RU2777238C1 - Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах - Google Patents
Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах Download PDFInfo
- Publication number
- RU2777238C1 RU2777238C1 RU2021137753A RU2021137753A RU2777238C1 RU 2777238 C1 RU2777238 C1 RU 2777238C1 RU 2021137753 A RU2021137753 A RU 2021137753A RU 2021137753 A RU2021137753 A RU 2021137753A RU 2777238 C1 RU2777238 C1 RU 2777238C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- minutes
- fgfr1
- fluorescent
- alcohol
- dna probe
- Prior art date
Links
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 12
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 title description 2
- 241000894007 species Species 0.000 title description 2
- 101710002377 FLG Proteins 0.000 title 1
- 101710044679 fgfr1a Proteins 0.000 title 1
- 102000027758 FGFR1 Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108010081291 Type 1 Fibroblast Growth Factor Receptor Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims abstract description 10
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims abstract description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 14
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 6
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N o-xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000001993 wax Substances 0.000 claims description 4
- 239000008096 xylene Substances 0.000 claims description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N DATI Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000002264 Mammary Glands, Animal Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004293 Mammary Glands, Human Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 16
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000771 oncological Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 11
- 102100016662 ERBB2 Human genes 0.000 description 5
- 101700025368 ERBB2 Proteins 0.000 description 5
- 101710037934 QRSL1 Proteins 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 230000003328 fibroblastic Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 208000000409 Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 3
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 210000002536 Stromal Cells Anatomy 0.000 description 3
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N Texas Red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000002380 cytological Effects 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 229940029303 fibroblast growth factor-1 Drugs 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 208000004019 Papillary Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 241000397921 Turbellaria Species 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- 208000009956 Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000481 Breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229920000665 Exon Polymers 0.000 description 1
- 210000002288 Golgi Apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920002248 Nuclear DNA Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional Effects 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 239000000994 contrast dye Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblasts Anatomy 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000012760 regulation of cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 201000007423 tubular adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а именно к лабораторной диагностике. При проведении реакции флуоресцентной гибридизации in situ на гистологических препаратах опухоли молочной железы у собак и кошек используют ДНК-зонд FGFR1 Breakapart/Amplification Probe. Способ сокращает время обработки материала, повышает точность диагностики при определении онкологического процесса. 3 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к лабораторной диагностике и может быть использовано для гистологических срезов, сделанных при биопсии опухоли молочной железы в ходе хирургической операции. Это основано на применении тест-системы из специальных ДНК-зондов с меткой FGFR1 для проведения реакции флуоресцентной in situ гибридизации (fluorescent in situ hybridization - FISH).
Уровень техники
Известен способ выполнения флюоресцентной гибридизации in situ на гистологических парафиновых срезах планарной ткани (Jordi Solana, RNA In Situ Hybridizationon Planarian Paraffin Sections MethodsMolBiol. 2018; 1774: 393-404. doi: 10.1007/978-1-4939-7802-1_13), в котором полученные участки от планарий гибридизуруют с гаптен-мечеными РНК-зондами. Последующее иммунологическое зондовое обнаружение проводят либо с хромогенным, либо с флуоресцентным проявлением, чтобы визуализировать экспрессию генов с клеточным или субклеточным разрешением.
Недостатком данного способа является долгая обработка в промывочных буферах (кол-во 6) перед использованием РНК-зонда. А также относительный дефицит определенных структур доступных антител для планарных белков.
Известен способ амплификации гена HER2 с помощью флуоресценцией in situ гидридизации при карциноме молочной железы у кошек (HER2 Amplification Status in Feline Mammary Carcinoma: A Tissue Microarray - Fluorescence In Situ Hydridization - Based Study» Luisa Vera Muscatello, 1.10.2018). Целью этого способа была оценка эпителиального фактора роста (HER2), статус амплификации гена и его корреляция с экспрессией белка HER2 в карциномах молочной железы кошек, с помощью иммуногистохимического метода (ИГХ) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Недостатком способа является, что проводят исследование только на амплификацию гена HER2.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах (патент RU 2755391). При котором FISH-реакцию проводят на цитологическом материале, отобранного при помощи тонкоигольной аспирационной биопсии из опухолей молочных железу собак и кошек.
Недостатками способа заключаются низкая достоверность для некоторых типов опухолей (связана с особенностями их строения), а также исследование ограниченного участка патологической ткани (только тех клеток, которые попадут на стекло при взятии биопсии).
Раскрытие изобретения
Задачей заявляемого изобретения является разработка тест-системы для исследования и определения редких типов опухолей молочной железы.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого способа, сводится к повышению точности диагностики при определении онкологического процесса.
Технический результат достигается способа флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах, включающий взятие на исследование кусочка ткани, который фиксируют в фиксаторе, а затем заключают в расплавленный парафиновый воск, после чего восковой блок с образцом ткани, режут на микротоме для получения тонких срезов парафина, содержащих ткань, типично от 3 до 4 микрон толщины, с последующим нанесением срез образца на предметное стекло, высушиванием на воздухе и нагреванием, после того как срез зафиксирован удаляют парафин путем окунания стекол в две порции ксилола - 5 минут в каждой и две порции спирта 96% - по 5 минут в каждой, после чего проводят ополоскивание в 70% спирте и дистиллированной воде, далее наносят на парафиновый срез примерно 200 мкл раствора пепсина Pepsin Solution и инкубируют 15 минут, затем промывают в дистиллированной воде и помещают в раствор 2×SSC на 5 минут, после дегидратируют препараты в 70% спирте - 1 минута, в двух порциях 96% спирта - по 1 минуте в каждой и высушивают на воздухе в течение 20 минут, после чего наносится ДНК-зонд FGFR1 Breakapart/Amplification Probe, с последующей денатурацией в автоматической FISH- системе в течение 5 минут при 80°С и гибридизацией при 37°С 16-18 часов, затем проводят отмывание буферными растворами в течение 3 минут и наносят флюоресцентный краситель DAPI.
Фибробласты управляют морфогенезом эпителия молочной железы через передачу сигналов паракринной связи, которая между стромальными и эпителиальными клетками является двунаправленной, т.е. эпителиальные клетки также сигнализируют стромальным клеткам. Одним из таких является фактор роста фибробластов 1 (FGF1) - циркулирующий белок, состоящий из 181 аминокислот, который способен стимулировать пролиферацию фибробластов, а также участвует в регуляции клеточной миграции и выживания, регенерации тканей, в процессах ангиогенеза и нейрогенеза. При наличии аберрантно активированных стромальных клеток, особенно миофибробластов, может произойти нарушение сигнального пути FGF1, что может привести к злокачественной трансформации эпителиальных клеток в молочной железе, которая способствует развитию опухолевого роста.
Рецептор, кодирующий FGFR1, локализуется на хромосоме 8 в локусе p11.23 (8p11.23), преимущественно всего его обнаруживают на плазматической мембране и цитоплазме, включая аппарат Гольджи. При наличии опухолевой патологии данный ген подвергается многообразным изменениям, в том числе амплификации и мутации в различных экзонах.
В настоящее время в опубликованных источниках отсутствуют какие-либо данные о применении флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 на гистологических срезах опухоли молочной железы у лабораторных (крысы) и домашних млекопитающих (кошка, собака) животных. Понимание того, как сигнальные пути фибробластов регулируют развитие молочной железы, можно дать представление о механизме биологии рака молочной железы (РМЖ).
Краткое описание чертежей и иных материалов
Фиг. 1 - сигнал Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) в клетке фибробластического дифферона у собаки. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Фильтр FITC (зеленое свечение). Ок. 15, об. 100.
Фиг. 2 - сигнал Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) в клетке фибробластического дифферона у собаки. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Фильтр Texas Red (красное свечение). Ок. 15, об. 100.
Фиг. 3 - количество клеток с сигналами гена FGFR1.
Осуществление изобретения
Исследования проводят на базе Научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» в гистологической лаборатории.
Гистологическое исследование материала опухоли молочных желез, отобранного при биопсии в ходе хирургической операции, осуществляют следующим образом: для приготовления образца ткани для гистологического исследования кусочки ткани фиксируют в фиксаторе (формальдегид), а затем заключают в расплавленный парафиновый воск. Затем восковой блок, содержащий образец ткани, режут на микротоме для получения тонких срезов парафина, содержащих ткань, типично от 3 до 4 микрон толщины. Потом срез образца наносят на предметное стекло, высушивают на воздухе и нагревают, чтобы вызвать приклеивание образца к предметному стеклу.
Далее удаляют парафин (депарафинизация и регидратация) путем окунания стекол в 1 порции ксилола -5 минут, во 2 порции ксилола -5 минут, затем окунали в 1 порцию спирта 96% - 5 минут, 2 порцию спирта 96% - 5 минут и полоскание в 70% спирте, затем полоскание в дистиллированной воде. После чего наносят на парафиновый срез примерно 200 мкл раствора пепсина (Pepsin Solution) и инкубируют 15 минут. Затем промывают в дистиллированной воде и помещают в раствор 2×SSC на 5 минут, после дегидратируют препараты в 70% спирте и после дегидратируют препараты в 70% спирте - 1 минута, в 1 порции 96% спирта -1 минута, во 2 порции 96% спирта -1 минута и высушивают на воздухе в течение 20 минут.
Далее накрывают каждый гистологический материал квадратным покровным 24×24 мм2 стеклом и наносят по краям покровного стекла универсальный резиновый клей Момент «Кристалл» для герметизации, который согласно проведенным исследованиям имеет высокую прочность склеивания, водостойкость клеевого соединения, теплостойкость и легкое снятие без повреждения исследуемого материала после проведения денатурации и гибридизации (https://dm.henkel-dam.com/is/content/henkel/TDS-003003-RU-Moment-Contact-Crystal-tube).
Проводят денатурацию на автоматической FISH-гибридизационной системе «ThermoBrite», (кампания StatSpin), устанавливают стекла на пластину и вставляют две увлажняющие полоски, смоченные в ультрачистой ионизированной воде, в держатели на внутренней стороне крышки (https://manualzz.com/doc/4619533/wasser-bi-destillationsapparate-water-stills-for). Далее устанавливают программу «Денатурация и Гибридизация». Денатурация - это когда молекула ДНК приобретает вид одноцепочечной нити. При реакции гибридизации происходит взаимодействие ДНК-зонда и комплементарным ему участком ядерной ДНК материала.
Денатурируют материал при 80°С - 5 минут. Потом происходит автоматическое охлаждение столика, на котором расположены предметные стекла, после чего происходит автоматическая гибридизация. При гибридизации инкубируют препараты в течение 18 часов при температуре 37°С у собак и 16 часов при температуре 37°С у кошек, в связи с разным сцеплением белков с ДНК-зондом.
После гибридизации удаляют клей с краев покровного стекла и при помощи гистологической иглы снимают стекло. Затем следует отмывка, в предварительно нагретый отмывочный буфер Prewarm Wash Buffer 1 (0,4×SSC / 0,3% lgepal) до 72°С вносят стекла на 2 минуты. После чего стекла быстро (чтобы не высохли клетки) промакивают вокруг исследуемых зон одноразовыми бумажными полотенцами для создания сухого поля вокруг материала и наносят гидрофобный слой восковым маркером (для предотвращения растекания реактивов). Далее наносят при помощи 1-канальной автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) 20 мкм буфера Wash Buffer 2 (2×SSC / 0,1% lgepal) на 1 минуту. Промакивают препараты бумажными полотенцами и наносят с помощью автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) 15 мкл контрастирующего красителя DAPI/Antifadec0.1, содержащий флюорохромом, после чего накрывают каждое предметное стекло покровным стеклом размерами 24×60 мм2.
После этого помещают в термостат при температуре 25°С, при этом время выдержки в термостате предметных стекол с флюорохромом для собак составляет 10 минут, для кошек составляет 15 минут. Затем предметные стекла с исследуемым цитологическим материалом помещают под темную светонепроницаемую пластину, после чего поочередно анализируют каждый препарат при помощи флюоресцентного микроскопа, остальные стекла с материалом остаются под темной светонепроницаемой пластиной во избежание попадания света, что влияет на экспрессию свечения.
Таким образом, время на проведение FISH-реакции составляет примерно 19 часов.
Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах: выполняется следующим образом материал, полученный от собак под номерами №1, 3, 5 показал наличие флюоресцирующих сигналов под фильтрами Texas Red (красный) и FITC (зеленый), что означает среднее количество копий гена FGFR1 на клетку регистрировалось ≥6, свечения сигналов были выражены, что говорит об амплификации гена в клетках фибробластического дифферона, их активной пролиферации и синтеза белка коллагена. Материал под №2 показал среднее количество копий гена FGFR1 на клетку ≥4 и <6 (амплификация неопределенная), в то время у № 3 показал количество копий гена <4, что говорит об отсутствии амплификации гена FGFR1.
Таким образом, при патогистологическом исследовании были диагностированы такие новообразования, как папиллярная аденокарцинома, тубулярная аденокарцинома.
Материал, полученный от кошек под номерами №2, 3 ,5 показал наличие флюоресцирующих сигналов под фильтрами Texas Red/FITC, что означает среднее количество копий гена FGFR1 на клетку регистрировалось ≥6. Свечения сигналов были выражены, что говорит об амплификации гена FGFR1 в клетках фибробластического дифферона. Материал под №1 показал среднее количество копий гена FGFR1 на клетку ≥4 и <6 (амплификация неопределенная), в то время у №4 показал количество копий гена <4, что говорит об отсутствии амплификации гена FGFR1.
При патогистологическом исследовании были диагностированы такие новообразования, как папиллярная аденокарцинома, плеоморфная аденокарцинома.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- непродолжительное время обработки материала;
- высокое разрешение локализации экспрессии свечения и большая чувствительность на клеточном и даже субклеточном уровнях, благодаря значительно уменьшенной толщины ткани;
- высокая оценка флюоресцентного сигнала и его интенсивность;
- снижение стоимости гистологического препарата за счет малого расхода жидких реактивов и буферов.
Claims (1)
- Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у собак и кошек на гистологических препаратах, включающий взятие на исследование кусочков тканей опухолей молочной железы у собак и кошек, который фиксируют в фиксаторе, а затем заключают в расплавленный парафиновый воск, после чего восковой блок с образцом ткани режут на микротоме для получения тонких срезов парафина, содержащих ткань, с последующим нанесением среза образца на предметное стекло, высушиванием на воздухе и нагреванием, после того как срез зафиксирован, удаляют парафин путем окунания стекол в две порции ксилола - 5 минут в каждой и две порции спирта 96% - по 5 минут в каждой, после чего проводят ополоскивание в 70% спирте и дистиллированной воде, далее наносят на парафиновый срез 200 мкл раствора пепсина Pepsin Solution и инкубируют 15 минут, затем промывают в дистиллированной воде и помещают в раствор 2×SSC на 5 минут, после дегидратируют препараты в 70% спирте – 1 минута, в двух порциях 96% спирта – по 1 минуте в каждой и высушивают на воздухе в течение 20 минут, после чего наносится ДНК-зонд FGFR1 Breakapart/Amplification Probe с последующей денатурацией в автоматической FISH- системе в течение 5 минут при 80°С и гибридизацией при 37°С 16-18 часов, затем проводят отмывание буферными растворами в течение 3 минут и наносят флюоресцентный краситель DAPI.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2777238C1 true RU2777238C1 (ru) | 2022-08-01 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2410438C2 (ru) * | 2004-08-06 | 2011-01-27 | Дженентек, Инк. | Анализы и способы, использующие биомаркеры |
| EP2447360A1 (en) * | 2006-04-14 | 2012-05-02 | Cell Signaling Technology, Inc. | Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors |
| EP1711590B1 (en) * | 2004-01-08 | 2016-12-14 | Dako Denmark A/S | Apparatus and methods for processing biological samples and a reservoir therefore |
| RU2755392C1 (ru) * | 2021-02-25 | 2021-09-15 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1711590B1 (en) * | 2004-01-08 | 2016-12-14 | Dako Denmark A/S | Apparatus and methods for processing biological samples and a reservoir therefore |
| RU2410438C2 (ru) * | 2004-08-06 | 2011-01-27 | Дженентек, Инк. | Анализы и способы, использующие биомаркеры |
| EP2447360A1 (en) * | 2006-04-14 | 2012-05-02 | Cell Signaling Technology, Inc. | Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors |
| RU2755392C1 (ru) * | 2021-02-25 | 2021-09-15 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Франк Г.А. и др. Иммуногистохимические методы: Руководство, М., 2011, с.105-115. Lambros M. et al. Unlocking pathology archives for molecular genetic studies: a reliable method to generate probes for chromogenic and fluorescent in situ hybridization. Lab Invest 86, 2006, 398-408. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20060041385A1 (en) | Method of quantitating proteins and genes in cells using a combination of immunohistochemistry and in situ hybridization | |
| RU2405158C2 (ru) | Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца | |
| KR101823697B1 (ko) | 항원 복원 공정을 위한 방법 및 장치 | |
| US20190064140A1 (en) | Substance labeling patch, method and apparatus for tissue diagnosis using the same | |
| EP1525476A1 (en) | Method for solution based diagnosis | |
| JP2002537561A (ja) | 細胞タンパク質成分を単離および分析するための方法および装置 | |
| AU5809799A (en) | Removal of embedding media from biological samples and cell conditioning on automated staining instruments | |
| US8163565B2 (en) | Light curing fixative | |
| CN113348356A (zh) | 用于针对形态学特征和生物标志物表达而制备和分析细胞样品的方法和系统 | |
| KR101969847B1 (ko) | 동일 검체에서 여러 항원을 검출하기 위한 순차적 다중 면역염색법 | |
| CN106980018A (zh) | 一种应用cd45免疫荧光联合cep17探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 | |
| CN108603879B (zh) | 样品多重循环和原位成像的方法 | |
| JP6087313B2 (ja) | 細胞分析方法 | |
| RU2777238C1 (ru) | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах | |
| CN104991073B (zh) | 检测scml2的即用型快速酶免疫组织化学试剂盒 | |
| Mead et al. | Expression analysis by RNAscope™ in situ hybridization | |
| CN116593262B (zh) | 基于pdx/pdtx肿瘤活组织生物样本和数据库的分子标志物检测产品及其制备方法 | |
| JP2011013051A (ja) | 生体試料標本の作製方法 | |
| RU2755392C1 (ru) | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах | |
| McGinley et al. | Collection of epithelial cells from rodent mammary gland via laser capture microdissection yielding high-quality RNA suitable for microarray analysis | |
| Teng et al. | A new method for real-time evaluation of pepsin digestion of paraffin-embedded tissue sections, prior to fluorescence in situ hybridisation | |
| CN117887820B (zh) | 一种同时原位荧光检测人类rna、dna、蛋白质的方法 | |
| RU2107911C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики гиперпластических процессов и рака молочной железы в гистологических срезах | |
| WO2017061152A1 (ja) | 子宮頸がんの試験方法およびそれに用いる試験試薬 | |
| RU2530557C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики злокачественной и доброкачественной патологии молочной железы |