟；
在室温下用含有5％BSA的PBS缓冲液封闭1小时；
稀释一级抗体，滴加100μl一抗，4℃冰箱孵育过夜；
PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟；
将适量的HRP酶联标记的二抗滴在玻片上，室温孵育30分钟；
用PBS洗涤三次，每次五分钟；
在室温下用AEC显色试剂盒染色10-20分钟；
在自来水中冲洗5分钟；
苏木精复染玻片，吸水纸吸去组织附近多余的水，滴加2-3滴水溶性封片剂，用24mm×48mm盖玻片覆盖，避免气泡的产生；
S2.5：使用数字切片扫描与应用系统(Mot i c Easy Scan 6，中国)将IHC染色玻片扫描成数字切片，并保存；
S3、多重免疫组织化学染色；
S3.1:将已扫描成数字切片的玻片，置于80℃±3℃的热水中，用尖口镊取下盖玻片；
S3.2：将玻片置于80％的酒精溶液中，在摇床上以60r/mi n的转速震荡洗涤10-30mi n，直至显微镜下红色AEC被完全洗掉；AEC没洗干净，会直接影响到下次多重免疫组化的结果；
S3.3：使用ddH2O洗涤三次；将玻片置于柠檬酸钠抗原修复液(pH＝6.0)高压蒸煮15分钟，自然冷却至室温；
S3.4：使用PBS缓冲液洗涤三次，用含有5％BSA的PBS缓冲液封闭1小时；使用针对第二个目标抗原的抗体进行新一轮的I HC染色；内源性过氧化物酶的阻断仅在第一轮IHC染色中进行；第二轮及以后的IHC染色中使用与第一轮IHC染色相同的HRP标记的二抗和AEC显色剂；
S3.5：使用数字切片扫描与应用系统(Mot i c Easy Scan 6，中国)将IHC染色玻片扫描成数字切片，并保存；
S3.6：重复S3.1-S3.6的各步骤；
S3.7：最后一轮IHC染色结束后，进行H&E染色，通过数字切片扫描与应用系统(Motic Easy Scan 6，中国)将H&E染色玻片扫描成数字切片，并保存；
S4、X/Y染色体荧光原位杂交；
S4.1：选择已经完成多重IHC和H&E染色的组织切片，将玻片置于80℃±2℃的热水中，用尖口镊取下盖玻片；
S4.2：将玻片置于80％的酒精溶液中，在摇床上以60r/mi n的转速震荡洗涤10-30mi n，直至显微镜下红色AEC被完全洗掉；
S4.3：将玻片置于柠檬酸钠抗原修复液(pH＝6.0)中蒸煮30分钟，自然冷却至室温；2×SSC溶液洗涤两次；在组织切片上滴加200μl预先制备的胃蛋白酶(12000U/ml)溶液，37℃湿润条件下消化20-40分钟(胃蛋白酶容易失活，可在20分钟左右，更换一次胃蛋白酶)；显微镜下观察组织消化情况，发现组织细胞间有明显分离后，用2×SSC溶液(pH＝7.0±0.1)洗涤玻片，终止消化；将玻片依次浸入70％、90％和100％的梯度酒精溶液中，各2分钟，进行脱水处理；
S4.4：将10μl特异性探针滴在组织上；根据组织大小，选择对应大小的盖玻片进行覆盖，避免气泡的产生，盖玻片的边缘用橡胶粘合剂密封；将玻片置于杂交仪(美国AbbottThermo Br ite)上孵育，程序设置为：76℃孵育5分钟，37℃孵育16小时(始终保持杂交仪内的湿润环境)；
S4.5：探针孵育结束后，去除橡胶粘合剂和盖玻片；将玻片浸于72℃的0.4×SSC溶液(pH＝7.0±0.1)中洗涤2分钟；取出玻片恢复室温后，将玻片置于0.05％tween20/2×SSC溶液(pH＝7.0±0.1)中，洗涤30秒；在蒸馏水中冲洗，以避免晶体形成，自然干燥；
S4.6：在组织上滴10μl DAPI/ant ifate(MetaSystems DAPI/ant i fade,D-0902-500-DA)，使用24mm×24mm的盖玻片覆盖；
S4.7使用荧光扫描仪对原位杂交切片进行扫描，并与前面多重免疫组织化学染色电子切片图像进行比较分析；
S5、后期软件制作：利用目前市面上现有商业化图形制作软件进行多重免疫组化的各个不同抗原显色图形的虚拟颜色制作，将各个图像色彩进行虚拟合成合成，最终完成最终的合成图。
在一个优选的实施方式中，所述步骤S1.3中脱水剂依次选用：①70％乙醇、②75％乙醇、③85％乙醇、④95％乙醇、⑤100％乙醇、⑥100％乙醇、⑦50％无水乙醇+50％二甲、⑧二甲苯、⑨二甲苯、⑩石蜡和
Figure BDA0004114400590000051
石蜡，单轮脱水剂的脱水时长设置为2h。
在一个优选的实施方式中，所述步骤S2.1中脱蜡处理后的样本切片需在一系列100％、95％、75％、65％乙醇中再水合，并用ddH2O洗涤三次；所述步骤S2.2中抗原修复液选用10mM Tr i s 1mM EDTA，pH＝8.0。
在一个优选的实施方式中，所述步骤S2.5、步骤S3.5和步骤S3.7中使用的数字切片扫描与应用系统均选用Motic Easy Scan 6，中国。
在一个优选的实施方式中，所述步骤S4.4-步骤S4.7均在避光环境中进行。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明在多重免疫组化过程中，无需荧光显微镜，本实验方法仅仅通过可见光普通显微镜即可对结果进行成像；相对于传统的多重免疫组化，本发明可以在多重免疫组化的基础上再进行一次荧光原位杂交，这是过去相关技术无法做到的；
2、本发明可以仅仅使用一种二抗即可以完成所有抗原的标记，同时也仅仅需要最常用最便宜的HRP标记的二抗进行标记，相对于传统多重免疫组化中的荧光二抗更加节约成本；相对于传统免疫组化，不会出现串色和无法判断假阳性的情况出现。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法，具体检测步骤如下：
S1、组织样本准备：
S1.1：新鲜胎盘组织用PBS缓冲液洗涤三次；
S1.2：将步骤S1.1处理后的样本放置在包埋盒中,用4％多聚甲醛固定过夜；
S1.3：在脱水器中使用各类脱水剂进行梯度过夜脱水，脱水剂依次选用：①70％乙醇、②75％乙醇、③85％乙醇、④95％乙醇、⑤100％乙醇、⑥100％乙醇、⑦50％无水乙醇+50％二甲、⑧二甲苯、⑨二甲苯、⑩石蜡和
Figure BDA0004114400590000061
石蜡，单轮脱水剂的脱水时长设置为2h；
S1.4：将步骤S1.3中脱水后的样本利用石蜡包埋机对组织进行包埋；
S1.5、切片：将步骤S1.4中包埋处理后的样本切片处理，处理成4μm的组织切片放在硅烷化的玻片上，并在60℃下烘烤过夜后备用；
S2、免疫组织化学染色；
S2.1、脱蜡：组织切片在二甲苯中脱蜡，在一系列100％、95％、75％、65％乙醇中再水合，并用ddH2O洗涤三次；
S2.2、抗原修复：将玻片置于预先加热到95℃的抗原修复液(10mM Tr is1mMEDTA，pH＝8.0)中，高压锅蒸煮玻片10分钟，自然冷却至室温；
S2.3：用3％的H2O2孵育10分钟以抑制内源性过氧化物酶活性；
S2.4：用PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟；
在室温下用含有5％BSA的PBS缓冲液封闭1小时；
稀释一级抗体，滴加100μl一抗，4℃冰箱孵育过夜；
PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟；
将适量的HRP酶联标记的二抗滴在玻片上，室温孵育30分钟；
用PBS洗涤三次，每次五分钟；
在室温下用AEC显色试剂盒染色10-20分钟；
在自来水中冲洗5分钟；
苏木精复染玻片，吸水纸吸去组织附近多余的水，滴加2-3滴水溶性封片剂，用24mm×48mm盖玻片覆盖，避免气泡的产生；
S2.5：使用数字切片扫描与应用系统(Mot i c Easy Scan 6，中国)将IHC染色玻片扫描成数字切片，并保存；
S3、多重免疫组织化学染色；
S3.1:将已扫描成数字切片的玻片，置于80℃±3℃的热水中，用尖口镊取下盖玻片；
S3.2：将玻片置于80％的酒精溶液中，在摇床上以60r/mi n的转速震荡洗涤10-30mi n，直至显微镜下红色AEC被完全洗掉；AEC没洗干净，会直接影响到下次多重免疫组化的结果；
S3.3：使用ddH2O洗涤三次；将玻片置于柠檬酸钠抗原修复液(pH＝6.0)高压蒸煮15分钟，自然冷却至室温；
S3.4：使用PBS缓冲液洗涤三次，用含有5％BSA的PBS缓冲液封闭1小时；使用针对第二个目标抗原的抗体进行新一轮的I HC染色；内源性过氧化物酶的阻断仅在第一轮IHC染色中进行；第二轮及以后的IHC染色中使用与第一轮IHC染色相同的HRP标记的二抗和AEC显色剂；
S3.5：使用数字切片扫描与应用系统(Mot i c Easy Scan 6，中国)将IHC染色玻片扫描成数字切片，并保存；
S3.6：重复S3.1-S3.6的各步骤；
S3.7：最后一轮IHC染色结束后，进行H&E染色，通过数字切片扫描与应用系统(Motic Easy Scan 6，中国)将H&E染色玻片扫描成数字切片，并保存；
S4、X/Y染色体荧光原位杂交；
S4.1：选择已经完成多重IHC和H&E染色的组织切片，将玻片置于80℃±2℃的热水中，用尖口镊取下盖玻片；
S4.2：将玻片置于80％的酒精溶液中，在摇床上以60r/mi n的转速震荡洗涤10-30mi n，直至显微镜下红色AEC被完全洗掉；
S4.3：将玻片置于柠檬酸钠抗原修复液(pH＝6.0)中蒸煮30分钟，自然冷却至室温；2×SSC溶液洗涤两次；在组织切片上滴加200μl预先制备的胃蛋白酶(12000U/ml)溶液，37℃湿润条件下消化20-40分钟(胃蛋白酶容易失活，可在20分钟左右，更换一次胃蛋白酶)；显微镜下观察组织消化情况，发现组织细胞间有明显分离后，用2×SSC溶液(pH＝7.0±0.1)洗涤玻片，终止消化；将玻片依次浸入70％、90％和100％的梯度酒精溶液中，各2分钟，进行脱水处理；
以下步骤S4.4-步骤S4.7均在避光环境中进行；
S4.4：将10μl特异性探针滴在组织上；根据组织大小，选择对应大小的盖玻片进行覆盖，避免气泡的产生，盖玻片的边缘用橡胶粘合剂密封；将玻片置于杂交仪(美国AbbottThermo Br ite)上孵育，程序设置为：76℃孵育5分钟，37℃孵育16小时(始终保持杂交仪内的湿润环境)；
S4.5：探针孵育结束后，去除橡胶粘合剂和盖玻片；将玻片浸于72℃的0.4×SSC溶液(pH＝7.0±0.1)中洗涤2分钟；取出玻片恢复室温后，将玻片置于0.05％tween20/2×SSC溶液(pH＝7.0±0.1)中，洗涤30秒；在蒸馏水中冲洗，以避免晶体形成，自然干燥；
S4.6：在组织上滴10μl DAPI/ant ifate(MetaSystems DAPI/ant i fade,D-0902-500-DA)，使用24mm×24mm的盖玻片覆盖，盖玻片的边缘用指甲油密封；
S4.7使用荧光扫描仪(3D HISTECH)对原位杂交切片进行扫描，并与前面多重免疫组织化学染色电子切片图像进行比较分析；
S5、后期软件制作：利用目前市面上现有商业化图形制作软件进行多重免疫组化的各个不同抗原显色图形的虚拟颜色制作，将各个图像色彩进行虚拟合成合成，最终完成最终的合成图。
现在市面上的多重免疫组化如abs i n公司的多重免疫组化试剂盒；本技术方式是建立在过去两种传统方法的基础上通过组合优化实验步骤完成的；
技术手段：免疫组化，自创染色褪色技术，荧光原位杂交；
方法步骤：免疫组化-染褪色-免疫组化-染褪色-免疫组化-染褪色-免疫组化-染褪色-免疫组化-染褪色-H&E染色-染褪色-荧光原位杂交；
1.相对传统免疫组化，本技术可以在同一张组织切片上完成多个蛋白质抗原的标记；
2.相对传统免疫组化，本技术可以在免疫组化实验的基础上再进行一次荧光原位杂交实验，既在同一张组织切片上同时完成免疫组化实验和荧光原位杂交实验；
3.相对于传统多重免疫组化实验本实验方法仅需要基于普通二抗(非荧光二抗)与一抗结合，仅仅只需要利用常规生物学显微镜平台进行成像，不需要贵重的荧光成像系统；
4.相对传统多重免疫组化利用荧光信号进行信号采集，本技术是利用可见光技术成像，最大可能的避免了假阳性的出现，实验准确性更强，更真实；
5.相对于传统多重免疫组化，本方法可以在多重免疫组化实验后在同一张免疫组化切片组织上再进行一次荧光原位杂交实验，即可以在同一张玻片上同时完成多个蛋白质抗原的标记的基础上，再完成一次可视化特定DNA序列的荧光原位杂交实验。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法，其特征在于，具体检测步骤如下：
S1、组织样本准备：
S1.1：新鲜胎盘组织用PBS缓冲液洗涤三次；
S1.2：将步骤S1.1处理后的样本放置在包埋盒中,用4％多聚甲醛固定过夜；
S1.3：在脱水器中使用各类脱水剂进行梯度过夜脱水；
S1.4：将步骤S1.3中脱水后的样本利用石蜡包埋机对组织进行包埋；
S1.5、切片：将步骤S1.4中包埋处理后的样本切片处理，处理成4μm的组织切片放在硅烷化的玻片上，并在60℃下烘烤过夜后备用；
S2、免疫组织化学染色；
S2.1、脱蜡：组织切片在二甲苯中脱蜡；
S2.2、抗原修复：将玻片置于预先加热到95℃的抗原修复液中，高压锅蒸煮玻片10分钟，自然冷却至室温；
S2.3：用3％的H2O2孵育10分钟以抑制内源性过氧化物酶活性；
S2.4：用PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟；
在室温下用含有5％BSA的PBS缓冲液封闭1小时；
稀释一级抗体，滴加100μl一抗，4℃冰箱孵育过夜；
PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟；
将适量的HRP酶联标记的二抗滴在玻片上，室温孵育30分钟；
用PBS洗涤三次，每次五分钟；
在室温下用AEC显色试剂盒染色10-20分钟；
在自来水中冲洗5分钟；
苏木精复染玻片，吸水纸吸去组织附近多余的水，滴加2-3滴水溶性封片剂，用24mm×48mm盖玻片覆盖；
S2.5：使用数字切片扫描与应用系统将IHC染色玻片扫描成数字切片，并保存；
S3、多重免疫组织化学染色；
S3.1:将已扫描成数字切片的玻片，置于80℃±3℃的热水中，用尖口镊取下盖玻片；
S3.2：将玻片置于80％的酒精溶液中，在摇床上以60r/min的转速震荡洗涤10-30min，直至显微镜下红色AEC被完全洗掉；
S3.3：使用ddH2O洗涤三次；将玻片置于柠檬酸钠抗原修复液(pH＝6.0)高压蒸煮15分钟，自然冷却至室温；
S3.4：使用PBS缓冲液洗涤三次，用含有5％BSA的PBS缓冲液封闭1小时；使用针对第二个目标抗原的抗体进行新一轮的IHC染色；S3.5：使用数字切片扫描与应用系统将IHC染色玻片扫描成数字切片，并保存；
S3.6：重复S3.1-S3.6的各步骤；
S3.7：最后一轮IHC染色结束后，进行H&E染色，通过数字切片扫描与应用系统将H&E染色玻片扫描成数字切片，并保存；
S4、X/Y染色体荧光原位杂交；
S4.1：选择已经完成多重IHC和H&E染色的组织切片，将玻片置于80℃±2℃的热水中，用尖口镊取下盖玻片；
S4.2：将玻片置于80％的酒精溶液中，在摇床上以60r/min的转速震荡洗涤10-30min，直至显微镜下红色AEC被完全洗掉；
S4.3：将玻片置于柠檬酸钠抗原修复液(pH＝6.0)中蒸煮30分钟，自然冷却至室温；2×SSC溶液洗涤两次；在组织切片上滴加200μl预先制备的胃蛋白酶(12000U/ml)溶液，37℃湿润条件下消化20-40分钟；显微镜下观察组织消化情况，发现组织细胞间有明显分离后，用2×SSC溶液(pH＝7.0±0.1)洗涤玻片，终止消化；将玻片依次浸入70％、90％和100％的梯度酒精溶液中，各2分钟，进行脱水处理；
S4.4：将10μl特异性探针滴在组织上；根据组织大小，选择对应大小的盖玻片进行覆盖，避免气泡的产生，盖玻片的边缘用橡胶粘合剂密封；将玻片置于杂交仪上孵育，程序设置为：76℃孵育5分钟，37℃孵育16小时；
S4.5：探针孵育结束后，去除橡胶粘合剂和盖玻片；将玻片浸于72℃的0.4×SSC溶液(pH＝7.0±0.1)中洗涤2分钟；取出玻片恢复室温后，将玻片置于0.05％tween20/2×SSC溶液(pH＝7.0±0.1)中，洗涤30秒；在蒸馏水中冲洗，自然干燥；
S4.6：在组织上滴10μl DAPI/antifate，使用24mm×24mm的盖玻片覆盖；
S4.7使用荧光扫描仪对原位杂交切片进行扫描，并与前面多重免疫组织化学染色电子切片图像进行比较分析；
S5、后期软件制作：利用目前市面上现有商业化图形制作软件进行多重免疫组化的各个不同抗原显色图形的虚拟颜色制作，将各个图像色彩进行虚拟合成合成，最终完成最终的合成图。
2.根据权利要求1所述的特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法，其特征在于：所述步骤S1.3中脱水剂依次选用：①70％乙醇、②75％乙醇、③85％乙醇、④95％乙醇、⑤100％乙醇、⑥100％乙醇、⑦50％无水乙醇+50％二甲、⑧二甲苯、⑨二甲苯、⑩石蜡和
Figure FDA0004114400570000031
石蜡，单轮脱水剂的脱水时长设置为2h。
3.根据权利要求1所述的特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法，其特征在于：所述步骤S2.1中脱蜡处理后的样本切片需在一系列100％、95％、75％、65％乙醇中再水合，并用ddH2O洗涤三次；所述步骤S2.2中抗原修复液选用10mM Tris 1mM EDTA，pH＝8.0。
4.根据权利要求1所述的特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法，其特征在于：所述步骤S2.5、步骤S3.5和步骤S3.7中使用的数字切片扫描与应用系统均选用Motic Easy Scan 6，中国。
5.根据权利要求1所述的特定核酸序列荧光原位杂交联合多重免疫组化实验方法，其特征在于：所述步骤S4.4-步骤S4.7均在避光环境中进行。
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CN117887820A (zh) * 2024-03-15 2024-04-16 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种同时原位荧光检测人类rna、dna、蛋白质的方法

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